JPH05264551A - 免疫測定方法及び試薬 - Google Patents
免疫測定方法及び試薬Info
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- JPH05264551A JPH05264551A JP5023679A JP2367993A JPH05264551A JP H05264551 A JPH05264551 A JP H05264551A JP 5023679 A JP5023679 A JP 5023679A JP 2367993 A JP2367993 A JP 2367993A JP H05264551 A JPH05264551 A JP H05264551A
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- sample
- complement
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- acid
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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- G—PHYSICS
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/586—Liposomes, microcapsules or cells
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 (i)測定対象物に対する抗原又は抗体を膜表
面に固定化し、内部に検出可能なマーカー物質を内包し
た、補体活性によって膜溶解作用を受けるリポソーム
と、(ii)補体、とを含んで成る免疫測定用試薬組成物を
用いて被検試料中の測定対象物を定量する測定方法に於
て、被検試料中に存在する測定妨害物質の影響を排除す
るために被検試料の液性を一時的にｐＨ4.5以下の酸性
又はｐＨ11以上のアルカリ性にし、然る後ｐＨを中性付
近に戻して測定を行うことを特徴とする免疫測定方法。 【効果】 本発明は、血清や血漿等を試料とする補体免
疫測定法に於て、被検試料中に含まれる補体成分等の影
響を回避する方法に関する。試料中の測定対象物の正確
な定量、自動分析機でのライン処理が可能となり、リポ
ソームを用いる免疫測定法の精度向上、迅速化、省力化
に優れた効果が期待できる。
面に固定化し、内部に検出可能なマーカー物質を内包し
た、補体活性によって膜溶解作用を受けるリポソーム
と、(ii)補体、とを含んで成る免疫測定用試薬組成物を
用いて被検試料中の測定対象物を定量する測定方法に於
て、被検試料中に存在する測定妨害物質の影響を排除す
るために被検試料の液性を一時的にｐＨ4.5以下の酸性
又はｐＨ11以上のアルカリ性にし、然る後ｐＨを中性付
近に戻して測定を行うことを特徴とする免疫測定方法。 【効果】 本発明は、血清や血漿等を試料とする補体免
疫測定法に於て、被検試料中に含まれる補体成分等の影
響を回避する方法に関する。試料中の測定対象物の正確
な定量、自動分析機でのライン処理が可能となり、リポ
ソームを用いる免疫測定法の精度向上、迅速化、省力化
に優れた効果が期待できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、補体によるリポソーム
の膜溶解作用を利用した免疫測定方法の改良に関する。
の膜溶解作用を利用した免疫測定方法の改良に関する。
【０００２】
【発明の背景】免疫測定法は、抗原抗体反応を利用した
測定法であり、例えば体液中のタンパク質，ホルモン，
活性ペプチド，オータコイド，腫瘍マーカー，免疫グロ
ブリン等の生体成分、ジゴキシン，フェニトイン，フェ
ノバルビタール等の薬剤等の微量成分を特異的に測定す
る方法の一つとして広く用いられている。現在一般によ
く用いられている免疫測定法としては、例えばラジオイ
ムノアッセイ法（ＲＩＡ法）やエンザイムイムノアッセ
イ法（ＥＩＡ法）等が挙げられる。これらの方法は検体
中の微量成分を定量的に測定し得る方法ではあるが、夫
々問題点も有している。即ち、ＲＩＡ法に於ては、放射
性同位元素を使用しなければならないことから、特別な
施設や機器が必要である点、及び廃棄物の処理が問題と
なる点等の問題点が、また、ＥＩＡ法に於ては、測定に
比較的時間を要する点、及び自動分析機への応用が難し
い点等の問題点が夫々挙げられる。
測定法であり、例えば体液中のタンパク質，ホルモン，
活性ペプチド，オータコイド，腫瘍マーカー，免疫グロ
ブリン等の生体成分、ジゴキシン，フェニトイン，フェ
ノバルビタール等の薬剤等の微量成分を特異的に測定す
る方法の一つとして広く用いられている。現在一般によ
く用いられている免疫測定法としては、例えばラジオイ
ムノアッセイ法（ＲＩＡ法）やエンザイムイムノアッセ
イ法（ＥＩＡ法）等が挙げられる。これらの方法は検体
中の微量成分を定量的に測定し得る方法ではあるが、夫
々問題点も有している。即ち、ＲＩＡ法に於ては、放射
性同位元素を使用しなければならないことから、特別な
施設や機器が必要である点、及び廃棄物の処理が問題と
なる点等の問題点が、また、ＥＩＡ法に於ては、測定に
比較的時間を要する点、及び自動分析機への応用が難し
い点等の問題点が夫々挙げられる。
【０００３】そこで、最近ではこれらの問題点を有さな
い免疫測定法として、リポソームを用いる免疫活性測定
法（以下、リポソーム免疫測定法と略記する。）が提案
され注目を浴びている。この方法の代表的なものとして
は、特開昭56-132564号公報に記載の方法が挙げられ
る。この方法は、測定対象物を表面に固定化し内部にマ
ーカー物質（例えば酵素等）を保持したリポソーム、検
体、及び測定対象物に対する抗体を混合して抗原抗体反
応を行わせた後、補体を添加すると、該リポソームの表
面上に形成された抗原抗体複合物により活性化された補
体が該リポソーム膜を溶解して、該リポソーム中のマー
カー物質を遊出させ、その量から検体中の測定対象物量
を測定するという方法である。この補体を用いたリポソ
ーム免疫測定法（以下、補体免疫測定法と略記する。）
は、ＲＩＡ法やＥＩＡ法の上記問題点を有さず、且つ均
一反応系中で一連の反応を行えるため、簡便に且つ短時
間に測定を実施し得る点から注目を集めている測定方法
である。
い免疫測定法として、リポソームを用いる免疫活性測定
法（以下、リポソーム免疫測定法と略記する。）が提案
され注目を浴びている。この方法の代表的なものとして
は、特開昭56-132564号公報に記載の方法が挙げられ
る。この方法は、測定対象物を表面に固定化し内部にマ
ーカー物質（例えば酵素等）を保持したリポソーム、検
体、及び測定対象物に対する抗体を混合して抗原抗体反
応を行わせた後、補体を添加すると、該リポソームの表
面上に形成された抗原抗体複合物により活性化された補
体が該リポソーム膜を溶解して、該リポソーム中のマー
カー物質を遊出させ、その量から検体中の測定対象物量
を測定するという方法である。この補体を用いたリポソ
ーム免疫測定法（以下、補体免疫測定法と略記する。）
は、ＲＩＡ法やＥＩＡ法の上記問題点を有さず、且つ均
一反応系中で一連の反応を行えるため、簡便に且つ短時
間に測定を実施し得る点から注目を集めている測定方法
である。
【０００４】しかしながら、補体免疫測定法では、試料
中に一連の補体成分や補体制御因子［例えばL.E.Glynn
ら,Immunochemistry:An advanced textbook,368頁,1977
年等に記載のC1INH、C3BINA(Factor I)、B1H(Factor H)
等］等が存在すると、補体の活性化によるリポソームの
溶解反応が影響を受け、試料中に存在する測定対象物質
の量とリポソームから放出されるマーカー物質の量とが
相関しなくなる。従って、血清や血漿を試料とした場合
には、これらに含まれる上記測定妨害物質の影響で補体
活性によるマーカー放出量が変動し、正確な測定値が得
られない。そこで通常、血清や血漿等を試料とする場合
には上記影響を除くため、試料を56℃,30分、又は60℃,
３分前処理することが望ましいとされている（特開平1-
214762号公報、Sam Frankelら,Gradwhol's Chemical la
boratory methods and diagnosis,第2巻,第7版,1478頁,
1970年等）。しかしながら、この方法は操作が煩雑であ
るうえ時間もかかり、しかも試料が熱により蒸発すると
いう不都合を生じる。更に、このような熱処理法を検査
室で多用されている自動分析装置に適用することは困難
であった。また、同じ目的で、反応用緩衝液のイオンの
強度を調節する方法も開示されている（特開平1-214763
号公報）。しかしながら、この方法の場合、塩濃度が高
くなり過ぎると抗原抗体反応に支障を生じる恐れがあ
る。
中に一連の補体成分や補体制御因子［例えばL.E.Glynn
ら,Immunochemistry:An advanced textbook,368頁,1977
年等に記載のC1INH、C3BINA(Factor I)、B1H(Factor H)
等］等が存在すると、補体の活性化によるリポソームの
溶解反応が影響を受け、試料中に存在する測定対象物質
の量とリポソームから放出されるマーカー物質の量とが
