JPH05500854A - 凍結乾燥反応試剤混合物を含む改良免疫アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 凍結乾燥反応試剤混合物を含む改良免疫アッセイ本願は、１９８５年６月２４日 出願の出願番号第７４７．６０５号の継続出願である１９８８年１１月２Ｉ日出 願の出願番号第２７５，６５６号の一部継続出願である。前記先行出願の開示全 体を、参考としてここに特定的に取入れる。

発明の分野 本発明は、免疫アッセイならびに抗体類および抗原類等の結合可能物質検出のた めの免疫アッセイ技術に関し、特にこれに使用する改良凍結乾燥反応試剤混合物 に関するものである。更に特定的には、本発明は、前記′６５６出願に開示され たＥＬＩＳＡ方法および材料、ならびに同時に誼渡され、同時に係属中の米国出 願、１９８７年ＩＯ月７日付出願番号第１０５，２８５号および１９８８年４月 ４日付出願番号第１７７．１１４号に開示された金属ゾル捕捉免疫アッセイ法の いずれかとの関連において使用される改良された材料および方法論に関する。

°２８５および’＋１４出願の開示の全体も、参考としてここに特定的に取入れ る。更に、゛２８５出願の開示は、免疫化学および反応に基く診断方法の分野に おける先行開発に関する優れた記述を提供する。

先行活動および開発の記述 前記゛２８５出願および’１１４出願に開示されたある種の特定の方法に従えば 、抗体−金ゾル粒子接合物および抗体−固相粒子接合物が、ヒト尿を含む水溶液 系に共に分散される。本願がその一部継続出願である前記゛６５６出願に開示さ れたある種の特定の方法に従えば、抗体−酵素接合物か、ヒト尿を含む水溶液系 に分散される。このような材料を、該反応試剤が調製される場所および時間から 離れた場所および時間において試験のために使用される場合には、該反応試剤の 保存、およびその試剤の、特にヒト尿からなる水溶液系への容易な分散を特徴と する特徴を物理的に維持するために、適切な方法がとられなければならない。

凍結乾燥、あるいはフリーズドライとしてより一般的に知られている方法は、免 疫アッセイの遂行に使用されるような方法で用いるための成分および構成要素を 保存するために使用されるであろう。しかしながら、凍結乾燥法か、多成分混合 物の各成分の均一な分布をもたらし、また凍結乾燥混合物が均一で、かつ保存期 間中、即使用可能な形態で維持されることが重要である。特には、凍結乾燥され た固体状態の材料が、試験材料との接触において直ちに溶液および／または分散 物を生成し、種々の構成要素および成分が、本質的に溶液、または単一分散条件 のいずれかになることが重要である。

前記°６５６出願に記載されているように、免疫アッセイ方法を、免疫複合体の 形成を増強すべく結合増強剤の存在下で、および／または非特異的相互作用を抑 制して操作する界面活性剤（または洗浄剤）の存在下で行なうことか育利な場合 がある。一般的に言うと、結合増強剤および界面活性剤は、室温で液体である有 機材料を含み、このような材料は、最適には反応系全体にわたって均一に分散さ れなければならない。

先に示したように、凍結乾燥材料は、免疫アッセイ材料との関連においては特に 長期間の保存時に成分を保存保護するために使用される。また、材料の単一の凍 結乾燥混合物が提供されることが望ましく、これは免疫アッセイ時に反応系内に 存在することが望まれる全ての成分を供給するために、水溶液中に容易に分散可 能である。

しかしながら、結合増強剤として、または非特異的相互作用を抑制する界面活性 剤として作用することによりアッセイの遂行を増強する液体有機材料は、それら の室温で凝集する傾向のために材料の凍結乾燥混合物に組入れることは容易では なく、また凍結乾燥混合物の均一性を破壊するものであることか明らかにされて いる。このような、通常液体の有機成分は、室温において凝集して液体の小滴を 形成する傾向を有し、このことは、凍結乾燥混合物の保存寿命に干渉するのみな らず、免疫アッセイ法を実行すべき時に水溶液系中に凍結乾燥成分を再分配する ことを阻害する。従って、過去においては、水性媒体への再構成にあたって反応 環境内に存在すべきすべての材料を供給する、材料の単一凍結乾燥混合物を含む キットを提供することは困難であった。

発明の要約 本発明は、容易に水性媒体中に再構成でき、免疫アッセイ法の遂行のために必要 なすへての成分を含む反応系を与える材料の凍結乾燥混合物を提供するという課 題に向けられている。本発明によれば、凍結乾燥混合物は、結合増強剤および非 特異的相互作用抑制洗浄剤等の液体有機成分の、凝集して該凍結乾燥混合物の均 一性を損なう傾向を、基本的に遅延させ、あるいは阻害する成分を含んでいる。

