JPH05507410A

JPH05507410A - 形質転換したエセリキヤ・コリにおけるポリ―β―ヒドロキシ酪酸塩の改良生成

Info

Publication number: JPH05507410A
Application number: JP91510838A
Authority: JP
Inventors: デニス、ダグラス・イー
Original assignee: センター・フォー・イノベイティブ・テクノロジー
Priority date: 1990-05-25
Filing date: 1991-05-20
Publication date: 1993-10-28
Also published as: FI925333A0; CA2083697A1; WO1991018993A1; EP0535065A4; AU7996291A; EP0535065A1; FI925333A; US5334520A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２゜該デオキシリボ核酸配列が、該ポリ−β−とドロキシ酪酸塩生合成経路において、３つの遺伝子配列の最初の前の該デオキシリボ核酸配列に位置する最初の４００ヌクレオシド塩基及び該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において該３つの遺伝子配列の第３の後の該デオキシリボ核酸配列に位置する第２の４００ヌクレオシド塩基をほぼ含む請求項１のエセリキア・コリ細菌宿主。

３　以下のＡＴＣＣ寄託番号６８３２９を有する請求項２つのエセリキア・コリ細菌宿主。

４、該宿主のエセリキア・コリ株ＨＭＳ１７４から誘導される請求項１のエセリキア・コリ細菌宿主。

５　該ベクターがプラスミドＩ）ＴＺ１８Ｕである請求項１のエセリキア・コリ細菌宿主。

６、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を合成経路をコードするデオキシリボ核酸配列を含んでいるベクターにより形質転換されたエセリキア・コリ細菌宿主であって、該エセリキア・コリ細菌宿主は、回収しうる量においてポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を生成するため炭素源としてホエイを用いることができる。

７　該デオキシリボ核酸配列が、該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において３つの遺伝子配列の最初の前の該デオキシリボ核酸配列に位置する最初の４００ヌクレオシド塩基及び該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生合成経路において該３つの遺伝子配列の第３の後の該デオキシリボ核酸配列に位置する第２の４００ヌクレオシド塩基をほぼ含む請求項６のエセリキア・コリ細菌宿主。

８８　ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路をコードするデオキシリボ核酸配列を含んでいるベクターにより形質転換されたエセリキア・コリ細菌宿主であって、該エセリキア・コリ細菌宿主は回収しつる量においてポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を生成するため食物源として最小培地を用いる能力を有する。

９、該デオキシリボ核酸配列が、該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において、３つの遺伝子配列の最初の前の該デオキシリボ核酸配列に位置する最初の４００ヌクレオシド塩基及び該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において該３つの遺伝子配列の第３の後の該デオキシリボ核酸配列に位置する第２の４００ヌクレオシド塩基をほぼ含む請求項８のエセリキア・コリ細菌宿主。

１０、最小培地及びホエイを含む形質転換されたエセリキア・コリ宿主にポリ− β−ヒドロキシ酪酸塩を生成するための培地であって、該形質転換されたエセリキア・コリ宿主はポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路を含み、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩の生成のため炭素源として該ホエイを利用する能力を有する。

１１、該最小培地が該培地の約２０％であり、該ホエイが該培地の約４０％であり、そして水が該培地の約４０％である請求項１０の培地。

１２．０．６％パーセントＮａ、ＨＰＯ，，０，３％パーセントＫＨ２ＰＯａ、０．１％パーセント塩化アンモニウム、０．０５％パーセント塩化ナトリウム、５８．８４％パーセント水、０、０１２％パーセント硫酸マグネシウム、０．０００５％パーセントチアミン、０．０１％パーセントカザミノ酸及び４０％バーセントホエイ溶液をほぼ含む、形質転換されたエセリキア・コリ宿主にポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を生成させるための培地。

１３、以下の段階を含むポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造法。

エセリキア・コリ細菌宿主の培養を供給すること、各宿主はラクトース利用系を有し、各宿主は、ポリ−β−ヒドロキソ酪酸塩生合成経路をコードするデオキシリポ核酸配列を含んでいるベクターにより形Ｗ転換されている。

ホエイを含んでいる最小培地に２４時間よりも大の期間、エセリキア・コリ細菌宿主の該培養を生育すること、該エセリキア・コリ細菌宿主の各々は細胞内のポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を生成する。

