JPH0532036B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、ガラクチトール（別名ダルシトー
ル）の測定方法に関するものであり、更に詳しく
は、体液を、生体外でガラクチトールからＤ−タ
ガトース産生能を有する細菌と接触せしめ、体液
中に含まれるガラクチトールをＤ−タガトースに
変換させ、このＤ−タガトースを測定する方法に
関する。 （従来の技術） Ｄ−ガラクトースは、生体内でガラクトキナー
ゼ（EC2.7.1.6）及びガラクトース−１−リン酸
塩ウリジントランスフエラーゼ（EC2.7.7.10）の
酵素系によりＤ−グルコース−１−リン酸塩に変
換されて代謝し利用されることが知られている。 しかし、この酵素系が遺伝的に欠損しているな
どして代謝に異常のある場合には、Ｄ−ガラクト
ースが体内に蓄積し、アルドースリダクターゼ
（EC1.1.1.21）によつてガラクチトールに還元さ
れることにより、血液、尿などの体液にその存在
が認められる。 ガラクチトールが多量に蓄積され、眼のレンズ
に晶出してくるのが白内障の主な原因であると言
われている。 従つて、血液、尿などの体液に含まれているガ
ラクチトールを検出または定量することは、白内
障の予防、診断上きわめて重要である。 ガラクチトールの測定方法としては、通常、ポ
リアルコールの測定方法、例えば、デイクソン、
ゼイ．エス．（Dixon、J.S.）等がアナリテイカル
ケミストリー（Analytical Chemistry）第26
巻第1092〜1093頁（1954年）に報告されている方
法が採用されている。この方法は、ポリアルコー
ルを過ヨウ素酸塩を用いて酸化し、この生成物を
発色させて比色測定する方法であつて、ポリアル
コールの違いが判別できず、総量が測定されるに
過ぎない。しかも、グルコースなどの還元性物質
の共存によりこの測定は妨害を受け、測定値を補
正するなどの作業を必要とする。 また、ガラクチトールは、ガスクロマトグラフ
イーによつて測定することができる。しかし、こ
の方法は、TMS化などの煩雑な前処理を必要と
するだけでなく、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビ
トールなど他のポリオールとの分別定量に高度の
熟練を必要としている。 （発明が解決しようとする問題点） 体液中のガラクチトールを容易に定性的または
定量的に測定する方法は、望まれているにもかか
わらず、未だ適当な方法が開発されていない。本
発明は、この点を解決しようとするものである。 （問題を解決するための手段） 本発明者等は、体液中のガラクチトールを容易
に測定することを目的として、生化学的手段に着
目し鋭意研究を続けてきた。 その結果、体液を、生体外でガラクチトールか
らＤ−タガトース産生能を有する細菌と接触せし
め、体液に含まれるガラクチトールをＤ−タガト
ースに変換させ、このＤ−タガトースを測定する
方法が好適であることを見いだし、本発明を完成
した。 ガラクチトールからＤ−タガトース産生能を有
する細菌としては、例えば、バイオケミカル ジ
ヤーナル（Biochemical Journal）第64巻第394
〜405頁（1956年）で報告されているシユードモ
ナス属に属する細菌や、アプライド アンド エ
ンビロメンタル マイクロバイオロジー
（Applied and Enviromental Microbiology）第
46巻第1055〜1057頁（1984年）に本発明者等が報
告しているアルスロバクター属に属する細菌など
が適宜使用される。 なかでも、ガラクチトールからＤ−タガトース
への高い変換能を有しているアルスロバクター・
グロビフオルミス（Arthrobacter globiformis）
ST−48、または、これの変異株は、本発明に有
利に利用できる。 アルスロバクター・グロビフオルミス ST−
48は、昭和59年５月１日付で、工業技術院微生物
工業技術研究所に、微生物受託番号 FERM Ｐ
−7592として寄託されている。 このアルスロバクター・グロビフオルミスST
