JPH05508006A - ペルオキシダーゼ触媒化酵素分析法における試料の予備処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素分析法における血液又は血液生産物の干渉を排除するための酸化 的試料処理に関するものであ特別の分析物か患者試料中に存在するかどうかを決 定するだめの酵素免疫定量法（ＥＩＡｓ）の使用は、診断医療の発展を助けた。

代表的な酵素免疫定量法においては、分析試薬は酵素を用いて標識化され、この 試薬は試料中の分析物の量に応じた量固体支持体に結合されるようになる。酵素 基剤は、通常分析の最終工程で添加され、酵素と反応して試料中に存在する分析 物の量に比例する検出可能な信号を発生する。

しかしなから、幾つかの患者試料中には酵素活性に対して干渉し得る化合物が存 在する。干渉形態の一つは、干渉化合物が特定の酵素の不存在下で信号発生反応 を触媒化するように作用する場合に起こる。前記化合物の存在は、患者試料中の 分析物の存在に比例しない量の信号発生に起因して不正確な分析解釈を生しさせ 得る。

血液又は血液生産物（例えば、溶解した赤血球からなる含有物）は、通常酵素源 ｉとしてベルオキシダーセを用いる酵素分析法における分析干渉源である。血液 又は血液生産物は酵素基剤のその酸化生成物への変換を助け、正の分析干渉を引 き起こす。

特に、ヘモグロビンのヘム成分は試薬を免疫化するためにＥ　ＩＡｓにおいて使 用される固体支持体に結合することができる。ベルオキシダーゼ触媒化ＥＩＡｓ における信号発生の間存在するヘム部分（又、“ミクロペルオキシダーゼ“と呼 ばれる）は、不特定信号を生じさせ（即ち、発色）、そして正の干渉源である。

本発明の要約 血液又は血液生産物によるペルオキシダーゼ触媒化酵素分析法における正の干渉 は、酸化性化合物例えば次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素及びメター過沃素酸 ナトリウムを患者検体に添加することにより排除することかできるということが 発見された。処理された患者検体は、全く干渉効果を有することなく酵素分析に 使用すること本発明の方法は、慣用の方法例えば綿棒、洗浄、吸引等により、目 、鼻の裏側の外鼻孔、頚、膣、尿道、直腸、咽喉、血液、血清、血漿等から採取 することにより得られた患者検体に対して使用することができる。

本発明の一態様として、酸化剤を患者試料に直接添加してよい。例えば、本分析 法を使用するために試料の一定部分を採取する直前に酸化剤溶液を患者試料に添 加してよい。

他の態様として、酸化剤溶液を例えば綿棒又は同種のものから患者試料を抽出す るために使用する洗浄溶液として試薬に添加してよい。この抽出溶液は、綿棒試 料を含む管に添加され、混合され、次いで予め決定された時間中インキュベート され、続いて綿棒から液体か除かれる。患者試料を含む液体を、次いでＥＩＡ又 は他の酵素分析法例えばペルオキシダーゼ触媒化酵素分析法を使用して評価する 。

更に他の態様として、酸化剤溶液を、洗浄剤又は同種のものを使用して患者綿棒 から抽出された液体に添加する。酸化剤及び患者試料からなるこの溶液を予め決 定された時間中インキュベートし、続いて酵素分析法に使用するために適切な一 定部分を採取する。

本発明の方法はとの様な酵素分析法にも使用し得るか、しかし特に正又は活性、 捕捉依存性（ｃａｐｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）、ペルオキシダーゼ触媒化 、サンドイッチ型ＥＩＡにおいて有用である。サンドインチ型ＥＩＡは、固体支 持体に拘束された抗体　抗原：抗体サンドイッチか生成する好ましい一方法であ る。代表的には、抗原又は抗体は固体支持体例えば濾紙、ポリエチレン、ポリス チレン、ポリプロピレン又は他の適する材料から作られた試験管ニラテックス粒 子、ガラス又はプラスチックビーズ、磁性粒子等に結合している。患者試料を固 体支持体と接触させ、そして分析すべき特定の分析物を固体支持体上に係止され た配位子に結合させる。分析物に対する選択性を有し且つベルオキシダーセを用 いて直接的に又は間接的に標識化した第二抗体を添加し、次いで反応混合物を反 応を起こさせるために充分な時間インキュベートした後、固体支持体を洗浄する 。第二抗体を直接的に標識化した場合には、次いて、固体支持体を洗浄した後、 酵素基剤を固体支持体に添加し、次いて得られた信号を比色又は分光光度技術に より測定する。第二抗体を標識化しない場合には、次いで、第二抗体に直結する 標識化抗グロブリンを添加してよく、次いてこの溶液を、洗浄及び慣用技術によ る標識の定量の前に予め決定された時間中インキュベートする。

