RU2819064C1 - Способ получения порошкообразного оксигемоглобина из артериальной крови крупного рогатого скота - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к технологии получения оксигемоглобина из артериальной крови крупного рогатого скота. Способ получения оксигемоглобина из артериальной крови крупного рогатого скота включает разделение артериальной крови на плазму и эритроцитарную массу (ЭМ) путем отстоя в течение 6 ч с последующим промыванием ЭМ талой водой, очищенной от солевых примесей и тяжелой воды, при соотношении ЭМ:вода в суспензии 1:1-1:10 и рН суспензии 8,2, который обеспечивают добавлением в суспензию бикарбоната натрия. Далее сепарированием отделяют гемоглобинную массу, содержащую оксигемоглобин, с удельным весом 1,3-1,4 г/см³, которую замораживают при температуре от –(20-60)°С и подвергают сублимационной вакуумной сушке при давлении 10-20 Па. Затем проводят измельчение высушенной массы до размера частиц 10-50 мкм и упаковку в полиэтиленовые пакеты в инертной атмосфере азота, при этом высушенный порошок представляет собой оксигемоглобин с чистотой 95-99% и содержанием двухвалентного гемового железа до 0,3%. Предлагаемый способ получения оксигемоглобина имеет упрощенную технологию, исключает применение химических реагентов, позволяет получить порошкообразный продукт с содержанием оксигемоглобина высокой чистоты 95-99%, повышенной биодоступности, высокоэффективными противоанемическими свойствами и гипоаллергенностью. 1 пр.

Description

Известен способ, в котором можно предположить масштабное производство добавки гемоглобина в кондитерские изделия (п. RU 2183408, 20.06.2002, A23G 3/00, A23L 1/0). Добавка представляет собой порошкообразный состав, включающий белки крови сельскохозяйственных животных, в том числе гемоглобин 30-80% от общей массы добавки. При этом гемоглобин содержит железо в количестве от 0,05 до 0,3% от массы содержащейся в добавке гемоглобина. Недостатком этого изобретения является низкий процент гемоглобина (30-80%), большой разброс концентрации железа (0,05-0,3%), неизвестна валентность железа в гемоглобине, наличие примесей.

Известна добавка на основе гемоглобина (п. RU 2031596, A23J 1/06, 27.03.1995). Добавку широко применяют в качестве красного красителя в колбасных изделий, сладких пищевых продуктах и для обогащения продуктов легко усвояемым двухвалентным железом. Добавка может быть использована в рационах лечебного и лечебно-профилактического питания при заболеваниях, сопровождающихся ЖДА состоянием организма человека. Согласно данному изобретению обработку крови проводят ультразвуком частотой 22 кГц перед насыщением ее оксидом углерода в течение 10-15 минут, а перед тепловой обработкой насыщенную кровь расфасовывают в емкости. Тепловую обработку ведут путем погружения емкостей в воду, нагретую до 72-74 С, на 90-95 минут. При этом в качестве емкостей используют полиэтиленовые пакеты, после расфасовки насыщенной крови, пакеты герметизируют, а после тепловой обработки краситель охлаждают до 2-4 С. Данное изобретение представляет интерес в том плане, что добавка содержит железо в двухвалентной форме. Недостатком изобретения является сложность аппаратурного оформления и неизвестно как получить продукт чистого гемоглобина с концентрацией не ниже 95%.

Наиболее близким аналогом (Прототип) для заявленного изобретения является способ получения гемоглобина из крови сельскохозяйственных животных путем разделения крови на плазму и эритроциты, получение гомолизата, очистку от балластных веществ фильтрованием, концентрирование с помощью ультрафильтрации с последующей фильтрацией, стерилизацией, и лиофилизацией целевого продукта (RU 2274003 С2), при этом эритроциты разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:2 до 1:4 и замораживают при температуре -20°С, затем размораживают и концентрируют кристаллизацией при 10-15°С при рН 6,8-7,2 и целевой продукт после стерилизующей фильтрации лиофилизируют.

Недостатком данного способа является, что для получения гемоглобина с высоким выходом 95-99% и содержанием железа до 0,3% от массы гемоглобина требуется много дополнительных операций (особенно при заборе и подготовки общей крови), необходимость анионообменной хроматографии, что затрудняет масштабирование технологии получения гемоглобина, не указана валентность железа в продукте, сложный способ очистки конечного продукта.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка относительно дешевого, простого промышленного способа производства высокоэффективной фракции гемоглобина, а именно порошкообразного оксигемоглобина с чистотой 95-99% и с содержанием двухвалентного железа до 0,3%, пригодного для лечения и профилактики ЖДА человека.