相関しなくなる。従って、血清や血漿を試料とした場合
には、これらに含まれる上記測定妨害物質の影響で補体
活性によるマーカー放出量が変動し、正確な測定値が得
られない。そこで通常、血清や血漿等を試料とする場合
には上記影響を除くため、試料を56℃,30分、又は60℃,
３分前処理することが望ましいとされている（特開平1-
214762号公報、Sam Frankelら,Gradwhol's Chemical la
boratory methods and diagnosis,第2巻,第7版,1478頁,
1970年等）。しかしながら、この方法は操作が煩雑であ
るうえ時間もかかり、しかも試料が熱により蒸発すると
いう不都合を生じる。更に、このような熱処理法を検査
室で多用されている自動分析装置に適用することは困難
であった。また、同じ目的で、反応用緩衝液のイオンの
強度を調節する方法も開示されている（特開平1-214763
号公報）。しかしながら、この方法の場合、塩濃度が高
くなり過ぎると抗原抗体反応に支障を生じる恐れがあ
る。
【０００５】
【発明の目的】本発明の目的は、試料中に含まれている
前記リポソームの溶解反応に影響を与える物質の影響を
なくし、補体免疫測定法を、より簡便，迅速且つ正確に
行わしめ、且つ自動分析装置への適用も可能ならしめる
方法と該方法を実施するための試薬組成物を提供するこ
とにある。
前記リポソームの溶解反応に影響を与える物質の影響を
なくし、補体免疫測定法を、より簡便，迅速且つ正確に
行わしめ、且つ自動分析装置への適用も可能ならしめる
方法と該方法を実施するための試薬組成物を提供するこ
とにある。
【０００６】
【問題を解決するための手段】本発明は、(i)測定対象
物に対する抗原又は抗体を膜表面に固定化し、内部に検
出可能なマーカー物質を内包した、補体活性によって膜
溶解作用を受けるリポソームと、(ii)補体、とを含んで
成る免疫測定用試薬組成物を用いて被検試料中の測定対
象物を定量する測定方法に於て、被検試料中に存在する
測定妨害物質の影響を排除するために被検試料の液性を
一時的にｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上のアルカリ
性にし、然る後ｐＨを中性付近に戻して測定を行うこと
を特徴とする免疫測定方法、及び該リポソーム，補体、
及び被検試料の液性を一時的にｐＨ4.5以下の酸性又は
ｐＨ11以上のアルカリ性にする試薬、を含んで成る免疫
測定用試薬組成物の発明である。
物に対する抗原又は抗体を膜表面に固定化し、内部に検
出可能なマーカー物質を内包した、補体活性によって膜
溶解作用を受けるリポソームと、(ii)補体、とを含んで
成る免疫測定用試薬組成物を用いて被検試料中の測定対
象物を定量する測定方法に於て、被検試料中に存在する
測定妨害物質の影響を排除するために被検試料の液性を
一時的にｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上のアルカリ
性にし、然る後ｐＨを中性付近に戻して測定を行うこと
を特徴とする免疫測定方法、及び該リポソーム，補体、
及び被検試料の液性を一時的にｐＨ4.5以下の酸性又は
ｐＨ11以上のアルカリ性にする試薬、を含んで成る免疫
測定用試薬組成物の発明である。
【０００７】即ち、本発明者らは、上記問題点を解決す
べく鋭意研究を行った結果、測定前に一時的に被検試料
の液性をｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上のアルカリ
性にし、然る後再度ｐＨを中性付近に戻して測定を行う
ことにより被検試料中に含まれる補体成分等の影響を回
避できることを見出し、本発明を完成するに至った。
べく鋭意研究を行った結果、測定前に一時的に被検試料
の液性をｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上のアルカリ
性にし、然る後再度ｐＨを中性付近に戻して測定を行う
ことにより被検試料中に含まれる補体成分等の影響を回
避できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】本発明に於て、被検試料の液性を一時的に
ｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上のアルカリ性にする
試薬としては、被検試料の液性をそのようなｐＨになし
得る試薬であって、測定対象物に影響を与えないもので
あればどのようなものでも用いられ得るが、例えばグリ
シン−塩酸，フタール酸カリウム−塩酸，クエン酸−リ
ン酸，クエン酸−クエン酸ナトリウム，酢酸−酢酸ナト
リウム，コハク酸−水酸化ナトリウム、フタール酸カリ
ウム−水酸化ナトリウム，グリシン−水酸化ナトリウ
ム，炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム，ホウ酸ナト
リウム−水酸化ナトリウム、或はジメチルグルタール酸
-トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−アミノメチ
ルプロパンジオール(GTA)の様な緩衝液や、例えば塩
酸，硫酸，リン酸，酢酸，マレイン酸の様な酸の単独又
はこれらの任意の組み合わせ、或は、例えば水酸化ナト
リウム，水酸化カリウム，アンモニア水，エタノールア
ミンの様なアルカリの単独又はこれらの任意の組み合わ
せ等が挙げられる。これらの試薬を用いて調整される被
検試料の液性は、通常ｐＨ4.5以下又はｐＨ11以上であ
るが、補体成分等の影響をより完全に近い状態で除くた
めにはｐＨ4以下又はｐＨ12以上が好ましい。
ｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上のアルカリ性にする
試薬としては、被検試料の液性をそのようなｐＨになし
得る試薬であって、測定対象物に影響を与えないもので
あればどのようなものでも用いられ得るが、例えばグリ
シン−塩酸，フタール酸カリウム−塩酸，クエン酸−リ
ン酸，クエン酸−クエン酸ナトリウム，酢酸−酢酸ナト
リウム，コハク酸−水酸化ナトリウム、フタール酸カリ
ウム−水酸化ナトリウム，グリシン−水酸化ナトリウ
ム，炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム，ホウ酸ナト
リウム−水酸化ナトリウム、或はジメチルグルタール酸
-トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−アミノメチ
ルプロパンジオール(GTA)の様な緩衝液や、例えば塩
酸，硫酸，リン酸，酢酸，マレイン酸の様な酸の単独又
はこれらの任意の組み合わせ、或は、例えば水酸化ナト
リウム，水酸化カリウム，アンモニア水，エタノールア
ミンの様なアルカリの単独又はこれらの任意の組み合わ
せ等が挙げられる。これらの試薬を用いて調整される被
検試料の液性は、通常ｐＨ4.5以下又はｐＨ11以上であ
るが、補体成分等の影響をより完全に近い状態で除くた
めにはｐＨ4以下又はｐＨ12以上が好ましい。
【０００９】また、反応液の液性を中性付近に戻す試薬
としては、中性付近に緩衝能を持つものが望ましく、リ
ン酸及びその塩，イミダゾール−塩酸，ベロナール−塩
酸，トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)，或
はN-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸(ACE
S)，3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)，N,N-ビス
(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BE
S)，N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタ
ンスルホン酸(TES)，N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-
N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)等のグッド(Good)の緩衝
剤等が好ましく用いられるが、上記した酸やアルカリそ
のものを用いて液性を中性に戻してもよい。
としては、中性付近に緩衝能を持つものが望ましく、リ
ン酸及びその塩，イミダゾール−塩酸，ベロナール−塩
酸，トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)，或
はN-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸(ACE
S)，3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)，N,N-ビス
(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BE
S)，N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタ
ンスルホン酸(TES)，N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-
N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)等のグッド(Good)の緩衝