該培養中に該エセリキア・コリ細菌宿主を溶解し、溶液中に該ポリーβ−ヒドロキシ酪酸塩を放出すること、及び該ボッ−β−ヒドロキシ酪酸塩を集めること。

１４、集めることの該段階が溶解したエセリキア・コリ細菌宿主及びポリ−β− ヒドロキシ酪酸塩を含んでいる該溶液を硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選ばれたイオン試薬にさらす段階を含み、該イオン試薬は該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を固化するのに十分な濃度である請求項１３の方法。

１５、該イオン溶液が１モルと１ミリモルの間にわたる濃度で塩化カルシウムである請求項１４の方法。

】６．塩化カルシウムが約１０ミリモルの濃度を有する請求項１５の方法。

１７、以下の段階を含むポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造法。

エセリキア・フリ細菌宿主の培養を供給すること、各宿主はポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路をコードしているデオキシリポ核酸配列を含んでいるベクターにより形質転換されており、各宿主はポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩の生成のために炭素源としてホエイを用いる能力を有する。

ホエイを含んでいる最小培地に２４時間より大の期間エセリキア・コリ細菌宿主の該培養を生育すること、該エセリキア・コリ細菌宿主の各々は細胞内のポリ− β−ヒドロキシ酪酸塩を生成する。

該培養に該エセリキア・コリ細胞宿主を溶解し、溶液中に該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を放出すること、及び該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を集めること。

１８、以下の段階を含む形質転換されたエセリキア・コリ細菌宿主の培養に、細胞内に生成したポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を回収する方法であって、該宿主はポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路をコードしているデオキシリポ核酸配列を含んでいるベクターにより形質転換されている。

該エセリキア・コリ細菌宿主を溶解して溶液中に該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を放出すること、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選ばれた十分量のイオン試薬を加えること、該十分量の該イオン試薬は該溶液中、該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を固化する、及び該溶液を遠心して該固化したポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩をベレット化すること。

１９、該イオン試薬の塩化カルシウムである請求項１８の方法。

２０、該塩化カルシウムが１モルと１ミリモルの間にわたる濃度で存在する請求項１８の方法。

２１、該塩化カルシウムが約１０ミリモルの濃度で存在する請求項２０の方法。

２２、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において、３つの遺伝子配列の最の前のＤＮＡ配列に位置する最初の４００のヌクレオシド塩基及びポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において、３つの遺伝子配列の第３の後のＤＮＡ配列に位置する第２の４００のヌクレオシド塩基をほぼ含んでいる精製され、分離されたＤＮＡ配列。

２３１）４Ａとして設計され、寄託番号６８３２９の下にエセリキア・コリ株ＨＭＳ１７４がジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたプラスミド。

２４、ベクターがｐ４Ａプラスミドを含む請求項１３の方法。

２５、ベクターがｐ４Ａプラスミドを含む請求項１７の方法。

２６、ベクターがｐ４Ａプラスミドを含む請求項１８の方法。

明　細　書形質転換したエセリキャ・コリにおけるポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩の改良生成技術分野本発明は、一般にポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩（ＰＨＢ）生合成経路をコードしている遺伝子を有しているベクターにより遺伝的に形質転換されたエセリキャ・コリ（イー、コリ）を用いるＰＨＢの生成に、より詳しくは形質転換されたイー。

コリでのＰＨＢの能率的生成に関する。

背景技術ＰＨＢは環境ストレスに対する種々の細菌により生成されるエネルギー貯蔵材料であり、ポリプロピレンに似た性質を有するＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸塩のホモポリマーである。ＰＨＢは生物分解できるので、ヒトのごみの環境影響を減するために他のプラスチック材料とは対照的にパッケージする目的にＰＨＰを用いることにかなりの興味がある。ＰＨＢは又、抗生物質、ドラッグ・デリバリ −１医学縫合及び骨置換適用に有用性を有する。ＰＨＢはアルカリゲネス・エウトロフス（エイ、エウトロフス）から商業的に生成され、商品名バイオボールの下に販売される。

スラター等による文献「クローニング・アンド・エスクプレッション・イン・エセリシア・コリ・オブ・ジ・アルカリゲネス・エウトロフスＨ−１６ポリーＢ− ヒドロキシブチラード・バイオシンセティック・パスウェイ」、ジャーナル・オブ・バクテリエロシイ、１７０巻１０号、１９８８年１０月、４４３１−４４３６頁に記載されるように、イー４　コリは、ＰＨＢ生合成経路をコードするエイ。

