JPS6440B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6440B2 JPS6440B2 JP55150240A JP15024080A JPS6440B2 JP S6440 B2 JPS6440 B2 JP S6440B2 JP 55150240 A JP55150240 A JP 55150240A JP 15024080 A JP15024080 A JP 15024080A JP S6440 B2 JPS6440 B2 JP S6440B2
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- JP
- Japan
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- glu
- solution
- gtp
- cyclodextrin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
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- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
の活性測定用試薬に関する。さらに詳しく言え
ば、本発明は、γ−グルタミル−４−ニトロアニ
リドとシクロデキストリンとを含有することを特
徴とするγ−グルタミルトランスペプチダーゼの
活性測定用試薬に関する。
の活性測定用試薬に関する。さらに詳しく言え
ば、本発明は、γ−グルタミル−４−ニトロアニ
リドとシクロデキストリンとを含有することを特
徴とするγ−グルタミルトランスペプチダーゼの
活性測定用試薬に関する。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下γ
−GTPと略記する）の活性測定には、現在、
種々の基質が用いらているが、中でも、Ｌ−γ−
グルタミル−４−ニトロアニリド（以下Glu−４
−NAと略記する）を用いる方法は、Szaszによ
る改良法〔Clin.Chem.15巻124頁（1969）〕が考
案されて以来、最も盛んに行われている方法であ
る。
−GTPと略記する）の活性測定には、現在、
種々の基質が用いらているが、中でも、Ｌ−γ−
グルタミル−４−ニトロアニリド（以下Glu−４
−NAと略記する）を用いる方法は、Szaszによ
る改良法〔Clin.Chem.15巻124頁（1969）〕が考
案されて以来、最も盛んに行われている方法であ
る。
ところで、このGlu−４−NAを用いる方法は、
Glu−４−NAが、水に対して非常に難容性であ
り、かつ、不安定で分解し易いという欠点を有し
ている。そこで、このGlu−４−NAの溶解性を
増大せしめるために、従来、一般には、塩酸、有
機溶媒、あるいは界面活性剤などを付加的に用い
る方法や、熱を加える方法などが行われている。
ところが、溶解性を増すためのこれらの種々の方
法がとられたとしても、これらの方法においては
Glu−４−NAは、γ−GTP活性測定時におい
て、約４ｍmole／（４ｍＭ）までしか溶解せ
ず、しかも、以下に述べる如き、好ましくない現
象、結果を招来するという問題が残されていた。
Glu−４−NAが、水に対して非常に難容性であ
り、かつ、不安定で分解し易いという欠点を有し
ている。そこで、このGlu−４−NAの溶解性を
増大せしめるために、従来、一般には、塩酸、有
機溶媒、あるいは界面活性剤などを付加的に用い
る方法や、熱を加える方法などが行われている。
ところが、溶解性を増すためのこれらの種々の方
法がとられたとしても、これらの方法においては
Glu−４−NAは、γ−GTP活性測定時におい
て、約４ｍmole／（４ｍＭ）までしか溶解せ
ず、しかも、以下に述べる如き、好ましくない現
象、結果を招来するという問題が残されていた。
すなわち、これらの方法においては、Glu−４
−NAの非酵素的分解が溶解時に起り、溶解後
も、経時的に分解反応が起るが、この非酵素的分
解により、グルタミン酸と４−ニトロアニリンが
生成し、この４−ニトロアニリンがγ−GTPの
触媒作用を阻害することとなる〔臨床化学７巻
255頁（1979）、Clin.Chem.22巻417頁（1976）〕。
また、これらの物質の存在により、γ−GTP活
性測定にあたつて考慮しなければならないPH、温
度、基質濃度、使用する緩衝物質の種類等々のあ
らゆる条件に影響を与えることとなり測定時の至
適条件の設定が極めて複雑、困難なものとなる。
しかも、γ−GTPの酵素活性は、酵素的分解に