上記サンドインチ型分析法は抗体及び抗原を用いるけれども、本発明の方法は通 常、配位子−受容体対要素を含むベルオキシダーゼ触媒化、サンドインチ型分析 法を使用し得る。本文中において使用する如く、“配位子−受容体対”は、−要 素である“受容体”が他の要素（“配位子“）又はその一部の特定の空間的及び 極性組織を認識することができ、且つその化合物に結合することができる化合物 対に関するものである。種々の配位子に対して、配位子−受容体対の他の半分を 形成する具体的受容体は抗体、酵素、レクチン、Ｆａｂフラグメント、補体性核 酸等を包含する。

本発明は広範囲の分析物を検出する際に有用である。

アメリカ合衆国特許明細書第４３７４９２５号及びアメリカ合衆国特許明細書第 ３８１７８３７号には（その教示は、文献として本文中に含まれる）、特定の結 合対の一部である分析物の優れた一覧表が記載されている。結合対の他の例は、 核酸及び補体性核酸を含む。特に重要な分析物はウィルス、バクテリア、カビ及 びプロトシア、特定の生成物及びその集合体及び高分子及び生命有機体の生成物 を包含する。

酵素分析に有用な抗体は、公知方法に基づく適する抗原を用いた免疫化により人 間又は非人間種例えばモルモット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ヒツジ等において生じ させることができる。適する抗原に対するモノクローナル抗体を本発明の方法に 使用することもできる。

分析干渉は、分析結果を他の評価方法即ち培養技術、顕微鏡分析等を使用して得 られた結果と比較することにより、検出することができる。直接抗原ＥＩＡの血 液又は血液生産物による干渉の特定の例を、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍ ｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ　）の検出のための分析と共に以下に記載す る。クラミジアの検出のための試料は、見込み患者から採取された。直接蛍光標 識化技術が、試料中にクラミジアが存在するかどうかを決定するために下記の如 く使用された。選択的にクラミジアに結合し且つ蛍光剤を用いて標識化された抗 体を得た。この種の標識化抗体は市販されている。検体抽出物の所定量を得、次 いでクラミジア有機体及び試料破砕物からなるベレットを形成するために遠心分 離した。ペレットを緩衝液の最小量に再懸濁し、次いで顕微鏡スライド上に滴下 し、メタノールと混合し、次いで標識化抗体試薬を用いて染色した。クラミジア に結合した抗体は、例えあるとしても、スライド上にある。クラミジアが存在す るかどうかを決定するために適する顕微鏡を使用してスライドを検査した。ＥＩ Ａを行う前に酸化剤を用いて処理しなかった試料中において、直接蛍光法を用い て負であると検査された充分な量の検体が、本発明に記載した添加剤の不存在下 において正のＥＩＡ結果を与えた。

機能的に誤った正の結果は、酸化剤例えば過酸化水素を用いた処理により排除さ れることが示された。患者綿棒試料は、試料処理溶液（緩衝剤及び洗剤を含む） １ｍｌを綿棒試料に添加し、次いで適する時間インキュベートすることにより処 理した。次いで試料溶液を渦巻かせ、綿棒を除去し、次いで綿棒から抽出された 液体を等容積に分割する。一定部分の内の一つに、過酸化水素溶液を添加し、他 に適する対照溶液を添加する。次いで試料をペルオキシダーゼ触媒化、サンドイ ッチ型ＥＩＡを使用してクラミジア抗原の存在において分析した。特定のＥＩＡ に付いての４５０ナノメーター（ｎｍ）における吸収単位が、０．１０．Ｄ、プ ラス同時に行った負の対照よりも大きい場合には、得られた結果はクラミジアに 対して正であると考えた。結果を、表１に示す。