エウトロフスから遺伝子で遺伝的に形質転換できることが示された。イー、コリは、細菌、イー、コリを取扱うについてより知られているので、即ち、イー、コリはより容易に調節され、扱われるので、エイ　エウトロフスよりもＰＨＢを生成するのによりはるかに良好なベクターである。形質転換したイー、コリは比較的大量にＰＨＢを発現し得た。

他の材料以上のＰＨＢの利点にもかかわらず、生成が高価であるので市場での実施を妨げて来た。最近ＰＨＢは、ルリアブロス（Ｌ　Ｂ）にイー、コリを生育し、炭素源としてグルコースを用いることにより形質転換したイー、コリに生成させる。ＰＨＨの生成コストの約１／３はＬＢに富んだ培地及びグルコースのコストに帰すことができる。高価でない炭素源を利用できればＰＨＢ生成の全体のコストは有意に減することができる。加えて、ＰＨＢ生成の全体のコストの多くは、イー、コリ中に生成されたＰＨＢを精製するのに帰すことができる。最近、ＰＨＢは遠心、次いで細胞の機械的溶解によりＰＨＢを放出し、高温処理でＰＨＢを固りとし、最後にスプレードライ段階で精製された粒子を得ることにより精製する。もしイー、コリからＰＨＢを集める高価でない方法が入手できれば、ＰＨＢ生成の全体のコストは有意に減することができる。

発明の開示従って、形質転換されたイー、コリにＰＨＢを生成する改良された技術を提供することが本発明の目的である。これまでのイー、コリより高いレベルでＰＨＢを蓄積でき、生育条件のためにホエイを含んでいる最小培地を用いることができる形質転換されたイー、コリ株を提供することが本発明の他の目的である。

イオン溶液を用い溶解したイー、コリ細胞からＰＨＢ粒子を固まらせる方法を提供することが本発明のさらに他の目的である。

本発明により、イー、コリの株、即ちイー、コリＨＭＳ　１７４がＰＨＢ生合成経路及び経路の上流及び下流側の約４００の余分の塩基を有するプラスミドを含んでいるベクターにより形質転換された。イー、コリのＨＭＳ１７４株は、それがラクトース利用系を含み、組換え欠損で、そのためラクトース遺伝部分を含んでいるプラスミドが組換えられず構造物を不安定にしないので選ばれた。ホエイはチーズ製造からの廃棄生成物で非常に安い。形質転換したイー　コリの株がホエイを含んでいる最小培地で生育し約８５％のＰＨＢの平均収率（ＰＨＢ乾燥重量／全細胞乾燥重量）を有することを示す実験がなされた。加えて、形質転換されたイー、コリに生成したＰＨＢは種々のイオン溶液で固りうることを示す実験がなされた。精製されたＰＨＢを大量に回収するため、形質転換されたイー、コリ細胞はまず機械的または物理的手段、例えば音波処理により又は遺伝的手段により溶解する。次いで細胞は、イオン溶液、例えば１００ミリモル（＋＋＋Ｍ）塩化カルシウム（ＣａＣ１□）中でインキュベートし、ＰＨＢ粒子を固める。最後に固まりは低速度で培養物から遠心する。実験は、培養物中のほとんど全て（１００％）のＰＨＢがこの方法により固り、回収されることを示す。結果は、同じ型の固化がエイ、エウトロフスからＰＨＢを回収するには不可能であるので特に刺激的である。

図面の簡単な説明前述の及び他の目的、局面及び利点は、図面を引用して本発明の好ましい実施実態の以下の詳細な記載からよりよく理解されよう。図において、図１は、ＰＨＢ蓄積対異なるプラスミド構造物を含んでいる種々のイー、コリクローンへの時間を示す線グラフである。

図２８及び２ｂは最小培地及びホエイを用い形質転換されたイー、コリにより生成したＰＨＢの蓄積を示す棒グラフである。

図３は、ＣａＣｌ２を用いるＰＨＢ固化のパーセントを示す棒グラフである。

図４は、ＰＨＢ固化対ＰＨＢが放射標識グルコースの存在で蓄積し、次いて固化手段に付される時間を示す線グラフである。そして、図５は、ＰＨＢ固化へのガラス牛乳及びカルシウムの対照的効果を示す棒グラフである。