かくして本発明は、免疫アッセイ法において使用するため凍結乾燥混合物を提供 する。該混合物は、凍結乾燥混合物全体に均一に分配された少なくとも１種の分 散しうる免疫反応成分を含む。該混合物は、更に、やはり混合物全体に均一に分 配された少なくとも１種の通常液体の有機成分を含み、このような有機成分は、 その存在によって免疫アッセイの遂行を増強する性質を有している。加うるに、 本発明の凍結乾燥混合物は、デキストリンまたはトレハロースを含む糖を含有し 、このような糖は、該有機成分の凝集を阻害するために充分な量をもって混合物 中に存在し、かくして該混合物の均一性を維持し、もって該混合物の保存および 保管寿命を増進し、かつ免疫アッセイ法の遂行のために該混合物の水性媒体への 分散を増進する。

本発明によると、免疫反応性成分は、抗体−金ゾル粒子接合体、固定−周体担体 粒子接合体または抗体−酵素接合体等の抗体接合体を含んでよい。

本発明の一態様において、該有機成分は、非イオン性水溶性ポリマー等の結合増 強剤を含んでよい。結合増強剤として使用する好適な材料は、ポリエチレングリ コール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピコリドンおよびデキストランを含 み、ポリエチレングリコールが特に好ましい結合増強剤である。

本発明の他の面において、該有機成分は、水溶性非イオン性界面活性剤を含んで よい。数多くのこのような試剤が、当業者に知られている。本発明によれば、特 に好ましい材料は、ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル 化合物を含む。

該凍結乾燥混合物は、しばしば２種の通常液体の有機−２゜ 成分を含み、そ一方は、結合増強剤を含み、他方は界面活性剤を含む。２種の有 機成分が関連する場合の本発明の好ましい形態においては、結合増強剤はポリエ チレン上述したように、本発明は、水溶液中に容易に再構成可能であって免疫ア ッセイ法の遂行に必要な成分を供給する凍結乾燥混合物を提供する。本発明の使 用により特に促進される免疫アッセイは、サンドイッチ形態の免疫生成物の形成 を起こすものである。従って、本発明は前記゛２８５および’１１４出願に記述 されているゾル捕捉法との関連において大きな有用性を有する。ゾル捕捉アッセ イは、固体担体粒子上を被覆する第１の抗体および金属ゾル標識粒子上を被覆す る第２の抗体を含む。このような抗体−粒子接合体は、次いで、分析対象を含む 試験溶液（通常、ヒト尿）と共に培養された成分の免疫反応、および金属ゾル標 識粒子を含む収集可能な免疫生成物の生成物産生を許容する。このアッセイにお いて、標識免疫生成物が収集され、目視的に観察されて金属ゾル標識粒子の取込 の結果である色が裸眼により検出可能である。

金属ゾル法の一つの重要な局面は、検出可能な免疫生成物の形成に必要なすべて の反応が、単一の反応容器中で同時に進行するであろうことである。成分の調製 のために、第１の抗体か固体担体粒子上に吸着され、また第２の抗体か金属ゾル 標識粒子上に吸着される。結合可能な分析対象物が含まれることか予想される試 験溶液が、同時に抗体接合物と共にインキュベートされ、試験が正てあった場合 に形成される免疫生成物が収集される。該収集された材料が、収集固相中の金属 ゾル着色の存在について目視的に観察される。このような免疫アッセイの遂行に おいて、抗体接合体の混合物を提供し、次いで試験溶液が接合体の混合物とあら かじめ混合されることか好ましい。次いて得られる混合物が、あらかじめ記述さ れた期間、約１５°Ｃから約３７°Ｃ未満の周囲室温条件下でインキュベートさ れる。次いで、該混合物は、多孔性膜フィルター上に注がれ、ここにおいて免疫 生成物は観察のために収集され、その一方、液体材料および非結合標識抗体接合 体は、膜を単に透過し、次いて廃棄される。

典型的には、分析対象物は抗原である。第１および第２の抗体の両者は、ポリク ローナル抗体てあってよいが、好ましくは、第１および第２の抗体の少なくとも １つがモノクローナル抗体である。最も好適な場合において、該抗体類は、抗原 分子上のそれぞれ異ったエピトープに対して特異的な２種類の異なったモノクロ ーナル抗体である。本発明の特に好ましい態様においては、収集膜上の結合成分 の存在の視覚的指示を与えるために金ゾル粒子が使用される。

