JPS5829715A - 肝炎の恐れのない無菌、無発熱素、無基質のヘモグロビン溶液の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は赤血球のβプロピオラクトン処理、溶血、Ｈ型
陽イオン交換樹脂による溶血質の処理、基質脂質の定量
分離および滅菌濾過による、肝炎の恐れのない無菌、無
発熱素、無基質のヘモグロビン溶液の製造方法に関する
。

ヘモグロビン溶液は生体中の赤血球にかかわりなく、酸
素を輸送することができる。しかしこの溶液の生理的適
合のために、溶血によってヘモグロビンが遊出する血液
の血漿と細胞成分をなるぺ（完全に除来することが必要
でおる（血漿蛋白質、基質、白血球、血小板］。

赤血球を生理的電解質溶液に懸濁させ、次に間欠操作の
遠心分離機で遠心分離により赤血球を分離することによ
って、血漿蛋白質と赤血球を分離する上記のヘモグロビ
ン溶液の製造方法が、西独特許公報第２２４８４７５号
により公知であるＯ フランクーデ帝ヴエヌート、ハｐルド・ジエイｅフリー
トマン、ジエイ―ライアン・ヌヴイユ、カールシー・ベ
ック著「代用血液としてのヘモグロビン溶液の評価Ｊ　
　（Ａｐｐｒａｉｓａｌ　ｏｆＨ＠ｍｏｇｌｏｂｉｎ　
５ｏｌｕｔｉｏｎ　ａｍ　ａ　Ｂ１００（Ｌ　５ｕｂｌ
ｔｉｔｕｔｅλ［外科・産婦人科Ｊ　　（８ｕｒｇ＠ｒ
ｙ、　Ｇｙｎｅｏｏｌｏｇｙ　＆０ｂｓｔ＠ｔｒｉｏ＊
　）　１９７９年９月、１４９巻４１７−４５６頁に、
晶出によってヘモグロビンｔｉる稙★の方法が記載され
ている０ 赤血球の洗浄に必要な間欠式遠心分１ｍ！（血液遠心分
離機）も、晶出法に必要な透析も、臨床用に必要な大量
のヘモグロビン溶液のＩｔ！には不適当な処理法でおる
０慣用の間欠操作式達心分ｍ機の容量は例えば約６ｔに
過ぎない。多数の間欠操作式遠心分離機の使用は、極め
て不経済である・ 電解質溶液による赤血球の洗浄は最終製品の高い電解質
含量をもたらす。これは特殊な用途、例えば開放心臓の
手術での心臓冠状血管の潅注（心臓発作）Ｋは不都合で
ある。

西独特許公報＠　２２４Ｂ４７５号に記載された方法を
除き、その他のすべてのＩｋｊｌｉ方法では、使用の際
に血清肝炎の伝染が排除されない。

ところが西独特許公報第２２４５１４７５号に記載さｔ
ｔ＋βプ四ビオラクトンによる滅菌法も、この処理が最
初の処理段階として行われる欠点がある。つまり使用さ
れるβプロピオラクトンの量が１赤血球濃縮液の製造に
応じて残留する血漿蛋白質の残量に作用するのである。

このため赤血球に対して、残留血漿量に従って興なるβ
プロピオラクトン膿度が作用する。

大量の血ａｔ−細胞成分と血漿に分離するための連続操
作式遠心分離機も知られており、例えば無ヘモダレビン
血漿の製造のためにＪｌｌ殺場で使用される。しかしこ
の方法では赤血球がはなはだしく傷むので、特に多数回
の通過でほぼ完全に破壊される。それ故、この連続式遠
心分離は赤血球の洗浄には不適当である０ 本発明の目的とするところは、肝炎の恐れのない無菌、
無発熱素、無基質のヘモグロビン溶液を種々の適用領域
に対して、臨床用に必要とされるような大ｊｌｔ−経済
的にｍ造することができ、かつ赤血球の損傷の無い洗浄
を可能にする１上記のヘモグロビンの製造方法を提供す
ることである。