発明実施のベストモード図面、より詳しくは図１を引用して、プラスミドｐ４ａを含んでいるイー、コリ株ＨＭＳ　１７４は、異なるプラスミド構造物を含んでいる他のイー、コリクローンよりも短い期間により大きなパーセントのＰＨＢを蓄積することを示す。イーコリ株ＨＭＳ　１７４はエイル・イー　コリ・ストック・センター、バーバラ・バックマン、支配人から入手できる。ｐ４ａプラスミドはＰＨＢ生合成経路及びベクターｐＴＺ−１８Ｌ’上ＰＨＢ生合成経路の上と及び下流側に約４００の余分の塩基を有する。ベクターｐＴＺ−１８Ｕはユナイテッド・ステイク・バイオケミカルズから入手できる。ＭＳＡは、ベクターｐＴＺ−１８Ｕ上にＰＨＢ生合成経路及び他の適合プラスミド上にファージｐｈｉＸ１７４からのＥ−溶解遺伝子を有する。

ＭＳＡは、それがＰＨＢ生合成経路の上流に約４００の余分の塩基を有することでｐ４ａと異なる（即ちＰＨＢ生合成経路はｐＴＺ−１８ＵにクローンされてｒＭＳＡ」と呼ばれるｐＴＺ−１８Ｕ−ＰＨＢを作り、Ｐ４Ａは、プロメガ・コーポレーションから入手できるベクターｐＧＥＭ−７Ｆ＋上のＰＨＢ生合成経路の上流側上のｐＴＺ−１８Ｕ−ＰＨＢ４００より少ない塩基である。

ｐ４Ａ、ｐＴＺ−１８Ｕ−ＰＨＢ（ＭＳＡ）及びｐＧＥＭ７ｆ−ＰＨＢ（ＧＥＭ）クローンは、全て、慣用の分子クローン化技術を用い上で引用し、組入れられた同時係属特許出願及び雑誌論文で検討されたＰＨＢ生合成経路を含むイー、コリクローンから構成された。特許出願及び雑誌論文で開示したように、ＰＨＢ生合成経路はエイ、エウトロフスから分離し、イー、コリで発現できる。生合成経路は約５キロ塩基の長さでβ−ケトチオラーゼ、ＮＡＤＰ−結合アセトアセチルーコエンザイムＡ（ＣｏＡ）レダクターゼ及びＰＨＢンンテターゼをコードする塩基を含んでいる。図１はＭＳＡ及びＯＥＭクローンがＰ４Ａクローンはど多くＰＨＢを生成しないことを示す。

イー、コリＨＭＳ１７４はそれがラクトース利用系を含み、そしてそれが組換え欠損であるので宿主として選んだ。組換え欠損は、ラクトース遺伝部分を含んでいるプラスミドが組換えせず、構造物を不安定にしないことを保証する。以下に述べるように、ＨＭＳ１７４でのラクトース利用系の存在により、ホエイ、その主成分がラクト−スであるチーズ製造廃棄生成物はＰＨＢ生成の炭素源として用いられる。形質転換されたイー、コリ株を作るについて、ＰＨＢ生合成経路プラス　ユナイテッド・ステイク・バイオケミカル・ベクターｐＴＺ−１８ＵにクローンされたＰＨＢ生合成経路の４００塩基上流及び下流であるプラスミドｐ４ａはイー　コリＨＭＳ１７４に電気塗布される。ｐ４Ａプラスミドを含んでいるイー、コリの株は、１９９０年５月２３日に１２３０１パークローン・ドライブ・ロツクヴイル・Ｍｄのジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号６８６２９を有する。

ｐ４ａプラスミドで形質転換したイー　コリのＨＭＳ１７４株がホエイを含んでいる最小培地に生育できることを示す実験が行なわれた。用いられた最小培地はほとんどの微生物学的生物学テキストに記載されるＭ９最小培地であった。表１はＭ９最小培地の５Ｘ濃縮物の処方を表示し、表示した成分の各々は１リツトルフラスコに加え、水は１リツトルまで加える。

表１５ＸＭの最小培地処方３０ｇ　Ｎａ２ＨＰ　０４１５８　ＫＨ２ＰＯ４５ｇ　Ｎ　Ｈ２Ｃ１２，５ｇ　ＮａＣ１ホエイは、シグマ・ケミカルズからウシホエイの粉末として得、１００ｍ１の最終容量を有する水に２０ｇのホエイを撹拌することにより作った。撹拌は約３０分間ゆるやかに加熱して行なった。次いでこの溶液をオートクレーブにかけ、遠心の間沈澱した粒子を１０分間１０．０００　Ｘｇで遠心することによりベレットとした。残っている上清をホエイ炭素源として用いた。

実験では、プラスミドｐ４ａを含んでいるＨＭＳ　１７４イー、コリ株を平板培養から５ＱｍｉのＭ９最小培地＋ホエイ溶液に接種した。表２は、８％の最終濃度でホエイを含んでいる５０ｍ１の最小培地から処方を表示する。