−48の菌学的性質を、以下に記載する。 Ａ 採集地及び分離源 採集地 岡山県津山市 分離源 土壌 Ｂ 細胞の形態 (1) 細胞の形及び大きさ 桿菌 球形および楕円形も少し見られる。 0.6〜0.8×1.0〜2.0μ (2) 細胞の多形性の有無 数は少ないがカーブした細胞が見られる。 (3) 運動性の有無 無 (4) 鞭毛の着生状態 無 (5) 胞子の有無 無 (6) グラム染色性 陰 性 (7) カプセル（莢膜）の有無 無 (8) 抗酸性 無 Ｃ 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養（28℃ ５日） 菌の生育はやや遅く、５日後に２〜３mmの
コロニーを形成する。 コロニーは、不透明な湿光を滞びた黄白色
の円形で、表面は平滑であり、半レンズ状の
隆起をしている。周縁は全縁で内容は均質で
ある。色素は生成しない。 (2) 肉汁寒天斜面培養（28℃ ５日） 菌の生育はやや遅く、中程度である。コロ
ニーは半透明で湿光を滞びた灰白色をし、糸
状で表面は平滑であり扁平な隆起をしてい
る。粘稠であるが、色素は生成しない。 (3) 肉汁液体培養（28℃ ３日） 菌の生育はやや遅く、全体的に薄く濁つてく
る。液表面に厚膜状の生育がみられ、粉状の沈
殿を形成する。色素、ガスは生成しない。 (4) 肉汁穿刺培養（28℃ ５日） 培地表面にコロニーの形成がみられ、穿刺
線の上層部にはとげ状の生育がみられる。ガ
ス、色素は生成しない。 (5) 肉汁ゼラチン穿刺培養 （20℃ 40日） 培地表面に穿刺部を中心にコロニーが形成
され、穿刺線上層部にとげ状の生育がみられ
るが、液化しない。 （28℃ 40日） 全体的に生育する。培養終了後、冷却する
とゼラチンは固化する。 (6) リトマス・ミルク（28℃ 40日） リトマスは変化せず、ブロム クレゾー
ル・パープル（BCP）は青色となりアルカ
リ性を示すが、液化、凝固は見られない。 Ｄ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元 陽 性 (2) 脱窒反応 陽 性 (3) MRテスト 陰 性 (4) VPテスト 陰 性 (5) インドールの生成 陰 性 (6) 硫化水素の生成 陽 性 (7) デンプンの加水分解 陽 性（非常に弱い） (8) クエン酸の利用 陽 性 (9) 無機窒素源の利用
硝酸塩・アンモニウム塩いずれも利用 (10) 色素の生成 生成せず (11) ウレアーゼ 陽 性 (12) オキシダーゼ 陽 性 (13) カタラーゼ 陽 性 (14) 生育の範囲 生育PH５〜８ 生育温度５〜37℃ 食塩濃度０〜３％ (15) 酸素に対する態度 好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト
糖（グルコース）をほとんど分解しない (17) 糖類から酸及びガスの生成の有無 酸 ガス Ｌ−アラビノース ＋ − Ｄ−キシロース ＋ − Ｄ−グルコース − − Ｄ−フラクトース − − シヨ糖 − − 乳 糖 − − マンニトール − − グリセロール − − (18) 生育PH（プロテオースペプトン・グルコー
ス培地） PH7.62 (19) セルロースの分解 陰 性 (20) 温度抵抗性 80℃、10分の処理で菌生育せず (21) 栄養要求性 なし 本菌株は、上述の菌学的性質から、バージーズ
マニユアル オブ デイタミネイテイブ バクテ
リオロジー（Bergey′s manual of
determinative bacteriology）第７版（1957年）、
第８版（1974年）に準じて分類すれば、グラム陰
性、好気性の桿菌であり、胞子を形成せず、運動
性なく、また、カタラーゼおよびオキシダーゼが
陽性であり、多形性も一部みられ、土壌中より分
離されたことからアルスロバクター属に属する。
更に、詳細に見れば、本菌株は、糖類からの酸の
生成が少なく、硝酸塩を還元し、インドールの生
成がなく、窒素源として硝酸塩、アンモニウム塩
を利用できる。また、クエン酸も利用できるが色
素を生成せず、更に、37℃でも生育し、デンプン
も弱いが分解することから、アルスロバクター・
グロビフオルミス（Arthrobacter globiformis）
と同定され、アルスロバクター・グロビフオルミ
ス ST−48と命名された。 本発明で使用する細菌は、ガラクチトールから
Ｄ−タガトースへの変換能が高い程望ましく、通
常、ガラクチトール、ソルビトールなどの糖アル