本発明に従うと、家庭および臨床的診断応用に特に適したキットおよび成分の提 供が促進され、これは特別な道具なしに非熟練者により使用可能である。特に、 本発明は、それらの反応性、免疫学的結合特異性または結合傾向を、その輸送中 、またはアッセイに使用する前に高温、高湿度の環境条件に曝しても失うことな く長期間保存され得る免疫学的試薬を提供する。更に、該試薬は、尿また他の水 性試験試料中への早い再構成を促進する条件を保って完全な反応系を提供する。

従って、本発明は、抗体−金属ゾル粒子接合体をゾル捕捉アッセイに使用される 活性免疫的試薬の一つとして含む凍結乾燥生成物混合物を提供する。該凍結乾燥 生成物は、抗体−固相担体粒子接合体も含んでもよい。２種類の抗体−粒子接合 体に加え、該凍結乾燥生成物混合物は、反応系中に存在することが望ましい添加 剤を含むことか好ましい。

該凍結乾燥混合物の調製のために、所望の成分が第一には水性凍結乾燥相に配合 される。該接合体および添加物を含む凍結乾燥相は、凍結乾燥に付され、粉末の 凍結乾燥（フリーズトライ）生成物を形成する。抗体−粒子接合体を含む本発明 の凍結乾燥生成物混合物の効果は、多重的である。該凍結乾燥生成物に抗体−粒 子接合体と共に含まれる添加物は、該抗体接合体を含む該凍結乾燥生成物か、８ ０°Ｆ〜１２０°Ｆの高温環境条件に供されても、アッセイに適用された場合の 抗体類の反応性、結合特異性または結合傾向を保つ能力について選択される。実 務的な意味において、このことは、キット成分か高温、多湿環境条件に曝された 場合にも抗体類の反応性または免疫学的結合特異性を損なう心配なしに、抗体接 合体を診断キット中に含めることかできることを意味している。加うるに、使用 者は該接合体を含む凍結乾燥生成物を、冷蔵の必要無しに、また環境条件か高温 多湿となる心配なしに周囲条件下に保存してかまわない。

重要なことは、該凍結乾燥混合物か、通常室温において液体であって、従って普 通には凍結乾燥の後に該凍結乾燥混合物を室温まで温めると凝集を起こしてフリ ーズドライされた混合物の均一性を破壊する１種以上の有機成分を含む場合にも 、その均一性を保持する能力を有することである。

材料の凍結乾燥混合物は、該方法の家庭診断での使用に適用するために必要とさ れる成分の数の減少を促す。

かくして、ゾル捕捉法との関連において有用な成分を組入れた好ましい診断キッ トは、抗体−粒子接合体および他の反応成分を含む凍結乾燥生成物のバイアル； 点眼容器のような測定用調剤器：および免疫生成物の収集および観察器具を含ん でなる。測定用調剤器を使用して、使用者は、必要量の試料（例えば、標的抗原 を含むことが予期される尿）を、該接合体を含む凍結乾燥生成物のバイアル中に 配合するのみてよい。次いで、該混合物は、室温にて所定の時間インキュベート に付される。得られた免疫生成物（試験か正の場合）は、次いで収集器具を用い て収集され、収集された量か金属ゾル粒子の色彩の特徴によって観察される。

このような診断キットの単純さは、一部においては、反応工程に対して所望の、 または必要なすべての添加物か、該接合体を含む凍結乾燥生成物混合物中に組込 まれて□いる事実によっている。この点に関して、免疫複合体の形成を増強する 結合増強剤、および非特異的相互作用を抑止する洗浄剤等の通常液体の有機成分 か、単にデキストリンまたはトレハロースを含む糖を凍結乾燥前の溶液に入れる ことにより、凍結乾燥混合物全体にわたって均一に分配され、かつ室温において も凝集か防止されることが見出された。凍結乾燥において、糖は、有機成分の凝 集を阻止する能力を有し、かくして混合物の均一性を維持し、これによって該混 合物の保存、保管寿命の増大、かつ免疫アッセイ法の遂行のための水性媒体への 該混合物の最終的分散を増進する。該凍結乾燥混合物への糖の取込みの結果とし て、免疫反応性成分および液体有機成分は、保存期間中に該混合物全体に均一な 分布が保たれる。該凍結乾燥混合物に於ける糖の存在およびその結果としての有 機液体の分配の結果、免疫反応性成分の反応性、結合特異性および結合傾向は、 維持され、かつ該凍結乾燥混合物は、その水性系との接触において容易に分散す る能力を保つ。