表２ＰＨＢ生成用最小培地＋ホエイ１０ｍ１５ＸＭ９培地２０ｍ１　ｄｄＨ２０（２回蒸留水）５０ｕｌ　ＩＭＭｇＳ○４５ｕｌ　０．　５％チアミン２５０ｕ１２０％カザミノ酸２０＋ａ１２０％ホエイ溶液接種した培養は２５０ｍ比やま板付（ｂａｆｆｌｅｄ）フラスコ中３０　Ｏｒｐｍでオービタルインキュベーターシェーカーで３７℃で４８時間生育した。４８時間のインキュベーション時間後、培養を止めて細胞を集めた。ガスクロマトグラフィーを用Ｌ）てＰＨＢ含量を分析した。

図２ａ及び２ｂはそれぞれ、細胞の全重量で割った細胞当りのＰＨＢ重量として表わした細胞中に蓄積したＰＨＨのパーセント及び最小培地を有する溶液中の異なる濃度のホエイに対し、ｗｇ／ｍｌでなした全ＰＨＢとして表わした細胞中のＰＨＢの収量を示す。図２ａ及び２ｂは、非常に低濃度のホエイ、即ち溶液中２％でさえ、高濃度のＰＨＢ蓄積（即ち９０％より大）及び高収量のＰＨＢ（即ち約１０ｎ１／ｍ１）であることを示す。図２８及び２ｂが高い濃度のホエイを有する培地がより大きな濃度及び収量のＰＨＢを生成する傾向があったことを示す一方、ホエイ濃度が８％を越えた後、ＰＨＢ生成が下り始めることが認められた。

上の実験で、ＰＨＢ生成は４８時間のインキュベーション後分析されたが、有意なＰＨＢ生成が２４時間のインキュベーション後、観察されたことに注意すべきである。加えて、５Ｘ最小培地処方でのＮａｚＨＰＯ４、ＮＨ，Ｃ１及びＮａＣ１の比較濃度及び５Ｘ最小培地、２回蒸留水、Ｍｇ　Ｓ　Ｏ４、チアミン、カザミノ酸及びホエイ溶液の比較濃度は変えることができ、一方ラクトース利用系を有する形質転換されたイー、コリ宿主で依然としてＰＨＢの生成がなされることが予期される。

ホエイが最小培地に存在するＰＨＢの生成に炭素源としてホエイを用いることは、ＰＨＢ生成にグルコースを伴う高い培地を用いる先行技術の慣行を越えてかなりの費用節減となることが期待される。ＰＨＢ生合成経路をコードしてＬｚるプラスミドを有し、同時係属特許出願及び雑誌論文で検討された先行技術の形質転換されたイー、コリ細胞は、それらの細菌がここに存在するラクトース利用系を有しないので、炭素源としてホエイを用いて生育できなかった。ＰＨＢは、その細菌もラクトース利用系に欠けるので、その炭素源としてホエイを用い自生の宿主、アルカリゲネス・エウトロフスに生成され得ない。加えて図１に示されるように、特殊なプラスミドｐ４ａで特殊なイー、コリ宿主を形質転換することは、イー、コリがＰＨＢ生合成経路をもコードする異なるベクターで形質転換された場合よりも高いパーセントでＰＨＢを生成させる。

ＰＨＢはその自生の宿主（エイ　エウトロフス）よりむしろイー、コリに生成されているので、出願人は形質転換されたイー、コリにより生成したＰＨＢポリマーはエイ、エウトロフスに生成したＰＨＢとは異なる物理的性質を有すると信じた。特に出願人は、形質転換されたイー、コリにより生成されたＰＨＢが種々のイオン溶液によって固化できるかを測定するため実験を行なった。実験によって、ＰＨＢは、上で取込まれた同時係属特許出願及び雑誌論文で検討したように形質転換されたイー、コリに生成した。簡単に云うと、ＰＨＢ−生成株を１％グルコースを含んでいるルリアブロス（ＬＢ）中２４時間３７℃で振盪フラスコ培養で生育する。細胞を遠心（２，０００ｘｇＳ分）によりベレットとし、次いで元の培養と等しい容量の水に再び懸濁する。細胞を次いで音波処理により溶解し、種々のイオン試薬を溶液に加えた。表３は種々のイオン溶液による形質転換されたイニコリに生成したＰＨＢへの集合効果を示す。