コールを炭素源とした栄養培地中で好気的に培養
して調製される生菌体が有利に利用できる。 また、本発明に使用する細菌は、培養直後の生
菌体に限る必要はなく、それが、例えば凍結融解
菌体、凍結乾燥菌体、固定化菌体であつても、ガ
ラクチトールからＤ−タガトースへの変換能を有
している限り使用できる。 固定化菌体の場合には、例えば、生の細菌を中
性ないし微酸性下でトルエン２，４−ジイソシア
ネートなどのジイソシアネート化合物や、グルタ
ールアルデヒドなどのジアルデヒド化合物で処理
した細菌、半透膜製のホローフアイバーに封入し
た細菌、寒天、ゼラチン、κ−カラギーナン、ア
ルギン酸塩などで包括し、ビーズ状、シート状な
どの各種形状に固定化した細菌などとして、ガラ
クチトールからＤ−タガトースへの変換に繰り返
し利用することも好都合である。 また、本発明でいう体液とは、ヒトまたはヒト
以外の温血動物などから採取した血液、尿などの
各種体液を意味する。 体液を、生体外でガラクチトールからＤ−タガ
トース産生能を有する細菌と接触せしめると言う
ことは、例えば、採取した体液を、そのままで、
または遠心分離、除蛋白、透析などの処理をした
後、マイクロウエル、磁性皿、試験官、フラスコ
などの適当な容器にとり、これにガラクチトール
からＤ−タガトース産生能を有する細菌を加え、
体液中のガラクチトールをＤ−タガトースによく
変換させるため、通常、約10〜50℃の好気的条件
で約0.1〜100時間インキユベートすることであ
る。 このようにして、変換され生成したＤ−タガト
ースを定性的または定量的に測定する方法は、適
宜に選択できる。 例えば、Ｄ−タガトースが還元糖であることを
利用したフエーリング法、ケトースであることを
利用したシステイン・カルバゾール法などの化学
的方法、またＤ−タガトースがガラクチトールデ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.16）と特異的に反応
すること、すなわち、Ｄ−タガトースの量と反応
に使用するNADH₂の340nｍにおける減少量とが
比例することを利用した生化学的方法などを利用
すればよい。 このようにして、体液中のガラクチトールは、
Ｄ−タガトースに高率で変換され、このＤ−タガ
トースを測定することによりガラクチトールを容
易に測定できることとなつた。 本発明の血液、尿など体液中におけるガラクチ
トールの測定方法は、ガラクトース代謝異常者の
発見、ガラクトース代謝異常の予防、診断などの
ための検査方法として有利に利用できる。 次に、実験を用いて本発明を説明する。 実験１ 硫酸アンモニウム0.2w／ｖ％、リン酸−カリ
ウム0.24w／ｖ％、リン酸二カリウム0.56w／ｖ
％、硫酸マグネシウム・７水塩0.01w／ｖ％、酵
母エキス0.5w／ｖ％、ガラクチトール2w／ｖ％
および脱イオン水からなる培養液100mlずつを500
ml容振とうフラスコ20本にとり、120℃で20分間
オートクレーブした後、アルスロバクター・グロ
ビフオルミス ST−48 FERM Ｐ−7592を１白
金耳ずつ植菌し、30℃で７日間振とう培養した。 培養終了液をガスクロマトグラフイーで分析し
たところ、ガラクチトールは検出されず、Ｄ−タ
ガトースは原料ガラクチトールの約85％の収率で
あつた。培養終了後、培養液を遠心分離して細菌
と上清とを別々に採取した。 得られた上清に25w／ｖ％硫酸亜鉛を1/10容加
えPH7.6に調整し、遠心分離して上清を採取した。
この上清を、常法に従つて、活生炭を用いて脱色
し、次いで、ダイヤイオンSKIB（Ｈ型、三菱化
成工業(株)製造の商品名）およびダイヤイオン
WA30（OH型、三菱化成工業(株)製造の商品名）を
用いて脱塩し、減圧濃縮して濃度約95％の透明な
シラツプを得た。これに約３倍容の無水エタノー
ルを加えて混合し、室温に放置してＤ−タガトー
スの結晶を晶出させた。本結晶を別し、無水エ
タノールで洗浄した。得られた結晶をできるだけ
少量の水に溶解し、これに３倍容の無水エタノー
ルを加えてＤ−タガトースを再結し、同様に
別、洗浄し、Ｄ−タガトースの結晶を採取した。 Ｄ−タガトースのガラクチトールに対する収率
は、約70％であつた。 このようにして得られた結晶を同定するため、
Sigma社が市販している試薬Ｄ−タガトース結晶