より生成した４−ニトロアニリンを分光光学的に
測定することにより行われるものであるから、吸
光度が大になればなるほど、測定結果は著しく不
正確さを増すことになる。
−NAの非酵素的分解が溶解時に起り、溶解後
も、経時的に分解反応が起るが、この非酵素的分
解により、グルタミン酸と４−ニトロアニリンが
生成し、この４−ニトロアニリンがγ−GTPの
触媒作用を阻害することとなる〔臨床化学７巻
255頁（1979）、Clin.Chem.22巻417頁（1976）〕。
また、これらの物質の存在により、γ−GTP活
性測定にあたつて考慮しなければならないPH、温
度、基質濃度、使用する緩衝物質の種類等々のあ
らゆる条件に影響を与えることとなり測定時の至
適条件の設定が極めて複雑、困難なものとなる。
しかも、γ−GTPの酵素活性は、酵素的分解に
より生成した４−ニトロアニリンを分光光学的に
測定することにより行われるものであるから、吸
光度が大になればなるほど、測定結果は著しく不
正確さを増すことになる。
本発明者らは、Glu−４−NAを基質として、
γ−GTPの酵素活性の測定を行う方法につき、
種々研究を行つたところ、反応系にシクロデキス
トリンを添加すると、Glu−４−NAの溶解性を
著しく高めるとともに、Glu−４−NAの水又は
緩衝溶液における非酵素的分解を抑制し得ること
を見出した。本発明はかかる知見に基いてなされ
たものである。
γ−GTPの酵素活性の測定を行う方法につき、
種々研究を行つたところ、反応系にシクロデキス
トリンを添加すると、Glu−４−NAの溶解性を
著しく高めるとともに、Glu−４−NAの水又は
緩衝溶液における非酵素的分解を抑制し得ること
を見出した。本発明はかかる知見に基いてなされ
たものである。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明はγ−GTPの酵素活性測定用試薬とし
て、Glu−４−NAにシクロデキストリンを添加
して使用することを特徴とするものであるが、
Glu−４−NAは、従来法においては、前述の如
く、水又は緩衝液に対して、精々４ｍＭまでの溶
解性しか示さなかつたのに対し、本発明の試薬に
おいては、例えばシクロデキストリン0.3％
（Ｗ／Ｖ）の添加で16ｍＭ（４倍以上）という高い
溶解度を得ることができる。
て、Glu−４−NAにシクロデキストリンを添加
して使用することを特徴とするものであるが、
Glu−４−NAは、従来法においては、前述の如
く、水又は緩衝液に対して、精々４ｍＭまでの溶
解性しか示さなかつたのに対し、本発明の試薬に
おいては、例えばシクロデキストリン0.3％
（Ｗ／Ｖ）の添加で16ｍＭ（４倍以上）という高い
溶解度を得ることができる。
また、一方シクロデキストリンの添加は、上述
のGlu−４−NAの溶解性の増大に加えて、Glu−
４−NAの安定化効果をも、もたらす。すなわ
ち、Glu−４−NAの水溶液又は緩衝溶液（４ｍ
Ｍ）を室温に放置すると、その分解量は、24時間
で、すでに約27μMに達し、48時間で約55μM、
72時間で、約80μM、96時間で約108μMという値
を示すがこの分解により、生成する４−ニトロア
ニリンはγ−GTPの触媒作用を阻害するため、
24時間後において、すでに、本来γ−GTPの有
する酵素活性が約10％阻害されていることが判明
している。これに対し、シクロデキストリンを添
加するときは、24時間後において、Glu−４−
NAの非酵素的分解は、ほとんど認められず、
120時間後においても、その分解量は、シクロデ
キストリンを添加しない従来のものの24時間後の
値とほとんど同程度であるという結果が認められ
る。
のGlu−４−NAの溶解性の増大に加えて、Glu−
４−NAの安定化効果をも、もたらす。すなわ
ち、Glu−４−NAの水溶液又は緩衝溶液（４ｍ
Ｍ）を室温に放置すると、その分解量は、24時間
で、すでに約27μMに達し、48時間で約55μM、
72時間で、約80μM、96時間で約108μMという値
を示すがこの分解により、生成する４−ニトロア
ニリンはγ−GTPの触媒作用を阻害するため、
24時間後において、すでに、本来γ−GTPの有
する酵素活性が約10％阻害されていることが判明
している。これに対し、シクロデキストリンを添
加するときは、24時間後において、Glu−４−
NAの非酵素的分解は、ほとんど認められず、
120時間後においても、その分解量は、シクロデ
キストリンを添加しない従来のものの24時間後の
値とほとんど同程度であるという結果が認められ
る。
このようにシクロデキストリンを添加すると、
Glu−４−NAの溶解性を増大させ、安定性を向
上させ、かつ、γ−GTPの触媒作用に全く影響
