JPH0564737B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 イ 産業上の利用分野 この発明は糞便中のヘモグロビン検出方法に関
するものであり、特に被検者に食餌制限等の準備
をさせずに、しかも消化器系統における異常の部
位を推定することができ、且つ集団検診等のよう
に大量の検体を簡便に検出できる方法に関するも
のである。

ロ 従来技術及びその問題点 糞便中のヘモグロビン（血液）を検出して消化
器系統の異常、例えば癌、潰瘍等を早期に発見す
る検診方法が行われている。

この糞便中のヘモグロビンの検出には従来から
化学的糞便潜血反応法が用いられている。近年先
進国において大腸癌の発症頻度が著しく増加して
きた。即ち食生活の欧米化が進んだことが大腸癌
発症率を上昇させている。そのため大腸癌の早期
発見のための集団検診法として化学的糞便潜血反
応法が簡便で低コストの点から広く実施されてい
る。この化学的糞便潜血反応は非常に敏感であ
り、小量のヘモグロビンも検出できる。

ところが、従来の化学的糞便潜血反応は赤血球
中のヘモグロビンに含まれるヘムのペルオキシダ
ーゼ活性に基ずく種々の色原体との呈色反応によ
るものであるからヒトヘモグロビンに対しての特
異性がない。従つて食餌に由来する異種動物のヘ
モグロビン、ミオグロビン或いは葉緑素含有野菜
（ブロツコリー、大根、カリフラワー、にんじん、
きゆうり、かぼちや、キヤベツ等）の中のペルオ
キシダーゼとも反応する。さらに投薬（鉄、銅、
ヨウ化カリウム、ビタミンＣ等）の影響も受け
る。そこでヒトヘモグロビンに対する特異性を上
げるためには検査前の肉食を禁ずる等の食餌制限
を必要とする欠点がある。実際の集団検診におい
ては食餌制限と共に反応感度の低い色原体を用い
た化学的潜血反応を使用して偽陽性の増加を防止
しているが、その結果逆に偽陰性（ヘモグロビン
があるのに検出しない）が増加する危険性を伴つ
ていた。

また新鮮血液中のヘモグロビンでも消化酵素で
分解されたヘモグロビンでも同様にペルオキシダ
ーゼ活性が発現するから、従来の化学的糞便潜血
反応法では口腔から肛門に至る全消化器径路での
出血を検出してしまうので出血部位の情報が得ら
れず、例えば大腸癌等の消化器系統下部からの出
血を証明するための特異性と鋭敏性を共に満足さ
せることは不可能であつた。

今日なお化学的糞便潜血反応法による集団検診
法が確立されていないのは上記欠点によるもので
ある。

これに対し最近Barrow（Am.J.Cli.Pathol.69：
342，1978 March）らをはじめとしてヒトヘモ
グロビンと抗ヒトヘモグロビンの抗体−抗原反応
を用いる免疫学的糞便潜血反応による測定法が開
発されている。この免疫学的糞便潜血測定法によ
ると、ヘモグロビンは消化系統中での消化酵素の
作用を受けると大部分の抗原性を失うので、ヒト
ヘモグロビンに対する特異性は勿論糞便中で抗原
性を残す消化器系統の下部からの出血のみを検出
することができる特徴を有するものである。

しかし今日までこの免疫学的潜血測定原理に基
づき開発された測定法は、糞便を一定量採取して
溶液と混和したのち遠心分離機にかけて上清（ウ
ワズミ）を試料とする操作が必要であり、その上
一次元平板拡散法（抗体を含むゲル中に試料を拡
散させて反応を見る法）、オークテルロニー
（Ouchterlony）法（ゲル中に抗体と試料を一定
間隔の場所に注入して両者が拡散して反応するの
を判定する）では成績判定に24〜48時間を必要と
するし、またCounter Immunoelectro−
phoresis法（電流を流して支持体上での試料と抗
体の反応生成物を測定する）では特殊な分析機器
を必要とする等の欠点があり、一般には普及する
に至つてはいないし、また大量の集団検診には不
適当である。

さらにこの方法を集団検診に応用するには多数
の検診者の糞便を一定量づつ採取して、その多数
の試料にID（標識）を付して分析室まで運搬して
取り扱う必要があり、この作業は臭気、不潔感等
のため作業者に不快である欠点もある。

