JPH0532372B2 - - Google Patents
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Description
本発明は一般にバイオ高分子を独特の構造型
（conformational state）に安定化すること及び
生物医学及び生物工学的応用のためにその関連あ
る活性及び機能を利用することに関するものであ
る。更に詳細にはその何れかの構造
（conformation）〔タイトHb(T)又はリラツクス
Hb(R)〕の状態にあるヘモグロビン（Hb）を安定
化及び／又は架橋して解離を防止し所望のリガン
ド−結合親和性を得ることである。本発明の方法
及び試剤は新規動物−ヘモグロビン、人間−ヘモ
グロビン及び赤血球の酸素運搬機能のための遺伝
子工学的につくられたヘモグロビンに基く代用品
又は「代用血液」の製造；及びシアン化物中毒治
療に用いるためのオキシヘモグロビン誘導体のメ
トヘモグロビン誘導体への転換を開発するための
ものである。 輸注液としての血液の使用には重大な制約があ
る。これは主として赤血球（RBC）の自然的特
性及び病気の感染の危険性によるものである。 血液及び血液製品によるウイルス性の病気の感
染は輸注用薬剤の大きな問題である。 ウイルスに感染した血液を発見するための検査
はコストが高くつきしかも完全に有効なものでは
ない。血液製剤注のウイルス感染を不活性化する
ために利用できる方法の中で工業的に行なわれて
いる方法は湿熱低温殺菌である。しかしRBCは
低温殺菌不能である。 輸血において全血を用いる場合のその他の制約
としては厳しい保存条件、短かい寿命及び赤血球
の複雑な免疫特性がある。したがつてストローマ
を含まないヘモグロビンの化学的修飾により細胞
を含まないヘモグロビンに基く代用血液の開発に
つき研究がなされて来た。 周知のように、ヘモグロビンは２つのアルフア
（α）及び２つのベーター（β）グロビン鎖より
構成される４つのサブユニツトの四量体から成つ
ている。この四量体の分子量は約64キローダルト
ンであり、各サブユニツトはほぼ同じ分子量をも
つている。稀釈溶液においては四量体ヘモグロビ
ンはαβ二量体の半分の分子に容易に解離する。
これら二量体の比較的低い分子量のため腎臓によ
り循環系から速やかに濾過され尿中に失われる。
このため約２−３時間という短い半減期（Ｔ1/2）
となる。 また、ヘモグロビンはその赤血球膜の保護がな
いと自然リガンドジホスホグリセレート（DPG）
を失う。DPGは通常ヘモグロビンの酸素親和性
を低下せしめるからこれが失われると可溶性ヘモ
グロビンが更に強く酸素と結合し赤血球のように
効率よく酸素を組織に運搬しなくなる。この理由
によりストローマを含まぬヘモグロビンは代用血
液として使用するのに適さない。 今迄これらの欠点はピリドキサール−5′−ホス
フエート（PLP）のようなDPGアナローグをデ
オキシ状態のHb(T)に共有結合せしめるRBCに近
い低い酸素親和性を有するPLP−Hbを生成する
ことにより克服せんとして来た。即ち、Green−
burg〔Greenburg et al、Surgery、vol.86
（1979）、pp.13−16〕は生理的酸素親和性を有す
るPLP−Hbを代用血液として使用することを試
みた。しかし、分子内架橋なしにはPLP−Hbは
SFHと同様に半分子に解離し、腎臓により急速
に放出されてしまう。また、Hsia及びその共同
研究者（McGarrity et al、Journal of
Chromatographr、vol.419（1987）、pp.37−50）
はPLP−Hbはヘモグロビン１モルにつき０乃至
６モルのPLPを含有する修飾ヘモグロビンの複
雑な混合物であり、これらのサブスピーシーズは
それぞれ異なつた酸素親和性を有することを示し
た。 DPGアナローグはHbを分子内架橋することが
わかつた。この架橋剤は人間ヘモグロビンの
DPG−結合部位に特定的に結合するように設計
される。これらの架橋剤にはβサブユニツトに特
定的であるもの（Benesch et al、Biochem.
Biophys.Rse.Commun.、vol.63、No.４（1975）、
pp1123−1129；Benesch et al、in Methods ni
Enzymology、vol.76、Hemoglobins（1981）
pp.147−159Academic Press）あるいはαサブ
ユニツトに特定的であるもの（Chatterjee et
al、Journal of Biol.Chem.、Vol.261、July25、
1986、pp.9929−9937）が含まれる。 これらの特定のリガンドによる架橋は一般に収
率が低く（＜70％）、製品を更に精製する必要が
ある。活性化したトリホスフエートヌクレオチド
を用いてヘモグロビンの架橋と同時にDPG結合
部位を占有してATP−Hbが得られた。これは
PLP−Hbよりも酸素親和性が低くプラズマ保持
時間が長いことがわかつた。（Greenburg et al、
Progress in Clinical and Biological Re−
search、vol.122、Advances in Blood
Substitate Research（1983）、pp9−17、Alan R.
Liss、New York；McGarrity et al、Journal
of Chro−matography、vol.415、（1987）pp.136
−142）。80−90％の血液交換において、ATP−
Hbは胸腔及び腹腔から滲出するので高レベルの
血液交換を行なうのは危険であろう。 非特定的架橋剤〔たとえばグルタルアルデヒド
（GA）〕によるPLP−Hbの分子内架橋（重合）
がプラズマ保持時間の延長のために用いられた。
（Bonhard et al、英国特許4136093号、1979年１
月23日）。得られたポリマーPLP−Hb（14ｇHb／
dl）は生理的酸素担持能力（20c.c.O2／dl以下）
及び同膨張圧（iso−oncotic pressure）を有し
ていた。しかし、重合は不完全でありその成分は
不均一な酸素親和性を有する。 他のグループはPLP−Hbをポリエチレングリ
コール（Iwasaki et al、Artificial Organs、
vol.10、No.５、（1986）、pp.411−416）及びイタ
リン（Iwaski et al、Biochem.Biophys.Res.
Commun、vol.113、No.２（1983）、pp.513−518）
と複合せしめることにより、及びHbをデキスト
ランと複合せしめることにより（Tam et al、
Proc.Nat′l.Acad.Sci.、U.S.A. vol.73（1976）
pp.2128−2131）プラズマ半減期を延長すること
を試みた。製品の不均一性及び高い酸素親和性が
矢張り欠点であつた。 種々の２価架橋剤を用いてHbを重合し代用血
液としてポリHbを得ることはprior artに記載さ
れている。この方法の欠点は重合が過度であるこ
と（生成物の90％がその寸法が150キロダルトン
より大きい）、酸素親和性が変り易いこと、反応
機構が複雑であること及び用いる架橋剤の生物学
的不和合性（たとえばジビニルスルホン、潜在性
発がん物質：米国特許第4001300号；4001401号；
4053590号）である。この方法の追求において、
同じ族の二価架橋剤を用いて分子内架橋したHb
が得られた。ジビニルスルホンは酸素親和性の変
り易いかつ組成の特定されない製品を生ずること
が示された（米国特許第4061736号）。 本発明の目的は新規な代用血液及びその製法を
提供することである。 本発明の更に他の目的は輸注における治療剤と
して有用な安定化されかつ低温殺菌したヘモグロ
ビンを提供することであり、前記低温殺菌により
伝播性感染物が実質的にヘモグロビン中に存在し
なくなる。 更に他の目的はヘモグロビンを何れかの分子構
造（(T)又は(R)）において分子内架橋を起こし、こ
の構造を架橋生成物中に保持する（即ち、構造の
安定化された）ような架橋剤及び方法を提供する
ことである。このような構造の安定化は一般の生
物高分子に適用することができる。 本発明の四量体の形のヘモグロビンを安定化す
る新規方法に基くものであり、この方法により二
量体へ解離しないように安定化されるのみなら
ず、Hbの何れかの自然的構造、即ち、通常デオ
キシヘモグロビンと言われるタイト(T)又は通常オ
キシヘモグロビンと言われるリラツクス(R)の何れ
かの型に安定化される。Hb(T)を安定化し架橋す
るのにDPGアナローグを用いる代りに、本発明
の製品はそれぞれのサブユニツトのグロビン鎖間
の共有化学結合を用いることにより解離及び構造
状態の変化の両方に対して安定化されている。出
発四量体ヘモグロビンの構造型がＴあるいはＲの
何れであつても、本発明によるとこの構造型は安
定化された製品通に保持される。 両構造型の間を移動するヘモグロビンのこの能
力はヒル係数(n)で示される。係数が２以上の場合
はサブユニツト間の酸素結合が構造の変化により
協同的であることを示し、係数が約１であること
はHbがＴ又はＲ型構造に固定されていることを
示す。１−1.5のヒル係数は完全な安定化及び酸
素結合に協同性が無いことを示し、これは本発明
の独特の特徴である。 本発明と従来技術との更に他の相違は従来技術
ではヘモグロビンの安定化は特定部位のサブユニ
ツトのグロビン鎖を結合してヘモグロビン四量体
を構成することにより達成している。この生成物
は四量体ユニツトが二量体サブユニツトに解離す
ることに対してだけ安定化されており、即ち、酸
素の協同的結合が保持される（ヒル係数n3）。一
方、本発明によると四量体ヘモグロビンは解離に
対してのみならず、構造の変化に対しても安定変
される、即ち、協同的酸素結合が存在しない（ヒ
ル係数n1−1.5）。 構造の安定化というこの特徴は本発明の製品に
特有のものである。 本発明の構造的安定化四量体ヘモグロビンは多
くの重要な利点をもつている。たとえば、Ｔ−型
構造に安定化され、かつこの構造は溶液状におい
ても残るという事実そのものにより製品は天然の
赤血球と同様の酸素親和性を有するものであるこ
とがわかる。従つて、本発明の製品は肺における
酸素の吸収に関して赤血球と実質的に均等であ
る。他の重要な特徴は身体の組織に酸素を運搬す
る能力である。身体組織における酸素分圧下にお
いて、本発明のＴ型構造に安定化した製品はアロ
ステリツク協同性の構造的に安定化されていない
ヘモグロビン製品よりも実質的に多量の酸素を組
織に放出するであろう。この酸素放出量が大きい
ということは救急医学において常に遭遇するよう
に、たとえば組織を傷けられた外傷患者に輸血す
る場合等において非常に重要となる。 本発明と従来技術との非常に重要な相違は本発
明の安定化ヘモグロビン（Hemosafe ）は高
収率（95％以上）で容易に単一工程で製造され、
しかも未安定化のヘモグロビンが実質的に残らな
いということである。このため、更に精製する必
要がなく、従つて残留未反応物質を除去するため
の精製を行なわずとも溶液中に低分子量二量体生
成物がほとんど形成されない。従つて、構造の安
定化された単量体Hb（Hemo Safe と称する
ことがある）はストローマを含まないヘモグロビ
ンの約３倍のプラズマ半減期を有し従つて緊急の
場合の代用血液として非常に適しているであろ
う。更に、この安定化Hb(T)は他の新しいヘモグ
ロビンに基く製品の製造に非常に適している。
Hb(T)は結合して重合ヘモグロビン（ポリHb(T)又
はHeme Safe ）を生成することができこれ
は代用血液として有用であり、また分子量が大き
くプラズマ半減期が長い故にそれ自体で安定化四
量体製品よりも好ましい。これは別のバイオポリ
マーと共有結合して代用血液として有用な複合体
（Hemo Safe −複合体）を形成することがで
きる。これらの転換のすべてにおいてヘモグロビ
ン四量体はその特定の構造（たとえば、Hb(T)）
を保持する。この製品は凍結乾燥して長期間保存
できる。 更に、実用上重要なことには、本発明の構造安
定化したヘム含有四量体は第一鉄から第二鉄への
鉄の酸化を防止するために、たとえば、一酸化炭
素又は酸化窒素の如き、酸素置換剤又は亜ジチオ
ン酸ナトリウムの如き酸素除去剤を存在せしめて
処理し、次に汚染ウイルスを破壊すために低温殺
菌することができる。本発明の製品はタンパク質
の変性又は製品の分解を起こすこと無く低温殺菌
に必要な加熱、即ち少くとも60℃10時間の加熱に
耐え得るに十分安定である。この方法は四量体、
たとえばCO−Hemo Safe 、ポリマー、たと
えばCO−Hemo Safe 及び複合体CO−
Hemo Safe の低温菌に適用することができ
る。次にこれらのCO Hemo Safeはすべて構造
の機能的及び構造的完全さを失うことなく容易に
オキシ−Hemo Safeに再転換することができ、
このオキシ−Hemo Safeは代用血液として輸血
に適している。 また、この製品の重合あるいは複合を起こす
か、起こすことなく酸化してシアン化物除去剤と
して有効でありその予防に使用し得るメトヘモグ
ロビン製品（即ち、メト−Hemo Safe）とする
ことができる。 即ち、本発明によると水性剤としたときに二量
体への解離及びＴ−型構造とＲ−型構造間の変化
に対して安定化した四量体ヘモグロビンユニツト
から本質的になるヘモグロビン製品が提供される
のであり、前記四量体ユニツトはサブユニツトの
グロビン鎖間の共有化学結合をもつており、安定
化が行なわれるのである。 本発明の製品の製造において、デオキシ−Hb
（Hb(T)）の均一な組成を安定化し凍結中又は60℃
迄の温度下で不安定するのを防ぐための新規試
剤、反応条件及び方法が開発されたものであり、
これにより最終製品の低温殺菌、凍結乾燥及び均
一な生理的酸素親和性が達成されたのである。 構造特異性安定剤及び架橋剤（CSSC）： 本発明による四量体ヘモグロビンユニツトの所
望の構造及び分子内安定化を達成する好ましい方
法は構造特異性安定剤及び架橋剤（CSSC）と呼
ばれるクラスの試剤１種以上との反応によるもの
である。最も普通なものはジアルデヒドとポリア
ルデヒドである。これらはグロビン鎖上の第一ア
ミノ基と反応してシツフ塩基結合を生成する。こ
のシツフ塩基結合はつづいて還元して第２アミン
結合とすることができる。四量体ヘモグロビンに
おいてはα−鎖及びβ−鎖上に第１アミン基が適
当に配置されており、これらはジアルデヒド及び
ポリアルデヒドと優先的にかつすべての意図及び
目的にとつては選択的に反応し、安定化のための
所望の共有結合を生成する。 本発明においてCSSCとして使用するジアルデ
ヒドの一例は適切な条件下で用いる場合のグルタ
ルアルデヒド（GA）である。ヘモグロビンと
GAとの反応は以前に報告されている。しかし、
これらの方法は四量体ユニツトの構造の実質的に
完全な安定化をもたらさず、また安定化四量体か
ら本質的に成る製品をもたらさない条件で行なわ
れている。すでに使用されているように、グルタ
ルアルデヒドは非特異性試剤であり安定化のため
に四量体のサブユニツト間に分子内結合を形成す
るよりも速やかに四量体間に共有的分子内結合を
起こし重合ヘモグロビンを形成する。その結果、
広い分子量分布を有する安定化四量体、未安定化
四量体及び安定化ポリマーとなり、各成分は異な
つた酸素親和性を有する。 本発明においては低濃度のヘモグロビン（即
ち、１−４ｇ／dl）及びGAとヘモグロビンとの
高いモル比（即ち、約６：１乃至約60：１）を用
いてヘモグロビンとGAとを反応せしめる。この
ような条件下では四量体の形のHbモノマーは少
くとも95％、通常少くとも98％が重合ヘモグロビ
ン中で安定化される。かくして、実質的に完全に
構造の安定化した重合製品が得られる。この安定
化したポリマーの形の製品は次に低温殺菌のため
に一酸化炭素と結合せしめることができる。 動物ヘモグロビンに基く代用血液を人間に用い
る場合、抗原性のためオリゴマー及びポリマーの
生成を防止すべきである。 モノマー形のHb〔Hb(T)〕をGAで固定する過程
で重合化する傾向が大きい。従つて本発明の好ま
しい態様においてはヘモグロビン（Hb）の安定
化においては異なつたCSSC試剤及び反応条件を
使用する。これらのCSSC化合物を使用すること