該凍結乾燥混合物に含まれることが望ましい通常液体の有機成分は、接合体由来 の免疫複合体形成を加速することかできる結合増強剤を含む。該結合増強剤は、 好ましくはポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ ドンまたはデキストラン等の非イオン性水溶性ポリマーである。ポリエチレング リコールは、′２８５および’１１４出願のゾル捕捉法、および前記°６５６出 願に記述された酵素アッセイにおいて使用するための最適な結合増強剤であるこ とが見出された。

前述したように、凍結乾燥混合物は、免疫アッセイのために反応系に存在するこ とか望まれるすべての成分を含むことが好ましい。従って、該凍結乾燥混合物は 、反応環境において約７．８−８．２のｐＨを与えるように選択された緩衝剤成 分を含んでよい。好ましい緩衝剤成分、特にゾル捕捉法のためのものは、トリス 塩基を含む。更に、該系は、尿中にしばしば存在する二価陽イオンを捕らえるた めに、ＥＤＴＡジナトリウム等のキレート化剤を有利に含んでよい。エチレンジ アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、クエン酸、酒石酸、グルクロン酸、サッカリン酸 またはこれらの酸の適当な塩等の他のキレート化剤は、米国特許番号第４．２２ ８，２４０号に列挙されており、ＥＤＴＡジナトリウムを多分置換できるであろ う。しかしながら、本発明との関連においては、尿試験試料に使用するにはＥＤ ＴＡジナトリウムが好ましい。

本発明によれば、オリゴサツカライド、好ましくはジサッカライド（但しスクロ ースではない）を含むか、または更に好ましくはデキストリンもしくはトレハロ ースを含む糖は、本発明の利点を達成するためには、該凍結乾燥混合物中におい て重要な成分である。従って、このような糖か、該混合物中に充分な量をもって 存在する場合に、結合増強剤および／または界面活性剤の凝集か防止され、該混 合物の均一性が保たれる。従って、該混合物の保存、保管寿命、ならびに免疫ア ッセイを遂行するための水性媒体への該混合物の終局的分散か促進される。

糖類の特定種の選択に伴う臨界性は、驚くべきものである。糖類の適当な種は、 多くの固有の性質を同時に示すものであることか示された。適当な糖類は、水に 急速に溶解しなければならず、好ましくは１分間未満で溶解すべきである。また 、糖類は、視覚的に均一な、安定した固体混合物、すなわち該接合体を含む凍結 乾燥生成物の均一で安定な担体を与える性質を有していなければならない。性質 を要求される組合せて有する適当な糖類の発見は、困難であった。はとんどの糖 類は、ショ糖も含めて、それらが均一な安定した固体混合物、すなわち安定な均 一担体を凍結乾燥において生成せず、個々の成分について濃度勾配をもった凍結 乾燥混合物を生じるため満足できるものではないことか分かった。該濃度勾配は 、室温で有機成分か凝集した結果であることが、それらは室温で液体であるとい う事実から考えられる。このような凝集は、混合物の均一性を破壊し、そこに結 果として濃度勾配を生じさせる。該濃度勾配は、より直接的かつ濃縮された接合 抗体の凝集液体小滴への曝露により、凍結乾燥生成物中で接合抗体に対して有害 な効果を有する傾向かある。デキストリンを含んだ適当な商業製品は、商品名Ｍ ＡＬＴＲＩＮのもとにＧｒａｉｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｃｏｒｐ。

から入手可能である。

該混合物において使用され、しばしば洗浄剤として特徴付けられる界面活性剤は 、水溶性非イオン性界面活性剤から選択することかできる。該界面活性剤は、可 溶性の非イオン性界面活性剤の多くの種類から選択され得る。

しかしながら、最も適当な界面活性剤は、ＩＧＥＰＡＬの商品名でＧＡＦ社から 入手可能なものであることか決定された、ＩＧＥＰＡＬ液体非イオン性界面活性 剤は、ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル化合物であり 、種々の分子量の指定、例えばＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ７２０、ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ ６３０、およびＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ３９０をもって入手可能である。他の好まし い非イオン性界面活性剤は、商品名ＴＥＴＲＯＮＩＣ９０９のちとにＢＡＳＦＷ ｙａｎｄｏｔｔｅ社から入手できるものを含む。この材料は、四官能性ブロック コポリマー界面活性剤であって一級ヒドロキシル基で終わるものである。他の適 当な非イオン性界面活性剤は、ＶＩＳＴＡ　ＡＬＰＨＯＮＩＣ（７）商品名のも とにＶｉｓｔａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能であり、この 材料は、種々の分子量の直鎖−級アルコール調合物の非イオン性の生物分解可能 物であるエトキシレートである。このような非イオン性界面活性剤は、それらか アッセイに対して接合体に有害な効果を与えることなく適切な量の洗浄性を与え ることから本発明の目的には最も適当である。特に、このような界面活性剤は、 免疫アッセイ反応系の種々の成分間の非特異的相互作用を抑制する目的で反応混 合物中に含められ、この関連においてはＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ７２０が界面活性剤 または洗浄剤として特に好ましい。