を与えることがないので、本発明の試薬により、
γ−GTPの活性を従来法に比し、著しく正確に
測定することが可能となるものである。
Glu−４−NAの溶解性を増大させ、安定性を向
上させ、かつ、γ−GTPの触媒作用に全く影響
を与えることがないので、本発明の試薬により、
γ−GTPの活性を従来法に比し、著しく正確に
測定することが可能となるものである。
そもそも、酵素化学的研究においては、酵素−
基質親和性（Ｋｍ）の測定は重要な課題であると
ころ、γ−GTPのＫｍ測定は、基質の溶解性が
悪いため、従来法においては低濃度領域において
測定がなされ、高濃度領域に対しては推察的算定
が行われていたものであるが、本発明により、高
濃度領域の基質溶液が調製可能となつた結果、従
来技術より著しく正確な測定値が得られることと
なつた。
基質親和性（Ｋｍ）の測定は重要な課題であると
ころ、γ−GTPのＫｍ測定は、基質の溶解性が
悪いため、従来法においては低濃度領域において
測定がなされ、高濃度領域に対しては推察的算定
が行われていたものであるが、本発明により、高
濃度領域の基質溶液が調製可能となつた結果、従
来技術より著しく正確な測定値が得られることと
なつた。
本発明において用いられるシクロデキストリン
については、通常、試薬としては、α−シクロデ
キストリン、β−シクロデキストリン、γ−シク
ロデキストリンが知られ、これらの混合物として
も提供されているが、そのいずれも使用すること
が可能であり、純度その他特に特定されるべき条
件はない。コストならびに水溶性の点からは、β
−シクロデキストリンの使用が好ましい態様とし
て推奨される。
については、通常、試薬としては、α−シクロデ
キストリン、β−シクロデキストリン、γ−シク
ロデキストリンが知られ、これらの混合物として
も提供されているが、そのいずれも使用すること
が可能であり、純度その他特に特定されるべき条
件はない。コストならびに水溶性の点からは、β
−シクロデキストリンの使用が好ましい態様とし
て推奨される。
本発明の試薬に関して、特筆されるべき利点
は、凍結乾燥製品としてそれを提供し得ることで
ある。すなわち、従来、Glu−４−NAを主成分
とするγ−GTP酵素活性測定用試薬は、前述し
たとおり、Glu−４−NAが難溶性であるため、
種々の可溶化手段を用いて、ようやく４ｍＭ程度
の濃度を得ているほどであつて、試薬として、凍
結乾燥した製品とすることは、到底不可能であつ
たが、本発明による、シクロデキストリンとの組
合せ使用により、凍結乾燥製品を提供することが
可能となつた。すなわち、Glu−４−NAとシク
ロデキストリンとの混合溶液を凍結乾燥したもの
を用いれば簡便な燥作で、γ−GTPの測定を行
うことができるので、本発明によつてγ−GTP
の測定作業を著しく簡便にするという優れた利点
がもたらされることとなる。
は、凍結乾燥製品としてそれを提供し得ることで
ある。すなわち、従来、Glu−４−NAを主成分
とするγ−GTP酵素活性測定用試薬は、前述し
たとおり、Glu−４−NAが難溶性であるため、
種々の可溶化手段を用いて、ようやく４ｍＭ程度
の濃度を得ているほどであつて、試薬として、凍
結乾燥した製品とすることは、到底不可能であつ
たが、本発明による、シクロデキストリンとの組
合せ使用により、凍結乾燥製品を提供することが
可能となつた。すなわち、Glu−４−NAとシク
ロデキストリンとの混合溶液を凍結乾燥したもの
を用いれば簡便な燥作で、γ−GTPの測定を行
うことができるので、本発明によつてγ−GTP
の測定作業を著しく簡便にするという優れた利点
がもたらされることとなる。
以下に本発明の実施例を掲げる。
実施例 １
γ−GTPの酵素活性測定
Ａ 試薬の調製
(イ) 緩衝液：グリシルグリシン6.2ｇとジエタ
ノールアミン10.5ｇとを約900mlの蒸留水に
溶かし、塩酸を用いてPH8.2（30℃）とした後
蒸留水を加えて1000mlとする (ロ) 基質液：Ｌ−γ−グルタミル−４−ニトロ
アニリド4.6ｇとシクロデキストリン2.7ｇと
を上記(イ)の緩衝液100mlで溶解する。
ノールアミン10.5ｇとを約900mlの蒸留水に
溶かし、塩酸を用いてPH8.2（30℃）とした後
蒸留水を加えて1000mlとする (ロ) 基質液：Ｌ−γ−グルタミル−４−ニトロ
アニリド4.6ｇとシクロデキストリン2.7ｇと
を上記(イ)の緩衝液100mlで溶解する。
(ハ) 測定溶液：上記(イ)の緩衝液300mlと上記(ロ)
の基質液100mlとを混合して、溶液とする。
の基質液100mlとを混合して、溶液とする。
Ｂ 測定操作
上記(ハ)の測定溶液2.5mlを約２分間予備加温