ニ 発明の開示 このような実状に鑑み、本発明者らは大腸癌等
の消化器系統の出血を集団検診してスクリーニン
グする方法として、従来の化学的糞便潜血反応お
よび免疫学的糞便潜血反応が有する前記欠点を克
服すべく鋭意研究を行つた結果、糞便中のヘモグ
ロビンが高分子材料（特に疎水性プラスチツク樹
脂）の表面に容易に分子吸着する性質を利用して
糞便中のヘモグロビンを採便容器の中で広い濃度
域にわたつて容易に他の蛋白質と共に分離する方
法を見い出し、且つ該分子吸着したヘモグロビン
は酵素標識したヒトヘモグロビンを使用する酵素
免疫法によつてヒトヘモグロビンのみを特異的に
且つ高感度で簡便に検出できることを発見して本
発明をなしたものである。

即ち本発明は、先ず糞便を疎水性高分子材料
（例えばポリスチレン、塩化ビニール）製の採取
器に採取し、緩衝液を入れた容器中に一定時間浸
漬して糞便中のヘモグロビンを該材料の表面に分
子吸着させる。次ぎに予め準備した抗ヒトヘモグ
ロビンに酵素をラベルした酵素標識抗ヒトヘモグ
ロビンを採取器に吸着したヘモグロビンに滴下し
て抗原−抗体反応を行わせ、これに基質液を加え
て呈色反応を行い、呈色によつて糞便中のヒトヘ
モグロビンのみを特異的に検出する方法である。

さらに高分子材料表面に分子吸着させたヘモグ
ロビンは従来の化学的糞便潜血反応法による検出
も可能であり（但し本分離法で吸着されたヘモグ
ロビンに対して化学的潜血反応を実施すると野菜
中のペルオキシダーゼ、薬剤の影響は除去されて
おり、動物由来（食餌）のヘモグロビン、ミオグ
ロミンは従来通り検出される）、化学的糞便潜血
反応法にる検出を前記の酵素免疫学的反応法によ
る検出と同時に並行的に行つて糞便中のヘモグロ
ビンの検出をより確実にすると共に消化器系統中
での出血の部位を推定可能とする糞便中のヘモグ
ロビン検出方法を含むものである。

以下さらに詳しく本発明の方法を説明する。

Ａ 試料の採取 糞便試料の採取容器の一例を第１〜４図に示す
が、図面のように採取容器は採取器１と液容器８
からなつている。採取器１は中央の内部にネジ孔
７をもうけた本体３に被検者のIDラベル１１を
貼る平板の把持部２があり、ネジ孔７の底部には
先端に採便サジ５をもうけた軸４をもうけた構造
である。採便サジ５は両面が使用でき又検査用の
液を滴下した時流れ落ちないように格子状に小さ
な溝６をもうけるのが良い。液容器８は上部に採
取器１のネジ孔７に合うネジ部９をもうけた円筒
型のものである。採取器１は疎水性の高い高分子
材料、例えばポリスチレン、塩化ビニール等のプ
ラスチツク樹脂、で製作する。材料としては呈色
反応が見易いように白色のものが望ましい。採取
器の構造は図示のものに限られるものではなく、
スプーン状の先端構造でも又一面のみに糞便を採
取する構造でもよい。

この採取器１の採便サジ５の両面に被検者の糞
便を採取しIDラベル１１を把持部２に貼つて、
予め糞便中の消化酵素の活性を阻止するように調
整した緩衝液を入れた液容器８を採取器１とネジ
７，９によつて固定し、一定時間放置する。

多くの蛋白質、例えばグロブリン等が疎水性高
分子材料の表面に吸着されることは知られている
が、ヘモグロビン分子の原型立体構造は全べての
極性アミノ酸が外部に向かつて配列し、非極性
（疎水性）のアミノ酸は分子の内部に向かつて配
列しており、またプロトヘムは疎水性の強いポケ
ツトに疎水性の強いビニール基を先頭に入りこん
だ構造をとるのは周知の事実であり、そのままで
は疎水性結合による吸着性があるが大きくない。
ところが消化管を通過したヘモグロビンは主に消
化酵素の作用を受けて立体構造がくずれ疎水性部
分が露出し、疎水性結合により高分子材料の表面
への吸着性が著しく増強する。例えばポリスチレ
ンの場合には約30分間そのような変性ヘモグロビ
ンと接触することにより吸着平衡状態に達する。
すなわち糞便中のヘモグロビンは他の蛋白質と共
に採取器の表面にその大部分が分子吸着される。

またヘモグロビンは酸性の緩衝液によつても立
体構造が変化して消化酵素の場合と同様に高分子
材料の表面に容易に吸着されるようになる。従つ
て糞便採取後、液容器内の酸性の緩衝液と混和し
て放置すると糞便中のヘモグロビンは高分子材料
の採便サジの表面に疎水結合により吸着され広い
濃度域にわたつて容易に分離される。