免疫学的成分の環境条件および化学的環境の両者に対する高度な感受性から見る と、ここに記述した性質を有する凍結乾燥生成物を達成することの困難性は、明 らかである。該凍結乾燥生成物への界面活性剤の包含により、洗浄剤をリキッド の分離した構成として含めることか省略される。

先行技術は、洗浄剤等の界面活性剤が、通常は免疫反応剤から分離された状態に 保たれことを教示している。

このことは、免疫反応剤かしはしは洗浄剤および界面活性剤に対して感受性であ り、このような物質に対する曝露が、該免疫反応剤の結合性にしばしば影響を与 える事実による。同様のことは、ポリエチレングリコール等の結合増強剤におい ても事実であり、すなわち免疫反応剤のポリエチレングリコールへの曝露は、該 免疫反応剤の結合性に影響を与えるであろう。しかしながら、本発明によると凍 結乾燥混合物中のデキストリンまたはトレハロースを含む糖の存在は、免疫試剤 の結合性に対するこのような成分の効果を除去するか、または少なくとも最小に する。これは、有機成分の凝集を阻止し、混合物全体に基本的に単一分散型で均 一な分配を保つ糖の性質の結果てあろう。かくして糖の存在は、凍結乾燥混合物 全体に均一に分配された液体有機成分および免疫反応成分の間の接触を効果的に 遅延させる。とにかくも、デキストリンまたはトレハロースを含む糖が充分な量 をもって凍結乾燥混合物に存在すると、有機成分の凝集か阻害され、該混合物の 均一性か保たれ、これによって該混合物の保存、保管寿命および免疫アッセイ法 の遂行のための混合物の最終的分散か促進されるという知見は、驚くへきもので ある。更に、凍結乾燥混合物全体に均一に分布する免疫反応成分か、高温の周囲 条件に曝され、またかなりな期間保存されても結合性を失わない。

本発明は、前記′２８５および゛１１４出願に記述されたゾル捕捉アッセイに用 いて好適な凍結乾燥混合物を提供するものである。更に、本発明の凍結乾燥混合 物は、前記°６５６親出願に完全に記述されているＥＬＩＳＡ型の免疫アッセイ との関連において有用である。これらのアッセイは、試験試料中に未知の濃度で 存在するであろう特定の抗原または抗体の検出に採用して有用である。

本発明の凍結乾燥混合物による免疫アッセイは、広範囲の特定の抗原および抗体 の測定に適用可能であり、またそれらは、妊娠女性の尿中に存在するヒトコリオ ニックゴナドトロピンホルモン（ｈＣＧ）等の抗原を検出するための家庭用診断 キットにおいて特に有用性を有することが見出された。本発明の凍結乾燥混合物 は、淋病の原因細菌またはゴノコッカス（ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、　Ｇ　Ｃ）と も称さくｈＬＨ）すなわち排卵時に女性の尿中に存在するホルモン等の検出にも 使用され得る。

前記したように、本発明は、上記に同定される°２８５および’１１４出願に記 述されたゾル捕捉法において高い有用性を育する凍結乾燥混合物を提供するもの である。かくして、該凍結乾燥混合物は、２種の分散可能な免疫反応性成分を含 み、その一方は、抗体−金ゾル粒子接合体であり、他方は、抗体一固体担体粒子 接合体である。このような接合体の調製に関しては、前記°２８５出願に完全に 記述されている。この本発明の好適な実施態様においても、凍結乾燥混合物は、 ポリエチレングリコール結合増強剤、および該反応混合物中の種々の成分間の非 特異的相互作用を抑制するためのポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェ ニルエーテル界面活性剤の両者を含まなければならない。好ましくは、好適な凍 結乾燥混合物は、ｐＨを制御するためのトリス塩基緩衝剤、およびヒト尿由来の 二価陽イオンを捕捉するためのキレート化剤としてのＥＤＴＡジナトリウムを含 む。フリーズドライ前の保管寿命を改善するための抗菌剤として、チメロサール （ｔｈｉｍｅｒａｌ）を含んでもよく、またこの意味においてこれは、凍結乾燥 混合物に対する効果のためというよりもむしろ、フリーズドライ前の材料に対す る効果のために凍結乾燥混合物中に存在すると理されるへきである。