と、その理化学的性質を比較実験した。この実験
においては、Sigma社の試薬Ｄ−タガトース結晶
を標準Ｄ−タガトースと呼び、本発明の方法で得
られたＤ−タガトース結晶を本発明調製品と呼
ぶ。 (1) ペーパークロマトグラフイーでの比較 東洋紙No.50にスポツトし、展開溶媒（ｎ
−ブタノール：酢酸：水＝12：３：５）、また
は、展開溶媒（酢酸エチル：ピリジン：水＝
12：５：４）を用いて上昇法で展開し、アルカ
リ性硝酸銀で発色し、R_f値を比較した。

【表】 (2) 融点の比較

【表】 (3) 比液光度の比較

【表】 (4) 赤外線吸収スペクトルの比較 KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルの
結果を第１図に示す。 第１図から明らかなように、標準Ｄ−タガト
ースの吸収スペクトルと本発明調製品のそれは
よく一致している。 以上の結果から明らかなように、本発明の方法
で得られた結晶は、Ｄ−タガトースであると判断
される。 実験２ (1) 固定化菌体の調製 実験１の方法で得た菌体を、0.05Mリン酸塩
緩衝液（PH7.0）で洗浄した後、遠心分離して
集菌した。本菌体を水で懸濁して、懸濁液ml当
り菌体湿重１ｇを含む菌体懸濁液を調製した。 0.6％塩化ナトリウム水溶液12mlにκ−カラ
ギーナン0.4ｇを加熱溶解した後、45℃に保ち、
これに、先に調製した菌体懸濁液２mlを加えて
混合し、冷却して固化した。 次いで、0.3M塩化カリウム水溶液に保持し
て、約１mm角に切断、成形し、同水用液にて保
存した。 (2) 固定化菌体のＤ−タガトースへの変換能の向
上 実験１の培養液のうち、酵母エキス0.5w／
ｖ％、ガラクチトール 2w／ｖ％を、酵母エ
キス0.1w／ｖ％、Ｄ−ソルビトール0.5w／ｖ
％に換えた培養液100mlを50ml容振とうフラス
コにとり、実験１と同様にオートクレーブした
後、実験２−(1)で調製した固定化菌体を加え、
30℃で12時間振とうし、固定化菌体を過採取
した。 得られた固定化菌体一片当りのガラクチトー
ルからＤ−タガトースへの変換能は、実験２−
(1)の固定化菌体と比較して、約８〜10倍に向上
した。 (3) ガラクチトールの定量 0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）0.5ml、ガラ
クチトールをml当り０〜100μｇ含有している
供試液0.5mlおよび実験２−(2)で調製した固定
化菌体一片（0.06ｇ）を加えて試験管にとり、
35℃で１時間振とうした。次いで、固定化菌体
を除去した反応液を用いて、ジヤーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Journal of
Biological Chemistry）第192巻第583〜587頁
（1951年）に報告されているシステイン カル
バゾール（cysteine carbazule）法に準じて、
すなわち、Ｄ−タガトース含有水溶液1.0mlに、
1.5w／ｖ％システイン塩酸塩水溶液0.2ml、
70w／ｖ％硫酸塩液 ６mlおよび0.12w／ｖ％
カルバゾールエタノール溶液0.2mlを加え、50
℃で30分間発色させ、１cmセルにおける580n
ｍでの吸光度を測定して第２図に示した。 第２図の結果から明らかなように、ガラクチ
トール濃度は、供試液ml当り20μｇ〜100μｇ
で、580nｍにおける吸光度とよい相関を示し、
ガラクチトールの微量定量方法として充分利用
できることが判明した。 (4) ガラクチトール測定における他の糖類の影響
ガラクチトール測定における他の糖類の影響を
テストした。 他の糖類としては、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトー
ス、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ
−アラビトール、Ｌ−アラビトール、キシリト
ール、リビトール、ミオイノシトール、マルチ
トール、ラクチトール、マルトース、ラクトー
ス、シユクロースを用いた。 ml当りガラクチトール50μｇおよびいずれか
の他の糖類50μｇを含む水溶液を供試液とし
た。対照供試液には、ml当りガラクチトール