し（30℃）、これに測定対象の酵素溶液0.1mlを
加え：よく振り混ぜた後分光光度計にて、
405nｍにおける１分間の吸光度の増加を測定
する。
し（30℃）、これに測定対象の酵素溶液0.1mlを
加え：よく振り混ぜた後分光光度計にて、
405nｍにおける１分間の吸光度の増加を測定
する。
Ｃ 単位（活性）の計算
１分間当りの吸光度の増加量をＸとすると
単位（活性）＝Ｘ×2.6／9.9×0.1×1000＝Ｘ×2626IU
／ となる。
／ となる。
実施例 ２
γ−GTPのGlu−４−NAに対する酵素基質親
和性（Ｋｍ）の測定 Ａ 試薬の調製 実施例１に記載した(イ)緩衝液(ロ)基質液を使用
して次の溶液を作る。
和性（Ｋｍ）の測定 Ａ 試薬の調製 実施例１に記載した(イ)緩衝液(ロ)基質液を使用
して次の溶液を作る。
基質液１mlに緩衝液39mlを加える（0.4ｍ
Ｍ） 基質液２mlに緩衝液38mlを加える（0.8ｍ
Ｍ） 基質液３mlに緩衝液37mlを加える（1.2ｍ
Ｍ） 基質液４mlに緩衝液36mlを加える（1.6ｍ
Ｍ） 基質液５mlに緩衝液35mlを加える（2.0ｍ
Ｍ） Ｂ 測定操作 上記Ａの〜の溶液各2.5mlにそれぞれ約
100IU／のγ−GTP溶液を0.1ml加え、１分
間の吸光度の増加を405nｍにて測定する。そ
してその各溶液に対して得られた１分間の吸光
度の増加量をXi（X1〜X5）とする。
Ｍ） 基質液２mlに緩衝液38mlを加える（0.8ｍ
Ｍ） 基質液３mlに緩衝液37mlを加える（1.2ｍ
Ｍ） 基質液４mlに緩衝液36mlを加える（1.6ｍ
Ｍ） 基質液５mlに緩衝液35mlを加える（2.0ｍ
Ｍ） Ｂ 測定操作 上記Ａの〜の溶液各2.5mlにそれぞれ約
100IU／のγ−GTP溶液を0.1ml加え、１分
間の吸光度の増加を405nｍにて測定する。そ
してその各溶液に対して得られた１分間の吸光
度の増加量をXi（X1〜X5）とする。
Ｃ Ｋｍの求め方
Xiに対するGlu−４−NAの濃度をSi（S1〜
S5）とし、縦軸に１／Xiを、横軸に１／Siを目盛り、 上記操作で得た値をプロツトする。次に各プロ
ツトを直線で結び、直線の両端を延長させる。
この延長線と横軸との交点の値が−１／Ｋｍであ る。すなわち交点の値の逆数の絶対値がＫｍと
なる。
S5）とし、縦軸に１／Xiを、横軸に１／Siを目盛り、 上記操作で得た値をプロツトする。次に各プロ
ツトを直線で結び、直線の両端を延長させる。
この延長線と横軸との交点の値が−１／Ｋｍであ る。すなわち交点の値の逆数の絶対値がＫｍと
なる。
実施例 ３
凍結乾燥品の調製
Ｌ−γ−グルタミル−４−ニトロアニリド4.6
ｇとシクロデキストリン2.7ｇとを蒸留水100mlに
溶解する。次に本溶液を、３mlずつに分けて、凍
結乾燥を行なう。
ｇとシクロデキストリン2.7ｇとを蒸留水100mlに
溶解する。次に本溶液を、３mlずつに分けて、凍
結乾燥を行なう。
得られた凍結乾燥品は、３mlの水又は緩衝液を
用いて溶解すると16ｍMGlu−４−NA溶液とな
る。上記の凍結乾燥品は、Glu−４−NAのみの
固形状態のものと比較して、はるかに安定であ
り、この製品は、安定状態で保管することができ
る。
用いて溶解すると16ｍMGlu−４−NA溶液とな
る。上記の凍結乾燥品は、Glu−４−NAのみの
固形状態のものと比較して、はるかに安定であ
り、この製品は、安定状態で保管することができ
る。
Claims (1)
- １ γ−グルタミル−４−ニトロアニリドとシク
ロデキストリンとを含有することを特徴とするγ
−グルタミルトランスペプチダーゼの活性測定用
試薬
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55150240A JPS5774099A (en) | 1980-10-28 | 1980-10-28 | Reagent for measuring activity of gamma-cultanyl transpeptidase |
| PCT/JP1981/000303 WO1982001564A1 (en) | 1980-10-28 | 1981-10-28 | Reagent for assaying gamma-clutamyl transpeptidase activity |
| DE3152458T DE3152458C2 (ja) | 1980-10-28 | 1981-10-28 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55150240A JPS5774099A (en) | 1980-10-28 | 1980-10-28 | Reagent for measuring activity of gamma-cultanyl transpeptidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5774099A JPS5774099A (en) | 1982-05-10 |