本発明によると、金ゾル捕捉法において使用するための適切な凍結乾燥混合物を 調製するためには、凍結乾燥に付されるへき溶液は同時係属中の゛２８５出願の 例［Ｖ（ｆ）および（ｇ）に記述されたものと同様なアッセイ方法を使用するｈ ＣＧの存在の検出のために適した材料を含むであろう。抗体被覆金ゾル粒子は、 先行出願に示したようにして基本的には調製され、また、該金ゾル粒子は約３０ ｎｍの直径を有するへきである。（Ｇ、　Ｆｒｅｎｓ。

Ｎａｔｕｒｅ　２４１．　２０−２２．　（１９７３）参照）、金ゾル粒子被覆 のための好ましい抗体は、前記先行゛２８５出願に記述それた２Ｏ２抗体である 。該抗体被覆金ゾル粒子は、′２８５出願に示したように処理され、全標識プロ ーブ粒子のサスペンションを含む最終生成物を生成し、これは本発明の好適な免 疫アッセイにおける標識成分として使用されるであろう、従って、該標識成分は 、適切な量の３０ｎｍ金ゾル粒子と接合した２Ｏ２抗体を含む。

本発明の好ましい形態において、該アッセイ方法は、更に第２の抗体と固相粒子 とのカップリング生成物を含む固相成分の使用に関連する。該第２の抗体もまた 、ｈＣＧに対する抗体であり、また同様なものが前記゛２８５出願中に２Ｂ２抗 体として引用されている。この好ましい発明の局面に従って、２Ｂ２抗体および ２Ｏ２抗体は、ｈＣＧ分子の異なった部位またはエピトープに関して特異的に免 疫反応性である。すなわち、２Ｂ２抗体は、ｈＣＧ分子の一つの特定のエピトー プ部位と反応し、その一方２Ｇ９抗体は、ｈＣＧ分子の異なった空間的に離れた 特異的エピトープ部位と反応する。かくして、試験か正であった場合、金ゾル粒 子、２０９抗体、ｈＣＧ分子、２Ｂ２抗体および固相粒子から作られた生成物か 形成される。このような生成物は、フィルター要素上に捕捉されるに充分大きく 、結合金ゾル粒子の固有の顕著な着色か視覚的に観察される。

本発明の好ましい形態に関連して使用するための２Ｂ２抗体一固体担体粒子接合 体は、前記同時係属′２８５出願に開示され、記述された種々の方法および材料 のいずれを使用して調製してもよい。か（して２Ｂ２抗体−ラテックスプローブ 粒子は、２Ｂ２抗体を０．９９μカルボキシル化修飾ラテツクス粒子を接合する ことにより調製される。

本発明に従って、凍結乾燥抗体−ラテックス粒子接合体および凍結乾燥抗体−金 ゾル粒子接合体の混合物は、各接合体の単一試験の遂行に必要な量を容れた単一 試験容器（またはバイアル）中に与えられる。凍結乾燥抗体−粒子接合体の混合 物は、接合体の両種を含む単一の分散物を形成し、これら接合物を共に凍結乾燥 することにより調製され得る。これは、商業的な目的のために単純化されたキッ トを提供する。更に、免疫アッセイに従って含まれるべき他の成分は、該凍結乾 燥混合物中に取入れられ、この時点て試験容器中に入れられる。

各個別の試験は、好ましくは、約０．２７の０Ｄｓ３３□単位の３０ｎｍ金ゾル 粒子に接合された約２７５μｇの２０９抗体からなる金プローブ粒子、および約 １．ＯＯＤ、。。、、、単位の０．９９μカルボキシル化修飾ラテツクス粒子に 接合された約６．０μｇの２８２抗体からなるラテックスプローブ粒子を含む。