50μｇを含む水溶液を用いた。 測定は、実験２−(3)の方法と同様の方法で行
つた。 測定の結果は、いずれも対照供試液の結果と
よく一致し、他の糖類の影響は見られなかつ
た。 以下、本発明における２〜３の実施例を述べ
る。 実施例 １ 定性的測定方法 健常者およびガラクトース代謝異常者各２名の
尿1.0mlずつを採取し、これを多検体透析セルで
透析した。この透析外液を白色磁性皿にとり、こ
れに実験２−(1)の方法で調製した菌体懸濁液の水
50倍希釈液0.1mlずつを加え、35℃で１時間反応
させた後、システイン カルバゾール試薬を加え
て呈色させた。 その結果、健常者の尿の反応液と比較して、ガ
ラクトース代謝異常者の尿の反応液は、いずれも
強く赤紫色に呈色した。 この方法は、ガラクチトールから生成したＤ−
タガトースを定性的に測定する方法であつて、ガ
ラクトース代謝異常者発見のための簡易検査法な
どとして有利に利用できる。 実施例 ２ 定量的測定方法 健常者およびガラクトース代謝異常者各２名ず
つから採尿し、実施例１と同様に透析した後、こ
の透析外液を用いてガラクチトール量を実験２−
(3)の方法に従つて測定した。 その結果、健常者は、どちらにも尿中にガラク
チトールの存在が確認できなかつたのに対し、ガ
ラクトース代謝異常者は、それぞれ尿ml当り
140μｇおよび220μｇのガラクチトールを含んで
いた。 この方法は、ガラクトース代謝異常者の発見の
ための検査法として、またガラクトース負荷テス
トの際の尿中ガラクチトール測定法などとして有
利に利用できる。 実施例 ３ 定量的測定方法 健常者およびガラクトース代謝異常者各２名ず
つから採血したヘパリン加新鮮血を遠心分離して
得られる血清を実施例１と同様に透析した後、こ
の透析外液を用いてガラクチトール量を実験２−
(3)の方法に従つて測定した。 その結果、健常者は、どちらにも血清中にガラ
クチトールの存在が確認できなかつたのに対し、
ガラクトース代謝異常者は、それぞれ血清ml当り
100μｇおよび180μｇのガラクチトールを含んで
いた。 この方法は、ガラクトース代謝異常者の発見の
ための検査法として、またガラクトース負荷テス
トの際の血中ガラクチトール測定法などとして有
利に利用できる。 （発明の効果） 上記したことから明らかなように、従来きわめ
て困難であつた体液中のガラクチトールの測定
が、本発明によつて、他の糖に影響されることな
く、特異的にきわめて容易に定性的、定量的に測
定できることになつた。 従つて、本発明の測定方法は、体液中にガラク
チトールの存在が認められるガラクトース代謝異
常者の発見のための検査方法として、更には、ガ
ラクトース代謝異常の予防、診断のための検査方
法としてなどの用途を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、標準Ｄ−タガトースと本発明調製品
との赤外線吸収スペクトルを示す図である。第２
図は、ガラクチトール濃度と吸光度との関係を示
す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 体液を、生体外でガラクチトールからＤ−タ
   ガトース産生能を有する細菌と接触せしめ、体液
   に含まれているガラクチトールをＤ−タガトース
   に変換させ、このＤ−タガトースを測定すること
   を特徴としたガラクチトールの測定方法。 ２ ガラクチトールからＤ−タガトース産生能を
   有する細菌がシユードモナス属に属する細菌であ
   るか、またはアルスロバクター属に属する細菌で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   のガラクチトールの測定方法。 ３ アルスロバクター属に属する細菌が、アルス
   ロバクター・グロビフオルミスST−48 FERM
   Ｐ−7592であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項または第２項記載のガラクチトールの測定
   方法。 ４ Ｄ−タガトースの測定が定性的方法である
   か、または定量的方法であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の
   ガラクチトールの測定方法。