この目的は本発明により次のようにして達成される。す
なわち赤血球濃縮液ｔ−ｌ乃至６倍の容積の、砂糖、砂
糖アルコールまた鉱高分子量コリイドの５乃至１５％水
溶液と攪拌しながら混合し、壌として生理的に適合する
酸で懸濁液のＰＨ値を５乃至６．５に調整し１攪拌機を
停止した後、赤血球を沈降させ、上澄液を除き１場合に
よっては上述の洗浄処理を得た赤血球沈殿物で単数Ｉｇ
ｌまたは複数回反復し、沈殿物のＰＨ値を７乃至８に調
整し、沈殿物音均質化し、そのヘマトクリット′ｆｒ５
５乃至４０襲に調整し、希釈したβプルビオチクトン溶
液で数分乃至２５分処理し１続いて前述の洗浄処理を単
Ｗｋ回または複数回反復し、赤血球を蒸留水にかき混ぜ
て得た溶血質を次にＨ型陽イオン交換体で、ＰＨ値が５
．０乃至５．５に低下するまで処理し１遠心分離及び／
又Ｆｉ濾過によって樹脂と沈殿した基質を＃失し、ＰＨ
値７．２乃至７．６並びに所望のヘモグロビン濃度に調
整し１場合によっては使用目的に応じて必要な添加物を
加え、濾過による滅菌処理をするのである０ 懸濁液中の赤血球は沈降しようとする。この現象は血球
沈降と呼ばれ、医学診断において炎症性過程のｌｌ１ｌ
別のために使用される。正常な血球沈降は約５■／時で
ある。各種の物質の添加によって、赤血球沈降が速めら
れる０沈降促進剤の応用例が文献で知られている。例え
ばアール、ジー、シュドラウス［デキシトラン、ヒドロ
キシエチル殿粉および新しい低分子蓋とドロキシエチル
殿粉の赤血球沈降特性の生体内比較」（工ｎマ１ｔｒｏ
　Ｏｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＣｒｙｔｈ
ｒｏｏｙｔ＊８＊ｄ１ｍ＠ｎｔｉｎｇ　Ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ　ｏｆ　Ｄ＠ｘｔｒａｎ。

Ｈｙ４ｒｏｘｙ＠ｔｈｙｌ　Ｂｔａｒｏｈ　ａｎｄ　Ｎ
ｓｗ　Ｌｏｗ−Ｍｏｌｅｏｕｌａｒ−Ｗ＠ｉｇｈｔ　Ｈ
ｙｄｒｏｘ）ｒｖｔｈｙＬ　８ｔａｒｏｈ　）　、［７
オツクスツアングＪ　　（Ｖｏｗ　８ａｕｇ）　５７　
：　２６　Ｂ−２７１（１？７９年ン（３）によれば、
血小板および白血球濃縮液の製造のために高分子量コロ
イドが使用される。オー、アカープｐムおよびシー、エ
フ、ヘヒマン［スウェーデンにおける赤血球細胞の冷凍
保存の進歩Ｊ　　（Ｐｒｏｇｒ＠ｓｓ　ｉｎ　１ｒ＊＊
ｘ＊−Ｐｒ＠ａ＠ｒｖａｔｌｏｎ　ｏｆ　Ｒ＠（Ｌ　Ｂ
ｌｏｏｄ　０ｓｌｌｓ　ｌｎ　８ｗ＠ｄ＊ｎ　）（赤血
球の低温冷凍保存に関するシンポジウム、１９７５年１
１月２７−２８日、７ランクフルト／マイン）（４）に
よれば、急速冷凍貯蔵の後に解凍された赤血球濃縮液か
らグリセリンを除去する際に１砂糖または砂糖アルコー
ルが使用される。この場合、種々の濃度のグルコースと
フルクトースの混合物が使用され１特定の配合比が指定
される。電解質濃度は１０乃至最大１５ｍｍｏＬ／Ｌ　
Ｋ　ｉｌｌ限される。このようにして１４１　Ｋより沈
降促進剤としての砂糖または砂糖アルコールの使用が公
知であるが、しかしこの促進剤を使用した沈降法はこれ
までヘモグ田ピンＣＤ製造ＶＣおいては（２０年間ノ一
度も試みられたことがなかった。何故なら酸素を輸送す
るヘモグロビン溶液の分野の当業者は、赤血球の急速冷
凍を取扱う保存血液製造業者の分野に示唆を求めないか
らである。

本発明による方法において社、上述の文献の記述と異な
り、砂糖または砂糖アルコールだけで沈降が可能である
ことが判明した。数種の砂糖の特定の混合物は本発明方
法には必要でなく、前述のような人混な用辿を考えると
望ましくないのである。

