JPH05176782A - Ｎｇｆ作用増強因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】ＮＧＦ（神経成長因子）様作用及びＮＧＦの作
用増強効果を有する新規な生理活性物質を提供し、アル
ツハイマーの治療薬として用いる際の投与を簡便にする
こと。 【構成】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は神経成長因子（以下、Ｎ
ＧＦと称する。）様作用とその作用増強効果を有する新
規な生理活性物質に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年増えつつあるアルツハイマー型老年
痴呆においては、大脳基底核神経細胞であるアセチルコ
リン作動性神経の変性、脱落が、記憶障害、知的活動低
下に深く係わっていることが示唆されている［ウイット
ホースら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２１５巻、
第１２３７頁（１９８２年）］。

【０００３】ＮＧＦは、繊維切断によるアセチルコリン
作動性神経の変性、脱落を抑制すること［コーシング
ら、ニューロサイエンス レター（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ
ｎｃｅＬｅｔｔ．）第６６巻、第１７５頁（１９８６
年）］及び老齢ラットの迷路学習障害を改善すると共に
アセチルコリン作動性神経細胞の萎縮を抑制ことが報告
されている［茂野 卓ら、医学のあゆみ 第１４５巻、
第５７９頁（１９８６年）］。これらからＮＧＦがアル
ツハイマー型老年痴呆の治療薬となりうることが示唆さ
れる。

【０００４】一方、ＮＧＦは、脳虚血スナネズミの海馬
神経細胞脱落を防ぐことも確かめられており、脳卒中後
後遺症治療薬としても有用である。

【０００５】また、本発明のＮＧＦ作用増強因子は、こ
れらと同一の物理化学的性質、および生理活性作用を有
する物質の存在は知られていない新規な物質である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ＮＧＦ様の神経細胞保
護活性を示す生体成分は、いくつか発見されているが、
ＮＧＦも含めそのいずれもがタンパク質である。タンパ
ク質はアルツハイマーの治療薬として用いる際、脳室内
投与が必要となることが予想されるため、より簡単な投
与方法が可能な治療薬が望まれている。

【０００７】本発明の目的は、ＮＧＦ様作用及びＮＧＦ
の作用増強効果を有する新規な生理活性物質を提供し、
アルツハイマーの治療薬として用いる際の投与方法を簡
便にすることにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
の達成のために多数の菌株を土壌より分離し、その菌株
の代謝産物について種々検討した結果、ある種の菌株
が、ＮＧＦ作用増強効果を有する新規な生理活性物質を
生産することを見いだし本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明は、

【０００９】

【００１０】で表される化合物（以下、ＮＧ―１２１と
略称する。）、

【００１１】

【００１２】で表される化合物（以下、ＮＧ―１２２と
略称する。）及び

【００１３】

【００１４】で表される化合物（以下、ＮＧ―１２３と
略称する。）である。

【００１５】本発明のＮＧ−１２１，ＮＧ−１２２，Ｎ
Ｇ−１２３を生産する菌株は、本発明者らが、埼玉県大
宮市吉野町にて採取した落葉から新たに分離した菌株で
あり、微生物の名称 Stachybotrys parvispora F-47
08 および微生物寄託番号「微工研菌寄第１２６６０号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６６０）」として、工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。

【００１６】次に、この菌株の菌学的性状を以下に示
す。 ［形態］本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、オ
−トミ−ル寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地等で良好に生育
し、また胞子の形成も良好である。本菌株がバレイショ
・ブドウ糖寒天培地上、２６℃、１４日間の培養で形成
したコロニ−を光学顕微鏡で観察すると、菌糸は隔壁を
有し高度に分岐しており、ロープ状の菌糸束を多数形成
している。分生子柄は菌糸束から側生し、単生か稀に分
岐する。表面は滑面、無色で隔壁を有し、先端付近に脱
落性の顆粒が多数付着している。高さは４５〜８３μ
ｍ、幅は基部で２．９〜４．８μｍ、先端付近ではやや
先細りとなり１．７〜２．９μｍである。フィアライド
は分生子柄の先端に複数個形成され、棍棒形、表面は滑
面、大きさは６．７〜１１．４×２．９〜４．８μｍ
（膨潤部）である。分生子は長円形、暗灰緑色、大きさ
は３．８〜５．９×２．７〜２．９μｍ、フィアライド
の先端で粘球状の塊となる。また、走査型電子顕微鏡で
分生子の表面を観察すると、わずかに粗面を呈してい
る。