剤等が好ましく用いられるが、上記した酸やアルカリそ
のものを用いて液性を中性に戻してもよい。
【００１０】本発明は、自体公知の補体免疫測定法に於
て、測定前に一時的に被検試料の液性をｐＨ4.5以下の
酸性又はｐＨ11以上のアルカリ性にする点に特徴を有す
る発明であり、その他の操作及び用いる試薬類等は自体
公知の補体免疫測定法の操作法及び試薬類等に準じてこ
れを行うことで足りる。
て、測定前に一時的に被検試料の液性をｐＨ4.5以下の
酸性又はｐＨ11以上のアルカリ性にする点に特徴を有す
る発明であり、その他の操作及び用いる試薬類等は自体
公知の補体免疫測定法の操作法及び試薬類等に準じてこ
れを行うことで足りる。
【００１１】即ち、本発明で用いられるリポソームの調
製法としては、例えば従来から知られているボルテック
スイング法，超音波法，界面活性剤除去法，逆相蒸発法
(REV法)，エタノール注入法，エーテル注入法，プレ−
ベジクル(Pre-Vesicle)法，フレンチプレスエクストル
ージョン(French Press Extrusion)法，Ｃａ2+融合法，
アニーリング(Annealing)法，凍結融解融合法，W/O/Wエ
マルジョン法等の方法や、最近、S.M.Grunerら（Bioche
mistry,第24巻,2833頁,1985年）により報告されたStabl
e Plurilamellar Vesicle法(SPLV法)、リポポリサッカ
ライドを膜構成成分の一部とする方法(特開昭63-107742
号公報)等の方法が全て挙げられる。また、その主たる
膜構成成分としては、通常のリポソーム調製に於て膜構
成成分として用いられている天然レシチン(例えば、卵
黄レシチン，大豆レシチン等)やジパルミトイルフォス
ファチジルコリン(DPPC)，ジミリストイルフォスファチ
ジルコリン(DMPC)，ジステアロイルフォスファチジルコ
リン(DSPC)，ジオレオイルフォスファチジルコリン(DOP
C)，ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン
(DPPE)，ジミリストイルフォスファチジルエタノールア
ミン(DMPE)，卵黄フォスファチジルグリセロール，ジパ
ルミトイルフォスファチジルグリセロール(DPPG)，ジミ
リストイルフォスファチジン酸(DMPA)，ジパルミトイル
フォスファチジン酸(DPPA)，パルミトイルオレオイルフ
ォスファチジルコリン(POPC)等のリン脂質の一種または
二種以上、或はこれらとコレステロール類との混合系、
或はこれらに更にリポポリサッカライド等を組み合わせ
たもの等が全て挙げられる。
製法としては、例えば従来から知られているボルテック
スイング法，超音波法，界面活性剤除去法，逆相蒸発法
(REV法)，エタノール注入法，エーテル注入法，プレ−
ベジクル(Pre-Vesicle)法，フレンチプレスエクストル
ージョン(French Press Extrusion)法，Ｃａ2+融合法，
アニーリング(Annealing)法，凍結融解融合法，W/O/Wエ
マルジョン法等の方法や、最近、S.M.Grunerら（Bioche
mistry,第24巻,2833頁,1985年）により報告されたStabl
e Plurilamellar Vesicle法(SPLV法)、リポポリサッカ
ライドを膜構成成分の一部とする方法(特開昭63-107742
号公報)等の方法が全て挙げられる。また、その主たる
膜構成成分としては、通常のリポソーム調製に於て膜構
成成分として用いられている天然レシチン(例えば、卵
黄レシチン，大豆レシチン等)やジパルミトイルフォス
ファチジルコリン(DPPC)，ジミリストイルフォスファチ
ジルコリン(DMPC)，ジステアロイルフォスファチジルコ
リン(DSPC)，ジオレオイルフォスファチジルコリン(DOP
C)，ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン
(DPPE)，ジミリストイルフォスファチジルエタノールア
ミン(DMPE)，卵黄フォスファチジルグリセロール，ジパ
ルミトイルフォスファチジルグリセロール(DPPG)，ジミ
リストイルフォスファチジン酸(DMPA)，ジパルミトイル
フォスファチジン酸(DPPA)，パルミトイルオレオイルフ
ォスファチジルコリン(POPC)等のリン脂質の一種または
二種以上、或はこれらとコレステロール類との混合系、
或はこれらに更にリポポリサッカライド等を組み合わせ
たもの等が全て挙げられる。
【００１２】リポソーム膜の表面に抗原又は抗体を感作
させる（固定化する）方法も自体公知の架橋法（Bioche
mistry,第20巻,4229〜4238頁,1981年、J.Biol.Bioche
m.,第257巻,286〜288頁,1982年等）、脂質活性化法等に
準じてこれを行えば良く、またこれ以外の方法でも勿論
構わない。尚、該架橋法に於て用いられる架橋剤として
は、例えばN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プ
ロピオネート(SPDP)、N-スクシンイミジル4-(p-マレイ
ミドフェニル)ブチレート(SMPB)、N-スクシンイミジル4
-(p-マレイミドフェニル)アセテート(SMPA)、N-スクシ
ンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)プロピオネートア
セテート(SMPP）、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)ス
クシンイミド(GMBS)およびN-(6-マレイミドカプロイル
オキシ)スクシンイミド(EMCS)等が好ましく挙げられ
る。
させる（固定化する）方法も自体公知の架橋法（Bioche
mistry,第20巻,4229〜4238頁,1981年、J.Biol.Bioche
m.,第257巻,286〜288頁,1982年等）、脂質活性化法等に
準じてこれを行えば良く、またこれ以外の方法でも勿論
構わない。尚、該架橋法に於て用いられる架橋剤として
は、例えばN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プ
ロピオネート(SPDP)、N-スクシンイミジル4-(p-マレイ
ミドフェニル)ブチレート(SMPB)、N-スクシンイミジル4
-(p-マレイミドフェニル)アセテート(SMPA)、N-スクシ
ンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)プロピオネートア
セテート(SMPP）、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)ス
クシンイミド(GMBS)およびN-(6-マレイミドカプロイル
オキシ)スクシンイミド(EMCS)等が好ましく挙げられ
る。
【００１３】本発明に於て、測定対象物が抗原である場
合に使用される抗体としては、測定対象物に対する抗体
であれば何れにてもよく特に限定されない。即ち、常
法、例えば免疫実験学入門,第2刷,松橋直ら,(株)学会出
版センター,1981年、又は、E.Harlowら,Antibodies,Col
d Spring Harbor Labolatory,53〜138頁,1988年等に記
載の方法に準じて馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウ
ス等の動物に測定対象物を免疫して作製されるポリクロ
ーナル抗体でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタ
イン（Nature,第256巻,495頁,1975年）により確立され
た細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と
測定対象物で予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合さ
せて得られるハイブリドーマが産生する単クローン性抗
体でも何れにてもよく、これらを単独で或はこれらを適
宜組み合わせて用いる等は任意である。また、これら抗
体は、要すればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消
化してＦ(ab')、Ｆab'、或はＦabとして使用してもよい
ことは言うまでもない。本発明に於て、測定対象物が抗
体である場合に使用される抗原としては、測定対象物と
結合する抗原であれば何れにてもよく特に限定されな
い。
合に使用される抗体としては、測定対象物に対する抗体
であれば何れにてもよく特に限定されない。即ち、常
法、例えば免疫実験学入門,第2刷,松橋直ら,(株)学会出
版センター,1981年、又は、E.Harlowら,Antibodies,Col
d Spring Harbor Labolatory,53〜138頁,1988年等に記
載の方法に準じて馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウ
ス等の動物に測定対象物を免疫して作製されるポリクロ
ーナル抗体でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタ
イン（Nature,第256巻,495頁,1975年）により確立され