表３種々のイオン溶液によるＰＨＢの集合溶液＊　集合程度＊＊Ｍ、ｇＳＯ４＋＋＋（ＮＨ４）２ＨＰ○４十Ｍｇ０ＡＣ＋＋＋＋Ｎａ０Ａｃ　＋＋（ＮＨ４）ＯＡＣ− ＊全ての溶液はＩＭの最終濃度であった。＊＊固りは各集合体のミクログラフを用いて主観的に格付けした。ｒ＋＋＋＋Ｊは最善の固りを示し、「＋」は最低量の固りを示す。「−」は固りのないことを示す。

化することを示す。最善の固化剤は固りの速度及び大きさに関する主観的判定に基づきＣａＣ１□であった。ＣａＣ１，の固化効果は、その自生エイ、エウトロフスに生成したＰＨＢを固化しない（即ち、ＰＨＢ粒子は溶解したアルカリゲネスＨ１６エウトロフスから得られた、塩化カルシウムで処理して固化が観察されない実験がなされた）。

実験はＰＨＢを固化するのに用いるＣａＣ１，の理想的濃度を決定するためになした。実験において、形質転換されたイー、コリ細胞を調製し、上述したように溶解した。次いで溶液は、１Ｍ貯蔵ＣａＣ１４溶液を用い異なるｍＭＣａＣ１４濃度とした。低濃度のＣａＣ１４、例えば１ｍＭでは、ＰＨＢ粒子を固化するのに非常に長時間を要し、少しの固化体しか生成しなかった。高濃度のＣａＣｌ２、例えば１００ｍＭ及びそれ以上では、固化はほとんど瞬間的に起こり、大きな「雪のフレーク」様粒子となり、管の底に積もった。しかしながら高濃度のＣａＣｌ２で得られた固りは大量の細胞残骸を有するように見えた。従って高濃度のＣａＣｌ２は固化に望ましくない。中濃度のＣａ　Ｃ１ｔ　ｓ例えば５ｍＭないし３０ｍＭを用いた場合、ベレットを作った培地の固化が５ないし１５分の短いインキュベーションで起きた。固化物形成の速度及び大きさの点で最良の固化結果を生ずるために１０ｍＭＣａＣ１□の使用が決定された。

ＣａＣ１□のより固まるＰＨＢのパーセント対溶液に残るＰＨＢのパーセントを決定するために実験がなされた。実験において、イー、コリのＰＨＢ−生成株は１％放射標識グルコースを含んでいるルリアブロス中、２４時間３７℃で振盪フラスコ培養で生育した。細胞は遠心（２，０００Ｘｇ５分間）によりベレットとし、次いで元の培養に等しい容量の水に再び懸濁した。次いで細胞を音波処理により溶解し、次いで溶液を１Ｍ塩化カルシウム貯蔵の添加により１０ｍＭとした。管を１０分室温でインキュベートし、次いで４００　ｘｇ２分間遠心した。固化したＰＨＢ粒子がペレット化し、一方多くの細胞残骸が上清液に残った。次いで上清を吸引した。ベレット及び上清におけるＰＨＢの分配を測定するためベレットと上清を毛細管ガスクロマトグラフィー又は液体シンチレイシクン計数を用いて測定した。

図３は培養におけるほとんど全て（１００％）のＰＨＢが上記方法により固化し回収されたことを示す。この実験でＰＨＢの量はガス毛細管クロマトグラフィーでのみ測定した。この実験はフラスコの容量が固化の程度に影響するかどうかを測定するため幾つかの細胞容量で行ない、全ての容量において、全てのＰＨＢが固化し、遠心により実質的にペレット化することが判った。

図４は培養は固化に十分な時間起こさせることが極度に重要であり、さもないと収率が減することを示す。溶液をｌＱｍＭＣａＣｌｚに調節した後、たっぷり１０分インキュベーション時間をとり、ベレット及び上清フラクションを調節後２分間隔で計数した。図４は、ＣａＣｌ２添加後初めの数分間は上清に存在するＰＨＢの量はベレットにおけるものより確かに大であることを示す。しかしながら８分後（ペレット中に測定されたＰＨＢの量は、平らになり始める）ベレットにおけるＰＨＢの量は、上溝ワラクシ３ンにおｔｆるものよりずっと多い。この時点で、この実験は、そのほとんどが１４Ｃ−グルコースとしてＰＨＢに取込まれ（約６０％に取込まれる）るが、その幾らかは溶解性物質として存在する放射活性１４炭素を測定することに注意すべきである。従って、はとんど全てのＰＨＢが沈澱しても溶解性放射活性グルコースのために依然として上清に多くの数の計数が存在する。