によりHbモノマーの安定化、ポリマーの生成を
伴わずに最小の二量体の形成（＜５％）を達成す
ることができ更にこれらのCSSC化合物は一般に
所望ならば最小の重合を伴つて、選択した構造の
他の高分子を安定化するのに使用することができ
る。このようなCSSC化合物は特有の構造の高分
子を安定化することにより生物高分子の活性及び
機能を保持することができる。しかし、CSSC化
合物を用いることにより更に反応条件を慎重に調
節して高分子をお互いに結合せしめ（重合）、あ
るいは別の高分子、たとえばイヌリンと複合せし
めることができる。具体的には結合試剤としての
このようなCSSC化合物とともにタイト(T)構造の
デオキシヘモグロビン（Hb(T)）を用い、反応条
件を調節して、安定化Hb(T)と別の高分子との結
合及び所望ならば安定化Hb(T)モノマーの重合を
行なうことができる。このようなCSSC化合物は
ヘモグロビン誘導体、たとえばPLP−Hbを反応
条件に応じて安定化及び重合し、更にこの誘導体
を別の高分子に結合するのに使用することもでき
る。 本発明で用いるCSSC化合物は一般にジアルデ
ヒド及びポリアルデヒドである。その一具体例は
HOC−COHの式を有するグリオキサールであ
る。他の例はベンゼンジアルデヒド（オルト、メ
タ及びパラ）である。ただし残りの芳香族基から
の免疫原反応の危険があるので芳香族架橋剤はあ
まり好ましくない。CSSC化合物として最も好ま
しいものは単糖類及びオリゴ糖類における酸化開
環反応によつて生成するアルデヒド系生成物であ
る。たとえば過沃素酸塩酸化を用いるこのような
反応は知られている。この反応によりオリゴ糖中
の各糖モノマーにつき２個のアルデヒド基を有す
る生成物が得られる。即ち、たとえば６個のアル
デヒド基が１つのラフイノース（Ｏ−ラフイノー
ス）又はマルトトリオース（Ｏ−マルトトリオー
ス）から生成する。同族列内において、グルコー
スのような二価アルデヒドと同程度のサブユニツ
ト安定化を達成するに必要なポリアルデヒド架橋
剤のモル当量数はCSSCの原子価に反比例する。
GAとは対照的にＯ−ラフイノースは分子内架橋
特異性を有し、したがつてHbに対して高いモル
比（20：１）のＯ−ラフイノースをポリマーを含
まないHb(T)の調整に用いることができる。この
発見はCSSCがHbモノマーを最少の分子内架橋
をもつて特定の構造に有効に安定化することを示
している。これにより重合反応を遅らせ反応の有
効な制御が可能となり実質的にポリマーを含まぬ
安定化Hb製品を容易に製造することができる。 有用なCSSC化合物の具体例としてグルコー
ス、イヌリン、マルトース、マルトトリオース、
マルトテトロース、マルトペントース、マルトヘ
キソース及びマルトヘプトースのような糖類の沃
素酸塩酸化糖の同族列がある。一般に糖類の開環
酸化によつて誘導されたCSSC化合物は下記の式
に対応する。
（conformational state）に安定化すること及び
生物医学及び生物工学的応用のためにその関連あ
る活性及び機能を利用することに関するものであ
る。更に詳細にはその何れかの構造
（conformation）〔タイトHb(T)又はリラツクス
Hb(R)〕の状態にあるヘモグロビン（Hb）を安定
化及び／又は架橋して解離を防止し所望のリガン
ド−結合親和性を得ることである。本発明の方法
及び試剤は新規動物−ヘモグロビン、人間−ヘモ
グロビン及び赤血球の酸素運搬機能のための遺伝
子工学的につくられたヘモグロビンに基く代用品
又は「代用血液」の製造；及びシアン化物中毒治
療に用いるためのオキシヘモグロビン誘導体のメ
トヘモグロビン誘導体への転換を開発するための
ものである。 輸注液としての血液の使用には重大な制約があ
る。これは主として赤血球（RBC）の自然的特
性及び病気の感染の危険性によるものである。 血液及び血液製品によるウイルス性の病気の感
染は輸注用薬剤の大きな問題である。 ウイルスに感染した血液を発見するための検査
はコストが高くつきしかも完全に有効なものでは
ない。血液製剤注のウイルス感染を不活性化する
ために利用できる方法の中で工業的に行なわれて
いる方法は湿熱低温殺菌である。しかしRBCは
低温殺菌不能である。 輸血において全血を用いる場合のその他の制約
としては厳しい保存条件、短かい寿命及び赤血球
の複雑な免疫特性がある。したがつてストローマ
を含まないヘモグロビンの化学的修飾により細胞
を含まないヘモグロビンに基く代用血液の開発に
つき研究がなされて来た。 周知のように、ヘモグロビンは２つのアルフア
（α）及び２つのベーター（β）グロビン鎖より
構成される４つのサブユニツトの四量体から成つ
ている。この四量体の分子量は約64キローダルト
ンであり、各サブユニツトはほぼ同じ分子量をも
つている。稀釈溶液においては四量体ヘモグロビ
ンはαβ二量体の半分の分子に容易に解離する。
これら二量体の比較的低い分子量のため腎臓によ
り循環系から速やかに濾過され尿中に失われる。
このため約２−３時間という短い半減期（Ｔ1/2）
となる。 また、ヘモグロビンはその赤血球膜の保護がな
いと自然リガンドジホスホグリセレート（DPG）
を失う。DPGは通常ヘモグロビンの酸素親和性
を低下せしめるからこれが失われると可溶性ヘモ
グロビンが更に強く酸素と結合し赤血球のように
効率よく酸素を組織に運搬しなくなる。この理由
によりストローマを含まぬヘモグロビンは代用血
液として使用するのに適さない。 今迄これらの欠点はピリドキサール−5′−ホス
フエート（PLP）のようなDPGアナローグをデ
オキシ状態のHb(T)に共有結合せしめるRBCに近
い低い酸素親和性を有するPLP−Hbを生成する
ことにより克服せんとして来た。即ち、Green−
burg〔Greenburg et al、Surgery、vol.86
（1979）、pp.13−16〕は生理的酸素親和性を有す
るPLP−Hbを代用血液として使用することを試
みた。しかし、分子内架橋なしにはPLP−Hbは
SFHと同様に半分子に解離し、腎臓により急速
に放出されてしまう。また、Hsia及びその共同
研究者（McGarrity et al、Journal of
Chromatographr、vol.419（1987）、pp.37−50）
はPLP−Hbはヘモグロビン１モルにつき０乃至
６モルのPLPを含有する修飾ヘモグロビンの複
雑な混合物であり、これらのサブスピーシーズは
それぞれ異なつた酸素親和性を有することを示し
た。 DPGアナローグはHbを分子内架橋することが
わかつた。この架橋剤は人間ヘモグロビンの
DPG−結合部位に特定的に結合するように設計
される。これらの架橋剤にはβサブユニツトに特
定的であるもの（Benesch et al、Biochem.
Biophys.Rse.Commun.、vol.63、No.４（1975）、
pp1123−1129；Benesch et al、in Methods ni
Enzymology、vol.76、Hemoglobins（1981）
pp.147−159Academic Press）あるいはαサブ
ユニツトに特定的であるもの（Chatterjee et
al、Journal of Biol.Chem.、Vol.261、July25、
1986、pp.9929−9937）が含まれる。 これらの特定のリガンドによる架橋は一般に収
率が低く（＜70％）、製品を更に精製する必要が
ある。活性化したトリホスフエートヌクレオチド
を用いてヘモグロビンの架橋と同時にDPG結合
部位を占有してATP−Hbが得られた。これは
PLP−Hbよりも酸素親和性が低くプラズマ保持
時間が長いことがわかつた。（Greenburg et al、
Progress in Clinical and Biological Re−
search、vol.122、Advances in Blood
Substitate Research（1983）、pp9−17、Alan R.
Liss、New York；McGarrity et al、Journal
of Chro−matography、vol.415、（1987）pp.136
−142）。80−90％の血液交換において、ATP−
Hbは胸腔及び腹腔から滲出するので高レベルの
血液交換を行なうのは危険であろう。 非特定的架橋剤〔たとえばグルタルアルデヒド
（GA）〕によるPLP−Hbの分子内架橋（重合）
がプラズマ保持時間の延長のために用いられた。
（Bonhard et al、英国特許4136093号、1979年１
月23日）。得られたポリマーPLP−Hb（14ｇHb／
dl）は生理的酸素担持能力（20c.c.O2／dl以下）
及び同膨張圧（iso−oncotic pressure）を有し
ていた。しかし、重合は不完全でありその成分は
不均一な酸素親和性を有する。 他のグループはPLP−Hbをポリエチレングリ
コール（Iwasaki et al、Artificial Organs、
vol.10、No.５、（1986）、pp.411−416）及びイタ
リン（Iwaski et al、Biochem.Biophys.Res.
Commun、vol.113、No.２（1983）、pp.513−518）
と複合せしめることにより、及びHbをデキスト
ランと複合せしめることにより（Tam et al、
Proc.Nat′l.Acad.Sci.、U.S.A. vol.73（1976）
pp.2128−2131）プラズマ半減期を延長すること
を試みた。製品の不均一性及び高い酸素親和性が
矢張り欠点であつた。 種々の２価架橋剤を用いてHbを重合し代用血
液としてポリHbを得ることはprior artに記載さ
れている。この方法の欠点は重合が過度であるこ
と（生成物の90％がその寸法が150キロダルトン
より大きい）、酸素親和性が変り易いこと、反応
機構が複雑であること及び用いる架橋剤の生物学
的不和合性（たとえばジビニルスルホン、潜在性
発がん物質：米国特許第4001300号；4001401号；
4053590号）である。この方法の追求において、
同じ族の二価架橋剤を用いて分子内架橋したHb
が得られた。ジビニルスルホンは酸素親和性の変
り易いかつ組成の特定されない製品を生ずること
が示された（米国特許第4061736号）。 本発明の目的は新規な代用血液及びその製法を
提供することである。 本発明の更に他の目的は輸注における治療剤と
して有用な安定化されかつ低温殺菌したヘモグロ
ビンを提供することであり、前記低温殺菌により
伝播性感染物が実質的にヘモグロビン中に存在し
なくなる。 更に他の目的はヘモグロビンを何れかの分子構
造（(T)又は(R)）において分子内架橋を起こし、こ
の構造を架橋生成物中に保持する（即ち、構造の
安定化された）ような架橋剤及び方法を提供する
ことである。このような構造の安定化は一般の生
物高分子に適用することができる。 本発明の四量体の形のヘモグロビンを安定化す
る新規方法に基くものであり、この方法により二
量体へ解離しないように安定化されるのみなら
ず、Hbの何れかの自然的構造、即ち、通常デオ
キシヘモグロビンと言われるタイト(T)又は通常オ
キシヘモグロビンと言われるリラツクス(R)の何れ
かの型に安定化される。Hb(T)を安定化し架橋す
るのにDPGアナローグを用いる代りに、本発明
の製品はそれぞれのサブユニツトのグロビン鎖間
の共有化学結合を用いることにより解離及び構造
状態の変化の両方に対して安定化されている。出
発四量体ヘモグロビンの構造型がＴあるいはＲの
何れであつても、本発明によるとこの構造型は安
定化された製品通に保持される。 両構造型の間を移動するヘモグロビンのこの能
力はヒル係数(n)で示される。係数が２以上の場合
はサブユニツト間の酸素結合が構造の変化により
協同的であることを示し、係数が約１であること
はHbがＴ又はＲ型構造に固定されていることを
示す。１−1.5のヒル係数は完全な安定化及び酸
素結合に協同性が無いことを示し、これは本発明
の独特の特徴である。 本発明と従来技術との更に他の相違は従来技術
ではヘモグロビンの安定化は特定部位のサブユニ
ツトのグロビン鎖を結合してヘモグロビン四量体
を構成することにより達成している。この生成物
は四量体ユニツトが二量体サブユニツトに解離す
ることに対してだけ安定化されており、即ち、酸
素の協同的結合が保持される（ヒル係数n3）。一
方、本発明によると四量体ヘモグロビンは解離に
対してのみならず、構造の変化に対しても安定変
される、即ち、協同的酸素結合が存在しない（ヒ
ル係数n1−1.5）。 構造の安定化というこの特徴は本発明の製品に
特有のものである。 本発明の構造的安定化四量体ヘモグロビンは多
くの重要な利点をもつている。たとえば、Ｔ−型
構造に安定化され、かつこの構造は溶液状におい
ても残るという事実そのものにより製品は天然の
赤血球と同様の酸素親和性を有するものであるこ
とがわかる。従つて、本発明の製品は肺における
酸素の吸収に関して赤血球と実質的に均等であ
る。他の重要な特徴は身体の組織に酸素を運搬す
る能力である。身体組織における酸素分圧下にお
いて、本発明のＴ型構造に安定化した製品はアロ
ステリツク協同性の構造的に安定化されていない
ヘモグロビン製品よりも実質的に多量の酸素を組
織に放出するであろう。この酸素放出量が大きい
ということは救急医学において常に遭遇するよう
に、たとえば組織を傷けられた外傷患者に輸血す
る場合等において非常に重要となる。 本発明と従来技術との非常に重要な相違は本発
明の安定化ヘモグロビン（Hemosafe ）は高
収率（95％以上）で容易に単一工程で製造され、
しかも未安定化のヘモグロビンが実質的に残らな
いということである。このため、更に精製する必
要がなく、従つて残留未反応物質を除去するため
の精製を行なわずとも溶液中に低分子量二量体生
成物がほとんど形成されない。従つて、構造の安
定化された単量体Hb（Hemo Safe と称する
ことがある）はストローマを含まないヘモグロビ
ンの約３倍のプラズマ半減期を有し従つて緊急の
場合の代用血液として非常に適しているであろ
う。更に、この安定化Hb(T)は他の新しいヘモグ
ロビンに基く製品の製造に非常に適している。
Hb(T)は結合して重合ヘモグロビン（ポリHb(T)又
はHeme Safe ）を生成することができこれ
は代用血液として有用であり、また分子量が大き
くプラズマ半減期が長い故にそれ自体で安定化四
量体製品よりも好ましい。これは別のバイオポリ
マーと共有結合して代用血液として有用な複合体
（Hemo Safe −複合体）を形成することがで
きる。これらの転換のすべてにおいてヘモグロビ
ン四量体はその特定の構造（たとえば、Hb(T)）
を保持する。この製品は凍結乾燥して長期間保存
できる。 更に、実用上重要なことには、本発明の構造安
定化したヘム含有四量体は第一鉄から第二鉄への
鉄の酸化を防止するために、たとえば、一酸化炭
素又は酸化窒素の如き、酸素置換剤又は亜ジチオ
ン酸ナトリウムの如き酸素除去剤を存在せしめて
処理し、次に汚染ウイルスを破壊すために低温殺
菌することができる。本発明の製品はタンパク質
の変性又は製品の分解を起こすこと無く低温殺菌
に必要な加熱、即ち少くとも60℃10時間の加熱に
耐え得るに十分安定である。この方法は四量体、
たとえばCO−Hemo Safe 、ポリマー、たと
えばCO−Hemo Safe 及び複合体CO−
Hemo Safe の低温菌に適用することができ
る。次にこれらのCO Hemo Safeはすべて構造
の機能的及び構造的完全さを失うことなく容易に
オキシ−Hemo Safeに再転換することができ、
このオキシ−Hemo Safeは代用血液として輸血
に適している。 また、この製品の重合あるいは複合を起こす
か、起こすことなく酸化してシアン化物除去剤と
して有効でありその予防に使用し得るメトヘモグ
ロビン製品（即ち、メト−Hemo Safe）とする
ことができる。 即ち、本発明によると水性剤としたときに二量
体への解離及びＴ−型構造とＲ−型構造間の変化
に対して安定化した四量体ヘモグロビンユニツト
から本質的になるヘモグロビン製品が提供される
のであり、前記四量体ユニツトはサブユニツトの
グロビン鎖間の共有化学結合をもつており、安定
化が行なわれるのである。 本発明の製品の製造において、デオキシ−Hb
（Hb(T)）の均一な組成を安定化し凍結中又は60℃
迄の温度下で不安定するのを防ぐための新規試