た細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と
測定対象物で予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合さ
せて得られるハイブリドーマが産生する単クローン性抗
体でも何れにてもよく、これらを単独で或はこれらを適
宜組み合わせて用いる等は任意である。また、これら抗
体は、要すればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消
化してＦ(ab')、Ｆab'、或はＦabとして使用してもよい
ことは言うまでもない。本発明に於て、測定対象物が抗
体である場合に使用される抗原としては、測定対象物と
結合する抗原であれば何れにてもよく特に限定されな
い。
【００１４】また、リポソーム内に保持されるマーカー
物質(標識物質)も、補体免疫測定法に於て通常用いられ
る検出可能なマーカー物質であれば何れにてもよく特に
限定されることなく挙げられるが、例えばアルカリホス
ファターゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)，
β−ガラクトシダーゼ等の酵素類、例えばニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド(NAD)，ニコチンアミドアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)，フラビンアデ
ニンジヌクレオチド(FAD)等の補酵素類、例えばカルボ
キシフルオレセイン，フルオレセインイソチオシアネー
ト，フルオレセインイソシアネート，テトラローダミン
イソチオシアネート，5-ジメチルアミノ-1-ナフタレン
スルフォニルクロリド等の蛍光性物質類、例えばルミノ
ール，ルシフェリン，ビス(2,4,6-トリクロロフェニル)
オキザレート，N-メチルアクリジウムエステル等の発光
性物質類、例えば、アルセナゾ III，4-(2-ピリジリア
ゾ)レゾルシノール，2-(5-ブロモ-2-ピリジルアゾ)-5-
(N-プロピル-N-スルホプロピルアミノ)フェノール ナト
リウム塩等の色素類、例えばグルコース等の糖類、例え
ば重クロム酸カリウム，重クロム酸ナトリウム，塩化ナ
トリウム等のイオン性化合物、例えばニトロキシド化合
物等のラジカル性化合物、例えば2,2,6,6-テトラメチル
ピペリジン-1-オキシル(TEMPO)等に代表されるスピンラ
ベル化剤等が代表的なものとして挙げられる。
物質(標識物質)も、補体免疫測定法に於て通常用いられ
る検出可能なマーカー物質であれば何れにてもよく特に
限定されることなく挙げられるが、例えばアルカリホス
ファターゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)，
β−ガラクトシダーゼ等の酵素類、例えばニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド(NAD)，ニコチンアミドアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)，フラビンアデ
ニンジヌクレオチド(FAD)等の補酵素類、例えばカルボ
キシフルオレセイン，フルオレセインイソチオシアネー
ト，フルオレセインイソシアネート，テトラローダミン
イソチオシアネート，5-ジメチルアミノ-1-ナフタレン
スルフォニルクロリド等の蛍光性物質類、例えばルミノ
ール，ルシフェリン，ビス(2,4,6-トリクロロフェニル)
オキザレート，N-メチルアクリジウムエステル等の発光
性物質類、例えば、アルセナゾ III，4-(2-ピリジリア
ゾ)レゾルシノール，2-(5-ブロモ-2-ピリジルアゾ)-5-
(N-プロピル-N-スルホプロピルアミノ)フェノール ナト
リウム塩等の色素類、例えばグルコース等の糖類、例え
ば重クロム酸カリウム，重クロム酸ナトリウム，塩化ナ
トリウム等のイオン性化合物、例えばニトロキシド化合
物等のラジカル性化合物、例えば2,2,6,6-テトラメチル
ピペリジン-1-オキシル(TEMPO)等に代表されるスピンラ
ベル化剤等が代表的なものとして挙げられる。
【００１５】リポソームに保持されるマーカー物質の量
はマーカー物質の種類により異なり特に限定されない
が、リポソーム膜の破壊の前後で充分検出可能な差が生
じる量が保持されていればよく、例えばマーカー物質が
グルコース-6-リン酸脱水素酵素の場合を例にとると、
リポソーム調製時に使用されるマーカー物質を含む溶液
として通常1000〜5000U/ml、好ましくは2000〜3000U/ml
の濃度の酵素溶液を用いればよい。
はマーカー物質の種類により異なり特に限定されない
が、リポソーム膜の破壊の前後で充分検出可能な差が生
じる量が保持されていればよく、例えばマーカー物質が
グルコース-6-リン酸脱水素酵素の場合を例にとると、
リポソーム調製時に使用されるマーカー物質を含む溶液
として通常1000〜5000U/ml、好ましくは2000〜3000U/ml
の濃度の酵素溶液を用いればよい。
【００１６】マーカー物質量を測定する方法は、用いた
マーカー物質の種類により自ずから異なるが、例えばマ
ーカー物質が酵素の場合には、例えば酵素免疫測定法,
蛋白質 核酸 酵素,別冊 No.31,北川常廣・南原利夫・辻
章夫・石川栄治編集,51〜63頁,共立出版(株),1987年9月
10日発行 等に記載された方法に準じて該マーカー物質
の測定を行えばよく、マーカー物質が補酵素の場合に
は、例えば米国特許第4,704,355号公報等に記載された
方法に準じて該マーカー物質の測定を行えばよい。また
マーカー物質が蛍光性物質の場合には、例えば図説 蛍
光抗体,川生明著,第１版,(株)ソフトサイエンス社,1983
年 等に記載された方法に準じて該マーカー物質の測定
を行えばよく、マーカー物質が発光性物質の場合には、
例えば酵素免疫測定法,蛋白質 核酸 酵素,別冊 No.31,
北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川栄治編集,252〜263
頁,共立出版(株),1987年9月10日発行 等に記載された方
法に準じて該マーカー物質の測定を行えばよい。マーカ
ー物質が色素の場合には、例えばAndrews,Janoffら,Cli
n.Chem.,第29巻,1587頁,1983年 等に記載された方法に
準じて該マーカー物質の測定を行えばよく、マーカー物
質が糖類の場合には、例えばT. Kataokaら,Eur.J.Bioch
em.,第21巻,80頁,1971年 等に記載された方法に準じて
該マーカー物質の測定を行えばよい。更に、マーカー物
質がイオン性化合物の場合には、例えばY.Umezawaら,Ta
lamta,第31巻,375頁,1984年 等に記載された方法に準じ
て該マーカー物質の測定を行えばよく、マーカー物質が
ラジカル性化合物の場合には、例えばWu R,Alvingら,J.
Immunal Methods,第9巻,165頁,1975年 等に記載された
方法に準じて該マーカー物質の測定を行えばよく、マー
カー物質がスピンラベル化剤としての性質を有する物質
の場合には、例えば酵素免疫測定法,蛋白質 核酸 酵素,
別冊 No.31,北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川栄治編
集,264〜271頁,共立出版(株),1987年9月10日発行 等に
記載された方法に準じて該マーカー物質の測定を行えば
よい。
マーカー物質の種類により自ずから異なるが、例えばマ
ーカー物質が酵素の場合には、例えば酵素免疫測定法,
蛋白質 核酸 酵素,別冊 No.31,北川常廣・南原利夫・辻
章夫・石川栄治編集,51〜63頁,共立出版(株),1987年9月
10日発行 等に記載された方法に準じて該マーカー物質
の測定を行えばよく、マーカー物質が補酵素の場合に
は、例えば米国特許第4,704,355号公報等に記載された
方法に準じて該マーカー物質の測定を行えばよい。また
マーカー物質が蛍光性物質の場合には、例えば図説 蛍
光抗体,川生明著,第１版,(株)ソフトサイエンス社,1983
年 等に記載された方法に準じて該マーカー物質の測定
を行えばよく、マーカー物質が発光性物質の場合には、
例えば酵素免疫測定法,蛋白質 核酸 酵素,別冊 No.31,
北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川栄治編集,252〜263
頁,共立出版(株),1987年9月10日発行 等に記載された方
法に準じて該マーカー物質の測定を行えばよい。マーカ
ー物質が色素の場合には、例えばAndrews,Janoffら,Cli
n.Chem.,第29巻,1587頁,1983年 等に記載された方法に
準じて該マーカー物質の測定を行えばよく、マーカー物
質が糖類の場合には、例えばT. Kataokaら,Eur.J.Bioch
em.,第21巻,80頁,1971年 等に記載された方法に準じて
該マーカー物質の測定を行えばよい。更に、マーカー物
質がイオン性化合物の場合には、例えばY.Umezawaら,Ta
lamta,第31巻,375頁,1984年 等に記載された方法に準じ
て該マーカー物質の測定を行えばよく、マーカー物質が
ラジカル性化合物の場合には、例えばWu R,Alvingら,J.