同様にして、適当に低いＰＨ値で処理すれは、多重沈降
を唯１＃Ｉｌの砂糖濃度で行えば十分である０ 本発明によれば、最大貯蔵期間を超え念ために輸液にも
はや適さない赤血球濃縮液を、血液の種類にかかわりな
くプールして、１乃至６倍、好ましくは２．５倍の容積
の５乃至１！ｉ％、好ましくは１０襲砂糖ま九は砂糖溶
液または高分子量コロイドと攪拌しながら混合する。砂
糖または砂糖アルコールとしてグルコース、マンニトー
ル１フルクトース、ンルビトール、キシリトール並びに
二軸類、例えばサッカ四−ス、麦芽糖を准用することが
できる。高分子量コロイドとしてヒト四キシエチル殿粉
またはデキシトランが適する。懸濁液のＰＨ値は生理的
に適合する酸、例えば１１Ｊ塩酸で５乃至６．５、好ま
しくは５．４に調整する。特に原料の１解質含量が高い
時は、Ｐ、Ｈ値５．４が好適であることが判明し九〇懸
濁液の温度は全処理工程を通して２乃至１８°Ｃ１特に
好ましくは１０°Ｃに保持するとよい◎攪拌機を停止し
た後、赤血球を１５分乃至１０時間、特に好ましくは６
０分間沈降させる０沈降時間の後、上澄を除き、沈殿物
の容積を定め、洗浄処理を反復する・こうして得た赤血
球沈殿物を、ＰＨ値の７乃至８、好ましくは７．４への
調整によって離解し、攪拌により均質化する。沈ｊｌｌ
のヘマトクリツ）ｌ沈降液により５５乃至６０％に調整
する。次に攪拌しながらβプロピオラクトン溶液を速や
かに添加する。１．５％沈降液で調合したばかりのβプ
ロピオラクトン溶ｔｆ！を沈殿物リットル当り０，１６
４７．使用することカ好マしい◎βプロピオラクトンの
添加の前に赤血球を２回または多数回洗浄することは、
前に述へ食方法と比べて、βプロピオラクトンの滅菌効
果に影響する残留血漿がほとんど存在しないという利点
がある。このことは、常に不蛮のβプロピオラクトン濃
度が一定の赤血球容積に作用することを意味する◎ ２０分の作用時間の後にβプロピオラクトンははとんど
完全に反応している。反応生成物の除去の次めに、更に
単数回ま九１１複数回鳥好ましくは５回の洗浄を前述の
ように行う。洗浄した赤血球に蒸留水を添加して、溶血
を生じさせる。溶血は１．５乃至５倍、特に好ましくは
２．５倍の容積の蒸留水でＰＨ７で行うことが好筐しい
０基質の分離のために、５０乃至１５０１好ましくは８
０　ａ＋ｖａｔ／ｌの量のＨ型陽イオン交換樹脂で、Ｐ
Ｈ値が５．０乃至５．５、好ましくは５．１に低下する
まで、溶血質會処理するのが適当である０特に適当な陽
イオン交換樹脂は、乾燥樹脂ｑ当り４乃至５　ｍｖａｔ
の交換能力を持つスルホン酸ポリスチロール陽イオン交
換体、および耐熱性、粒度、顔料含量および交換能力の
点で実質的に互いに具なるその他のボリスチ四−ル樹脂
でめる。絆しくはケイ、ドル７ナ一着「イオン交換体」
　（工ｏｎ＠ｎａｕｇｔａｕｓｏｈ＠ｒ　）ワルター、
デ、グルイタ−、ベルリン（１９４４年）から知ること
ができる＠ ＰＨ餘′Ｊｋ５．２乃至６１好ましくは５．６５に上げ
良後、イオン交換体ｃｍ別し、沈殿した基質を連続遠心
分離及び／又は濾過により除く。ＰＨ値ｔ−７，２乃至
乙６、好ましくは７．４に調整し、所望のヘモグロビン
一度に調整し、また場合によっては別の添加物ｔｓ加し
た後湾ｔＩｌ管滅菌濾過処理の前に再度遠心分離及び／
又は予備濾過する。

添加物は用途に応じて、ヘモグロビンの酸素送出の教養
のための電解質または効果物質、例えば２．５−ジホス
ホグリセリン酸塩、燐酸ピリドキサールま友はへキサ燐
酸イノシトール−ｊｓすることができる◎ 本発明の方法により沈降容器の大きさと利用可能な遠心
器能力に応じて、１回のバッチで任意の量が製造される
。

本発明による極品は添加物の種数に従って、心臓冠状血
管（心臓発作）または切断また挫滅した四肢の潅注に使
用され、あるいは例えば西独特許公報麩２４４９８８５
号またＦｉ第２４１７１５２２号に記載されたような、
化学的に改良された注射用ヘモグロビン溶液の製造のた
めの原料として使用される。