剤、反応条件及び方法が開発されたものであり、
これにより最終製品の低温殺菌、凍結乾燥及び均
一な生理的酸素親和性が達成されたのである。 構造特異性安定剤及び架橋剤（CSSC）： 本発明による四量体ヘモグロビンユニツトの所
望の構造及び分子内安定化を達成する好ましい方
法は構造特異性安定剤及び架橋剤（CSSC）と呼
ばれるクラスの試剤１種以上との反応によるもの
である。最も普通なものはジアルデヒドとポリア
ルデヒドである。これらはグロビン鎖上の第一ア
ミノ基と反応してシツフ塩基結合を生成する。こ
のシツフ塩基結合はつづいて還元して第２アミン
結合とすることができる。四量体ヘモグロビンに
おいてはα−鎖及びβ−鎖上に第１アミン基が適
当に配置されており、これらはジアルデヒド及び
ポリアルデヒドと優先的にかつすべての意図及び
目的にとつては選択的に反応し、安定化のための
所望の共有結合を生成する。 本発明においてCSSCとして使用するジアルデ
ヒドの一例は適切な条件下で用いる場合のグルタ
ルアルデヒド（GA）である。ヘモグロビンと
GAとの反応は以前に報告されている。しかし、
これらの方法は四量体ユニツトの構造の実質的に
完全な安定化をもたらさず、また安定化四量体か
ら本質的に成る製品をもたらさない条件で行なわ
れている。すでに使用されているように、グルタ
ルアルデヒドは非特異性試剤であり安定化のため
に四量体のサブユニツト間に分子内結合を形成す
るよりも速やかに四量体間に共有的分子内結合を
起こし重合ヘモグロビンを形成する。その結果、
広い分子量分布を有する安定化四量体、未安定化
四量体及び安定化ポリマーとなり、各成分は異な
つた酸素親和性を有する。 本発明においては低濃度のヘモグロビン（即
ち、１−４ｇ／dl）及びGAとヘモグロビンとの
高いモル比（即ち、約６：１乃至約60：１）を用
いてヘモグロビンとGAとを反応せしめる。この
ような条件下では四量体の形のHbモノマーは少
くとも95％、通常少くとも98％が重合ヘモグロビ
ン中で安定化される。かくして、実質的に完全に
構造の安定化した重合製品が得られる。この安定
化したポリマーの形の製品は次に低温殺菌のため
に一酸化炭素と結合せしめることができる。 動物ヘモグロビンに基く代用血液を人間に用い
る場合、抗原性のためオリゴマー及びポリマーの
生成を防止すべきである。 モノマー形のHb〔Hb(T)〕をGAで固定する過程
で重合化する傾向が大きい。従つて本発明の好ま
しい態様においてはヘモグロビン（Hb）の安定
化においては異なつたCSSC試剤及び反応条件を
使用する。これらのCSSC化合物を使用すること
によりHbモノマーの安定化、ポリマーの生成を
伴わずに最小の二量体の形成（＜５％）を達成す
ることができ更にこれらのCSSC化合物は一般に
所望ならば最小の重合を伴つて、選択した構造の
他の高分子を安定化するのに使用することができ
る。このようなCSSC化合物は特有の構造の高分
子を安定化することにより生物高分子の活性及び
機能を保持することができる。しかし、CSSC化
合物を用いることにより更に反応条件を慎重に調
節して高分子をお互いに結合せしめ（重合）、あ
るいは別の高分子、たとえばイヌリンと複合せし
めることができる。具体的には結合試剤としての
このようなCSSC化合物とともにタイト(T)構造の
デオキシヘモグロビン（Hb(T)）を用い、反応条
件を調節して、安定化Hb(T)と別の高分子との結
合及び所望ならば安定化Hb(T)モノマーの重合を
行なうことができる。このようなCSSC化合物は
ヘモグロビン誘導体、たとえばPLP−Hbを反応
条件に応じて安定化及び重合し、更にこの誘導体
を別の高分子に結合するのに使用することもでき
る。 本発明で用いるCSSC化合物は一般にジアルデ
ヒド及びポリアルデヒドである。その一具体例は
HOC−COHの式を有するグリオキサールであ
る。他の例はベンゼンジアルデヒド（オルト、メ
タ及びパラ）である。ただし残りの芳香族基から
の免疫原反応の危険があるので芳香族架橋剤はあ
まり好ましくない。CSSC化合物として最も好ま
しいものは単糖類及びオリゴ糖類における酸化開
環反応によつて生成するアルデヒド系生成物であ
る。たとえば過沃素酸塩酸化を用いるこのような
反応は知られている。この反応によりオリゴ糖中
の各糖モノマーにつき２個のアルデヒド基を有す
る生成物が得られる。即ち、たとえば６個のアル
デヒド基が１つのラフイノース（Ｏ−ラフイノー
ス）又はマルトトリオース（Ｏ−マルトトリオー
ス）から生成する。同族列内において、グルコー
スのような二価アルデヒドと同程度のサブユニツ
ト安定化を達成するに必要なポリアルデヒド架橋
剤のモル当量数はCSSCの原子価に反比例する。
GAとは対照的にＯ−ラフイノースは分子内架橋
特異性を有し、したがつてHbに対して高いモル
比（20：１）のＯ−ラフイノースをポリマーを含
まないHb(T)の調整に用いることができる。この
発見はCSSCがHbモノマーを最少の分子内架橋
をもつて特定の構造に有効に安定化することを示
している。これにより重合反応を遅らせ反応の有
効な制御が可能となり実質的にポリマーを含まぬ
安定化Hb製品を容易に製造することができる。 有用なCSSC化合物の具体例としてグルコー
ス、イヌリン、マルトース、マルトトリオース、
マルトテトロース、マルトペントース、マルトヘ
キソース及びマルトヘプトースのような糖類の沃
素酸塩酸化糖の同族列がある。一般に糖類の開環
酸化によつて誘導されたCSSC化合物は下記の式
に対応する。
【式】又は
上記式中Ｒ、R1、R2、R3、R4及びR5はそれぞ
れ水素、ヒドロキシル、メトキシ及びヒドロキシ
メチルから選ばれ、ｍは０又は１であり、Ｑは36
以下の糖成分を有するジー又はオリゴ糖の酸化開
環から得られる化学基である。 出発化合物がラフイノース（三糖）の場合
CSSC酸化生成物は下記の式を有する。 出発化合物がイヌリン（多糖類）の場合、
CSSC酸化生成物は下記の式を有する。 このように本発明で使用する架橋剤は従来技術
においてHbをその四量体の形に安定化及び架橋
するのに従来用いられているDPGアナローグと
全く相違する。これらはホスフエートやカルボキ
シレートのような負に帯電した基をもたずHbの
DPG部位と特異的に反応することは知られてい
ない。従つて、これらは人間及び家畜動物由来の
Hbの構造安定化を行ない構造中に各Hbユニツト
を保持せしめることができるのであり、この構造
中でHbユニツトが架橋剤と出合い反応するので
ある。 ヘモグロビンに対するアルデヒドの相対量は少
くとも12：１、好ましくは少くとも60：１のヘモ
グロビンに対するアルデヒド基のモル比をもたら
すように調整するのが好ましい。即ち、ポリアル
デヒドを用いる場合はジアルデヒドを用いる場合
よりも同量のヘモグロビンに対し小量のポリアル
デヒドが必要である。モル比の計算はヘモグロビ
ンが約50の第１アミン基を有するものと仮定して
行なう。本発明におけるグロビン鎖結合反応は部
位特異的である必要がないので、安定差製品を高
収率（少くとも95％）で得るために過剰モル比の
アルデヒド（たとえば、Ｏ−ラフイノースの場合
５−30のモル比を使用することができ、好ましく
は20：１である）を使用することができる。部位
特異的反応を必要とする従来技術では実質的に化
学量論量の試剤を使用しなければならず、その結
果収率が低下する。反応は４℃−37℃、好ましく
は周囲温度で水溶液中で行なうのが好ましい。反
応混合物のPHは適当な緩衝剤により6.7乃至9.5、
好ましくは8.0に調節すべきである。 ポリHb(T)を製造するのに架橋剤としてGAを
用いる場合は、反応を適切に制御するため約５−
７ｇ／dlより低い溶液濃度のHbを用いるべきで
ある。しかしその他のCSSC物質の場合は反応を
容易に制御することができるので、広い範囲の
Hb濃度、たとえば１−20ｇ／dl、好ましくは３
−４ｇ／dlを用いることができる。 赤血球から得られるような基質（stroma）を
含まないヘモグロビンは約３−４ｇ／dlのヘモグ
ロビン濃度を有する。このヘモグロビン溶液は稀
釈や濃縮をせずに用いるのが便利である。好まし
い濃度は選択したアルデヒドによつて決まる。か
くして、二価GAに対する新規CSSCの利点はポ
リマーを含まぬ人間Hb誘導体及びポリマーを含
まぬ動物Hb誘導体の製造に等しく適用できるが、
Ｏ−ラフイノースのような新規CSSCを用いてポ
リHbの形成を防止することにより動物Hb誘導
Hemo Safe製品を人間に用いることができる。 安定化ヘモグロビン： 本発明の構造安定化が架橋されたデオキシ−
Hb（XL−Hb(T)）の製造において適当な時期に還
元剤又は急冷剤を添加することにより二量体、三
量体、四量体及び高ポリマーを生成する分子内架
橋が始まる前にデオキシ−Hbの分子内架橋反応
を終了せしめることができる。第一アミン基と
CSSCのアルデヒド基との反応によりシツフ塩基
結合が生成する。水素化ホウ素ナトリウム又は水
素化ホウ素カリウム等を添加するとシツフ塩基結
合が第二アミン結合に還元され、また過剰のアル
デヒド基が第一アルコールに還元され、かくして
更に架橋が進むのが止まる。適切な還元時間は反
応混合物のサンプルを高圧液体クロマトグラフイ
（HPLC）分析することにより得ることができる。 構造安定化四量体Hb製品は標準的方法により
回収及び精製することかできる。即ち、製品の膜
濾過により洗浄及び濃縮し、血管系中の半減期が
比較的短かくてもよい緊急の場合の基準に基き代
用血液として用いるために生理的塩類溶液として
形成してもよい。あるいは、本発明による他の製
品を製造するための出発物質として用いてもよ
い。 重合安定化ヘモグロビン 上記の他の製品の一つは重合したHb（Hemo
Safe ）であり、構造安定化され、解離に対
しても安定化された四量体ヘモグロビン（Hemo
Safe ）が分子内結合し好ましくはヘモグロ
ビン濃度14ｇ／dlにおいて等膨張圧を与える分子
量を有する重合Hbが形成されている。重合は構
造の安定化を与えるのに用いるのと同じでもよく
異なつていてもよいジアルデヒド又はポリアルデ
ヒドを使用することにより適切に達成される。従
来技術、たとえばグルタルアルデヒドを用いるこ
とにより製造されたポリ（Hb）製品はHemo
Safe から製造されたものではないから本発
明の製品の完全な構造安定性をもつていなかつ
た。 本発明のポリマー製品は分子量（ポリマー中の
ユニツトの数）の異なるポリマーの混合物を含ん
でいてもよい。しかし、すべてのポリマーはＴ−
構造で安定化されている。すべてのポリマーは同
一あるいは実質的に同一の酸素親和性を有するも
のである。従つて本発明の重合化製品は従来技術
の均一な酸素親和性を有し、たやすく再現し得る
組成のものよりもすぐれている。 これらポリマーを製造するための適当な反応条
件は室温（約37℃を越えてはいけない）で水溶液
である。ヘモグロビンに対するアルデヒドの比は
Hb1モルにつきアルデヒド基のモルに基き２乃至
100が適当である。反応溶液はPH6.7乃至9.5、好
ましくは8.0に緩衝すべきである。ホウ水素化ナ
トリウム又はシアノホウ水素化ナトリウムのよう
な還元剤を添加して残りのアルデヒド基を還元
し、シツフ塩基を安定な共有炭素−窒素結合に変
換することにより反応を完了することができる。 本発明の特に好ましいポリマー組成物は構成ポ
リマーの20−25％が５以上の四量体ヘモグロビン
モノマーユニツトを有し、50−60％が２−４のヘ
モグロビンモノマーユニツトを有し、20−25％が
単一ヘモグロビンユニツト（分子量64キロダルト
ン）を有し、１−２％が不完全に安定化したヘモ
グロビンである分子量分布を有するものである。
このような組成物は14ｇ／dlで同膨張性であり、
血圧の問題を起こすことなく代用血液として血液
と等容量で用いることができる。 安定化ヘモグロビン複合体 このような製品のもう一つは「複合Hemo
Safe 」であり、構造安定化及び解離安定化
したヘモグロビン（Hemo Safe ）が共有結
合により生物高分子と複合し望ましくは高分子量
の製品が形成されたものである。ヘモグロビンと
生物ポリマー（イヌリン、デキストラン、ヒドロ
キシエチル澱粉等）との複合体は従来公知であ
る。しかし、本発明においては従来技術と同じ生
物ポリマー及び同様なヘモグロビンへの結合方法
を用いることができるのであるが、ヘモグロビン
は複合型において構造安定性、好ましくはＴ構造
を保持しており、前述の如き欠点を伴う。 本発明において複合体を製造するためのポリマ
ーとして特に好ましいものはイヌリンである。こ
れは約5000の分子量を有する多糖類であり診断試
薬として用いられる。 低温殺菌製品 従来の安定化、重合及び複合方法では高分子が
加熱、乾燥又は凍結されたときヘムの酸化又は高
分子の変性が防止されていない。本発明によれば
ヘム含有高分子が前述のように先づ安定化され、
次に任意に重合又は複合されたとき、たとえば酸
素置換剤又は除去剤を用いることにより、あるい
は好ましくは、たとえば変性を起こすことなく低
温殺菌及び凍結乾燥を行なうことができるカーボ
ンモノオキシ−ヘム誘導体を形成する方法により
一酸化炭素（CO）又は酸化窒素と反応せしめて
得られるようなヘム保護錯体を形成することによ
りヘム含有高分子の熱酸化を防止することができ
る。 具体的にはGA又はCSSC物質を用いて誘導し
た新規安定化ヘモグロビンにCOを添加すること
によりここではCO−Hemo Safeとも呼ぶ新規製
品が得られる。この目的のためには、ヘモグロビ
ン製品を単離せずに反応混合物にCOを添加する
ことができる。すでに安定化したヘモグロビンに
おいてはCOによるヘムの保護とアロステリツク
構造変化の防止とが相まつて熱及び凍結乾燥条件
下でのCO−Hemo Safeの酸化及び変性を防止す
る。Hemo Safe 、Hemo Safe 及び
Hemosafe −イヌリン又はその他のヘモグロ
ビンに基く代用血液にカーボンモノオキレーシヨ
ン（carbon monoxylation）及び低温殺菌を適
用することは従来知られていない。 適当な保護剤を添加しないでヘモグロビン誘導
体を低温殺菌（たとえば60℃における10時間の湿
熱）及び凍結乾燥すると沈澱及び変性をもたら
す。本発明の独特の方法で安定化したヘモグロビ
ンのヘムをCOで保護することによりCO−Hemo
Safeの製品の加熱及び凍結乾燥を問題なく達成
することができる。この低温殺菌によりウイルス
に感染していない可溶性非変性CO−Hemo Safe
が得られる。また、前記凍結乾燥により乾燥CO
−Hemo Safe製品が得られる。液状及び乾燥CO
−Hemo Safe製品は両方とも通常の温度におい
て長期間の貯蔵が可能である（たとえば56℃で60
日間）。CO−Hemo Safeは安定であるが酸素を
運搬しない。従つて輸血に使用するには酸素の存
在下で光により処理することによりCO−Hemo
Safe溶液をオキシ−Hemo Safe溶液に転換せし
める。かくして、本発明のもう一つの特徴は輸血
前にCO−Hemo Safeをオキシ−Hemo Safeに
光により変換せしめることである。 本発明の方法の初期段階で使用するGA濃度
（即ち、５ｍＭ）は従来技術においてHTLV−
／LAV又はHIV−として知られているウイ
ルスの95％を失活せしめるのに必要であると報告
されている１ｍＭよりも高濃度である。しかし、
ウイルス感染に対する安全性の保証は低温殺菌、
即ち60℃に10時間加熱（これはアルブミンの如き
プラズマー誘導医薬品に対して認められている標
準処理である）することにより達成することがで
きる。もし、たとえば前述のようにして誘導した
安定化オキシ−Hb(T)を60℃に10時間さらしたら、
褐色の沈澱物（即ち、変性メト−Hb(T)）が生成
し、もはや使用できなくなる。しかし、安定化
Hb(T)のそのカーボンモノオキシ誘導体への変換
によりCO−Hemo Safe (T)が生成し、可視ス
ペクトル、酸素親和性（即ち、P50）又はHPLC
分析で示される組成のような生理化学的性質な実
質的に変化をもたらすことなく溶液中25℃又は56
℃で60日以内の保存及び低温殺菌が可能となる。
更に、CO−Hemo Safe (T)は上で低温殺菌に
ついて述べたような生理化学的性質の実質的な変
化をもたらすことなく凍結乾燥し25℃又は56℃で
60日間の保存が可能である。 輸注可能な製品 純粋のCO−HemoSafeは酸素を結合又は運搬