Immunal Methods,第9巻,165頁,1975年 等に記載された
方法に準じて該マーカー物質の測定を行えばよく、マー
カー物質がスピンラベル化剤としての性質を有する物質
の場合には、例えば酵素免疫測定法,蛋白質 核酸 酵素,
別冊 No.31,北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川栄治編
集,264〜271頁,共立出版(株),1987年9月10日発行 等に
記載された方法に準じて該マーカー物質の測定を行えば
よい。
【００１７】尚、本発明に於て用いられるリポソームの
使用量を最終反応液中の濃度で示すと、該リポソームに
含有されるリン脂質量として通常１〜500nmol/ml、好ま
しくは５〜100nmol/mlである。
使用量を最終反応液中の濃度で示すと、該リポソームに
含有されるリン脂質量として通常１〜500nmol/ml、好ま
しくは５〜100nmol/mlである。
【００１８】本発明により測定可能な測定対象物として
は、何らかの方法によりそれに対する抗体又は抗原を得
ることができるものであれば特に限定することなく挙げ
られ、例えば、生物学的及び臨床的重要性を有する薬
剤、代謝物質、ビタミン、殺虫剤、ステロイド、ペプチ
ド、ホルモン、肝炎マーカー、癌マーカー、抗体、及び
血清タンパク等、通常補体免疫測定法で測定可能と考え
られる測定対象物は全て挙げることができる。更に具体
的には、例えば内分泌機能関連物質として甲状腺刺激ホ
ルモン(TSH)，成長ホルモン，ソマトメジンＣ，黄体形
成ホルモン，卵胞刺激ホルモン，プロラクチン，副腎皮
質刺激ホルモン，バソプレッシン，オキシトシン，ソマ
トスタチン，エンケファリン，β-エンドルフィン，サ
イロキシン，トリヨードサイロニン，サイログロブリ
ン，抗サイログロブリン抗体，抗T4抗体，抗T3抗体，抗
ＴＳＨ抗体，カルシトニン，カテコールアミン，ドーパ
ミン，セロトニン，副甲状腺ホルモン，アルドステロ
ン，レニン，アンギオテンシン，コルチゾール，コルチ
ゾン，デオキシコルチゾール，デオキシコルチコステロ
ン，コルチコステロン，アンドロステロン，プロゲステ
ロン，プレグネノロン，エストロゲン，エストロン，エ
ストラジオール，エストリオール，テストステロン，ゴ
ナドトロピン，インシュリン，抗インシュリン抗体，C-
ペプタイド，グルカゴン，ガストリン，セクレチン，サ
イクリックＡＭＰ，サイクリックＧＭＰ，プロスタグラ
ンジン類，トロンボキサン，エリスロポイエチン，ヒス
タミン等が挙げられ、腫瘍関連物質としては、ＣＥＡ，
フェリチン，β2-マイクログロブリン，エラスターゼ，
α-フェトプロテイン，神経特異エノラーゼ，前立腺特
異抗原，CA19-9等が挙げられ、薬物，ビタミン関連のも
のとしては、フェノバルビタール，フェニトイン，カル
バマゼピン，プリミドン，エトスクシミド，バルプロ
酸，アセタゾールアミド，スルチアム，グルテチミド，
クロナゼパム，ニトラゼパム，ジアゼパム，ペントバル
ビタール，セコバルビタール，ブピバカイン，メピバカ
イン，リドカイン，プロカインアミド，キニジン，ジゴ
キシン，ジキトキシン，テオフィリン，アミトリプチリ
ン，イミプラミン，アミカシン，ゲンタマイシン，トブ
ラマイシン，セファレキシン，スルフアメトキサゾー
ル，メソトレキサート，シクロスポリン，メチルプレゾ
ニドロン，サリチル酸，アセトアミノフェン，インドメ
タシン，アロプリノール，ビタミンＡ，カロチン，ビタ
ミンＢ1，ビタミンＢ2，ビタミンＢ6，ビタミンＢ12，
葉酸，ビタミンＣ，ビタミンＤ，ビタミンＥ等が挙げら
れ、血清又は血漿タンパク関連物質としてはアルブミ
ン，α1-マイクログロブリン，α1-アンチトリプシン，
α2−マクログロブリン，ハプトグロブリン，ヘモペキ
シン，トランスフェリン，ミオグロビン，IgG，IgM，Ig
A，IgD，IgE，フィブリノーゲン，アンチトロンビン，
プラスミノーゲン，アンチプラスミン，プロティンＣ，
リュウマチ因子，抗DNA抗体，Ｃ反応性蛋白等が挙げら
れ、ウイルス，感染症関連物質としてはHBs抗原，HBs抗
体，HBc抗体，HTLV-I抗体，HTLV-III抗体，TPHA，各種
ウイルス抗原，各種ウイルス抗体等が挙げられる。
は、何らかの方法によりそれに対する抗体又は抗原を得
ることができるものであれば特に限定することなく挙げ
られ、例えば、生物学的及び臨床的重要性を有する薬
剤、代謝物質、ビタミン、殺虫剤、ステロイド、ペプチ
ド、ホルモン、肝炎マーカー、癌マーカー、抗体、及び
血清タンパク等、通常補体免疫測定法で測定可能と考え
られる測定対象物は全て挙げることができる。更に具体
的には、例えば内分泌機能関連物質として甲状腺刺激ホ
ルモン(TSH)，成長ホルモン，ソマトメジンＣ，黄体形
成ホルモン，卵胞刺激ホルモン，プロラクチン，副腎皮
質刺激ホルモン，バソプレッシン，オキシトシン，ソマ
トスタチン，エンケファリン，β-エンドルフィン，サ
イロキシン，トリヨードサイロニン，サイログロブリ
ン，抗サイログロブリン抗体，抗T4抗体，抗T3抗体，抗
ＴＳＨ抗体，カルシトニン，カテコールアミン，ドーパ
ミン，セロトニン，副甲状腺ホルモン，アルドステロ
ン，レニン，アンギオテンシン，コルチゾール，コルチ
ゾン，デオキシコルチゾール，デオキシコルチコステロ
ン，コルチコステロン，アンドロステロン，プロゲステ
ロン，プレグネノロン，エストロゲン，エストロン，エ
ストラジオール，エストリオール，テストステロン，ゴ
ナドトロピン，インシュリン，抗インシュリン抗体，C-
ペプタイド，グルカゴン，ガストリン，セクレチン，サ
イクリックＡＭＰ，サイクリックＧＭＰ，プロスタグラ
ンジン類，トロンボキサン，エリスロポイエチン，ヒス
タミン等が挙げられ、腫瘍関連物質としては、ＣＥＡ，
フェリチン，β2-マイクログロブリン，エラスターゼ，
α-フェトプロテイン，神経特異エノラーゼ，前立腺特
異抗原，CA19-9等が挙げられ、薬物，ビタミン関連のも
のとしては、フェノバルビタール，フェニトイン，カル
バマゼピン，プリミドン，エトスクシミド，バルプロ
酸，アセタゾールアミド，スルチアム，グルテチミド，
クロナゼパム，ニトラゼパム，ジアゼパム，ペントバル
ビタール，セコバルビタール，ブピバカイン，メピバカ
イン，リドカイン，プロカインアミド，キニジン，ジゴ
キシン，ジキトキシン，テオフィリン，アミトリプチリ
ン，イミプラミン，アミカシン，ゲンタマイシン，トブ
ラマイシン，セファレキシン，スルフアメトキサゾー
ル，メソトレキサート，シクロスポリン，メチルプレゾ
ニドロン，サリチル酸，アセトアミノフェン，インドメ
タシン，アロプリノール，ビタミンＡ，カロチン，ビタ
ミンＢ1，ビタミンＢ2，ビタミンＢ6，ビタミンＢ12，
葉酸，ビタミンＣ，ビタミンＤ，ビタミンＥ等が挙げら
れ、血清又は血漿タンパク関連物質としてはアルブミ
ン，α1-マイクログロブリン，α1-アンチトリプシン，
α2−マクログロブリン，ハプトグロブリン，ヘモペキ
シン，トランスフェリン，ミオグロビン，IgG，IgM，Ig
A，IgD，IgE，フィブリノーゲン，アンチトロンビン，
プラスミノーゲン，アンチプラスミン，プロティンＣ，
リュウマチ因子，抗DNA抗体，Ｃ反応性蛋白等が挙げら
れ、ウイルス，感染症関連物質としてはHBs抗原，HBs抗
体，HBc抗体，HTLV-I抗体，HTLV-III抗体，TPHA，各種
ウイルス抗原，各種ウイルス抗体等が挙げられる。
【００１９】本発明に於て用いられる補体としては、例
えばヒト、モルモット、馬、羊等の動物の血液から得ら
れたものを常法に従って適宜精製したもの等、この分野
で通常用いられる補体が何れも例外なく挙げられる。本
発明の免疫測定用試薬組成物は、(i)測定対象物に対す
る抗原又は抗体を膜表面に固定化し、内部に検出可能な
マーカー物質を内包した、補体活性によって膜溶解作用
を受けるリポソームと、(ii)補体、及び(iii)被検試料
