JP3922373B2 - プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼの安定化方法 - Google Patents
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コリンエステラーゼを測定する方法は数種類知られているが、正確性、迅速性、経済性などの点で酵素法が優れており、特にp-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ と プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ を使用した測定法が優れており、これら酵素の製造方法および酵素を用いた分析方法に関して多くの報告がある。
(1)アルドヘキソース、ケトヘキソース、ヘキソースを還元してなる糖アルコール、ヘキソースの誘導体、オリゴ糖、水溶性中性多糖からなる群から選ばれる少なくとも1種を安定化剤として添加する事を特徴とするプロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼの安定化方法;
(2)ヘキソースが、D-グルコース、D,L-ガラクトース、D-マンノース、D-タロース、L-ソルボース、D-タガロースから選ばれ、糖アルコールがグルシトール、マンニトールおよびイノシトールから選ばれ、ヘキソース誘導体がサリシンであり、オリゴ糖がマルトース、イソマルトース、セロビオース、トレハロース、ラクトース、スクロース、ラフィノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、γ-シクロデキストリン、α-シクロデキストリン及びβ-シクロデキストリンからなる群から選ばれ、
水溶性の中性多糖類がイヌリン、アミロース、アミロペクチン、デキストリン及びプルランからなる群から選ばれる、(1)記載のプロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼの安定化方法;
(3)安定化剤が、D-グルコース、マルトペンタオース、トレハロース、サリシン、L-ソルボース、セロビオース、D-ガラクトース、サッカロース、マルトース、マルトトリオース、イヌリン、プルラン、マルトテトラオース、D-フルクトース、イソマルトース、D-マンノース、マンニトール、ラクトース、グルシトール、γ-シクロデキストリン、α-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン及びmyo-イノシトールからなる群から選ばれる少なくとも1種である(1)記載の方法;
(4) アルドヘキソース、ケトヘキソース、ヘキソースを還元してなる糖アルコール、ヘキソースの誘導体、オリゴ糖、水溶性中性多糖からなる群から選ばれる少なくとも1種を含むプロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ水溶液を凍結乾燥することを特徴とする安定化されたプロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼ凍結乾燥品の製造方法;である。
本発明は、プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼの安定化にアルドヘキソース、ケトヘキソース、ヘキソースを還元してなる糖アルコール、ヘキソースの誘導体、オリゴ糖、水溶性中性多糖からなる群から選ばれる特定の糖類を使用する。
ヘキソースとは炭素数6の単糖の総称であり、アルデヒド基を持つアルドヘキソース、ケト基を持つケトヘキソースに分類される。これらは水酸基の結合によって異性体が存在し、不斉炭素を持つためそれぞれに対して対掌体が存在する。また、同様にヘキソースの還元によってなる糖アルコールにも対掌体が存在し光学活性を有する物がある。これらはD体、L体として識別されるが、いずれも本発明の安定化剤として利用する事が出来る。
また、プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼは金属酵素なので、EDTA、o-Phenanthrolineなどの金属キレート剤や,還元剤を添加しない事が望ましい。一方、これらの金属キレート剤を防腐などの目的で添加したほうが好ましい場合もありうるが、そのような場合は添加濃度は酵素の安定性を損ねない程度に最低限に留める事が望ましい。
凍結乾燥する場合の酵素蛋白質濃度が0.3%(w/w)から2%(w/w)の場合、安定化剤の添加量下限は酵素蛋白重量に対して好ましくは30%、さらに好ましくは50%、最も好ましくは100%である。安定化剤の添加量上限は酵素蛋白重量に対して好ましくは2000%、さらに好ましくは1500%、最も好ましくは1000%である
凍結乾燥する場合の酵素蛋白質濃度が3%(w/w)から10%(w/w)の場合、安定化剤の添加量下限は酵素蛋白重量に対して好ましくは3%、さらに好ましくは10%、最も好ましくは20%である。安定化剤の添加量上限は酵素蛋白重量に対して好ましくは1000%、さらに好ましくは500%、最も好ましくは300%である。
プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼはシュードモナス属細菌由来の製品を使用した。
活性値(U/ml)={ΔOD/min(ΔODtest-ΔODblank)×3.05(ml)×希釈倍率}/{3.8×1.0(cm)×0.05(ml)}
3.05ml=反応混液液量
3.8=プロトカテキュ酸の上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数
1.0cm=セルの光路長
0.05ml=酵素サンプル液量
得られた凍結乾燥粉末を乾燥条件下25℃で2週間保存し、初期活性を100%として活性残存率を求めた。結果を(表-1)に示す。
ヘキソース(表中ではD-グルコース、L-ソルボース、D-ガラクトース、D-マンノース)
ヘキソースの還元によってなる糖アルコール(表中ではグルシトール、マンニトール、myo-イノシトール)
少糖類(表中ではマルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、イソマルトース、セロビオース、α-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、γ-シクロデキストリン、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース)
水溶性中性多糖類(表中ではイヌリン、プルラン)
ヘキソースの誘導体(表中ではサリシン)
に安定化効果がみられる。
Claims (3)
- D−グルコース、L−ソルボース、トレハロース、マルトペンタオース、サリシンからなる群から選択される少なくとも一種の糖を安定化剤として添加するプロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼの安定化方法であって、リン酸緩衝液、モルフォリノプロパンスルホン酸(MOPS)緩衝液およびグリシルグリシン緩衝液からなる群から選択される少なくとも一種の緩衝液を共存させる、プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼの安定化方法。
- プロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼと共存するリン酸緩衝液の濃度が、10mMから600mMである、請求項1のプロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼの安定化方法。
- 酵素に対する糖の重量比率を1:1.5から1:10の範囲で添加する、請求項1のプロトカテキュ酸ジオキシゲナーゼの安定化方法。
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