しないから、その調製、低温殺菌及び凍結乾燥操
作を通じて安定であるにもかかわらず酸素の運搬
及び輸注には不適である。無菌条件下でCOを除
去することが代用血液として使用するための必要
条件である。従つて、本発明はCO−Hemo Safe
を容易に酸素化誘導体オキシ−ヘモグロビンに光
変換できることを教えるものである。このために
は、酸素を溶液に供給し、次にこの溶液に可視光
線にさらされている透明な管の中に通せばよい。
CO−Hemosafe及びオキシ−Hemo Safeの光吸
収スペクトルにより、これら２種の特性決定及び
定量を簡単に行なうことができる。現在入手可能
なポリPLP−Hbのような代用血液に比べHemo
Safeは生理学的及び均一に酸素親和性という利
点を有する。そのプレカーサーであるCO−
Hemo Safeは低温殺菌、凍結乾燥、光転換及び
60℃以下における保存の条件下において安定性を
示す。即ち、本発明はウイルス感染の無い効果の
大なる代用血液を製造する方法を教示するもので
ある。 また、本発明により、カーボンモノオキシレー
シヨンの方法によつて与えられた安定性は従来の
すべてのHbに基く代用血液に適用できることが
発見された。たとえば、本発明によればポリ
PLP−Hb（ポリCO−PLP−Hb）、ATP−Hb
（CO−ATP−Hb）及びポリATP−Hb（ポリCO
−ATP−Hb）のカルボモノオキシ誘導体は等し
く安定であり、低温殺菌可能であり、そのオキシ
誘導体に光変換可能であることが明らかになつ
た。即ち、本発明はヘモグロビンに基く酸素運搬
蘇生液から病原ウイルスを消去し、かつその保存
性を向上せしめるための一般的に必要な処理とし
て適用し得る方法を包含する。従つて、デキスト
ラン−Hb、ヒドロキシエチル澱粉Hb、ポリエチ
レングリコール−Hb及びジアスピリン架橋Hbの
ようなすべての現存するヘモグロビンに基づく代
用血液に本願に記載と同じ方法によりウイルス感
染の無い状態とすることができる。 本発明のHemo Safeの好ましい実用的方法を
下記にまとめる。 (i) プールした全血をNaCl等張液で稀釈し膜型
濾過系に入れる。 (ii) 接線方向流膜濾過により血液の細胞成分から
プラズマを分離する。 (iii) 赤血球を等張生理的食塩水中で洗浄する。 (iv) 赤血球を低張リン酸緩衝液で溶解し、細胞片
及びその他の特殊な物質を接線流濾過により可
溶性ヘモグロビンから分離する。 (v) 真空又はガス交換器及び還元剤によりオキシ
−Hbをデオキシ−Hbに変換する。 (vi) 構造特異性安定化架橋剤（CSSC）を添加す
ることによりデオキシ−Hbをモノマー又はポ
リマー組成物あるいは複合体の所望の形に安定
化させる。 (vii) デオキシ−Hbを一酸化炭素で物理的に安定
化しCO−Hemo Safeを得る。 (viii) CO−Hemo Safeを洗浄及び濃縮するか、あ
るいは適当な生理的食塩水を添加することによ
り電解質バランスを再安定化する。 (ix) CO−Hemo Safeの低温殺菌を行なう。 (x) 低温殺菌したCO−Hemo Safeを酸素の存在
下オキシ−Hemo Safeに光変換する。 (xi) オキシ−Hemosafeを無菌濾過し輸血用に
容器に詰める。 本発明の教示のようにしてオキシ−Hemo
Safeが得られると、これを解毒薬として及び化
学防御における如くシアン化物中毒を予想して予
防的輸血剤として用いるためにメト−Hemo
Safe誘導体に変換することができる。即ち、本
発明によれば、オキシ−Hemo Safeの調製後、
公知の方法を用いてこれを酸化してHemo Safe
とし、これは瞬間的に効果を表わしかつ長期間有
効なシアン化物除去剤として輸注することができ
ることが教示される。メト−Hemo Safeを静脈
中に使用することにより経口的に亜硝酸塩をとり
メト−Hbを形成することを利用する場合の時間
的遅延が回避される。亜硝酸塩も必ず存在する
RBCオキシヘモグロビンからメト−Hbを補充す
るのであり、メト−Hemo Safeを使用すること
により、存在する酸素の運搬能力の低下が避けら
れる。従つて、従来法よりもすぐれたシアン化物
中毒の治療法を提供するのである。 オキシ−Hemo Safeの輸注は血液をドーピン
グする技術の代りに用いることができる。従来技
術は赤血球を人に投与してその酸素運搬能力を高
めることができることを教示しているけれども、
赤血球のもたらす粘度のためにその能力の向上は
10−15％が限度である。しかし、公知のプラズマ
フエレシス技術と組合せてオキシ−Hemo Safe
を用いることによりプラズマをオキシ−Hemo
Safeで置換することができ、理論的に酸素運搬
能を50％増大せしめることができ、しかもこの場
合血液のヘマトクリツトあるいは流動特性の変化
をもたらさない。 本発明又はその範囲は製品の構造又はその製造
方法の機構の特定の理論に限定されるものではな
いが、製品の構造安定性及び解離安定性はCSSC
により四量体ヘモグロビンにおけるサブユニツト
内共有結合から得られるものであると考えられ
る。この結合は二量体への解離を防止するのに充
分安定であり、構造的変化を防止するに充分堅い
ものである。構造について説明がどうであれ
Hemo Safeのその構造安定性は独特のものであ
る。 また、本発明の範囲はヘモグロビンの処理及び
ヘモグロビン製品に限定されるものではない。溶
液中であれあるいは生物学的膜の中であれCSSC
物質によるこのようなタンパク質の処理により、
タンパク質とCSSCとが存在する構造が安定化さ
れるであろう。理論的には前記処理により安定化
構造と関連のある生物学的活性も安定化され分子
が低温殺菌に対して安定化される。即ち、その多
くが特定の構造においてのみ有用である生物学的
に活性なペプチドを包含する生物高分子に広く広
用することができる。 本発明を更に実施例によつて説明する。 実施例 １ 人間及び動物のストローマ不含ヘモグロビンの
調製。 カナダ赤十字から入手した古い血液又は容器入
り赤血球から人間ストローマ不含ヘモグロビンを
調製した。先づ、その全血を30分間3000rpmで遠
心分離にかけた。次にピペツトからの吸引により
プラズマ及び淡黄色の被膜を分離し廃棄した。沈
降した赤血球をその３倍の容積の氷冷した通常の
食塩水中を懸濁せしめることにより３回洗浄し
た。各々の洗浄後に赤血球を遠心分離により再沈
降せしめ上澄液を分離して廃棄した。 次に洗浄した赤血球を４容の５ｍＭリン酸塩緩
衝液（PH7.6）で溶解して完全な細胞壁を破壊し
てヘモグロビンを遊離せしめた。ストローマ及び
膜フラグメントを除去するためにフルオロカーボ
ンポリマーフイルター（HVLP、多孔度0.5μｍ）
を有するPellicon Cassette System（ミリポア
社）で濾過し、次にポリスルホンフイルター
（100000分子量カツトオフ）で濾過した。濾液中
のヘモグロビンを先づ14−20ｇ／dlに濃縮し、次
に10容過剰のPBS緩衝液（PH7.4）で洗浄し、5.0
平方フイートのメンプレンカセツト（PTシリー
ズ、30000分子量カツトオフ）を備えたPellicon
Cassette Systemで洗浄し、0.22μｍミリポアフ
イルターで濾過することにより滅菌し、使用する
迄４℃で貯蔵した。 動物ヘモグロビンの調製についてはPBS緩衝
液（PH7.4）の代りに20ｍＭホウ酸塩緩衝液（PH
9.5）を用いたヘモグロビンの可溶性を高めたラ
ツトヘモグロビンである以外は人間ヘモグロビン
の調製と同様に行なつた。 実施例 ２ ヘモグロビン用のCSSCとしての過沃素酸塩酸
化ラフイノース及びその他の糖類の調製。 それぞれ200mgのグルコース、スクロース、ラ
フイノース、マルトース、マルトトリオース、マ
ルトペントース、マルトヘキソース、マルトヘプ
トース及びそ他の糖を６mlの蒸留H2Oに溶かし
たものを室温において糖に対して一定のモル比の
固体の過沃素酸ナトリウムで処理した。（糖に対
する過沃素酸ナトリウムのモル比はピラノシドに
ついて2.2、フラノサイドについて1.1である）。
１時間後、反応混合物を氷水浴中で冷却し、激し
く攪拌しつつ沈澱沃素が再溶解する迄亜硫酸水素
ナトリウムを加えて無色の溶液を得た。次に6N
NaOHを添加して溶液のPHを急速に8.0±0.1に調
製した。得られた酸化糖溶液を更に稀釈して最終
濃度20mg／mlとしミリポア0.45μｍ型GS膜フイル
ターで濾過し使用する迄４℃で保存した。 実施例 ３ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造的に安定しかつ架橋した人間Hemo Safe
(T)の調製。 分子内架橋デオキシヘモグロビン（XL−Hb
(T)）の調製：電磁攪拌下にあるPH8.0の0.1Mリン
酸塩緩衝液中のストローマ不含オキシヘモグロビ
ン（Hb(R)）１％ｗ／ｖ溶液350mlを室温で約４時
間真空中でデオキシヘモグロビン（Hb(T)）に転
換した。脱ガスした緩衝液0.3ml中に溶解した0.1
ミリモルの亜ジチオン酸ナトリウムを前記ヘモグ
ロビン溶液に添加し５時間反応を行なつた。架橋
剤としてのＯ−ラフイノース1.08ミリモルをPH
8.0の予め脱ガスした緩衝液20mlを溶解したもの
を激しく攪拌しつつ真空中で添加し溶液を室温で
４時間攪拌した。反応混合物を氷水浴中で冷却し
脱ガスした１ｍＭ NaOH中の15.0ミリモルのホ
ウ水素化ナトリウムを不活性ガスの正圧下添加し
た。反応を45分間行なつた。 第１図は5μｇ／100mlの製品（実線）及び対照
の人間SFH（ダツシユ線）から得られたHPLCプ
ロフイルである。Ｂ−グロピン半分（ピークａ）
及び（αβ）2安定化人間Hb(T)（ピークｂ）につい
ての分子量検量線は印をつけた通りである。使用
した緩衝剤は50ｍＭリン酸塩及び150ｍＭ
NaCl、PH7.0であつた。クロマトグラムはGP、
250グラジエントプログラマー、P500ポンプ、モ
デル482チヤートレコーダー及び405nｍフイルタ
ー付きシングルパスUVモニターを備えた
Pharmacia FPLC系上で得た。 プロフイルは95％より多量のヘモグロビンが安
定化及び架橋を受け５％以下のXL−Hb(T)が半分
子に解離したことを示している。これと同一の実
験条件下でヘモグロビンは完全に半分子に解離す
る。 XL−Hb(T)の一酸化炭素誘導対（COXL−Hb
(T)）の調製及び低温殺菌：ホウ水素化ナトリウム
による還元後、COを直接XL−Hb(T)反応混合物
中に泡立てた。膜濾過による洗浄及び濃縮後、
100％CO下COXL Hb(T)を10時間60℃に加熱する
ことにより大気圧下で低温殺菌し、CO−Hemo
Safe を得た。周囲温度における長期保存の
ためには、このCO−Hemo Safe を凍結乾燥
して乾燥粉末とし、必要なときに緩衝液で再生す
ることができる。 CO−Hemo Safe (T)のオキシ−Hemo
Safe (T)への光転換：回転蒸発器上に取り付
けた500ml丸底フラスコ中に15mlのCO−Hemo
Safe (T)を移しＣ Ｇ Ｅ Brooderランプ
（C250、Ｒ40/1、内側艶消し軟質ガラス）の下で
０℃の氷水浴中で連続的に回転せしめた。未結合
COを除去するためこのフラスコをアスピレータ
ー又は真空ポンプで排気した。２分後、空気又は
100％酸素を導入した。このサンプルは組成を577
乃至560mmについて分光光度分析して吸光度比1.8
となる迄前記のサイクルを繰り返した。その結
果、COの除去は完全となつたとみなした。
（Enzymology vol.76、Hemoglobin、pp.60、
164に記載の方法）。得られた最終生成物は第１図
に示す不変のゲル浸透クロマトグラフイー組成を
有する。 第３図は本実施例及び他の実施例の製品（リン
ガー緩衝液中、PH7.4、22℃）の相対吸収スペク
トルを示す。実線はXL−Hb(T)、即ちカーボンモ
ノオキシレーシヨン前のものであり、点線はオキ
シ−Hemo Safe最終製品のものである。第３図
のこれらの曲線は最終製品が実質的に不変の物理
−化学的性質を有していることを示している。 第２図は本実施例においてＯ−ラフイノースに
よつて架橋安定化したHemo Safe(1)の酸素解離
曲線（ダツシユ線）及びオキシ−ヘモグロビン又
はHb(R)の酸素解離曲線（実線）である。これら
はヘモグロビン濃度3.5ｇ／dlでPH7.4のリンガー
リン酸塩緩衝液中37℃で測定したものである。こ
れらはこれらの製品の典型的な曲線である。50％
飽和（P50）における酸素の分圧を曲線から直接
読みとる。 第２図によると本実施例のHemo Safe(1)製品
はPBS緩衝液（PH7.4）中37℃で27mmHgのP50
（P50は50％のヘモグロビンが酸素ヘモグロビンの
状態にある酸素の分圧のことである）を有する双
曲線形酸素解離曲線を示す。これはヒル係数約１
−1.5を有する。 第４図はヘモグロビンに基づく代用血液の典型
的なプラズマ半減期を示す。ダツシユ線は本実施
例の最終オキシ−Hemo Safe １(T)の半減期であ
る。測定は30％血液過剰モデル（hypervolemic
model）のラツトで行なつた。製品は約４−５時
間の半減期を有し、一方ヘモグロビンの半減期
（点線）は約１−1.5時間であつた。 実施例 ４ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）で構造
安定化し架橋した人間Hemo Safe (R)の調製。 反応をオキシ状態で亜ジチオン酸ナトリウムの
不存在下で行なつた以外は実施例３のHemo
Safe (T)と同様な方法を用いた。 最終製品はPH7.4のPBS緩衝液中、37℃で測定
してP502−３mmHgを有する双曲線形の酸素解離
曲線を示し（第２図、実線）、そのゲル浸透クロ
マトグラフイ組成及び可視スペクトルはHemo
Safe (T)のものと区別できないものである。 実施例 ５ グリオキサールによつて構造安定化され架橋さ
れた人間Hemo Safe (T)の調製： グリオキサールにより分子内架橋したストロー
マ不含デオキシヘモグロビンの調製：電磁攪拌
下、0.1M重炭酸ナトリウム中の人間ストローマ
不含ヘモグロビン2.9ｇ、４％ｗ／ｖを真空中で
約２時間デオキシヘモグロビンに転換した。架橋
剤としてのグリオキサール2.58ミリモル（7.5ml
の脱ガス0.1M重炭酸ナトリウム中）を加え、溶
液を室温で２時間攪拌した。反応混合物を氷水浴
中で冷却し、脱ガス１ｍＭ NaOH3ml中の６ミ
リモルのホウ水素化ナトリウムを不活性ガスの正
圧下添加した。反応を45分間行なつた。HPLCゲ
ル浸透プロフイルは第１図のものと同様であり、
このことはヘモグロビンの90％以上が分子内安定
化されていることを示す。 グリオキサール安定化CO−Hemo Safe (T)
の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光による逆転換の方法は
いずれも実施例３に記載のものと同様である。最
終製品は30％過剰血液置換したラツトにおいて測
定した約3.5時間の半減期を有していた。 実施例 ６ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化、架橋したウシHemo Safe (T)
の調製： PH8.0の0.1Mリン酸緩衝液中のウシストローマ
不含オキシヘモグロビン（１％ｗ／ｖ）溶液90ml
を電磁攪拌下真空中で室温で約２時間デオキシヘ
モグロビンに転換した。0.3mlの脱ガスした緩衝
液中に溶解した亜ジチオン酸ナトリウム400μモ
ルを上記ヘモグロビン溶液に添加し５分間反応を
行なつた。PH8.0の予め脱ガスした緩衝液６ml中
の架橋剤Ｏ−ラフイノース276μモルを真空下添
加し、この溶液を３時間室温で攪拌した。反応混
合物を氷水浴中で冷却し１ｍＭ NaOH（脱ガ
ス）２ml中のホウ水素化ナトリウム3.5ミリモル
を不活性ガス正圧で添加した。還元を45分間行な
つた。HPLCゲル浸透クロマトグラフプロフイル
は90％よりも多いウシヘモグロビンが分子内安定
化されたことを示す。架橋ウシヘモグロビンのク
ロマトグラムは第１図に示したものと同様であつ
た。 Ｏ−ラフイノース安定化ウシCO−Hemo Safe
(T)の調製、低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光転換は実施例３と同様
にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は不変のゲル
浸透クロマトグラフイ組成及び物理−化学的性質
を有する。この製品はPH7.2のPBS緩衝液中で37
℃で測定してP5034mmHgを有する双曲線形酸素解
離曲線、ヒル係数約1.5及びラツトについて30％
過剰血液の輸血において測定したプラズマ半減期
約４時間を有していた。 実施例 ７ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化され架橋された羊のHemo Safe
(T)の調製。 分子内架橋した羊のデオキシヘモグロビンの調
製：PH8.0の0.1Mリン酸塩緩衝液中の羊のストロ
ーマ不含オキシヘモグロビン（１％ｗ／ｖ）の溶
液100mlを電磁攪拌下、真空中にて室温で約２時
間デオキシヘモグロビンに転換した。100μの
脱ガスした緩衝液中の50μモルの亜ジチオン酸ナ
トリウムを前記ヘモグロビン溶液に添加した。５
分後、PH8.0の予め脱ガスした緩衝液12.5ml中の
架橋剤Ｏ−ラフイノース616μモルを真空中で攪
拌しつつ添加した。４℃で16時間架橋を行なつ
た。反応混合物を氷水浴中で冷却し、脱ガスした
１ｍＭ NaOH2.5ml中のホウ水素化ナトリウム
4.4ミリモルを正の不活性ガス圧下で添加した。
還元を45分間続けた。HPLCゲル浸透クロマトグ
ラフプロフイルは羊のヘモグロビン半分子の95％
より多量が分子内安定化されており、第１図に示
すものと同様であることを示した。 Ｏ−ラフイノース安定化羊CO−Hemo Safe
(T)の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ
−Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施
例３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は不変ゲル浸
透クロマトグラフイ組成及び物理−化学的性質を
有していた。この製品はPH7.4のPBS緩衝液中37
℃で測定してP5038mmHgを有していた。 実施例 ８ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化し架橋したラツトのHemo Safe
(T)の調製。 分子内架橋したラツトのデオキシヘモグロビン
の調製：PH9.5の20ｍＭホウ酸塩緩衝液中にラツ
トのストローマ不含オキシヘモグロビン（２％
ｗ／ｖ）を溶解した溶液18mlを電磁攪拌下、真空
中、室温で約１時間デオキシヘモグロビンに転換
した。0.1mlの脱ガス緩衝液中に溶解した50μモル
の亜ジチオン酸ナトリウムを上記ヘモグロビン溶
液に添加し５分間反応せしめた。PH8.0の予め脱
ガスした緩衝液３mlに溶解した架橋剤Ｏ−ラフイ
ノース110μモルを攪拌下真空中で添加した。４
℃で16時間架橋を行なつた。反応混合物を氷水浴
中で冷却し１ｍＭ NaOH1ml中に溶かした1.2ミ
リモルのホウ水素化ナトリウムを正の不活性ガス
圧下添加した。還元を45分間続けた。HPLCゲル
浸透クロマトグラフプロフイルはラツトのヘモグ
ロビン半分子の90％よりも多量が第１図に示した
ものと同様に分子内安定化されたことを示してい
る。 Ｏ−ラフイノース安定化ラツトCO−Hemo
Safe (T)の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及
びオキシ−Hemo Safe (T)への光による逆転
換は実施例３と同様にして行なつた。 得られた最終製品は不変ゲル浸透クロマトグラ
フイ組成及び物理的−化学的性質を有していた。
この製品はPH7.4のPBT緩衝液中37℃で測定した
P5024mmHg及びヒル係数約1.0を有する。 実施例 ９ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化し、重合した人間Hemo Safe
の調製。 分子内安定化及び分子内架橋した人間デオキシ
ヘモグロビンの調製：PH8.0の0.1Mリン酸塩緩衝
液中に溶解した人間オキシヘモグロビン（４％
ｗ／ｖ）の溶液77mlを電磁攪拌下、真空中、室温
で約４時間デオキシヘモグロビンに転換した。
0.3mlの脱ガス緩衝液中に溶解した0.10ミリモル
の亜ジチオン酸ナトリウムを上記ヘモグロビン溶
液に添加し５分間反応せしめた。20mlの予め脱ガ
スした緩衝液20ml中の架橋剤Ｏ−ラフイノース
0.95ミリモルを真空下添加し、反応を６時間続け
た。反応混合物を氷浴中で冷却し、脱ガスした１
ｍＭ NaOH4ml中のホウ水素化ナトリウム9.5ミ
リモルを正の不活性ガス圧下添加した。還元を45
分間続けた。第５図においてHPLCゲル浸透クロ
マトグラフプロフイルは98％よりも多いヘモグロ
ビンが安定化及び架橋され、20−25％が安定化さ
れたモノマーであり、55−５％二量体、三量体及
び四量体の組合せであり、20−25％が五量体以上
のポリマーであることを示している。 このクロマトグラフプロフイルは緩衝液として
50ｍＭホスフエート及び150ｍＭ NaCl（PH７）
及び第１図で用いた装置を用いて得られたもので
ある。ポリHb(T)は流速0.4ml／分でSuperose−12
充填HR10/30カラム上でモノマー（ピークａ）、
二量体、三量体及び四量体（ピークｂ）及び五量
体以上のポリマー（ピークｃ）に解離した。重合
化した製品のこのような組成は14ｇ／dlの濃度で
同膨張性であることがわかつた。 Ｏ−ラフイノース安定化CO−Hemo Safe
(T)の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施例
３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は低温殺菌の
前後において不変のゲル浸透クロマトグラフイー
組成及び物理−化学的性質を有し、PH7.2のPBS
緩衝液中37℃で測定して32mmHgの均一なP50及び
ヒル係数1.6の双曲線形酸素解離曲線を有する。
Hemo Safe (T)の単離精製フラクシヨン、即
ちモノマー、二量体、三量体、四量体、五量体以
上（第５図参照）は区別できないP50、ヒル係数
及び30％過剰血液置換をしたラツトについて測定
して７−８時間の半減期を有していた。 実施例 10 開環スクロース（Ｏ−スクロース）によつて構
造安定化し重合した人間Hemo Safe の調製。 Ｏ−スクロースによる分子内安定化及び分子内
架橋した人間デオキシヘモグロビンの調製：PH
8.0の0.1Mリン酸塩緩衝液中にストローマ不含人
間オキシヘモグロビン（13％ｗ／ｖ）を溶解した
溶液10mlを電磁攪拌下、真空中、約２時間デオキ
シヘモグロビンに転換した。脱ガスした緩衝液
0.2mlに溶解した亜ジチオン酸ナトリウム40μモル
を上記ヘモグロビン溶液に添加した。５分後、予
め脱ガスした緩衝液３ml中の架橋剤Ｏ−スクロー
ス200μモルを真空下添加し反応を６時間行なつ
た。反応混合物を氷水浴中で冷却し、脱ガスした
１ｍＭ NaOH1ml中のホウ水素化ナトリウム2.0
ミリモルを正の不活性ガス圧下添加した。45分間
還元を行なつた。HPLCゲル浸透クロマトグラフ
プロフイルは98％よりも多いヘモグロビンが安定
化及び架橋し、製品の組成は実施例９（第５図）
のものと同様であることを示している。 Ｏ−スクロース安定化CO−Hemo Safe (T)
の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施例
３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は低温殺菌の
前後不変のゲル浸透クロマトグラフイー組成及び
物理−化学的性質を有していた。この製品は
PBS緩衝液（PH7.2）中、37℃で測定して24mmHg
のP50、ヒル係数1.3及び30％過剰血液置換で測定
してラツト中で半減期約７−８時間を有してい
た。 実施例 11 グルタルアルデヒドによつて安定化及び重合し
た人間Hemo Safe (T)の調製。 グルタルアルデヒドによる分子内安定化及び分
子内重合した人間デオキシヘモグロビンの調製：
PH8.0の0.01Mリン酸塩緩衝液中にストローマ不
含人間オキシヘモグロビン（４％ｗ／ｖ）を溶解
した溶液78mlを電磁攪拌下、真空中、室温で約４
時間デオキシヘモグロビンに転換した。脱ガスし
た緩衝液0.3ml中に溶解した亜ジチオン酸ナトリ
ウム0.1ミリモルを上記ヘモグロビン溶液に添加
し５分間反応を行なつた。予め脱ガスした緩衝液
2.5ml中の架橋剤グルタルアルデヒド480μモルを
真空下添加し、６時間反応を行なつた。反応混合
物を氷水浴中で冷却し、脱ガスした１ｍＭ
NaOH4ml中のホウ水素化ナトリウム４ミリモル
を正の不活性ガス圧下添加した。45分間還元を行
なつた。HPLCゲル浸透クロマトグラフプロフイ
ルは98％よりも多量の人間ヘモグロビンが安定化
及び架橋され製品の組成は実施例９のものと同様
であることを示している。 グルタルアルデヒド安定化CO−Hemo Safe
(T)の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ
−Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施
例３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は不変のゲル
浸透クロマトグラフイー組成及び物理的性質を有
していた。この製品はPH7.4のPBS緩衝液中37℃
で測定して〜30mmHgのP50、ヒル係数1.5及びラ
ツト中で30％過剰血液置換で測定した半減期７−
８時間を有していた。 実施例 12 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）により
構造安定化及び重合したウシのHemo Safe
(T)の調製。 Ｏ−ラフイノースによる分子内安定化及び分子
内架橋したウシのデオキシヘモグロビンの調製：
PH8.0の0.1Mリン酸塩緩衝液中にウシのストロー
マ不含オキシヘモグロビン（６％ｗ／ｖ）を溶解
した溶液40mlを電磁攪拌下、真空中室温で約４時
間デオキシヘモグロビンに転換した。脱ガスした
緩衝液0.2ml中に溶解した亜ジチオン酸ナトリウ
ム80μモルを上記ヘモグロビン溶液に添加し５分
間反応を行なつた。予め脱ガスした緩衝液10ml中
の架橋剤Ｏ−ラフイノース550μモルを真空下添
加し反応を６時間行なつた。反応混合物を氷水浴
中で冷却し、脱ガスした１ｍＭ NaOH4.0ml中
のホウ水素化ナトリウム3.5ミリモルを正の不活
性ガス圧下添加した。還元を45分間行なつた。
HPLCゲル浸透クロマトグラフプロフイルは95％
よりも多量のウシヘモグロビン半分子が安定化か
つ架橋され、製品の組成は実施例９と同様である
ことを示していた。 Ｏ−ラフイノース安定化ウシCO−Hemo Safe
(T)の調製、低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施例
３と同様にして行なつた。 最終製品は低温殺菌の前後で不変のゲル浸透ク
ロマトグラフ組成及び物理的性質を有していた。
この製品はPH7.4のPBS緩衝液中37℃で測定した
P5028mmHg、ヒル係数約1.5及び30％過剰血液置
換でラツト中で測定した半減期７−８時間を有し
ていた。 実施例 13 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化及び重合したラツトのHemosafe
(T)の調製。 分子内安定化及び分子内架橋したラツトのデオ
キシヘモグロビンの調製：PH9.5の20ｍＭホウ酸
塩緩衝液中にラツトのストローマ不含オキシヘモ
グロビン（9.4％ｗ／ｖ）を溶解した溶液６ｍを
電磁攪拌下、真空中室温で約２時間デオキシヘモ
グロビンに転換した。100μの脱ガス緩衝液中
に溶解した亜ジチオン酸ナトリウム20μモルをヘ
モグロビン溶液に添加し、５分間反応を行なつ
た。予め脱ガスした緩衝液２ml中の架橋剤Ｏ−ラ
フイノース87μモルを真空下で添加し４℃で16時
間、次に室温で５時間反応を行なつた。反応混合
物を氷水浴中で冷却し、脱ガス１ｍＭ
NaOH1.0ml中のホウ水素化ナトリウム1.2ミリモ
ルを正の不活性ガス圧の下で添加した。還元を45
分間行なつた。HPLCゲル浸透クロマトグラフプ
ロフイルは98％よりも多くのラツトヘモグロビン
半分子が安定化及び架橋され製品の組成は実施例
９のものと同様であることを示している。 Ｏ−ラフイノース安定化ラツトCO−Hemo
Safe (T)の調製、低温殺菌、凍結乾燥及びオ
キシ−Hemo Safe (T)への光転換は実施例３
と同様にして行なつた。 最終製品は低温殺菌の前後で不変のゲル浸透ク
ロマトグラフ組成及び物理的−化学的性質をもつ
ていた。 実施例 14 開環ラフイノースにより構造安定化した人間
Hemo Safe (T)−イヌリン複合体の調製。 分子内架橋した人間Hemo Safe (T)の調
製：実施例３と同じ方法による。 過沃素酸塩酸化イヌリン（Ｏ−イヌリン）の調
製：開環イヌリンの調製は実施例２と同様にして
行なつた。 Hemo Safe (T)−イヌリン複合体の調製：
0.1M NaHCO3中に人間のオキシ−Hemo Safe
(T)（４％ｗ／ｖ）を溶解した溶液35mlを電磁
攪拌下、真空中室温で約２時間デオキシHemo
Safe (T)に転換した。脱ガスした緩衝液50μ
に溶解した亜ジチオン酸ナトリウム40モルを添加
した。５分後、予め脱ガスした0.1M
NaHCO38.5ml中の等モルのＯ−イヌリンを攪拌
下真空中で添加し、反応を室温で５時間行なつ
た。反応混合物を氷水浴中で冷却し、脱ガスした
１ｍＭ NaOH1.5ml中のホウ水素化ナトリウム
2.0ミリモルを正の不活性ガス圧下で添加した。
還元を45分間行なつた。HPLCゲル浸透クロマト
グラフプロフイル及びHemo Safe (T)−イヌ
リン複合体の組成は第５図のものと同様であつ
た。ラフイノース安定化人間CO−Hemo Safe
(T)−イヌリン複合体の調製、その低温殺菌、凍
結乾燥及び人間オキシ−Hemo Safe (T)への
光転換は実施例３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は不変のゲル
浸透クロマトグラフ組成及び物理的−化学的性質
をもつていた。この製品はPH7.2のPBS緩衝液中
37℃において27mmHgのP50、ヒル係数約1.2及び
30％過剰血液置換のラツト中で測定して半減期７
−８時間を有していた。 実施例 15 Ｏ−ラフイノース構造安定化人間メト−Hemo
Safe (T)及び(R)の調製。 前述のようにして（実施例３）、CO−Hemo
Safe (T)及び(R)をそれぞれオキシ−Hemo
Safeに光転換した後、これらオキシ−Hemo
Safeを37℃に放置しメト−Hemo Safeへの転換
を行なつた。第３図にダツシユ線で示したように
吸収スペクトルによつて決定したメト−ヘモグロ
ビンレベルが90％より大きくなつたとき転換は完
了したものとする。そのCN除去剤として効力は
第３図のダツシユ−点線で示す如く対応するシア
ノメト−ヘモグロビン光学吸収スペクトルを得る
能力によつて確認した。 実施例 16 Ｏ−ラフイノースにより構造安定化し重合した
メト−Hemo Safe (T)及び(R)の調製。 Ｏ−ラフイノースによつて構造安定化し重合し
た人間Hemo Safe (T)及び(R)を実施例９に従
つて調製した。実施例15に従いこれらをそれぞれ
のメト−Hemo Safeに転換した。 実施例 17 Ｏ−ラフイノースにより構造安定化した人間メ
ト−Hemo Safe (T)−イヌリン複合体の調製。 Ｏ−ラフイノースにより構造安定化した人間
Hemo Safe (T)−イヌリン複合体を実施例14
に従つて調製し、実施例15に従つてメト−Hemo
Safeに転換した。 実施例 18 ラフイノースにより構造安定化し重合した人間
Hemo Safe のウイルス失活化。 実施例９に従つて人間Hemo Safe を調製
し、Hemo Safe 、104HIVユニツトでスパイ