の液性を一時的にｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上の
アルカリ性にする試薬、を主たる構成成分とするが、こ
れ以外に、測定対象物に対する遊離の（固定化していな
い）抗原又は抗体や、例えばマーカー物質が酵素の場合
等には、その基質等もその成分の一つとして含有するも
のであることは言うまでもない。
えばヒト、モルモット、馬、羊等の動物の血液から得ら
れたものを常法に従って適宜精製したもの等、この分野
で通常用いられる補体が何れも例外なく挙げられる。本
発明の免疫測定用試薬組成物は、(i)測定対象物に対す
る抗原又は抗体を膜表面に固定化し、内部に検出可能な
マーカー物質を内包した、補体活性によって膜溶解作用
を受けるリポソームと、(ii)補体、及び(iii)被検試料
の液性を一時的にｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上の
アルカリ性にする試薬、を主たる構成成分とするが、こ
れ以外に、測定対象物に対する遊離の（固定化していな
い）抗原又は抗体や、例えばマーカー物質が酵素の場合
等には、その基質等もその成分の一つとして含有するも
のであることは言うまでもない。
【００２０】本発明の測定系に牛血清アルブミン(BS
A)，ゼラチン等の蛋白質、糖、キレート剤、還元剤、防
腐剤等の、通常この分野に於て使用される添加剤等を、
必要に応じて適宜添加する等は任意である。本発明の測
定方法に於て用いられる各種試薬類の使用量や、マーカ
ー物質が酵素である場合に用いられる基質量、或は必要
に応じて添加される上記各種添加剤等の濃度範囲等は、
自体公知の補体免疫測定法に於て通常用いられる濃度範
囲等を適宜選択して用いることで足りる。
A)，ゼラチン等の蛋白質、糖、キレート剤、還元剤、防
腐剤等の、通常この分野に於て使用される添加剤等を、
必要に応じて適宜添加する等は任意である。本発明の測
定方法に於て用いられる各種試薬類の使用量や、マーカ
ー物質が酵素である場合に用いられる基質量、或は必要
に応じて添加される上記各種添加剤等の濃度範囲等は、
自体公知の補体免疫測定法に於て通常用いられる濃度範
囲等を適宜選択して用いることで足りる。
【００２１】本発明は用手法に限らず、自動分析装置を
用いた測定系にも十分利用可能であり、容易に且つ迅速
に測定を行うことができる。尚、自動分析装置を用いて
測定を行う場合の試薬類等の組み合わせ等については特
に制約はなく、機種に合わせて、或は他の要因を考慮に
入れて最も良いと思われる試薬類等の組み合わせを適宜
選択して用いればよい。以下に実験例及び実施例を挙げ
て本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施
例によって何ら制約を受けるものではない。
用いた測定系にも十分利用可能であり、容易に且つ迅速
に測定を行うことができる。尚、自動分析装置を用いて
測定を行う場合の試薬類等の組み合わせ等については特
に制約はなく、機種に合わせて、或は他の要因を考慮に
入れて最も良いと思われる試薬類等の組み合わせを適宜
選択して用いればよい。以下に実験例及び実施例を挙げ
て本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施
例によって何ら制約を受けるものではない。
【００２２】
実験例１ (1)リポソームの調製 グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDHと略記する。)を
内包し、抗てんかん薬フェニトインのリン脂質誘導体を
膜成分として持つリポソームを、ボルテックスイング法
により以下のようにして調製した。まず、ジミリストイ
ルフォスファチジルコリン 72μmol、ジミリストイルフ
ォスファチジルグリセロール 8μmol、コレステロール
80μmol、及びフェニトインのフォスファチジルエタノ
ールアミン誘導体 0.8μmolをクロロホルム 5mlに溶解
し、減圧乾燥した。これにG6PDHを10mM Tris/HCl緩衝液
(pH7.8)に2500U/mlになるように溶解した溶液7.5mlを加
えボルテックスミキサーにて混和した。このようにして
得た脂質水和液を,0.2μmの膜を通し整粒した。次にリ
ポソームに内包されなかった酵素を超遠心分離(100,000
×g)を繰り返すことによって除き、最終的に得たリポソ
ームを、0.1MのTris/HCl緩衝液(ｐＨ7.8)に懸濁して、
冷蔵保存した。 (2)補体活性に及ぼすｐＨの影響 (1)で調製したG6PDH内包リポソームを用い、試料中に含
まれる補体成分等によって引き起こされるリポソーム膜
溶解反応に及ぼすｐＨの影響について調べた。まず、ヒ
ト新鮮血清20μlにｐＨ１〜13までの25mM GTA緩衝液200
μlを各々加えた。37℃で5分間処理後、十分量のウサギ
抗フェニトイン抗体とG6PDH内包フェニトイン感作リポ
ソーム(脂質濃度5nmol/ml)を含む0.25M Tris/HCl緩衝液
200μlを加え、ｐＨを8にした。37℃で5分間反応後リポ
ソーム膜免疫溶解反応により遊出されるG6PDH活性をグ
ルコース-6-リン酸(G6P)及びNADを基質としてNADHの340
nmの吸光度変化で測定し、補体残存活性値を求めた。結
果を図１に示す。尚、図中の補体残存活性値は、ｐＨ8
のGTA緩衝液で試料(ヒト新鮮血清)を処理したときの吸
光度を100として、その相対値で示してある。図１から
明らかなように、血清試料の場合には、試料自体にも補
体活性を有する成分が含まれ、リポソーム膜溶解作用を
発現するが、この活性は試料の液性を一時的に酸性又は
アルカリ性に傾けることにより低減でき、ｐＨ4.5以下
又はｐＨ11以上にすると、補体活性は60％以下に減少
し、pH4以下又はｐＨ12以上とすると試料中の補体の影
響は、ほぼ完全に排除できることがわかった。
内包し、抗てんかん薬フェニトインのリン脂質誘導体を
膜成分として持つリポソームを、ボルテックスイング法
により以下のようにして調製した。まず、ジミリストイ
ルフォスファチジルコリン 72μmol、ジミリストイルフ
ォスファチジルグリセロール 8μmol、コレステロール
80μmol、及びフェニトインのフォスファチジルエタノ
ールアミン誘導体 0.8μmolをクロロホルム 5mlに溶解
し、減圧乾燥した。これにG6PDHを10mM Tris/HCl緩衝液
(pH7.8)に2500U/mlになるように溶解した溶液7.5mlを加
えボルテックスミキサーにて混和した。このようにして
得た脂質水和液を,0.2μmの膜を通し整粒した。次にリ
ポソームに内包されなかった酵素を超遠心分離(100,000
×g)を繰り返すことによって除き、最終的に得たリポソ
ームを、0.1MのTris/HCl緩衝液(ｐＨ7.8)に懸濁して、
冷蔵保存した。 (2)補体活性に及ぼすｐＨの影響 (1)で調製したG6PDH内包リポソームを用い、試料中に含
まれる補体成分等によって引き起こされるリポソーム膜
溶解反応に及ぼすｐＨの影響について調べた。まず、ヒ
ト新鮮血清20μlにｐＨ１〜13までの25mM GTA緩衝液200
μlを各々加えた。37℃で5分間処理後、十分量のウサギ
抗フェニトイン抗体とG6PDH内包フェニトイン感作リポ
ソーム(脂質濃度5nmol/ml)を含む0.25M Tris/HCl緩衝液
200μlを加え、ｐＨを8にした。37℃で5分間反応後リポ
ソーム膜免疫溶解反応により遊出されるG6PDH活性をグ
ルコース-6-リン酸(G6P)及びNADを基質としてNADHの340
nmの吸光度変化で測定し、補体残存活性値を求めた。結
果を図１に示す。尚、図中の補体残存活性値は、ｐＨ8
のGTA緩衝液で試料(ヒト新鮮血清)を処理したときの吸
光度を100として、その相対値で示してある。図１から
明らかなように、血清試料の場合には、試料自体にも補
体活性を有する成分が含まれ、リポソーム膜溶解作用を