図５は、Ｐ）（Ｂの固化を核形成剤、例えばバイ第１０１から入手できるガラスミルクの添加により強めることができることを示す。図５において、ベレット及び上清の分当りの計数（ＣＰＭ）を表わし、ｒ　十ｇｍ、　＋　ＣａＪはガラスミルク及び１０ｍＭｃａｃ１２の存在でのＰＨＢ固化を示し、ｒ−ｇｎ＋Ｊはガラスミルは存在せず１０ｍＭＣａＣ１□の存在でのＰＨＢ固化を示し、ｒ−ｇｍ、　−Ｃａｌはガラスミルク及びＣａＣ１□の不存在でのＰＨＢ固化を示し、そしてｒ−Ｃａｌはガラスミルクの存在下、ＣａＣｌ２の不存在下でのＰＨＢ固化を示す。図５から、核形成剤の添加による固化の強化は、それほど大きくなり、従って、大量の生成計画ではこのような剤の使用によつて大きな利益が与えられることはないことが判る。

本発明は、大量のＰＨＢを蓄積できる形質転換されたイー、コリ株を処理し一方、ＰＨＢ生成のため安価な炭素源、例えばホエイを使用し、イオン溶液、例えばＣａＣ１□がＰＨＢを固化するのに使用できるその好ましい実施態様に関して記載されたが、この分野の当業者は本発明が添付された請求の範囲の精神及び範囲内で修飾して実施できることを理解するであろう。

％ＰＨＢ異なる濃度のホエイで生育した細胞ＰＨＢ％％　ホエイ異なる濃度のホエイで生育したときのＰ　ＨＢ収量％ホエイ搭区ＰＨＢの％ＣＰＭ図団要約書スミド構造物よりも短時間に大量のＰＨＢ蓄積を生成することを示した。ＣａＣｌ２は形質転換されたイー、コリ宿主（こ生成したＰＨＢを固イヒするだめの効果的な固化剤であることを示した。

国際調査報告ＰＣＴ／ＵＳ９１１０３５４７Ｖ、Ｃ１ａｔ＋ａ　２３　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｆｏｕｒｔｈ　ｐｒｏｄｕｃｔ　（ｐｌａｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ）。