Поставленная задача решается тем, что предлагаемый способ предусматривает в качестве первой операции забор артериальной крови крупного рогатого скота, ее разделения путем отстоя не менее 5 часов на плазму и эритроцитарную массу (далее по тексту - ЭМ), при этом плазма удаляется, а ЭМ поступает на следующую операцию промывки «легкой», талой очищенной водой, которую получают путем последовательной заморозки и разморозки и удалением 10-15% части воды с концентрированными солями и «тяжелой водой». Оставшиеся 85-90% воды соединяют с ЭМ и доводят до рН 8,2. Полученный раствор ЭМ сепарируют, получают фильтрат, который удаляют, а гемоглобинную массу (ГМ) с удельным весом р=1,3-1,4 г/см³ раскладывают на алюминиевые подносы, толщиной слоя не более 10 мм. Затем замораживают при температуре - 20-60°С и подвергают вакуумной (10 Па) сублимационной сушке. Полученный конгломерат гемоглобина измельчают до размера частиц 10-50 мкм, пакуют в атмосфере инертного газа (азот) в полиэтиленовые пакеты. Продукт, оксигемоглобин, с чистотой 95-99% и концентрацией двухвалентного гемового железа до 0,3% готов к употреблению.

Необходимость использования артериальной крови обусловлена тем, что артериальная кровь проходя через печень животного очищается от возможного присутствия в крови различного рода токсинов, химических соединений (например, антибиотиков, паразитов и патогенных организмов и прочего), что положительно скажется на чистоте и качестве конечного продукта. Артериальная кровь содержит высокий процент оксигемоглобина, который является более эффективным и биодоступным для организма человека.

Изобретение относится к технологии выделения биологически активного оксигемоглобина из артериальной крови крупного рогатого скота в виде порошка. Препарат оксигемоглобина в первую очередь служит для профилактики и лечения ЖДА человека, и может применяться как в научно-исследовательских работах, так и для обогащения продуктов питания. Огромная потребность в оксигемоглобине для этих целей требует создания способов и технологий для масштабного производства этого продукта. Задачей предлагаемого способа является упрощение и удешевление процесса получения порошкообразного оксигемоглобина с чистотой 95-99% и содержанием двухвалентного гемового железа до 0,3%.

Поставленная задача достигается разделением артериальной крови крупного рогатого скота на плазму и эритроцитарную массу (ЭМ) путем отстаивания (не менее 5 часов), при этом плазма удаляется, а ЭМ отправляется на следующую операцию промывки.

Операция промывки сводится к разбавлению ЭМ «легкой», очищенной, талой водой с рН 8,2 в соотношениях ЭМ к воде как 1:1 до 1:10 до получения коллоидного раствора соответственно. Соотношение ЭМ к воде устанавливается экспериментально в зависимости от состояния эритроцитарной массы. При заморозке воды, присутствующие в ней соли, а также «тяжелая» вода, концентрируются в конечной порции замерзшей воды. При разморозке эта конечная порция тает в первую очередь. Если при разморозке удалить 10-15% от общей массы воды, то оставшиеся 85-90% будут представлять очищенную от примесей и «тяжелой» воды «легкую» талую воду. Следует отметить, что такая вода сохраняет структуру льда, что положительно сказывается при ее употреблении и использовании. Разведенная суспензия ЭМ дополнительно коррелируется до рН 8,2. Такая величина рН обусловлена получением изоэлектрической точки частиц гемоглобина, что способствует коагуляции и расслоению суспензии на коллоидный раствор и фильтрат.

При прибавлении к коллоидному раствору небольших количеств электролитов происходит перезарядка (изменение знака заряда поверхности коллоидной частицы) наступает момент, когда на поверхности коллоидной частицы нет электрического заряда, что соответствует изоэлектрической точки системы для крови крупного рогатого скота. Сила отталкивания коллоидных частиц, обусловленная одноименными зарядами, перестает действовать и частицы начинают коагулировать, и как следствие выпадать в осадок. (Некрасов Б.В. «Основы общей химии», М. Химия 1974 г., Том 1, стр. 195, стр. 617.) В нашем случае, чтобы привести стабильную систему коллоидной эритроцитарной массы к коагуляции, достаточно естественный рН крови равный 7,35-7,45 ед сдвинуть до рН 8,2 ед. путем добавления небольшого количества электролита. Следует отметить важность такой технологии промывки («легкая» талая вода при рН 8,2 ед) на оптимальные условия проведения последующих операций и в конечном счете на качество, чистоту конечного продукта. Подготовленный коллоидный раствор поступает в сепаратор, где происходит механическое разделение коллоидного раствора на фильтрат (который сбрасывается в отходы) и гемоглобинную массу (ГМ) с плотностью 1,3-1,4 г/см³. Основу данной массы составляет оксигемоглобин.