発現するが、この活性は試料の液性を一時的に酸性又は
アルカリ性に傾けることにより低減でき、ｐＨ4.5以下
又はｐＨ11以上にすると、補体活性は60％以下に減少
し、pH4以下又はｐＨ12以上とすると試料中の補体の影
響は、ほぼ完全に排除できることがわかった。
【００２３】実施例１． (1)フェノバルビタール感作リポソームの調製 フェニトインのフォスファチジルエタノールアミン誘導
体の代わりにフェノバルビタールのリン脂質誘導体を用
いた以外は実験例１の(1)と同様の方法で、フェノバル
ビタール感作リポソームを調製した。 (2)血清中フェノバルビタール濃度の測定 抗てんかん薬フェノバルビタール投与患者血清試料200
μlと0.3N塩酸200μlを混和し、試料を酸性下(ｐＨ
１)、5分間処理した。次いで処理した試料液 6μlに200
μlのウサギ抗フェノバルビタール抗体及び酵素基質(6m
M NAD、16mM G6P)を含む緩衝液(ｐＨ6.0)を加え、37
℃、5分間反応させた。これにフェノバルビタールを感
作したG6PDH内包リポソーム(脂質濃度5nmol/ml)及びモ
ルモット補体(20CH50/ml)を含む30mM Tris/HCl緩衝液(p
H8,5)200μlを加えて37℃で5分間反応させ、補体のリポ
ソーム膜溶解作用によりリポソームから遊出したG6PDH
の活性値をNADHによる340nmの吸光度を測定することに
より求めて、フェノバルビタールの定量を行った。結果
を表１に示す。表１に於て、対照試料は、補体活性が既
に失活しているプール血清であり、妨害物質含有試料
は、測定妨害物質のある（補体活性がある）血清試料を
表わす。
体の代わりにフェノバルビタールのリン脂質誘導体を用
いた以外は実験例１の(1)と同様の方法で、フェノバル
ビタール感作リポソームを調製した。 (2)血清中フェノバルビタール濃度の測定 抗てんかん薬フェノバルビタール投与患者血清試料200
μlと0.3N塩酸200μlを混和し、試料を酸性下(ｐＨ
１)、5分間処理した。次いで処理した試料液 6μlに200
μlのウサギ抗フェノバルビタール抗体及び酵素基質(6m
M NAD、16mM G6P)を含む緩衝液(ｐＨ6.0)を加え、37
℃、5分間反応させた。これにフェノバルビタールを感
作したG6PDH内包リポソーム(脂質濃度5nmol/ml)及びモ
ルモット補体(20CH50/ml)を含む30mM Tris/HCl緩衝液(p
H8,5)200μlを加えて37℃で5分間反応させ、補体のリポ
ソーム膜溶解作用によりリポソームから遊出したG6PDH
の活性値をNADHによる340nmの吸光度を測定することに
より求めて、フェノバルビタールの定量を行った。結果
を表１に示す。表１に於て、対照試料は、補体活性が既
に失活しているプール血清であり、妨害物質含有試料
は、測定妨害物質のある（補体活性がある）血清試料を
表わす。
【００２４】
【表１】
【００２５】表１から明らかなように、測定妨害物質が
共存する試料の場合には、塩酸処理を行わない従来の補
体免疫測定法では、試料中の共存物質の影響を受け、EI
A法による測定値との間に著しい差異が認められたが、
試料を塩酸処理することによりEIA法による測定値に近
づき、正確な測定が可能となった。
共存する試料の場合には、塩酸処理を行わない従来の補
体免疫測定法では、試料中の共存物質の影響を受け、EI
A法による測定値との間に著しい差異が認められたが、
試料を塩酸処理することによりEIA法による測定値に近
づき、正確な測定が可能となった。
【００２６】実施例２．血清中のフェニトイン濃度の測
定 (1)フェニトイン感作リポソームの調製 フェニトイン感作リポソームは、実験例１の(1)と同様
の方法で調製した。 (2)血清中のフェニトイン濃度の測定 抗てんかん薬フェニトイン投与患者血清3μlに兎抗フェ
ニトイン抗体及び酵素基質(6mM NAD、16mM G6P)を含む
ｐＨ4の緩衝液200μlを加え、37℃で5分間処理し、反応
させた。次に、フェニトインを感作したG6PDH内包リポ
ソーム(脂質濃度5nmol/ml)及びモルモット補体(20CH50/
ml)を含む30mM Tris/HCl緩衝液(ｐＨ8.5)200μlを加
え、反応ｐＨを7.8に戻して、37℃で5分間反応させた。
遊出したG6PDHの酵素活性値をNADHによる340nmの吸光度
を測定することにより求めて試料中のフェニトイン量を
算出し、EIA法で求めた血清中フェニトイン濃度と比較
した。結果を図2(1)に示す。また、対照として同じ試料
を用い、酸性処理を行わずにｐＨ6で同様の測定を行っ
た場合の結果を図2(2)に示す。図2(1)に於て、検体数7
9、γ=0.993、Y=1.017X-0.35である。また、図2(2)に於
て、検体数30、γ=0.984、Y=0.697X+0.60である。この
結果から明らかなように、本発明に基づいて試料を一時
的に酸性にすることによって、試料中の妨害物質の影響
を回避することができ、補体免疫測定法の他法との相関
性が向上することがわかる。
定 (1)フェニトイン感作リポソームの調製 フェニトイン感作リポソームは、実験例１の(1)と同様
の方法で調製した。 (2)血清中のフェニトイン濃度の測定 抗てんかん薬フェニトイン投与患者血清3μlに兎抗フェ
ニトイン抗体及び酵素基質(6mM NAD、16mM G6P)を含む
ｐＨ4の緩衝液200μlを加え、37℃で5分間処理し、反応
させた。次に、フェニトインを感作したG6PDH内包リポ
ソーム(脂質濃度5nmol/ml)及びモルモット補体(20CH50/
ml)を含む30mM Tris/HCl緩衝液(ｐＨ8.5)200μlを加
え、反応ｐＨを7.8に戻して、37℃で5分間反応させた。
遊出したG6PDHの酵素活性値をNADHによる340nmの吸光度
を測定することにより求めて試料中のフェニトイン量を
算出し、EIA法で求めた血清中フェニトイン濃度と比較
した。結果を図2(1)に示す。また、対照として同じ試料
を用い、酸性処理を行わずにｐＨ6で同様の測定を行っ
た場合の結果を図2(2)に示す。図2(1)に於て、検体数7
9、γ=0.993、Y=1.017X-0.35である。また、図2(2)に於
て、検体数30、γ=0.984、Y=0.697X+0.60である。この
結果から明らかなように、本発明に基づいて試料を一時
的に酸性にすることによって、試料中の妨害物質の影響
を回避することができ、補体免疫測定法の他法との相関
性が向上することがわかる。
【００２７】
【発明の効果】本発明は、血清や血漿等を試料とする補
体免疫測定法に於て、測定前に被検試料の液性を一時的
にｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上のアルカリ性に
し、然る後再度ｐＨを中性付近に戻して測定を行うこと
により被検試料中に含まれる補体成分等の影響を回避
し、正確な測定を行わんとするものであり本発明の方法
によれば、試料中の測定対象抗原或は測定対象抗体の正
確な定量が可能になると共に、従来の熱処理法では困難
であった自動分析機でのライン処理が可能となり、リポ
ソームを用いる免疫測定法の精度向上、迅速化、省力化
に優れた効果が期待できる点に顕著な効果を奏する発明
である。
体免疫測定法に於て、測定前に被検試料の液性を一時的
にｐＨ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上のアルカリ性に
し、然る後再度ｐＨを中性付近に戻して測定を行うこと
により被検試料中に含まれる補体成分等の影響を回避
し、正確な測定を行わんとするものであり本発明の方法
によれば、試料中の測定対象抗原或は測定対象抗体の正
確な定量が可能になると共に、従来の熱処理法では困難
であった自動分析機でのライン処理が可能となり、リポ
ソームを用いる免疫測定法の精度向上、迅速化、省力化
に優れた効果が期待できる点に顕著な効果を奏する発明