クしたHemo Safe 及び104HIVユニツトのみ
からなるサンプルを調製した。対照実験におい
て、溶液中にHemo Safe が存在してもHIV
−の感染性に影響しないことが示された。これ
らのサンプルを56℃で１週間湿熱処理した。この
処理の終了時にサンプルのHIV感染性を抗原分
析によつて調べた。これらのサンプルのいずれに
おいてもHIVの感性は見られなかつた。
れ水素、ヒドロキシル、メトキシ及びヒドロキシ
メチルから選ばれ、ｍは０又は１であり、Ｑは36
以下の糖成分を有するジー又はオリゴ糖の酸化開
環から得られる化学基である。 出発化合物がラフイノース（三糖）の場合
CSSC酸化生成物は下記の式を有する。 出発化合物がイヌリン（多糖類）の場合、
CSSC酸化生成物は下記の式を有する。 このように本発明で使用する架橋剤は従来技術
においてHbをその四量体の形に安定化及び架橋
するのに従来用いられているDPGアナローグと
全く相違する。これらはホスフエートやカルボキ
シレートのような負に帯電した基をもたずHbの
DPG部位と特異的に反応することは知られてい
ない。従つて、これらは人間及び家畜動物由来の
Hbの構造安定化を行ない構造中に各Hbユニツト
を保持せしめることができるのであり、この構造
中でHbユニツトが架橋剤と出合い反応するので
ある。 ヘモグロビンに対するアルデヒドの相対量は少
くとも12：１、好ましくは少くとも60：１のヘモ
グロビンに対するアルデヒド基のモル比をもたら
すように調整するのが好ましい。即ち、ポリアル
デヒドを用いる場合はジアルデヒドを用いる場合
よりも同量のヘモグロビンに対し小量のポリアル
デヒドが必要である。モル比の計算はヘモグロビ
ンが約50の第１アミン基を有するものと仮定して
行なう。本発明におけるグロビン鎖結合反応は部
位特異的である必要がないので、安定差製品を高
収率（少くとも95％）で得るために過剰モル比の
アルデヒド（たとえば、Ｏ−ラフイノースの場合
５−30のモル比を使用することができ、好ましく
は20：１である）を使用することができる。部位
特異的反応を必要とする従来技術では実質的に化
学量論量の試剤を使用しなければならず、その結
果収率が低下する。反応は４℃−37℃、好ましく
は周囲温度で水溶液中で行なうのが好ましい。反
応混合物のPHは適当な緩衝剤により6.7乃至9.5、
好ましくは8.0に調節すべきである。 ポリHb(T)を製造するのに架橋剤としてGAを
用いる場合は、反応を適切に制御するため約５−
７ｇ／dlより低い溶液濃度のHbを用いるべきで
ある。しかしその他のCSSC物質の場合は反応を
容易に制御することができるので、広い範囲の
Hb濃度、たとえば１−20ｇ／dl、好ましくは３
−４ｇ／dlを用いることができる。 赤血球から得られるような基質（stroma）を
含まないヘモグロビンは約３−４ｇ／dlのヘモグ
ロビン濃度を有する。このヘモグロビン溶液は稀
釈や濃縮をせずに用いるのが便利である。好まし
い濃度は選択したアルデヒドによつて決まる。か
くして、二価GAに対する新規CSSCの利点はポ
リマーを含まぬ人間Hb誘導体及びポリマーを含
まぬ動物Hb誘導体の製造に等しく適用できるが、
Ｏ−ラフイノースのような新規CSSCを用いてポ
リHbの形成を防止することにより動物Hb誘導
Hemo Safe製品を人間に用いることができる。 安定化ヘモグロビン： 本発明の構造安定化が架橋されたデオキシ−
Hb（XL−Hb(T)）の製造において適当な時期に還
元剤又は急冷剤を添加することにより二量体、三
量体、四量体及び高ポリマーを生成する分子内架
橋が始まる前にデオキシ−Hbの分子内架橋反応
を終了せしめることができる。第一アミン基と
CSSCのアルデヒド基との反応によりシツフ塩基
結合が生成する。水素化ホウ素ナトリウム又は水
素化ホウ素カリウム等を添加するとシツフ塩基結
合が第二アミン結合に還元され、また過剰のアル
デヒド基が第一アルコールに還元され、かくして
更に架橋が進むのが止まる。適切な還元時間は反
応混合物のサンプルを高圧液体クロマトグラフイ
（HPLC）分析することにより得ることができる。 構造安定化四量体Hb製品は標準的方法により
回収及び精製することかできる。即ち、製品の膜
濾過により洗浄及び濃縮し、血管系中の半減期が
比較的短かくてもよい緊急の場合の基準に基き代
用血液として用いるために生理的塩類溶液として
形成してもよい。あるいは、本発明による他の製
品を製造するための出発物質として用いてもよ
い。 重合安定化ヘモグロビン 上記の他の製品の一つは重合したHb（Hemo
Safe ）であり、構造安定化され、解離に対
しても安定化された四量体ヘモグロビン（Hemo
Safe ）が分子内結合し好ましくはヘモグロ
ビン濃度14ｇ／dlにおいて等膨張圧を与える分子
量を有する重合Hbが形成されている。重合は構
造の安定化を与えるのに用いるのと同じでもよく
異なつていてもよいジアルデヒド又はポリアルデ
ヒドを使用することにより適切に達成される。従
来技術、たとえばグルタルアルデヒドを用いるこ
とにより製造されたポリ（Hb）製品はHemo
Safe から製造されたものではないから本発
明の製品の完全な構造安定性をもつていなかつ
た。 本発明のポリマー製品は分子量（ポリマー中の
ユニツトの数）の異なるポリマーの混合物を含ん
でいてもよい。しかし、すべてのポリマーはＴ−
構造で安定化されている。すべてのポリマーは同
一あるいは実質的に同一の酸素親和性を有するも
のである。従つて本発明の重合化製品は従来技術
の均一な酸素親和性を有し、たやすく再現し得る
組成のものよりもすぐれている。 これらポリマーを製造するための適当な反応条
件は室温（約37℃を越えてはいけない）で水溶液
である。ヘモグロビンに対するアルデヒドの比は
Hb1モルにつきアルデヒド基のモルに基き２乃至
100が適当である。反応溶液はPH6.7乃至9.5、好
ましくは8.0に緩衝すべきである。ホウ水素化ナ
トリウム又はシアノホウ水素化ナトリウムのよう
な還元剤を添加して残りのアルデヒド基を還元
し、シツフ塩基を安定な共有炭素−窒素結合に変
換することにより反応を完了することができる。 本発明の特に好ましいポリマー組成物は構成ポ
リマーの20−25％が５以上の四量体ヘモグロビン
モノマーユニツトを有し、50−60％が２−４のヘ
モグロビンモノマーユニツトを有し、20−25％が
単一ヘモグロビンユニツト（分子量64キロダルト
ン）を有し、１−２％が不完全に安定化したヘモ
グロビンである分子量分布を有するものである。
このような組成物は14ｇ／dlで同膨張性であり、
血圧の問題を起こすことなく代用血液として血液
と等容量で用いることができる。 安定化ヘモグロビン複合体 このような製品のもう一つは「複合Hemo
Safe 」であり、構造安定化及び解離安定化
したヘモグロビン（Hemo Safe ）が共有結
合により生物高分子と複合し望ましくは高分子量
の製品が形成されたものである。ヘモグロビンと
生物ポリマー（イヌリン、デキストラン、ヒドロ
キシエチル澱粉等）との複合体は従来公知であ
る。しかし、本発明においては従来技術と同じ生
物ポリマー及び同様なヘモグロビンへの結合方法
を用いることができるのであるが、ヘモグロビン
は複合型において構造安定性、好ましくはＴ構造
を保持しており、前述の如き欠点を伴う。 本発明において複合体を製造するためのポリマ
ーとして特に好ましいものはイヌリンである。こ
れは約5000の分子量を有する多糖類であり診断試
薬として用いられる。 低温殺菌製品 従来の安定化、重合及び複合方法では高分子が
加熱、乾燥又は凍結されたときヘムの酸化又は高
分子の変性が防止されていない。本発明によれば
ヘム含有高分子が前述のように先づ安定化され、
次に任意に重合又は複合されたとき、たとえば酸
素置換剤又は除去剤を用いることにより、あるい
は好ましくは、たとえば変性を起こすことなく低
温殺菌及び凍結乾燥を行なうことができるカーボ
ンモノオキシ−ヘム誘導体を形成する方法により
一酸化炭素（CO）又は酸化窒素と反応せしめて
得られるようなヘム保護錯体を形成することによ
りヘム含有高分子の熱酸化を防止することができ
る。 具体的にはGA又はCSSC物質を用いて誘導し
た新規安定化ヘモグロビンにCOを添加すること
によりここではCO−Hemo Safeとも呼ぶ新規製
品が得られる。この目的のためには、ヘモグロビ
ン製品を単離せずに反応混合物にCOを添加する
ことができる。すでに安定化したヘモグロビンに
おいてはCOによるヘムの保護とアロステリツク
構造変化の防止とが相まつて熱及び凍結乾燥条件
下でのCO−Hemo Safeの酸化及び変性を防止す
る。Hemo Safe 、Hemo Safe 及び
Hemosafe −イヌリン又はその他のヘモグロ
ビンに基く代用血液にカーボンモノオキレーシヨ
ン（carbon monoxylation）及び低温殺菌を適
用することは従来知られていない。 適当な保護剤を添加しないでヘモグロビン誘導
体を低温殺菌（たとえば60℃における10時間の湿
熱）及び凍結乾燥すると沈澱及び変性をもたら
す。本発明の独特の方法で安定化したヘモグロビ
ンのヘムをCOで保護することによりCO−Hemo
Safeの製品の加熱及び凍結乾燥を問題なく達成
することができる。この低温殺菌によりウイルス
に感染していない可溶性非変性CO−Hemo Safe
が得られる。また、前記凍結乾燥により乾燥CO
−Hemo Safe製品が得られる。液状及び乾燥CO
−Hemo Safe製品は両方とも通常の温度におい
て長期間の貯蔵が可能である（たとえば56℃で60
日間）。CO−Hemo Safeは安定であるが酸素を
運搬しない。従つて輸血に使用するには酸素の存
在下で光により処理することによりCO−Hemo
Safe溶液をオキシ−Hemo Safe溶液に転換せし
める。かくして、本発明のもう一つの特徴は輸血
前にCO−Hemo Safeをオキシ−Hemo Safeに
光により変換せしめることである。 本発明の方法の初期段階で使用するGA濃度
（即ち、５ｍＭ）は従来技術においてHTLV−
／LAV又はHIV−として知られているウイ
ルスの95％を失活せしめるのに必要であると報告
されている１ｍＭよりも高濃度である。しかし、
ウイルス感染に対する安全性の保証は低温殺菌、
即ち60℃に10時間加熱（これはアルブミンの如き
プラズマー誘導医薬品に対して認められている標
準処理である）することにより達成することがで
きる。もし、たとえば前述のようにして誘導した
安定化オキシ−Hb(T)を60℃に10時間さらしたら、
褐色の沈澱物（即ち、変性メト−Hb(T)）が生成
し、もはや使用できなくなる。しかし、安定化
Hb(T)のそのカーボンモノオキシ誘導体への変換
によりCO−Hemo Safe (T)が生成し、可視ス
ペクトル、酸素親和性（即ち、P50）又はHPLC
分析で示される組成のような生理化学的性質な実
質的に変化をもたらすことなく溶液中25℃又は56
℃で60日以内の保存及び低温殺菌が可能となる。
更に、CO−Hemo Safe (T)は上で低温殺菌に
ついて述べたような生理化学的性質の実質的な変
化をもたらすことなく凍結乾燥し25℃又は56℃で
60日間の保存が可能である。 輸注可能な製品 純粋のCO−HemoSafeは酸素を結合又は運搬
しないから、その調製、低温殺菌及び凍結乾燥操
作を通じて安定であるにもかかわらず酸素の運搬
及び輸注には不適である。無菌条件下でCOを除
去することが代用血液として使用するための必要
条件である。従つて、本発明はCO−Hemo Safe
を容易に酸素化誘導体オキシ−ヘモグロビンに光
変換できることを教えるものである。このために
は、酸素を溶液に供給し、次にこの溶液に可視光
線にさらされている透明な管の中に通せばよい。
CO−Hemosafe及びオキシ−Hemo Safeの光吸
収スペクトルにより、これら２種の特性決定及び
定量を簡単に行なうことができる。現在入手可能
なポリPLP−Hbのような代用血液に比べHemo
Safeは生理学的及び均一に酸素親和性という利
点を有する。そのプレカーサーであるCO−
Hemo Safeは低温殺菌、凍結乾燥、光転換及び
60℃以下における保存の条件下において安定性を
示す。即ち、本発明はウイルス感染の無い効果の
大なる代用血液を製造する方法を教示するもので
ある。 また、本発明により、カーボンモノオキシレー
シヨンの方法によつて与えられた安定性は従来の
すべてのHbに基く代用血液に適用できることが
発見された。たとえば、本発明によればポリ
PLP−Hb（ポリCO−PLP−Hb）、ATP−Hb
（CO−ATP−Hb）及びポリATP−Hb（ポリCO
−ATP−Hb）のカルボモノオキシ誘導体は等し
く安定であり、低温殺菌可能であり、そのオキシ
誘導体に光変換可能であることが明らかになつ
た。即ち、本発明はヘモグロビンに基く酸素運搬
蘇生液から病原ウイルスを消去し、かつその保存
性を向上せしめるための一般的に必要な処理とし
て適用し得る方法を包含する。従つて、デキスト
ラン−Hb、ヒドロキシエチル澱粉Hb、ポリエチ
レングリコール−Hb及びジアスピリン架橋Hbの
ようなすべての現存するヘモグロビンに基づく代
用血液に本願に記載と同じ方法によりウイルス感
染の無い状態とすることができる。 本発明のHemo Safeの好ましい実用的方法を
下記にまとめる。 (i) プールした全血をNaCl等張液で稀釈し膜型
濾過系に入れる。 (ii) 接線方向流膜濾過により血液の細胞成分から
プラズマを分離する。 (iii) 赤血球を等張生理的食塩水中で洗浄する。 (iv) 赤血球を低張リン酸緩衝液で溶解し、細胞片
及びその他の特殊な物質を接線流濾過により可
溶性ヘモグロビンから分離する。 (v) 真空又はガス交換器及び還元剤によりオキシ
−Hbをデオキシ−Hbに変換する。 (vi) 構造特異性安定化架橋剤（CSSC）を添加す
ることによりデオキシ−Hbをモノマー又はポ
リマー組成物あるいは複合体の所望の形に安定
化させる。 (vii) デオキシ−Hbを一酸化炭素で物理的に安定
化しCO−Hemo Safeを得る。 (viii) CO−Hemo Safeを洗浄及び濃縮するか、あ
るいは適当な生理的食塩水を添加することによ
り電解質バランスを再安定化する。 (ix) CO−Hemo Safeの低温殺菌を行なう。 (x) 低温殺菌したCO−Hemo Safeを酸素の存在
下オキシ−Hemo Safeに光変換する。 (xi) オキシ−Hemosafeを無菌濾過し輸血用に
容器に詰める。 本発明の教示のようにしてオキシ−Hemo
Safeが得られると、これを解毒薬として及び化
学防御における如くシアン化物中毒を予想して予
防的輸血剤として用いるためにメト−Hemo
Safe誘導体に変換することができる。即ち、本
発明によれば、オキシ−Hemo Safeの調製後、
公知の方法を用いてこれを酸化してHemo Safe
とし、これは瞬間的に効果を表わしかつ長期間有
効なシアン化物除去剤として輸注することができ
ることが教示される。メト−Hemo Safeを静脈
中に使用することにより経口的に亜硝酸塩をとり
メト−Hbを形成することを利用する場合の時間
的遅延が回避される。亜硝酸塩も必ず存在する
RBCオキシヘモグロビンからメト−Hbを補充す
るのであり、メト−Hemo Safeを使用すること
により、存在する酸素の運搬能力の低下が避けら
れる。従つて、従来法よりもすぐれたシアン化物
中毒の治療法を提供するのである。 オキシ−Hemo Safeの輸注は血液をドーピン
グする技術の代りに用いることができる。従来技
術は赤血球を人に投与してその酸素運搬能力を高
めることができることを教示しているけれども、
赤血球のもたらす粘度のためにその能力の向上は
10−15％が限度である。しかし、公知のプラズマ
フエレシス技術と組合せてオキシ−Hemo Safe
を用いることによりプラズマをオキシ−Hemo
Safeで置換することができ、理論的に酸素運搬
能を50％増大せしめることができ、しかもこの場
合血液のヘマトクリツトあるいは流動特性の変化
をもたらさない。 本発明又はその範囲は製品の構造又はその製造
方法の機構の特定の理論に限定されるものではな
いが、製品の構造安定性及び解離安定性はCSSC
により四量体ヘモグロビンにおけるサブユニツト
内共有結合から得られるものであると考えられ
る。この結合は二量体への解離を防止するのに充