Подносы с замороженной ГМ помещаются в вакуумную камеру (10 Па), где ГМ подвергается сублимационной сушке, в результате которой получаем конгломерат оксигемоглобина с чистотой 95-99% и содержанием двухвалентного гемового железа до 0,3%. Время сушки определяется экспериментально и зависит от массы ГМ и других факторов. Высушенный гемоглобин быстро измельчают до частиц размером 10-50 мкм. Измельчение частиц менее 10 мкм приводит к значительным потерям, а частицы размером более 50 мкм менее биологически доступны для организма человека. Порошок оксигемоглобина упаковывают в полиэтиленовые пакеты в атмосфере инертных газов (азот). Пакеты поступают на хранение при температуре не более 35°С, влажности не более 70% и на срок хранения не более 2 лет.

При реализации способа используются аппаратура и устройства известных технических решений исключительно отечественного производства.

Пример промышленного получения порошкообразного оксигемоглобина.

1. 35 л артериальной крови КРС заливаем в емкость, отстаиваем в течение 6 часов, после чего удаляем плазму.

2. Оставшиеся 10 л желеобразной эритроцитарной массы заливаем 18 л очищенной «легкой» талой водой. Путем обработки полученной суспензии бикарбонатом натрия (NaHCO₃) доводим суспензию до рН 8,2 ед. (изоэлектрическая точка для крови КРС), то есть для отсутствия заряда на поверхностях коллоидных частиц, что способствует процессу их коагуляции. Экспериментально, с отдельной пробой по вискозиметру ВЗ-246 с выходным отверстием диаметром 4 мм, определяем количество очищенной «легкой» талой воды, которой необходимо добавить к 18 литра суспензии, чтобы ее вязкость стала равной 15 сек., которая является оптимальной для следующей операции сепарирования. В нашем случае следует добавить 2 литра очищенной «легкой» талой воды. Вращением мешалок суспензию эритроцитарной массы подвергают механическому измельчению, в результате которого происходит частичное разрушение оболочек эритроцитов с получением коллоидного раствора гемоглобинной массы, при этом фильтрат удаляется. Все операции по пункту 2 осуществляют в одной и той же емкости, что и в пункте 1 в атмосфере азота.

3. Подготовленный коллоидный раствор поступает в сепаратор, где происходит ее механическое разделение на гемоглобинную массу (ГМ) с плотностью 1,3-1,4 г/см³ и фильтрат, состоящий из разрушенных белковых оболочек эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, который сбрасывается в отходы. Основу гемоглобинной массы представляет оксигемоглобин

4. Полученную гемоглобинную массу в количестве 3,3 литра разливаем в алюминиевые поддоны с толщиной слоя не более 10 мм и подвергаем заморозке при температуре - 20-60°С в холодильных камерах. При замораживании происходит рост кристаллов льда (с поверхности внутрь) при котором происходит дальнейшее разрушение оставшихся целыми оболочки эритроцитов, неразрушенных при механическом измельчении ЭМ. Также разрушаются мембранные оболочки любых клеток, содержащих цитоплазму, чем достигается полная «стерилизация» продукта.

5. После заморозки поддоны с замороженной ГМ помещаются в вакуумную камеру (10 Па), где подвергаются сублимационной сушке. Затем начинается подогрев поддонов и собственно процесс сублимации, то есть фазовый переход воды из кристаллического состояния в газообразный. По мере высыхания продукта температура подогрева поддонов увеличивается и процесс ведется до достижения стабильного вакуума в 10-20 Па. Затем в камеру подается очищенный азот т производится плавное «натекание» инертной атмосферы в продукт. При достижении атмосферного давления в 100 кПа процесс заканчивается. Готовый продукт перемещается из поддонов в бункер-измельчитель и по закрытому трубопроводу подается на фасовку, где процесс также ведется с замещением воздуха на азот. Далее расфасованные пакеты по 0,5-1 кг вакуумируются и запаиваются.