である。
【００２８】
【図１】図１は、実験例１に於て得られた結果を示し、
横軸は一時的に変えた試料の液性(ｐＨ)を示し、縦軸は
補体活性の相対値を示す。
横軸は一時的に変えた試料の液性(ｐＨ)を示し、縦軸は
補体活性の相対値を示す。
【図２】図2(1)は、実施例２に於て得られた、本法（一
時的に被検試料のpHを酸性にした後、中性に戻して血清
フェニトイン濃度を測定した。)による結果と、ＥＩＡ
法による測定結果の相関図である。図2(2)は、実施例２
に於て得られた、従来の方法（リポソームを用いた免疫
測定法に於て、ｐＨ6で血清フェニトイン濃度を測定し
た。）による結果と、ＥＩＡ法による測定結果の相関図
である。
時的に被検試料のpHを酸性にした後、中性に戻して血清
フェニトイン濃度を測定した。)による結果と、ＥＩＡ
法による測定結果の相関図である。図2(2)は、実施例２
に於て得られた、従来の方法（リポソームを用いた免疫
測定法に於て、ｐＨ6で血清フェニトイン濃度を測定し
た。）による結果と、ＥＩＡ法による測定結果の相関図
である。
Claims (2)
- 【請求項１】(i)測定対象物に対する抗原又は抗体を膜
表面に固定化し、内部に検出可能なマーカー物質を内包
した、補体活性によって膜溶解作用を受けるリポソーム
と、(ii)補体、とを含んで成る免疫測定用試薬組成物を
用いて被検試料中の測定対象物を定量する測定方法に於
て、被検試料中に存在する測定妨害物質の影響を排除す
るために被検試料の液性を一時的にｐＨ4.5以下の酸性
又はｐＨ11以上のアルカリ性にし、然る後ｐＨを中性付
近に戻して測定を行うことを特徴とする免疫測定方法。 - 【請求項２】(i)測定対象物に対する抗原又は抗体を膜
表面に固定化し、内部に検出可能なマーカー物質を内包
した、補体活性によって膜溶解作用を受けるリポソーム
と、(ii)補体、及び(iii)被検試料の液性を一時的にｐ
Ｈ4.5以下の酸性又はｐＨ11以上のアルカリ性にする試
薬、を含んで成る免疫測定用試薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3159192 | 1992-01-22 | ||
| JP4-31591 | 1992-01-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05264551A true JPH05264551A (ja) | 1993-10-12 |
Family
ID=12335435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5023679A Pending JPH05264551A (ja) | 1992-01-22 | 1993-01-19 | 免疫測定方法及び試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5654156A (ja) |
| EP (1) | EP0552954B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05264551A (ja) |
| CA (1) | CA2087397A1 (ja) |
| DE (1) | DE69322179T2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2653867A1 (en) | 2012-04-16 | 2013-10-23 | King Saud University | Biotracer and its use in an immunoassay |
| CN110174363A (zh) * | 2019-01-09 | 2019-08-27 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4307190A (en) * | 1978-10-30 | 1981-12-22 | Technicon Instruments Corporation | Immunoassay using ascitic fluid |
| US4342826A (en) * | 1980-02-04 | 1982-08-03 | Collaborative Research, Inc. | Immunoassay products and methods |
| US4703001A (en) * | 1985-10-23 | 1987-10-27 | Synbiotics, Corporation | Immunoassay for the detection of serum analytes using pH dependent chastropic acids |
| JP2516359B2 (ja) * | 1987-03-19 | 1996-07-24 | 日水製薬株式会社 | 免疫分析法 |
| US5080833A (en) * | 1987-09-21 | 1992-01-14 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Immobilization of bioactive substance on lipid composition containing modified lipid compound |
| JP2604171B2 (ja) * | 1987-09-22 | 1997-04-30 | 日水製薬 株式会社 | 免疫分析方法 |
| SU1503821A1 (ru) * | 1988-01-15 | 1989-08-30 | Институт Прикладной Молекулярной Биологии | Способ получени реагента R @ дл тестировани компонента С @ комплемента человека |
| JPH01214762A (ja) * | 1988-02-23 | 1989-08-29 | Green Cross Corp:The | 免疫測定法 |
| JPH01214763A (ja) * | 1988-02-24 | 1989-08-29 | Green Cross Corp:The | 免疫測定法 |
-
1993
- 1993-01-15 CA CA002087397A patent/CA2087397A1/en not_active Abandoned
- 1993-01-19 JP JP5023679A patent/JPH05264551A/ja active Pending
- 1993-01-21 DE DE69322179T patent/DE69322179T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-01-21 EP EP93300428A patent/EP0552954B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-23 US US08/264,754 patent/US5654156A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2087397A1 (en) | 1993-07-23 |
| EP0552954A1 (en) | 1993-07-28 |
| DE69322179T2 (de) | 1999-06-24 |
| EP0552954B1 (en) | 1998-11-25 |
| US5654156A (en) | 1997-08-05 |
| DE69322179D1 (de) | 1999-01-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
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