このような免疫反応性成分から凍結乾燥混合物を調製するためには、単一の水性 系か与えられ、これは免疫アッセイ法において必要または望ましい種々の成分を 含む。かくして、凍結乾燥に供されるべき５００ｍ１の水性系か調製される。該 系は、好ましくは、金ゾル粒子に接合する２゜７５ｍｇの２０９抗体：カルボキ シル化修飾ラテックス粒子に接合する６、０ｍｇの２Ｂ２抗体、結合増強剤とし ての１０．０ｍｇのポリエチレングリコール（２０Ｍ）；４８ｍｇのチメロサー ル；５．８ｇのトリス塩基緩衝剤＝４８ｇのＭｅｌｔｒｉｎ＋１．４４ｇのＥＤ ＴＡジナトリウム塩および０．１４４ｍ１のＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ７２０を含んて なる。該液体系は、可溶材料の溶液、および抗体−粒子接合体等の不溶性材料の 分散された懸濁物を含んでなる。得られた分散物は、およそ１，０００試験を遂 行するために充分な成分を含み、これは１０００個のガラス凍結乾燥バイアルに 均等に分配され、慣用のフリースドライ法に付される。

好適であることか知られている凍結乾燥サイクルは、該接合体を含む水性凍結乾 燥用分散物の最初の凍結を必要とする。該分散物は、約−４０°Ｃと一３５°Ｃ との間の温度範囲において大気圧条件で少なくとも２時間保たれる慣用の凍結乾 燥用チェンバ内で凍結される。抗体−粒子接合体を含む凍結された凍結乾燥用分 散物は、約１０＝５０ミリｔｏｒｒの真空に２４時間にわたり付される。この２ ４時間のサイクルにおいて、凍結乾燥チェンバ内の温度は、上昇するように調節 され、一方高真空条件は、約２０−５０ミリｔｏｒｒに維持される。該凍結乾燥 サイクルにおいて採用される典型的な温度水準は、−１０’Ｃにて１８時間：お よび＋２５°Ｃに約７−１０時間、生成物が約２５°Ｃに達するまでである。次 いで、該凍結乾燥ヂエンバは、部分的に窒素か充填され、凍結乾燥生成物か入っ たバイアルか封止される。凍結乾燥サイクルにおいて、最初に含まれていた液体 は蒸発する。得られた抗体−粒子接合体を含む凍結乾燥生成物は、凍結乾燥混合 物およびその種々の成分が、混合物全体に均一に分布している。

所望のように、凍結乾燥に付せされるべき分散物は、免疫アッセイの遂行の間に 存在することか望ましい他の成分を含んでもよい。従って、前記”１１４出願に 記述されているように緑色染料を、凍結乾燥に供される分散物中含めてもよく、 これによって緑色染料か凍結混合物中に存在することになるてあろう。

凍結乾燥に供される凍結乾燥用バイアルは、上述したようにそれぞれが免疫方法 において使用するための凍結乾燥混合物を含んている。　該混合物は、その全体 に均一に分配された２種類の分散可能な免疫反応性成分を含んでいる。該分散可 能な免疫反応成分の一つは、０．９９μ力ルホキシル化修飾ラテツクス粒子に接 合された２Ｂ２抗体であり、また免疫反応性成分の他方は、３０ｎｍ金ゾル粒子 に接合された２Ｏ２固体を含んでなる。該凍結乾燥バイアル中の凍結乾燥混合物 は、２種類の通常液体の有機成分を含み、その一方はＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ７２０ 洗浄剤を含んでなり、また他方は、ポリエチレングリコール（２０Ｍ）を含んで なる。上述したように、ＩＧＥＰＡＬ成分は、系の成分間の非特異的相互作用を 阻害するために含められている。またポリエチレングリコールは、該免疫反応剤 の結合活性を増進するために存在している。これらの材料の量は、本発明の臨界 的な特徴ではないか、これらは、結果から見て必要であるか、または望ましい量 をもって存在すべきてあり、本発明は液体有機成分が使用された場合に経験され たであろう好ましからぬ結果を最小とするか、および７／すたは消去するための 機構を提供すると言えば充分であろう。

凍結乾燥バイアル中の凍結乾燥混合物は、糖も含んでいる。各バイアルは、約４ ８μｇのＭａｌｔｒｉｎを含み、その量は、各凍結乾燥混合に存在する０、１４ ４μｌのＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ７２０およびｌＯ９θμｇのＰＥＧについて凝集を 阻害するために経験的に決定した。しかしながら、糖の量は、臨界的ではないか 、これは通常液体の成分の凝集を阻止するために充分な量をもって存在しなけれ ばならず、これによって混合物の均一性が保たれ、また保存、保管寿命および該 混合物の水性媒体への最終的分散性の両者が増進されることか認識されなければ ならない。本発明が関与する分野の当業者によって認識されるように、成分の所 定の混合物に含まれるべき糖の量の最適値は、関連のない多くの現象に依存し、 一般的には経験的に決定されなければならない。この点に関し、液体有機成分の 凝集は、凍結乾燥混合物に粒状の特性よりむしろペースト様の特性を生じ、所望 の粒状の特性を達成する糖の正しい量の決定は、この技術分野の通常の実験者に とって困難は無いて・　あろう。