一定時間後に採取器と液容器を分解して採取器
を試料とする。

この方法によれば、例えば糞便を採取して採取
器と液容器を結合して放置し、一定時間後に採取
容器を分解して液容器あるいは液容器の内容液を
捨てて採取器のみを試料として測定場所に運ぶこ
とができる。そうすると採取器には糞便中のヘモ
グロビンを含む蛋白質だけが吸着しており臭気、
不潔感がないので作業者の不快感がなく、従つて
収集、運搬が容易である。

Ｂ 酵素免疫測定法 イ 酵素免疫測定法のための試薬の調整 (1) ヘモグロビンＡの調整 人の血液から例えばWilliamsらの方法（Anal.
Biochem.54：137，1973）によつてヘモグロビン
Ａを調整する。

(2) 抗ヒトヘモグロビンの調整 精製したヘモグロビンＡをFreund′s
completeadjuvantに混和し、家兎、山羊等の動
物に免疫して採血し遠心分離して抗血清を得る。

(3) 酵素の標識 抗血清に、例えば吉武氏ら（免疫実験法XI，
P3497〜3519，1982 日本免疫学会発行）の方法
で酵素をラベルし酵素標識抗体を調整する。この
場合にペルオキシダーゼ、アルカリフオスフアタ
ーゼ等各種の酵素を用いることができる。

Ｃ 測定方法 (1) ヘモグロビンを吸着した採取器の採便サジの
表面を脱イオン水で良く洗浄する。

(2) 酵素標識抗体試薬を表面に滴下或いは採取便
サジを浸漬して、例えば20〜40℃で30分間放置
して抗原−抗体反応を行わしめる。

(3) 採便サジを脱イオン水で十分洗浄して基質液
（呈色反応液）、例えばパラニトロフエニルリン
酸溶液、を滴下する。

(4) 約５〜10分後に呈色反応を観察して判定す
る。

この方法によると約１時間以内に大量の試料の
検出作業を行うことができる。

以上に酵素免疫反応法による糞便中のヘモグロ
ビンの検出法について説明したが、これに従来か
ら行われている化学的潜血反応を同時に行うと糞
便中のヘモグロビンをさらに確実に検出すること
ができる。

ホ 実施例 実施例 １ (a) 試薬 精製したヘモグロビンＡをFreund′s complete
adjuvantに混和し、家兎に週一回免疫した。一
回の免疫に使用する抗原量は0.5mgで2.5mlの
Freund′s complete adjuvantに混和して用いた。
これを５回繰り返し最終免疫後５日目に採血し、
遠心分離して抗血清（抗ヒトヘモグロビン）と
し、−80℃で凍結保存した。

次ぎに酵素標識抗体試薬としてアルカリフオス
フオターゼを用いてアルカリフオスフオターゼ標
識抗ヒトヘモグロビン（２％牛アルブミン、10％
正常ヤギ血清、0.5mM塩化マグネシウムを含む）
を調整した。

ヘモグロビンを含む蛋白質を採便サジに吸着さ
せ、採便サジを脱イオン水でよく洗浄し、前記酵
素標識抗体試薬0.3mlを分注した小試験管に移し、
37℃で30分間抗原抗体反応を行わせしめた。次ぎ
に採便サジを脱イオン水で洗浄し、40mMのパラ
ニトロフエニルリン酸、0.5mMマグネシウムを
含むジエタノールアミンPH10.5の基質液0.5mlを
入れた小試験管に入れて37℃で５〜10分間インキ
ユベートする。さらに1NのNaOHを0.5ml加えて
反応を停止させる。

肉眼で呈色（この場合黄色）度を測定し、判定
する。

種々の試料を判定の結果、ヘモグロビン濃度が
0.5mg／dl以上の場合には明らかに陽性と識別で
き、高濃度で300mg／dl以上あるいは全血状態の
ヘモグロビン濃度に至る領域で強度陽性の呈色を
示すことが分かつた。

実施例 ２ 図面に示すような採取器を用いて糞便を採便サ
ジの両面に採取し、1Mクエン酸液を緩衝液とし
て蛋白質（ヘモグロビンを含む）を採便サジの両
面に吸着させた。

採便サジを脱イオン水でよく洗浄し、片面に
1M酢酸緩衝液中にオルトリジン塩酸塩、過酸化
水素を含む化学的潜血反応用試薬を滴下する。約
10分間放置すると呈色（この場合は青色）反応が
生ずるので肉眼で判定する。実験の結果ヘモグロ
ビンが１mg／dl以上で陽性の呈色反応を示すこと
が分かつた。