例えば心臓発作用溶液は少量のＮａおよびグルコース含
量を必要とする一方、四肢の潅注のためには生理的Ｎａ
値と高いグルコース含量が望ましい。

科学の現状では、人体に適用するにはヒト赤血球を使用
しなければならない。

実施例１ １１１の赤血球濃縮液を１６０を入り冷却式攪拌機付真
空容器にプールした。体積が２６１となつ光。全処理工
程を通して温度を約１０℃に保持した。１０％グルコー
ス溶液６５ｔｔ−加え、　ＩＩＨ値ｔ−５，４に調整し
た後Ｓ１０分間攪拌し九。次に該混合物ｔ−４５分間沈
降させて１上澄を吸出した。沈殿物ケよ１８．４％のヘ
モグロビンを含み、へＹ）クリットが４９％でめった０
２回目の洗浄の九めに１０％グルコース溶液１１２ｔ１
に補充し、ＰＨ値Ｑ５．４に修正し、１０分間攪拌し、
改めて４５分間沈降させた０ １　Ｎ　１ｌａＯＨ”ＣＰＨ＠　ｆ　７．４に上げた上
で為沈殿物（２８１，ヘマトクリット６７％、ヘモグロ
ビン２５．５％）を攪拌して均質化した。ヘマトクリッ
ト全１０％グルコース溶液で５５乃至６０％（５９％）
に調整した。次に４．９ｔの１．５俸βプシビオツクト
ン溶液を１０％グルコースに速やかに加え、攪拌しなが
ら２０分間作用させた。その際ＰＨ値が７．１４に低下
した。５回目の沈降のため［１０％グルコース溶液を補
充して１００９’／　）ＡＩＫＬ、ＰＨｌｌＭｔＭＵＳ
、４ＫＷＩ４整した◎この沈降処理と４回目および５回
目の沈降処理は１前述のような行った。＃！！Ｓ回、第
４回、＃８５回の沈殿物の容積は５１．２７および２４
リツトルであった。５＠目の沈殿物のＰＨ値を１ＮＮａ
ＯＨで７．０に調整した０６０リツトルの蒸留水と混合
して、溶血を生じさせた・５０分間激しく攪拌した後、
溶血の完全性を調べた。基質の除去のためにまずＮ＆Ｏ
１１４Ｓ　９　、次に固形物ｑ当りの交換能ｔ−４ｍｖ
ａｔｓポリスチロール地の調造の際のジビニルペンゾー
ル分８％、粒度２９７乃至８４０μｍのに１　　型高純
度（）ム級ノ陽イオン交換樹脂２．！４ゆを加え喪・Ｐ
Ｈ値が連続的に低下し喪。

ＰＨ５，１に達した時、２．５リツトルのＮａＯＨを攪
拌しつつ徐々に加えた。ＰＨ値が５．６５に上昇した。

イオン交換体を粗目の鋳で、凛た沈殿し死重ｇＭを約５
０００９で連続遠心分ｌｌ１１により、分離した。こう
して清澄した溶液のＰＨ値を１Ｎ）ＩａＯＨ１，４リツ
トルの添加により７．４に調整したＯＭａｉｌ　２４７
　ｇ、ＮａＨＯｏｌ　１１０　ｇ、グルコース７１５ｇ
を加え１再び遠心分離した◎ 最後の濾過による滅菌処理は二重に、すなわち滅菌濾過
に通常使用されるように、まず深い瀘層により、次に膜
濾過器で行った。