| JPS6440B2 true JPS6440B2 (ja) | 1989-01-05 |
Family
ID=15492619
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55150240A Granted JPS5774099A (en) | 1980-10-28 | 1980-10-28 | Reagent for measuring activity of gamma-cultanyl transpeptidase |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5774099A (ja) |
| DE (1) | DE3152458C2 (ja) |
| WO (1) | WO1982001564A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04365706A (ja) * | 1991-06-13 | 1992-12-17 | Daifuku Co Ltd | シャッター付き回転棚装置の制御方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4451563A (en) * | 1981-08-28 | 1984-05-29 | Kaufman Richard A | Method for increasing the sensitivity of assays |
| US4511651A (en) * | 1982-07-30 | 1985-04-16 | American Monitor Corporation | Reagent composition and assay for the determination of γ-glutamyltransferase activity |
| JP2590983B2 (ja) * | 1987-12-11 | 1997-03-19 | 東ソー株式会社 | 難水溶性抗原の免疫測定方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51125046A (en) * | 1974-11-22 | 1976-11-01 | Ono Pharmaceut Co Ltd | Process for preparing prostaglandin analogues |
| JPS5443791A (en) * | 1977-09-13 | 1979-04-06 | Seishin Seiyaku Kk | Method and reagent for measuring hydrogen peroxide |
| JPS6016599A (ja) * | 1983-07-08 | 1985-01-28 | Yatoron:Kk | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼの活性測定用試薬 |
-
1980
- 1980-10-28 JP JP55150240A patent/JPS5774099A/ja active Granted
-
1981
- 1981-10-28 WO PCT/JP1981/000303 patent/WO1982001564A1/ja not_active Ceased
- 1981-10-28 DE DE3152458T patent/DE3152458C2/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04365706A (ja) * | 1991-06-13 | 1992-12-17 | Daifuku Co Ltd | シャッター付き回転棚装置の制御方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1982001564A1 (en) | 1982-05-13 |
| DE3152458T1 (ja) | 1982-12-02 |
| DE3152458C2 (ja) | 1991-02-14 |
| JPS5774099A (en) | 1982-05-10 |
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