本発明の凍結乾燥混合物は、前記′２８５および°ｌ１４出願に記述された免疫 アッセイの実行において成攻裏に使用された。このような免疫アッセイを行なう ためには、該凍結乾燥混合物を、単に０．４ｍｌの尿と接触させればよく、該凍 結乾燥混合物は数秒の程度で急速に尿に分散する。

補正書の翻訳文提出書　（特許法側８４条の８）平成３年１０月２８日 」

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．免疫アッセイ法において使用するための凍結乾燥混合物であって： 前記混合物全体に均一に分配された少なくとも１種の分散しうる免疫反応性成分 ； 前記混合物全体に均一に分配され、その存在により免疫アッセイの遂行を増強す る性質を有する、少なくとも１種の通常液体である有機成分；およびデキストリ ンまたはトレハロースを含んでなり、前記混合物中に該有機成分の凝集を防止す るに充分な量をもって存在し、該混合物の均一性を保持し、もって該混合物の保 存、保管寿命を延長し、かつ免疫アッセイ法の遂行のための該混合物の水性媒体 への分散を促進する糖を含んでなることを特徴とする凍結乾燥混合物。
2. ２．前記免疫反応性成分が、抗体接合体を含んでなる請求項１に記載の凍結乾燥 混合物。
3. ３．前記抗体接合体が、抗体−金ゾル粒子接合体を含んでなる請求項２に記載の 凍結乾燥混合物。
4. ４．前記抗体接合体が、抗体−固体担体粒子接合体を含んでなる請求項２に記載 の凍結乾燥混合物。
5. ５．前記固体担体粒子が、ラテックス粒子を含んでなる請求項４に記載の凍結乾 燥混合物。
6. ６．前記抗体接合体が、抗体−酵素接合体を含んでなる請求項２に記載の凍結乾 燥混合物。
7. ７．前記混合物が少なくとも２種の免疫反応性成分を含み、該免疫反応性成分の 一方が、抗体−金ゾル接合体を含み、かつ他方の免疫反応性成分の他方が抗体− 固体担体粒子を含んでなる請求項１に記載の凍結乾燥混合物。
8. ８．前記固体担体粒子がラテックス粒子である請求項７に記載の凍結乾燥混合物 。
9. ９．前記有機成分が結合増強剤を含んでなる請求項１に記載の凍結乾燥混合物。
10. １０．前記結合増強剤が、非イオン性の水可溶性ポリマーを含んでなる請求項９ に記載の凍結乾燥混合物。
11. １１．前記ポリマーが、ポリエチレングリコールを含んでなる請求項１０に記載 の凍結乾燥混合物。
12. １２．前記ポリマーが、ポリビニルアルコールを含んでなる請求項１０に記載の 凍結乾燥混合物。
13. １３．前記ポリマーが、ポリビニルピロリドンを含んでなる請求項１０に記載の 凍結乾燥混合物。
14. １４．前記ポリマーが、デキストランを含んでなる請求項１０に記載の凍結乾燥 混合物。
15. １５．前記有機成分が、界面活性剤を含んでなる請求項１に記載の凍結乾燥混合 物。
16. １６．前記界面活性剤が、水可溶性非イオン性界面活性剤を含んでなる請求項１ ５に記載の凍結乾燥混合物。
17. １７．前記界面活性剤が、ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエ ーテル化合物を含む請求項１６に記載の凍結乾燥混合物。
18. １８．前記混合物が、少なくとも２種の通常液体の有機成分を含み、該有機成分 の一方が、結合増強剤を含み、該有機成分の他方が、界面活性剤を含んでなる請 求項３に記載の凍結乾燥混合物。
19. １９．前記混合物が、少なくとも２種の通常液体の有機成分を含み、該有機成分 の一方が、結合増強剤を含み、該有機成分の他方が、界面活性剤を含んでなる請 求項５に記載の凍結乾燥混合物。
20. ２０．前記混合物が、少なくとも２種の通常液体の有機成分を含み、該有機成分 の一方が、結合増強剤を含み、該有機成分の他方が、界面活性剤を含んでなる請 求項７に記載の凍結乾燥混合物。
21. ２１．前記結合増強剤が、ポリエチレングリコールを含み、前記界面活性剤が、 ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル化合物を含んでなる 請求項２０に記載の凍結乾燥混合物。