過酸化水素を用いた処理による誤った正の応答の排除１　＋　１．４９１　＋　 １，５４１　＋２　−　０．２７５　４−　０．０２８　−３　−　０．１０１ 　−　０．０１４　−４−０．０３２　−　０．０２３　− ５　−　０．２０４　＋　０．０１３　−６　＋　０．２４４　＋　０．２３０ 　＋７　−　０．１３７　＋　０．０２２　−８　−　０．１５１　＋　０．０ ２４　−９　−　０．１４２　＋　０．０３２　−１０　−　０．１３５　＋　 ０．０２７　−負の対照　０．０３２　０．０２９ °各患者検体は血液又は血液生産物を含むものとして記録された。

”ＤＦＡ−直接蛍光分析法 本発明の他の適用において、過酸化水素の適する濃度を、処理患者試料のために 使用された緩衝化洗浄溶液で希釈した。患者綿棒試料を、最初に過酸化水素を含 まない試料処理溶液０．５ｍｌを用いて処理した。綿棒を除去した後、残りの検 体を二つの等容積に分割した。一定部分の内の一つに、過酸化水素を含む試料処 理溶液を添加し、試料の他の等容積に過酸化水素を含まない試料処理溶液を添加 した。結果を表２に示す。

１　＋　０．７７２　＋　０．６２６　＋２　＋　０．２１７　＋　０．２００ 　＋３　−　０．０９６　０．０２６　− ４　０．０９８　０．０１４　− ５　−　０．０９６　０．０６８ ６　０．１１０　０．０２７　− ７　０．１５０　＋　０．０１６　− ８　０．１２８　’　＋　０．０２４　−９　＋　１．０９３　＋　１．０７０ 　＋１０　＋　１．３３４　＋　１．２９７　＋負の対照　０．０２２　０．０ １５ １各患者検体は血液又は血液生産物を含むものとして記録された。

”Ｄ　Ｆ　Ａ−直接蛍光分析法 本発明の方法において有効な酸化剤は、次亜塩素酸ナトリウム、メター過沃素酸 ナトリウム及び過酸化水素並びにペルオキシダーゼ触媒化、酵素分析法におし） て生じる干渉を実質的に排除するために血液又は血液生産物に対して充分に反応 性がある他の酸化剤を包含する。試料に添加される酸化剤の濃度は、特定の最小 値を越える限りは広範に変化し得る。通常、過酸化水素の少なくとも約０．３％ 容積／容積（“Ｖ　／　Ｖ”）溶液を使用することができる。過酸化水素の１． ０％Ｖ／Ｖを越える量は通常必要ない。

下記の具体的で非限定的な実施例により、本発明を更に説明する。

実施例１ ３．０％ｖ／ｖ過酸化水素溶液０．１ｍｌを１２×７５ｍｍ試験管内に取った。

床厚性の綿棒検体を試験管内に取り、次いでｐＨ８，０の０．２Ｍ）リス（ヒド ロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（“トリスＨＣＩ“）、０．１Ｍ塩化ナトリ ウム、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｎ　ａ　ｚ　Ｅ　Ｄ 　Ｔ人）を含む試料処理溶液１．０ｍｌを試験管に添加することにより抽出し、 次いで０．０５％重量／容積３−（（３−コラミド−プロピル）−シアメチルア ンモニオ〕−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を試験管に添加した。綿 棒を管の側壁で絞り、廃棄し、次いで実施例４に記載する如きクラミジア選択性 ＥＩＡにおいて使用するために試験管から試料の適する容積を取り出した。

実施例２ 床厚性の綿棒検体を１２Ｘ７５ｍｍガラス試験管内に取った。０．３％ｖ　／　 ｖ過酸化水素を含む試料処理溶液（実施例１参照）１．０ｍｌ容量を、綿棒から 試料を抽出するために管に添加した。

綿棒を上記溶液中で少なくとも１０分間インキュベートし、渦巻かせ、吸収され た液を追い出すために管の側壁で絞り、そして廃棄した。実施例４に記載する如 きクラミジア選択性ＥＩＡにおいて分析するために、管から試料の適する容積を 取り出した。