化学的潜血反応完了後、或いは化学的潜血反応
用試薬を滴下した後ただちに採便サジの裏側を上
にして、実施例１で用いた酵素標識抗体試薬を一
滴、滴下する。この試料を20〜40℃で30分間放置
する。この間に化学的潜血反応による呈色を判定
することができる。

採便サジを脱イオン水でよく洗浄し、採便サジ
の裏側即ち酵素免疫反応用表面に実施例１と同様
の基質液を滴下して、５分後に呈色（黄色）反応
を判定する。

この方法でも実施例１と同様に酵素免疫法で、
ヘモグロビンが濃度0.5mg／dl以上で明らかに陽
性と識別できるし、高濃度では300mg／dl以上あ
るいは全血状態のヘモグロビン濃度に至る全領域
で強陽性の呈色を示すことが分かつた。

この方法で種々の実験をしたところ、健常者
（ヘモグロビン無し）の糞便にペプシン、トリプ
シンで消化反応させたヘモグロビンを混入して反
応性を調べたところ化学的潜血反応は陽性とな
り、酵素免疫反応では陰性となつた。次ぎに同じ
糞便に新鮮血を混和し37〜40℃で大腸滞留条件を
設定してヘモグロビンを検出したところ、化学的
潜血反応および酵素免疫反応いずれも陽性となつ
た。

即ち糞便中のヘモグロビンを酵素免疫反応法と
化学的潜血反応法を並行して検出することにより
ヘモグロビンが消化器系統の上部、下部のいずれ
から出ているかを推定できることがわかつた。

ヘ 発明の効果 以上に詳しく説明したように本発明の高分子材
料表面に糞便中のヘモグロビンを吸着させて酵素
免疫法により糞便中のヘモグロビンを測定する方
法によれば、従来から多用されている化学的糞便
潜血反応法の欠点、すなわち特異性と鋭敏度の両
面を解決し、且つ従来の免疫学的反応原理による
他の測定法に比し操作性が極めて簡便化できて免
疫学的反応による測定の実用性を大幅に向上させ
ることができる。また臨床的には消化器系統の下
部のみの出血を検出できるので、特に最近発症率
が増加している大腸癌等の早期発見のスクリーニ
ング検査として有用である。また高分子材料への
ヘモグロビンの吸着の利用によつて試料採取の作
業が簡単で清潔となる利点を有する。

さらに免疫学的反応法と化学的糞便潜血反応法
を同時に行うことによつて糞便中の潜血をより確
実に検出できると共に臨床的にも消化器系統中の
出血部位の推定が可能となる効果を有するもので
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に使用する試料の採取器の一例
を示す正面図、第２図は同側面図、第３図はその
Ａ−Ａ断面図、第４図はその液容器の正面図であ
る。 １……採取器、２……把持部、３……本体、４
……軸、５……採便サジ、６……溝、７……ネジ
孔、８……液容器、９……ネジ部、１１……ID
カード。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 糞便中のヘモグロビンを検出する方法におい
   て、疎水性高分子材料製の採取器の表面に糞便中
   のヘモグロビンを含む蛋白質を吸着させ、該蛋白
   質に抗ヒト酵素標識ヘモグロビンを添加して酵素
   免疫法により糞便中のヘモグロビンを特異的に検
   出することを特徴とする糞便中のヘモグロビンの
   検出方法。 ２ 化学的潜血反応を酵素免疫法と並行的に行つ
   てヘモグロビンを検出することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の糞便中のヘモグロビンの
   検出方法。 ３ 疏水性高分子材料の採取器に糞便を採取し酸
   性の緩衝液中に浸漬して一定時間放置してヘモグ
   ロビンを採取器表面に吸着させることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項もしくは第２項記載の糞
   便中のヘモグロビンの検出方法。 ４ 採取サジを有する採取器と緩衝液を入れる液
   容器を組み合わせた採取容器を用い、一定時間後
   に採取器のみを検出場所に運んで検出作業を行う
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３
   項いずれかに記載の糞便中のヘモグロビンの検出
   方法。 ５ 採取サジの両面に糞便を採取し、片面を化学
   的潜血反応、他面を抗ヒト酵素標識ヘモグロビン
   による免疫学的反応により糞便中のヘモグロビン
   を検出することを特徴とする特許請求の範囲第２
   項記載の糞便中のヘモグロビンの検出方法。 ６ 採取サジの表面に格子状の溝をもうけたこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第５項い
   ずれかに記載の糞便中のヘモグロビンの検出方
   法。