Время сушки определяется экспериментально и зависит от массы ГМ и других факторов. Высушенный оксигемоглобин быстро измельчают до частиц размером 10-50 мкм. Измельчение частиц менее 10 мкм приводит к значительным потерям, а частиц с размером более 50 мкм являются биологически менее доступными для организма человека.

Из 3,3 литра концентрата (гемоглобинная масса) получается 1,3-1,4 кг готового продукта (порошка темного цвета).

Таким образом, техническим результатом заявленного изобретения является способ промышленного производства порошкообразного оксигемоглобина высокой степени чистоты 95-99% с содержанием двухвалентного гемового железа до 0,3% в готовом продукте, без использования каких-либо химических веществ на всех стадиях производства. Конечный продукт обладает высоко эффективными противоанемическими свойствами, высокой растворимостью, легкой усвояемостью организмом человека, гипоаллергенностью и полным отсутствием побочных эффектов при употреблении.

В настоящее время патологические состояния человека, такие как: нарушение деятельности сердечно-сосудистой, дыхательной, иммунной, нервной систем, за частую обусловлены малокровием или дефицитом железа (анемией). Наглядным признаком ЖДА служит повышенная утомляемость, отдышка, учащенное сердцебиение, бледность и шелушение кожи, головокружение, депрессия и другие. Лечение ЖДА в основном сводится к приему препаратов на основе неорганических и органических соединений железа. Недостатком многих препаратов является низкое усвоение организмом человека, входящего в их состав, ионизированного железа, не более 1-2%. Избыток неосвоенного железа ведет к многочисленным болезненным побочным эффектам (боли в области желудка, диспепсия, головная боль, аллергические реакции организма, метеоризм, запоры и другие, что практически сводит на нет положительное действие препаратов. Одновременно угнетаются механизмы естественного всасывания железа с помощью белков переносчиков из обычной пищи.

Известно, что железо в гемовой форме из продуктов животного происхождения (например, мясо) усваивается в 6-10 раз эффективнее, чем из растительных продуктов и химических соединений железа. В продуктах животного происхождения железо находится в составе миоглобина мышц и различных форм гемоглобина крови в гемовой форме. Эта первичная форма поступления и основа для последующего распределения железа в организме человека (трансферрин, ферритин, некоторые ферменты и прочие). В этой связи для лечения и профилактики ЖДА в организме человека является использование либо самого гемоглобина, либо препаратов на его основе, в которых концентрация железа увеличена. При этом доказано, что наибольший эффект дают препараты, в которых железо содержится в двухвалентной гемовой форме, а именно препараты, в которых преобладает оксигемоглобин (гемовое железо, связанное с атомом кислорода).

Основным недостатком многих известных способов получения препаратов на основе гемоглобина с концентрированным содержанием железа до 0,3% (осаждение, хроматография, ультрафильтрация и другие) это невозможность очистки конечных продуктов от применяемых химических реагентов, большие потери продукта, а также сложность их масштабирования и высокая стоимость производства. В этой связи разработка промышленных способов получения препаратов из крови животных, содержащих гемоглобин высокой частоты (95-99%) с концентрацией железа до 0,3% и более медико-биологически доступных для организма человека и решающих задачу ликвидации ЖДА в кратчайшие сроки, является народнохозяйственной и социальной задачей.

Claims (1)

1. Способ получения оксигемоглобина из артериальной крови крупного рогатого скота, характеризующийся тем, что артериальную кровь разделяют на плазму и эритроцитарную массу (ЭМ) путем отстоя в течение 6 ч с последующим промыванием ЭМ талой водой, очищенной от солевых примесей и тяжелой воды, при соотношении ЭМ:вода в суспензии 1:1-1:10 и рН суспензии 8,2, который обеспечивают добавлением в суспензию бикарбоната натрия, далее сепарированием отделяют гемоглобинную массу, содержащую оксигемоглобин, с удельным весом 1,3-1,4 г/см³, которую замораживают при температуре от –(20-60)°С и подвергают сублимационной вакуумной сушке при давлении 10-20 Па, затем измельчают до размера частиц 10-50 мкм, упаковывают в полиэтиленовые пакеты в инертной атмосфере азота, при этом высушенный порошок представляет собой оксигемоглобин с чистотой 95-99% и содержанием двухвалентного гемового железа до 0,3%.