分安定であり、構造的変化を防止するに充分堅い
ものである。構造について説明がどうであれ
Hemo Safeのその構造安定性は独特のものであ
る。 また、本発明の範囲はヘモグロビンの処理及び
ヘモグロビン製品に限定されるものではない。溶
液中であれあるいは生物学的膜の中であれCSSC
物質によるこのようなタンパク質の処理により、
タンパク質とCSSCとが存在する構造が安定化さ
れるであろう。理論的には前記処理により安定化
構造と関連のある生物学的活性も安定化され分子
が低温殺菌に対して安定化される。即ち、その多
くが特定の構造においてのみ有用である生物学的
に活性なペプチドを包含する生物高分子に広く広
用することができる。 本発明を更に実施例によつて説明する。 実施例 １ 人間及び動物のストローマ不含ヘモグロビンの
調製。 カナダ赤十字から入手した古い血液又は容器入
り赤血球から人間ストローマ不含ヘモグロビンを
調製した。先づ、その全血を30分間3000rpmで遠
心分離にかけた。次にピペツトからの吸引により
プラズマ及び淡黄色の被膜を分離し廃棄した。沈
降した赤血球をその３倍の容積の氷冷した通常の
食塩水中を懸濁せしめることにより３回洗浄し
た。各々の洗浄後に赤血球を遠心分離により再沈
降せしめ上澄液を分離して廃棄した。 次に洗浄した赤血球を４容の５ｍＭリン酸塩緩
衝液（PH7.6）で溶解して完全な細胞壁を破壊し
てヘモグロビンを遊離せしめた。ストローマ及び
膜フラグメントを除去するためにフルオロカーボ
ンポリマーフイルター（HVLP、多孔度0.5μｍ）
を有するPellicon Cassette System（ミリポア
社）で濾過し、次にポリスルホンフイルター
（100000分子量カツトオフ）で濾過した。濾液中
のヘモグロビンを先づ14−20ｇ／dlに濃縮し、次
に10容過剰のPBS緩衝液（PH7.4）で洗浄し、5.0
平方フイートのメンプレンカセツト（PTシリー
ズ、30000分子量カツトオフ）を備えたPellicon
Cassette Systemで洗浄し、0.22μｍミリポアフ
イルターで濾過することにより滅菌し、使用する
迄４℃で貯蔵した。 動物ヘモグロビンの調製についてはPBS緩衝
液（PH7.4）の代りに20ｍＭホウ酸塩緩衝液（PH
9.5）を用いたヘモグロビンの可溶性を高めたラ
ツトヘモグロビンである以外は人間ヘモグロビン
の調製と同様に行なつた。 実施例 ２ ヘモグロビン用のCSSCとしての過沃素酸塩酸
化ラフイノース及びその他の糖類の調製。 それぞれ200mgのグルコース、スクロース、ラ
フイノース、マルトース、マルトトリオース、マ
ルトペントース、マルトヘキソース、マルトヘプ
トース及びそ他の糖を６mlの蒸留H2Oに溶かし
たものを室温において糖に対して一定のモル比の
固体の過沃素酸ナトリウムで処理した。（糖に対
する過沃素酸ナトリウムのモル比はピラノシドに
ついて2.2、フラノサイドについて1.1である）。
１時間後、反応混合物を氷水浴中で冷却し、激し
く攪拌しつつ沈澱沃素が再溶解する迄亜硫酸水素
ナトリウムを加えて無色の溶液を得た。次に6N
NaOHを添加して溶液のPHを急速に8.0±0.1に調
製した。得られた酸化糖溶液を更に稀釈して最終
濃度20mg／mlとしミリポア0.45μｍ型GS膜フイル
ターで濾過し使用する迄４℃で保存した。 実施例 ３ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造的に安定しかつ架橋した人間Hemo Safe
(T)の調製。 分子内架橋デオキシヘモグロビン（XL−Hb
(T)）の調製：電磁攪拌下にあるPH8.0の0.1Mリン
酸塩緩衝液中のストローマ不含オキシヘモグロビ
ン（Hb(R)）１％ｗ／ｖ溶液350mlを室温で約４時
間真空中でデオキシヘモグロビン（Hb(T)）に転
換した。脱ガスした緩衝液0.3ml中に溶解した0.1
ミリモルの亜ジチオン酸ナトリウムを前記ヘモグ
ロビン溶液に添加し５時間反応を行なつた。架橋
剤としてのＯ−ラフイノース1.08ミリモルをPH
8.0の予め脱ガスした緩衝液20mlを溶解したもの
を激しく攪拌しつつ真空中で添加し溶液を室温で
４時間攪拌した。反応混合物を氷水浴中で冷却し
脱ガスした１ｍＭ NaOH中の15.0ミリモルのホ
ウ水素化ナトリウムを不活性ガスの正圧下添加し
た。反応を45分間行なつた。 第１図は5μｇ／100mlの製品（実線）及び対照
の人間SFH（ダツシユ線）から得られたHPLCプ
ロフイルである。Ｂ−グロピン半分（ピークａ）
及び（αβ）2安定化人間Hb(T)（ピークｂ）につい
ての分子量検量線は印をつけた通りである。使用
した緩衝剤は50ｍＭリン酸塩及び150ｍＭ
NaCl、PH7.0であつた。クロマトグラムはGP、
250グラジエントプログラマー、P500ポンプ、モ
デル482チヤートレコーダー及び405nｍフイルタ
ー付きシングルパスUVモニターを備えた
Pharmacia FPLC系上で得た。 プロフイルは95％より多量のヘモグロビンが安
定化及び架橋を受け５％以下のXL−Hb(T)が半分
子に解離したことを示している。これと同一の実
験条件下でヘモグロビンは完全に半分子に解離す
る。 XL−Hb(T)の一酸化炭素誘導対（COXL−Hb
(T)）の調製及び低温殺菌：ホウ水素化ナトリウム
による還元後、COを直接XL−Hb(T)反応混合物
中に泡立てた。膜濾過による洗浄及び濃縮後、
100％CO下COXL Hb(T)を10時間60℃に加熱する
ことにより大気圧下で低温殺菌し、CO−Hemo
Safe を得た。周囲温度における長期保存の
ためには、このCO−Hemo Safe を凍結乾燥
して乾燥粉末とし、必要なときに緩衝液で再生す
ることができる。 CO−Hemo Safe (T)のオキシ−Hemo
Safe (T)への光転換：回転蒸発器上に取り付
けた500ml丸底フラスコ中に15mlのCO−Hemo
Safe (T)を移しＣ Ｇ Ｅ Brooderランプ
（C250、Ｒ40/1、内側艶消し軟質ガラス）の下で
０℃の氷水浴中で連続的に回転せしめた。未結合
COを除去するためこのフラスコをアスピレータ
ー又は真空ポンプで排気した。２分後、空気又は
100％酸素を導入した。このサンプルは組成を577
乃至560mmについて分光光度分析して吸光度比1.8
となる迄前記のサイクルを繰り返した。その結
果、COの除去は完全となつたとみなした。
（Enzymology vol.76、Hemoglobin、pp.60、
164に記載の方法）。得られた最終生成物は第１図
に示す不変のゲル浸透クロマトグラフイー組成を
有する。 第３図は本実施例及び他の実施例の製品（リン
ガー緩衝液中、PH7.4、22℃）の相対吸収スペク
トルを示す。実線はXL−Hb(T)、即ちカーボンモ
ノオキシレーシヨン前のものであり、点線はオキ
シ−Hemo Safe最終製品のものである。第３図
のこれらの曲線は最終製品が実質的に不変の物理
−化学的性質を有していることを示している。 第２図は本実施例においてＯ−ラフイノースに
よつて架橋安定化したHemo Safe(1)の酸素解離
曲線（ダツシユ線）及びオキシ−ヘモグロビン又
はHb(R)の酸素解離曲線（実線）である。これら
はヘモグロビン濃度3.5ｇ／dlでPH7.4のリンガー
リン酸塩緩衝液中37℃で測定したものである。こ
れらはこれらの製品の典型的な曲線である。50％
飽和（P50）における酸素の分圧を曲線から直接
読みとる。 第２図によると本実施例のHemo Safe(1)製品
はPBS緩衝液（PH7.4）中37℃で27mmHgのP50
（P50は50％のヘモグロビンが酸素ヘモグロビンの
状態にある酸素の分圧のことである）を有する双
曲線形酸素解離曲線を示す。これはヒル係数約１
−1.5を有する。 第４図はヘモグロビンに基づく代用血液の典型
的なプラズマ半減期を示す。ダツシユ線は本実施
例の最終オキシ−Hemo Safe １(T)の半減期であ
る。測定は30％血液過剰モデル（hypervolemic
model）のラツトで行なつた。製品は約４−５時
間の半減期を有し、一方ヘモグロビンの半減期
（点線）は約１−1.5時間であつた。 実施例 ４ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）で構造
安定化し架橋した人間Hemo Safe (R)の調製。 反応をオキシ状態で亜ジチオン酸ナトリウムの
不存在下で行なつた以外は実施例３のHemo
Safe (T)と同様な方法を用いた。 最終製品はPH7.4のPBS緩衝液中、37℃で測定
してP502−３mmHgを有する双曲線形の酸素解離
曲線を示し（第２図、実線）、そのゲル浸透クロ
マトグラフイ組成及び可視スペクトルはHemo
Safe (T)のものと区別できないものである。 実施例 ５ グリオキサールによつて構造安定化され架橋さ
れた人間Hemo Safe (T)の調製： グリオキサールにより分子内架橋したストロー
マ不含デオキシヘモグロビンの調製：電磁攪拌
下、0.1M重炭酸ナトリウム中の人間ストローマ
不含ヘモグロビン2.9ｇ、４％ｗ／ｖを真空中で
約２時間デオキシヘモグロビンに転換した。架橋
剤としてのグリオキサール2.58ミリモル（7.5ml
の脱ガス0.1M重炭酸ナトリウム中）を加え、溶
液を室温で２時間攪拌した。反応混合物を氷水浴
中で冷却し、脱ガス１ｍＭ NaOH3ml中の６ミ
リモルのホウ水素化ナトリウムを不活性ガスの正
圧下添加した。反応を45分間行なつた。HPLCゲ
ル浸透プロフイルは第１図のものと同様であり、
このことはヘモグロビンの90％以上が分子内安定
化されていることを示す。 グリオキサール安定化CO−Hemo Safe (T)
の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光による逆転換の方法は
いずれも実施例３に記載のものと同様である。最
終製品は30％過剰血液置換したラツトにおいて測
定した約3.5時間の半減期を有していた。 実施例 ６ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化、架橋したウシHemo Safe (T)
の調製： PH8.0の0.1Mリン酸緩衝液中のウシストローマ
不含オキシヘモグロビン（１％ｗ／ｖ）溶液90ml
を電磁攪拌下真空中で室温で約２時間デオキシヘ
モグロビンに転換した。0.3mlの脱ガスした緩衝
液中に溶解した亜ジチオン酸ナトリウム400μモ
ルを上記ヘモグロビン溶液に添加し５分間反応を
行なつた。PH8.0の予め脱ガスした緩衝液６ml中
の架橋剤Ｏ−ラフイノース276μモルを真空下添
加し、この溶液を３時間室温で攪拌した。反応混
合物を氷水浴中で冷却し１ｍＭ NaOH（脱ガ
ス）２ml中のホウ水素化ナトリウム3.5ミリモル
を不活性ガス正圧で添加した。還元を45分間行な
つた。HPLCゲル浸透クロマトグラフプロフイル
は90％よりも多いウシヘモグロビンが分子内安定
化されたことを示す。架橋ウシヘモグロビンのク
ロマトグラムは第１図に示したものと同様であつ
た。 Ｏ−ラフイノース安定化ウシCO−Hemo Safe
(T)の調製、低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光転換は実施例３と同様
にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は不変のゲル
浸透クロマトグラフイ組成及び物理−化学的性質
を有する。この製品はPH7.2のPBS緩衝液中で37
℃で測定してP5034mmHgを有する双曲線形酸素解
離曲線、ヒル係数約1.5及びラツトについて30％
過剰血液の輸血において測定したプラズマ半減期
約４時間を有していた。 実施例 ７ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化され架橋された羊のHemo Safe
(T)の調製。 分子内架橋した羊のデオキシヘモグロビンの調
製：PH8.0の0.1Mリン酸塩緩衝液中の羊のストロ
ーマ不含オキシヘモグロビン（１％ｗ／ｖ）の溶
液100mlを電磁攪拌下、真空中にて室温で約２時
間デオキシヘモグロビンに転換した。100μの
脱ガスした緩衝液中の50μモルの亜ジチオン酸ナ
トリウムを前記ヘモグロビン溶液に添加した。５
分後、PH8.0の予め脱ガスした緩衝液12.5ml中の
架橋剤Ｏ−ラフイノース616μモルを真空中で攪
拌しつつ添加した。４℃で16時間架橋を行なつ
た。反応混合物を氷水浴中で冷却し、脱ガスした
１ｍＭ NaOH2.5ml中のホウ水素化ナトリウム
4.4ミリモルを正の不活性ガス圧下で添加した。
還元を45分間続けた。HPLCゲル浸透クロマトグ
ラフプロフイルは羊のヘモグロビン半分子の95％
より多量が分子内安定化されており、第１図に示
すものと同様であることを示した。 Ｏ−ラフイノース安定化羊CO−Hemo Safe
(T)の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ
−Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施
例３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は不変ゲル浸
透クロマトグラフイ組成及び物理−化学的性質を
有していた。この製品はPH7.4のPBS緩衝液中37
℃で測定してP5038mmHgを有していた。 実施例 ８ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化し架橋したラツトのHemo Safe
(T)の調製。 分子内架橋したラツトのデオキシヘモグロビン
の調製：PH9.5の20ｍＭホウ酸塩緩衝液中にラツ
トのストローマ不含オキシヘモグロビン（２％
ｗ／ｖ）を溶解した溶液18mlを電磁攪拌下、真空
中、室温で約１時間デオキシヘモグロビンに転換
した。0.1mlの脱ガス緩衝液中に溶解した50μモル
の亜ジチオン酸ナトリウムを上記ヘモグロビン溶
液に添加し５分間反応せしめた。PH8.0の予め脱
ガスした緩衝液３mlに溶解した架橋剤Ｏ−ラフイ
ノース110μモルを攪拌下真空中で添加した。４
℃で16時間架橋を行なつた。反応混合物を氷水浴
中で冷却し１ｍＭ NaOH1ml中に溶かした1.2ミ
リモルのホウ水素化ナトリウムを正の不活性ガス
圧下添加した。還元を45分間続けた。HPLCゲル
浸透クロマトグラフプロフイルはラツトのヘモグ
ロビン半分子の90％よりも多量が第１図に示した
ものと同様に分子内安定化されたことを示してい
る。 Ｏ−ラフイノース安定化ラツトCO−Hemo
Safe (T)の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及
びオキシ−Hemo Safe (T)への光による逆転
換は実施例３と同様にして行なつた。 得られた最終製品は不変ゲル浸透クロマトグラ
フイ組成及び物理的−化学的性質を有していた。
この製品はPH7.4のPBT緩衝液中37℃で測定した
P5024mmHg及びヒル係数約1.0を有する。 実施例 ９ 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化し、重合した人間Hemo Safe
の調製。 分子内安定化及び分子内架橋した人間デオキシ
ヘモグロビンの調製：PH8.0の0.1Mリン酸塩緩衝
液中に溶解した人間オキシヘモグロビン（４％
ｗ／ｖ）の溶液77mlを電磁攪拌下、真空中、室温
で約４時間デオキシヘモグロビンに転換した。
0.3mlの脱ガス緩衝液中に溶解した0.10ミリモル
の亜ジチオン酸ナトリウムを上記ヘモグロビン溶
液に添加し５分間反応せしめた。20mlの予め脱ガ
スした緩衝液20ml中の架橋剤Ｏ−ラフイノース
0.95ミリモルを真空下添加し、反応を６時間続け
た。反応混合物を氷浴中で冷却し、脱ガスした１
ｍＭ NaOH4ml中のホウ水素化ナトリウム9.5ミ
リモルを正の不活性ガス圧下添加した。還元を45
分間続けた。第５図においてHPLCゲル浸透クロ
マトグラフプロフイルは98％よりも多いヘモグロ
ビンが安定化及び架橋され、20−25％が安定化さ
れたモノマーであり、55−５％二量体、三量体及
び四量体の組合せであり、20−25％が五量体以上
のポリマーであることを示している。 このクロマトグラフプロフイルは緩衝液として