Claims

【特許請求の範囲】このように私の発明を述べたように、私が新規なものとして請求し、特許証により確保することを望むものは以下の通りである。１．ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路をコードするデオキシリボ核酸を含んでいるベクターにより形質転換されたラクトース利用系を有するエセリキヤ・コリ細菌宿主。２．該デオキシリボ核酸配列が、該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において、３つの遺伝子配列の最初の前の該デオキシリボ核酸配列に位置する最初の４００ヌクレオシド塩基及び該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において該３つの遺伝子配列の第３の後の該デオキシリボ核酸配列に位置する第２の４００ヌクレオシド塩基をほぼ含む請求項１のエセリキア・コリ細菌宿主。３．以下のＡＴＣＣ寄託番号６８３２９を有する請求項２つのエセリキア・コリ細菌宿主。４．該宿主のエセリキァ・コリ株ＨＭＳ１７４から誘導される請求項１のエセリキア・コリ細菌宿主。５．該ベクターがプラスミドｐＴＺ１８Ｕである請求項１のエセリキァ・コリ細菌宿主。６．ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を合成経路をコードするデオキシリボ核酸配列を含んでいるベクターにより形質転換されたエセリキア・コリ細菌宿主であって、該エセリキア・コリ細菌宿主は、回収しうる量においてポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を生成するため炭素源としてホエイを用いることができる。７．該デオキシリボ核酸配列が、該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において３つの遺伝子配列の最初の前の該デオキシリボ核酸配列に位置する最初の４００ヌクレオシド塩基及び該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生合成経路において該３つの遺伝子配列の第３の後の該デオキシリボ核酸配列に位置する第２の４００ヌクレオシド塩基をほぼ含む請求項６のエセリキア・コリ細菌宿主。８．ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路をコードするデオキシリボ核酸配列を含んでいるベクターにより形質転換されたエセリキア・コリ細菌宿主であって、該エセリキア・コリ細菌宿主は回収しうる量においてポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を生成するため食物源として最小培地を用いる能力を有する。９．該デオキシリボ核酸配列が、該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において、３つの遺伝子配列の最初の前の該デオキシリボ核酸配列に位置する最初の４００ヌクレオシド塩基及び該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において該３つの遺伝子配列の第３の後の該デオキシリボ核酸配列に位置する第２の４００ヌクレオシド塩基をほぼ含む請求項８のエセリキア・コリ細菌宿主。１０．最小培地及びホエイを含む形質転換されたエセリキア・コリ借主にポリ− β−ヒドロキシ酪酸塩を生成するための培地であって、該形質転換されたエセリキア・コリ宿主はポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路を含み、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩の生成のため炭素源として該ホエイを利用する能力を有する。１１．該最小培地が該培地の約２０％であり、該ホエイが該培地の約４０％であり、そして水が該培地の約４０％である請求項１０の培地。１２．０．６％パーセントＮａ２ＨＰＯ４、０．３％パーセントＫＨ２ＰＯ４、０．１％パーセント塩化アンモニウム、０．０５％パーセント塩化ナトリウム、５８．８４％パーセント水、０．０１２％パーセント硫酸マグネシウム、０．０００５％パーセントチアミン、０．０１％パーセントカザミノ酸及び４０％パーセントホエイ溶液をほぼ含む、形質転換されたエセリキア・コリ宿主にポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を生成させるための培地。１３．以下の段階を含むポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造法。エセリキア・コリ細菌宿主の培養を供給すること、各宿主はラクトース利用系を有し、各借主は、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路をコードするデオキシリボ核酸配列を含んでいるベクターにより形質転換されている。ホエイを含んでいる最小培地に２４時間よりも大の期間、エセリキア・コリ細菌宿主の該培養を生育すること、該エセリキア・コリ細菌宿主の各々は細胞内のポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を生成する。該培養中に該エセリキア・コリ細菌宿主を溶解し、溶液中に該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を放出すること、及び該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を集めること。１４．集めることの該段階が溶解したエセリキア・コリ細菌宿主及びポリ−β− ヒドロキシ酪酸塩を含んでいる該溶液を硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選ばれたイオン試薬にさらす段階を含み、該イオン試薬は該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を固化するのに十分な濃度である請求項１３の方法。１５．該イオン溶液が１モルと１ミリモルの間にわたる濃度で塩化カルシウムである訴求項１４の方法。１６．塩化カルシウムが約１０ミリモルの濃度を有する請求項１５の方法。１７．以下の段階を含むポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造法。エセリキア・コリ細菌宿主の培養を供給すること、各宿主はポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路をコードしているデオキシリボ核酸配列を含んでいるベクターにより形質転換されており、各宿主はポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩の生成のために炭素源としてホエイを用いる能力を有する。ホエイを含んでいる最小培地に２４時間より大の期間エセリキア・コリ細菌宿主の該培養を生育すること、該エセリキア・コリ細菌宿主の各々は細胞内のポリ− β−ヒドロキシ酪酸塩を生成する。該培養に該エセリキア・コリ細胞宿主を溶解し、溶液中に該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を放出すること、及び該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を集めること。１８．以下の段階を含む形質転換されたエセリキア・コリ細菌宿主の培養に、細胞内に生成したポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を回収する方法であって、該宿主はポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路をコードしているデオキシリボ核酸配列を含んでいるベクターにより形質転換されている。該エセリキア・コリ細菌宿主を溶解して溶液中に該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を放出すること、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選ばれた十分量のイオン試薬を加えること、該十分量の該イオン試薬は該溶液中、該ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩を固化する、及び該溶液を遠心して該固化したポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩をペレット化すること。１９．該イオン試薬の塩化カルシウムである請求項１８の方法。２０．該塩化カルシウムが１モルと１ミリモルの間にわたる濃度で存在する請求項１８の方法。２１．該塩化カルシウムが約１０ミリモルの濃度で存在する請求項２０の方法。２２．ポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において、３つの遺伝子配列の最の前のＤＮＡ配列に位置する最初の４００のヌクレオシド塩基及びポリ−β−ヒドロキシ酪酸塩生合成経路において、３つの遺伝子配列の第３の後のＤＮＡ配列に位置する第２の４００のヌクレオシド塩基をほぼ含んでいる精製され、分離されたＤＮＡ配列。２３．ｐ４Ａとして設計され、寄託番号６８３２９の下にエセリキァ・コリ株ＨＭＳ１７４がジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたプラスミド。２４．ベクターがｐ４Ａプラスミドを含む請求項１３の方法。２５．ベクターがｐ４Ａプラスミドを含む請求項１７の方法。２６．ベクターがｐ４Ａプラスミドを含む請求項１８の方法。