【００１７】なお、培養を３週間に延長したが有性生殖
器官の形成は認められなかった。

【００１８】［培地上での諸性状］各種培地上で、２６
℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察結果を次の表１
に示した。なお色の表示は日本規格協会、ＪＩＳ色名帳
（１９８５）の系統色名を引用した。

【００１９】

【表１】

【００２０】［生理的性質］ １）生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ 本菌株はＹｐＳｓ液体培地中２６℃においてｐＨ４〜１
０の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜７である。 ２）生育温度範囲及び最適温度 本菌株はｐＨ６．０のサブロ−液体培地において、１２
〜３１℃の範囲で生育し、最適温度は２４〜２７℃であ
る。 ３）好気性，嫌気性の区別 ； 好気性

【００２１】以上の形態的特徴および培養上の性状か
ら、本菌株が不完全菌亜門、Stachy-botrys 属の１菌種
であることが明らかであり、宇田川 俊一，椿 啓介 編
『菌類図鑑』（1978年）、M. B. Ellis 著『DEMATIACEO
US HYPHOMYCETES』（1971年）および 『MORE DEMATIACE
OUS HYPHOMYCETES』（1976年）、Jong and Davis, MYC
OTAXON, 3, PP409-485（1976）に報告されている多くの
既知菌株と比較検討した。その結果、本菌株は Stachy
botrys parvispora hughesに最も近い性状を示すこ
とが明かとなり、本菌株を Stachybotrys parvispor
aF-4708と命名した。

【００２２】ＮＧ−１２１，ＮＧ−１２２，ＮＧ−１２
３の生産は、大略一般の発酵生成物を生産する場合に準
じ、各種の栄養物質を含む培地で Stachybotrys parvis
poraF-4708 を好気的条件下で培養することにより行
う。

【００２３】培地は主として液体培地を用い、炭素源、
窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先
駆物質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは６前後に調
整する。炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまた
は混合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混
合して用いる。無機塩としては、例えば燐酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウ
ムなどを単独かまたは混合して用いる。消泡剤としては
アデカノール、シリコン化合物などを用いることができ
る。

【００２４】培養方法としては振盪培養、通気撹拌培養
などの好気的培養が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３
０℃で３〜５日間、望ましくはｐＨ５〜７、２５〜２７
℃で４日間培養する。この培養により生産されたＮＧ−
１２１，ＮＧ−１２２，ＮＧ−１２３を単離するには、
発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行えばよ
い。

【００２５】すなわち、培養終了後、遠心分離または濾
過により分離した菌体からＮＧ−１２１、ＮＧ−１２
２，ＮＧ−１２３を低級アルコール、アセトンなどの有
機溶媒で抽出し、この抽出液を減圧濃縮し有機溶媒を除
去した後、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルムなどの
非水溶性有機溶媒に転溶し、これを減圧濃縮してシロッ
プ状とする。このシロップを再度酢酸エチル、ベンゼ
ン、クロロホルム、アセトン、メタノールなどの有機溶
媒に溶解し、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフ
ィー、逆相分配用シリカゲルＯＤＳを充填した高速液体
クロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーに付すことによりＮＧ−１２１、ＮＧ−１２２，Ｎ
Ｇ−１２３を精製、単離することができる。

【００２６】以上の精製によって得られた本発明の目的
物質であるＮＧ−１２１，ＮＧ−１２２，ＮＧ−１２３
は、その分子量、紫外線吸収スペクトル、¹Ｈ−ＮＭＲ
スペクトル、¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル等の解析結果より
化２のように構造式が決定された。

【００２７】ＮＧ−１２１の理化学的性質は以下の通り
である。 （ａ）ＨＲＥＩマススペクトル 実測値 ３８６．２０８３ 理論値 ３８６．２０９３ （Ｃ₂₃Ｈ₃₀Ｏ₅として計
算） （ｂ）ＥＩマススペクトル： ＥＩ ｍ／ｚ ３８６（Ｍ⁺） （ｃ）分子量：３８６ （ｄ）分子式：Ｃ₂₃Ｈ₃₀Ｏ₅ （ｅ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２１４ｎｍ（ε＝２７２００） ２５７ｎｍ（ε＝５６００） ３１０ｎｍ（ε＝２００） （メタノール溶液中で測定） （ｆ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル： ＣＤＣｌ₃中、４００ＭＨｚで測定した結果を図１に示
す。 （ｇ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル： ＣＤＣｌ₃中、１００ＭＨｚで測定した結果を図２に示
す。 （ｈ）ＩＲ吸収スペクトル ＣＨＣｌ₃中で測定した結果を図３に示す。 （ｉ）溶剤に対する溶解性： メタノ−ル、エタノ−ル、アセトンに可溶 ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶 水に不溶 （ｊ）呈色反応； 陽性：Ｈ₂ＳＯ₄、Ｉ₂、ＦｅＣｌ₃ 陰性：ニンヒドリン （ｋ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性 （ｌ）物質の色：白色油状