50ｍＭホスフエート及び150ｍＭ NaCl（PH７）
及び第１図で用いた装置を用いて得られたもので
ある。ポリHb(T)は流速0.4ml／分でSuperose−12
充填HR10/30カラム上でモノマー（ピークａ）、
二量体、三量体及び四量体（ピークｂ）及び五量
体以上のポリマー（ピークｃ）に解離した。重合
化した製品のこのような組成は14ｇ／dlの濃度で
同膨張性であることがわかつた。 Ｏ−ラフイノース安定化CO−Hemo Safe
(T)の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施例
３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は低温殺菌の
前後において不変のゲル浸透クロマトグラフイー
組成及び物理−化学的性質を有し、PH7.2のPBS
緩衝液中37℃で測定して32mmHgの均一なP50及び
ヒル係数1.6の双曲線形酸素解離曲線を有する。
Hemo Safe (T)の単離精製フラクシヨン、即
ちモノマー、二量体、三量体、四量体、五量体以
上（第５図参照）は区別できないP50、ヒル係数
及び30％過剰血液置換をしたラツトについて測定
して７−８時間の半減期を有していた。 実施例 10 開環スクロース（Ｏ−スクロース）によつて構
造安定化し重合した人間Hemo Safe の調製。 Ｏ−スクロースによる分子内安定化及び分子内
架橋した人間デオキシヘモグロビンの調製：PH
8.0の0.1Mリン酸塩緩衝液中にストローマ不含人
間オキシヘモグロビン（13％ｗ／ｖ）を溶解した
溶液10mlを電磁攪拌下、真空中、約２時間デオキ
シヘモグロビンに転換した。脱ガスした緩衝液
0.2mlに溶解した亜ジチオン酸ナトリウム40μモル
を上記ヘモグロビン溶液に添加した。５分後、予
め脱ガスした緩衝液３ml中の架橋剤Ｏ−スクロー
ス200μモルを真空下添加し反応を６時間行なつ
た。反応混合物を氷水浴中で冷却し、脱ガスした
１ｍＭ NaOH1ml中のホウ水素化ナトリウム2.0
ミリモルを正の不活性ガス圧下添加した。45分間
還元を行なつた。HPLCゲル浸透クロマトグラフ
プロフイルは98％よりも多いヘモグロビンが安定
化及び架橋し、製品の組成は実施例９（第５図）
のものと同様であることを示している。 Ｏ−スクロース安定化CO−Hemo Safe (T)
の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施例
３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は低温殺菌の
前後不変のゲル浸透クロマトグラフイー組成及び
物理−化学的性質を有していた。この製品は
PBS緩衝液（PH7.2）中、37℃で測定して24mmHg
のP50、ヒル係数1.3及び30％過剰血液置換で測定
してラツト中で半減期約７−８時間を有してい
た。 実施例 11 グルタルアルデヒドによつて安定化及び重合し
た人間Hemo Safe (T)の調製。 グルタルアルデヒドによる分子内安定化及び分
子内重合した人間デオキシヘモグロビンの調製：
PH8.0の0.01Mリン酸塩緩衝液中にストローマ不
含人間オキシヘモグロビン（４％ｗ／ｖ）を溶解
した溶液78mlを電磁攪拌下、真空中、室温で約４
時間デオキシヘモグロビンに転換した。脱ガスし
た緩衝液0.3ml中に溶解した亜ジチオン酸ナトリ
ウム0.1ミリモルを上記ヘモグロビン溶液に添加
し５分間反応を行なつた。予め脱ガスした緩衝液
2.5ml中の架橋剤グルタルアルデヒド480μモルを
真空下添加し、６時間反応を行なつた。反応混合
物を氷水浴中で冷却し、脱ガスした１ｍＭ
NaOH4ml中のホウ水素化ナトリウム４ミリモル
を正の不活性ガス圧下添加した。45分間還元を行
なつた。HPLCゲル浸透クロマトグラフプロフイ
ルは98％よりも多量の人間ヘモグロビンが安定化
及び架橋され製品の組成は実施例９のものと同様
であることを示している。 グルタルアルデヒド安定化CO−Hemo Safe
(T)の調製、その低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ
−Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施
例３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は不変のゲル
浸透クロマトグラフイー組成及び物理的性質を有
していた。この製品はPH7.4のPBS緩衝液中37℃
で測定して〜30mmHgのP50、ヒル係数1.5及びラ
ツト中で30％過剰血液置換で測定した半減期７−
８時間を有していた。 実施例 12 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）により
構造安定化及び重合したウシのHemo Safe
(T)の調製。 Ｏ−ラフイノースによる分子内安定化及び分子
内架橋したウシのデオキシヘモグロビンの調製：
PH8.0の0.1Mリン酸塩緩衝液中にウシのストロー
マ不含オキシヘモグロビン（６％ｗ／ｖ）を溶解
した溶液40mlを電磁攪拌下、真空中室温で約４時
間デオキシヘモグロビンに転換した。脱ガスした
緩衝液0.2ml中に溶解した亜ジチオン酸ナトリウ
ム80μモルを上記ヘモグロビン溶液に添加し５分
間反応を行なつた。予め脱ガスした緩衝液10ml中
の架橋剤Ｏ−ラフイノース550μモルを真空下添
加し反応を６時間行なつた。反応混合物を氷水浴
中で冷却し、脱ガスした１ｍＭ NaOH4.0ml中
のホウ水素化ナトリウム3.5ミリモルを正の不活
性ガス圧下添加した。還元を45分間行なつた。
HPLCゲル浸透クロマトグラフプロフイルは95％
よりも多量のウシヘモグロビン半分子が安定化か
つ架橋され、製品の組成は実施例９と同様である
ことを示していた。 Ｏ−ラフイノース安定化ウシCO−Hemo Safe
(T)の調製、低温殺菌、凍結乾燥及びオキシ−
Hemo Safe (T)への光による逆転換は実施例
３と同様にして行なつた。 最終製品は低温殺菌の前後で不変のゲル浸透ク
ロマトグラフ組成及び物理的性質を有していた。
この製品はPH7.4のPBS緩衝液中37℃で測定した
P5028mmHg、ヒル係数約1.5及び30％過剰血液置
換でラツト中で測定した半減期７−８時間を有し
ていた。 実施例 13 開環ラフイノース（Ｏ−ラフイノース）によつ
て構造安定化及び重合したラツトのHemosafe
(T)の調製。 分子内安定化及び分子内架橋したラツトのデオ
キシヘモグロビンの調製：PH9.5の20ｍＭホウ酸
塩緩衝液中にラツトのストローマ不含オキシヘモ
グロビン（9.4％ｗ／ｖ）を溶解した溶液６ｍを
電磁攪拌下、真空中室温で約２時間デオキシヘモ
グロビンに転換した。100μの脱ガス緩衝液中
に溶解した亜ジチオン酸ナトリウム20μモルをヘ
モグロビン溶液に添加し、５分間反応を行なつ
た。予め脱ガスした緩衝液２ml中の架橋剤Ｏ−ラ
フイノース87μモルを真空下で添加し４℃で16時
間、次に室温で５時間反応を行なつた。反応混合
物を氷水浴中で冷却し、脱ガス１ｍＭ
NaOH1.0ml中のホウ水素化ナトリウム1.2ミリモ
ルを正の不活性ガス圧の下で添加した。還元を45
分間行なつた。HPLCゲル浸透クロマトグラフプ
ロフイルは98％よりも多くのラツトヘモグロビン
半分子が安定化及び架橋され製品の組成は実施例
９のものと同様であることを示している。 Ｏ−ラフイノース安定化ラツトCO−Hemo
Safe (T)の調製、低温殺菌、凍結乾燥及びオ
キシ−Hemo Safe (T)への光転換は実施例３
と同様にして行なつた。 最終製品は低温殺菌の前後で不変のゲル浸透ク
ロマトグラフ組成及び物理的−化学的性質をもつ
ていた。 実施例 14 開環ラフイノースにより構造安定化した人間
Hemo Safe (T)−イヌリン複合体の調製。 分子内架橋した人間Hemo Safe (T)の調
製：実施例３と同じ方法による。 過沃素酸塩酸化イヌリン（Ｏ−イヌリン）の調
製：開環イヌリンの調製は実施例２と同様にして
行なつた。 Hemo Safe (T)−イヌリン複合体の調製：
0.1M NaHCO3中に人間のオキシ−Hemo Safe
(T)（４％ｗ／ｖ）を溶解した溶液35mlを電磁
攪拌下、真空中室温で約２時間デオキシHemo
Safe (T)に転換した。脱ガスした緩衝液50μ
に溶解した亜ジチオン酸ナトリウム40モルを添加
した。５分後、予め脱ガスした0.1M
NaHCO38.5ml中の等モルのＯ−イヌリンを攪拌
下真空中で添加し、反応を室温で５時間行なつ
た。反応混合物を氷水浴中で冷却し、脱ガスした
１ｍＭ NaOH1.5ml中のホウ水素化ナトリウム
2.0ミリモルを正の不活性ガス圧下で添加した。
還元を45分間行なつた。HPLCゲル浸透クロマト
グラフプロフイル及びHemo Safe (T)−イヌ
リン複合体の組成は第５図のものと同様であつ
た。ラフイノース安定化人間CO−Hemo Safe
(T)−イヌリン複合体の調製、その低温殺菌、凍
結乾燥及び人間オキシ−Hemo Safe (T)への
光転換は実施例３と同様にして行なつた。 このようにして得られた最終製品は不変のゲル
浸透クロマトグラフ組成及び物理的−化学的性質
をもつていた。この製品はPH7.2のPBS緩衝液中
37℃において27mmHgのP50、ヒル係数約1.2及び
30％過剰血液置換のラツト中で測定して半減期７
−８時間を有していた。 実施例 15 Ｏ−ラフイノース構造安定化人間メト−Hemo
Safe (T)及び(R)の調製。 前述のようにして（実施例３）、CO−Hemo
Safe (T)及び(R)をそれぞれオキシ−Hemo
Safeに光転換した後、これらオキシ−Hemo
Safeを37℃に放置しメト−Hemo Safeへの転換
を行なつた。第３図にダツシユ線で示したように
吸収スペクトルによつて決定したメト−ヘモグロ
ビンレベルが90％より大きくなつたとき転換は完
了したものとする。そのCN除去剤として効力は
第３図のダツシユ−点線で示す如く対応するシア
ノメト−ヘモグロビン光学吸収スペクトルを得る
能力によつて確認した。 実施例 16 Ｏ−ラフイノースにより構造安定化し重合した
メト−Hemo Safe (T)及び(R)の調製。 Ｏ−ラフイノースによつて構造安定化し重合し
た人間Hemo Safe (T)及び(R)を実施例９に従
つて調製した。実施例15に従いこれらをそれぞれ
のメト−Hemo Safeに転換した。 実施例 17 Ｏ−ラフイノースにより構造安定化した人間メ
ト−Hemo Safe (T)−イヌリン複合体の調製。 Ｏ−ラフイノースにより構造安定化した人間
Hemo Safe (T)−イヌリン複合体を実施例14
に従つて調製し、実施例15に従つてメト−Hemo
Safeに転換した。 実施例 18 ラフイノースにより構造安定化し重合した人間
Hemo Safe のウイルス失活化。 実施例９に従つて人間Hemo Safe を調製
し、Hemo Safe 、104HIVユニツトでスパイ
クしたHemo Safe 及び104HIVユニツトのみ
からなるサンプルを調製した。対照実験におい
て、溶液中にHemo Safe が存在してもHIV
−の感染性に影響しないことが示された。これ
らのサンプルを56℃で１週間湿熱処理した。この
処理の終了時にサンプルのHIV感染性を抗原分
析によつて調べた。これらのサンプルのいずれに
おいてもHIVの感性は見られなかつた。
第１図は実施例３に従つて調製した安定化人間
デオキシヘモグロビンの分析用ゲル浸透高圧液体
クロマトグラフイ（HPLC）のプロフイルであ
り、SFHと比較して示している。第２図は実施
例３及び４のHemo Safe(1)製品の酸素解離曲線
である。第３図は実施例３及び15の製品の吸収ス
ペクトルを示す。第４図は実施例３、実施例９及
びSFHの製品の半減期調査をグラフで示したも
のである。第５図は実施例９の方法による製品の
分析用ゲル浸透高圧液体クロマトグラフイ
（HPLC）のプロフイルである。
デオキシヘモグロビンの分析用ゲル浸透高圧液体
クロマトグラフイ（HPLC）のプロフイルであ
り、SFHと比較して示している。第２図は実施
例３及び４のHemo Safe(1)製品の酸素解離曲線
である。第３図は実施例３及び15の製品の吸収ス
ペクトルを示す。第４図は実施例３、実施例９及
びSFHの製品の半減期調査をグラフで示したも
のである。第５図は実施例９の方法による製品の
分析用ゲル浸透高圧液体クロマトグラフイ
（HPLC）のプロフイルである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヘモグロビン二量体ユニツトへの解離が起こ
らぬように安定化され、かつ、これとともに水性
剤とした時にＴ型構造とＲ型構造との間の構造上
の変化が起こらぬように構造的に安定化されたヘ
モグロビン四量体ユニツトから本質的になり、前
記四量体ユニツトは安定にするためにサブユニツ
トのグロビン鎖間に第２級アミノ共有化学結合を
有し、この結合は、ヘモグロビンと３個以上のア
ルデヒド基を有するポリアルデヒドとを反応させ
てシツフ塩基結合を形成させ、次いで第２級アミ
ノ結合へ還元して得られたものである、構造的に
安定化されたヘモグロビン製品。 ２ Ｔ型構造に構造的に安定化された請求項第１
項の安定化されたヘモグロビン製品。 ３ 少なくとも２つの糖部分を有するオリゴ糖の
酸化的開環によつて得られたポリアルデヒドとヘ
モグロビンとを反応させて生成された請求項第２
項の安定化されたヘモグロビン製品。 ４ オリゴ糖の糖部分が１分子について７以下で
ある請求項第３項の安定化されたヘモグロビン製
品。 ５ オリゴ糖がラフイノースである請求項第４項
の安定化されたヘモグロビン製品。 ６ 請求項第１項の安定化されたヘモグロビン四
量体ユニツトの複数が互いに共有結合して、各ヘ
モグロビンユニツトが構造上の安定性および解離
に対する安定性を備えた重合ヘモグロビン製品を
形成して成る安定化されたヘモグロビン製品。 ７ 各ヘモグロビンユニツトがＴ型構造で安定化
された請求項第６項の安定化された重合ヘモグロ
ビン製品。 ８ 少なくとも構成成分の20−25％が５個以上の
ヘモグロビン四量体ユニツトより成るヘモグロビ
ンポリマーであり、50−60％が２−４個のヘモグ
ロビン四量体ユニツトより成るヘモグロビンオリ
ゴマーであり、20−25％が単一のヘモグロビン四
量体である組成を有する請求項第７項の安定化さ
れた重合ヘモグロビン製品。 ９ 水性溶液中で、ヘモグロビンと３個以上のア
ルデヒド基を有するポリアルデヒド架橋剤とを反
応させて単一のヘモグロビン四量体ユニツトの鎖
間で共有シツフ塩基結合を形成させ、次いで該結
合を還元して第２級アミノ結合とした反応混合物
を得ることにより、大部分が構造的に安定化され
たヘモグロビン四量体の水溶液を得ることを特徴
とする構造的に安定化されたヘモグロビン四量体
の水溶液の製造方法。 １０ ポリアルデヒド架橋剤が、１分子について
少なくとも４個のアルデヒド基を有する請求項第
９項の製造方法。 １１ ポリアルデヒドがオリゴ糖類の開環酸化反
応の生成物である請求項第１０項の製造方法。 １２ オリゴ糖が、マルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトロース、マルトペントース、マル
トヘキソース、マルトヘプトースおよびラフイノ
ースからなる群から選ばれた糖である請求項第１
１項の製造方法。 １３ 一酸化炭素と錯体を形成しており、この錯
体は水溶液中で60℃以下の温度で10時間おかれて
も実質的に変性及び分解を起こさないものである
請求項第１項の安定化されたヘモグロビン製品。 １４ ヘモグロビンユニツトがＴ型構造で安定化
されている請求項第１３項の安定化された一酸化
炭素−ヘモグロビン錯体。 １５ 凍結乾燥形の請求項第１４項の安定化され
た一酸化炭素−ヘモグロビン錯体。 １６ 一酸化炭素：ヘモグロビンのモル比が約
４：１である請求項第１４項の安定化された一酸
化炭素−ヘモグロビン錯体。
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|---|---|---|---|
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