実施例３ 床厚性の綿棒検体を１２Ｘ７５ｍｍ試験管内に取り、次いで実施例１の試料処理 溶液１．０ｍｌ中に抽出した。

綿棒を上記溶液中で少なくとも１０分間インキュベートし、次いで管を約３０秒 同局巻かせた。綿棒を絞った後、して廃棄した。３．０％ｖ／ｖ過酸化水素０， １ｍｌを試料に添加し、次いで管を更に１０秒間渦巻かせた。実施例４に記載す る如きクラミジア選択性ＥＩＡにおいて使用するために、管から試料の適する容 積を取り出した。

実施例４ 予備処理した検体２００μｌ並びに正及び負の対照を、各々抗体を塗布した分析 管を分離するために添加した。

管を穏やかに振震し、次いで約１時間室温でインキユベートシた。

クラミジアに対して選択性のポリクローナル抗体〔エッチ、ディー、カルドウエ ル（Ｈ，Ｄ、Ｃａｌｄｗｅｌｌ）　、シー。

クオ（Ｃ，Ｋｕｏ　）及びジー、イー、ケニ（Ｇ、８．Ｋｅｎｎｙ　）　。

１１５ジヤーナル　オブ　イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　［ｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ　）　、第９６９−９７５頁（１９７５年）に記載された手順と同じ公 知手順を使用して製造し、次いで精製した〕０゜１ｍｌを容管に添加し、次いで 容管を穏やかに混合させ、次いで室温で１時間インキュベートした。

商品源から利用可能なりラミシア選択性のポリクローナル抗体に対して直接抗体 に結合したわさび大根ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、次いで容管に添加した。

容管を穏やかに振震し、次いで室温で１時間インキュベートした。各管内の混合 物を次いで取り出し、そして脱イオン水を用いて管を充分に洗浄した。

色原体（０，ＬＭ　ＨＣｌ中のテトラメチルベンジジン３．０ｍｇ／ｍ１）１部 対基剤緩衝液（０，０５Ｍクエン酸ナトリウム、０．０５Ｍホウ酸、０．０１２ ％Ｖ／Ｖ過酸化水素、ｐＨ４，２）２５部からなる新たに調製した基剤溶液０． ５ｍｌを容管に添加し、酵素反応を１５分間進行させ、次いで１．ＯＮ硫酸（Ｈ ２ＳＯ４）１、’Ｏｍｌを用いて停止させる。信号発生（色／生成）は、４５０ ｎｍで分光光度的に試料の吸収を測定することにより測定した。色強度は試料中 に存在するクラミジア抗原の量の関数であり、従って抗原の領域が決定された。

結果は上記表１に示されている。

本発明の好ましい態様を記載したけれども、本発明の精神及び添付された請求の 範囲から離れることな（、種々の変化、応用及び変性が本発明中で行われ得ると いうことを理解すべきである。

国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．血液又は血液生産物により引き起こされる分析の際の干渉を排除するために 検体を酸化剤と反応させることからなる、血液又は血液生産物を含む臨床的検体 における分析物を検出するためのペルオキシダーゼ触媒化酵素分析法における誤 った評価結果の発生を減少させるための方法。
2. ２．酸化剤が次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素又はメター過沃素酸ナトリウム である請求項１記載の方法。
3. ３．検出すべき分析物がクラミジア抗原である請求項１記載の方法。
4. ４．酵素分析法が免疫定量法である請求項１記載の方法。
5. ５．免疫定量法がサンドイッチ分析法である請求項４記載の方法。
6. ６．サンドイッチ分析法が捕捉依存性（ｃａｐｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ） 分析法である請求項５記載の方法。
7. ７．血液又は血液生産物により引き起こされる免疫定量の際の干渉を排除するた めに検体を次亜塩素酸ナトリウムと反応させることからなる、血液又は血液生産 物を含む臨床的検体における分析物の存在を検出するために作られたペルオキシ ダーゼ触媒化サンドイッチ酵素免疫定量法における誤った評価結果の発生を減少 させるための方法。
8. ８．血液又は血液生産物により引き起こされる免疫定量の際の干渉を排除するた めに検体を過酸化水素と反応させることからなる、血液又は血液生産物を含む臨 床的検体における分析物の存在を検出するために作られたペルオキシダーゼ触媒 化サンドイッチ酵素免疫定量法における誤った評価結果の発生を減少させるため の方法。
9. ９．ペルオキシダーゼがわさび大根ペルオキシダーゼである請求項１記載の方法 。