収　　量　　　　　　　　　　　６０　リ　ッ　トルヘ
モグロビン含量　　８％ 実施例２ １２２の赤血球濃縮液を実施例１と同様にプールした０
容＠Ｆｉ２９リツトル、濃度１０℃であった。１０％マ
ン二シール溶液７２．５リットルを加え、ＩＮＨＯＩで
ＰＨ値を５．４に調整した後１１０分間攪拌した。沈降
時間は４５分であって一沈殿物線ヘモグロビン２２．８
％ｔ−含み、へｖトラリット４５弧てあつ良。２回目の
洗浄ｆ：８２．５リツトルの１０％マンニトール溶液で
行った。沈殿物の容積は２４リツトルであった。βプロ
ピオラクトン処理を実施例１と同様に行った。５回目、
４回目、５回目の洗浄のための１０％マンニトール溶液
の量は７５、Ａｓおよび６３リツトルてあった。沈殿物
の容積は２４．２５および１７リツトルであった。以後
は実施例１と同様に処理し九〇 収　　量　　　　　　　　　　　５５　リ　ッ　トルヘ
モグロビン含量　　９％ 実施例５ 第１洗浄液 ０．９％Ｍａｉｌ　中の６％ヒドロキシエチル殿粉＃！
２洗浄液 １．３％ＮａＨＯＯ，中の６襲とドルキシエチル殿粉１
リットルの洗浄液１を１０リットル入り容量に予め入れ
、７の赤血球濃縮液（合計的１．７Ｌ）を攪拌しつつ加
え九０状に別の２．５ｔの洗浄液１ｔ−赤血球懸濁液に
加え、赤血球懸濁液と洗浄液の比？：１：２とした。７
５分以内に細胞が沈降し、その上澄と沈殿物の比が約１
：１となつ九◎上澄を吸出し、沈殿物を５．５Ｌの洗浄
液２で攪拌しつつ再懸濁し、続いて６０分間沈降させた
。なお０．１８％の蛋白質を含む上澄を除いた。ヘマト
クリツ）　５７．５　％の沈殿物に、βプロピオラクト
ン１．５第を含む洗浄液１を４１５１１／ｌ−加え、攪
拌しつつ２０分作用させた。次に洗浄液２を補充して６
ｔとした０ ６０分の後に、ヘモグマピン０．１５％を含む上澄を吸
出し、洗浄液１で沈降を繰返した。続いて実施例１のよ
うに処理した０ 収　　量　　　　　　　　　　　５．５　ｔヘモグ田ビ
ン含量　　７％ 特許出願人　　　ビオテスト−七ルムーインスチチュー
トゲゼルシャフト　ミツト　ベシュレンクターノ為７ツ
ング 外２名゛

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　赤血球の！プロピオラクトン処Ｉｆ　、溶ｍ［、
   Ｈ”型陽イオン交換樹脂による溶直質の処理、基質脂質
   の定量分離および滅菌濾過による、肝炎の恐れのない無
   菌、無発熱素、無基質の低カリウム含量ヘモグロビン溶
   液の製造方法において、赤血球濃縮液ｔ−ｌ乃至６倍の
   容積の砂糖の・砂糖アルコールのまたは高分子量コロイ
   ドの５乃至１５５ｇ水溶液と攪拌しながら混合し、塩と
   して生理的に適合する酸で懸濁液のｐｎ値を５乃至６．
   ５に調整し、攪拌機を停止した後、赤血球を沈降させ、
   上澄液を除き、場合によっては上述の洗浄処理ｔ〜得ら
   れた赤血球沈殿物で単数回または複数回反復しＳ該沈殿
   物のＢＥ値を７乃至８に調整し、沈殿物を均質化し、そ
   のヘマトクリツ）１ｉ５５乃至６０≦に調整し、希釈し
   たβブロビオフクトン溶液で数分乃至２５分蛤理し、続
   いて前述の洗浄処理を単数回ｉ次＃′ｉｖＩｗｋ回反復
   し、赤血球を蒸留水にかき混ぜて得た溶血質を次にＨ型
   陽イオン交換体で、ＰＨ値が５．０乃至５．５に低下す
   るまで処理し、遠心分離及び／又は濾過によって樹脂と
   沈殿した基質を除去し１ｐＨ軸７，２乃至７．６並びに
   所望のヘモダルビン濃度に＃調整し、場合によっては使
   用目的に応じて必要な添加物を加え、濾過による滅菌処
   理をすることを特徴とする肝炎の恐れのない無菌、無発
   熱素、無基質のヘモグロビン溶液の製造方法。 ２、、　　骸洗浄処理の際にＭ濁液の温度を２乃至１８
   ℃に保つことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 五　該沈降処理の前Ｖｃ該懸濁液のＰＨ値′ｔ５，４に
   調整することを特徴とする特許請求の範囲第１項又は＃
   １２項に記載の方法◎ Ｌ　該赤血球を１５分乃至１０時間にわたって沈降させ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第５項の
   何れか１項に記載の方法。 ５、該βプロピオラクトン処理の前に沈殿物のＰＨ値を
   ７．４に調整することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項乃至第４項の何れか１項に記載の方法。 瓜　該赤血球の洗浄をβプロピオラクトン処理の前に２
   回、後ＶＣ５回行うことを特徴とする特許請求の範１！
   ｌ！１項乃至ＩＩｌ！５項の何れか１ＸＪに記載の方法
   。