【００２８】ＮＧ−１２２の理化学的性質は以下の通り
である。 （ａ）ＨＲＥＩマススペクトル 実測値 ５０５．２８４０ 理論値 ５０５．２８２８ （Ｃ₃₁Ｈ₃₉ＮＯ₅として
計算） （ｂ）ＥＩマススペクトル： ＥＩ ｍ／ｚ ５０５（Ｍ⁺） （ｃ）分子量：５０５ （ｄ）分子式：Ｃ₃₁Ｈ₃₉ＮＯ₅ （ｅ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２１６ｎｍ（ε＝５２８００） ２５８ｎｍ（ε＝１２６００） ３０１ｎｍ（ε＝４０００） （メタノール溶液中で測定） （ｆ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル： ＣＤＣｌ₃中、４００ＭＨｚで測定した結果を図４に示
す。 （ｇ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル： ＣＤＣｌ₃中、１００ＭＨｚで測定した結果を図５に示
す。 （ｈ）ＩＲ吸収スペクトル ＣＨＣｌ₃中で測定した結果を図６に示す。 （ｉ）溶剤に対する溶解性： メタノ−ル、エタノ−ル、アセトンに可溶 ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶 水に不溶 （ｊ）呈色反応； 陽性：Ｈ₂ＳＯ₄、Ｉ₂、ＦｅＣｌ₃ 陰性：ニンヒドリン （ｋ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性 （ｌ）物質の色：白色

【００２９】ＮＧ−１２３の理化学的性質は以下の通り
である。 （ａ）ＦＡＢマススペクトル： ＦＡＢ ｍ／ｚ ３８９（Ｍ−Ｈ）^- （ｃ）分子量：３９０ （ｄ）分子式：Ｃ₂₃Ｈ³⁴Ｏ₅ （ｅ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２０６ｎｍ（ε＝１６７００） ２９５ｎｍ（ε＝５８００） （メタノール溶液中で測定） （ｆ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル： ＣＤＣｌ₃中、４００ＭＨｚで測定した結果を図７に示
す。 （ｇ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル： ＣＤＣｌ₃中、１００ＭＨｚで測定した結果を図８に示
す。 （ｈ）ＩＲ吸収スペクトル ＣＨＣｌ₃中で測定した結果を図９に示す。 （ｉ）溶剤に対する溶解性： メタノ−ル、エタノ−ル、アセトンに可溶 ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶 水に不溶 （ｊ）呈色反応； 陽性：Ｈ₂ＳＯ₄、Ｉ₂、ＦｅＣｌ₃ 陰性：ニンヒドリン （ｋ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性 （ｌ）物質の色：白色

【００３０】

【発明の効果】ＮＧＦ様作用及びＮＧＦ作用増強効果を
有する本発明の化合物 ＮＧ−１２１，ＮＧ−１２２，
ＮＧ−１２３は、アルツハイマーなどの抗痴呆薬及び脳
卒中後後遺症治療薬として有用である。

【００３１】

【実施例】以下、実施例及び試験例を示し、本発明を更
に詳細に説明する。

【００３２】実施例 １００ｍｌ当りグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５
ｇ、酵母エキス０．２ｇ、リン酸一カリウム０．１ｇ、
硫酸マグネシウム０．０５ｇからなるｐＨ６の無菌液体
培地に Stachybotrys parvispora F4708株 を接種
し、２６℃、９６時間振盪培養した。次に５Ｌ容培養ミ
ニジャー２基を用いて、種培養と同じ組成の無菌培地６
Ｌに前記種培養液２００ＭＬを接種し２６℃、９６時間
撹拌通気培養した。培養終了後吸引濾過により上澄液と
菌体に分けた。得られた上澄液を酢酸エチル２．５Ｌで
４回抽出し、この抽出液を合わせ無水硫酸ナトリウムで
脱水後、減圧濃縮乾固し褐色のシロップ状物質２．７ｇ
を得た。

【００３３】この褐色シロップ状物質をクロロホルムに
溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［ワコーゲ
ルＣ−２００（商品名、和光純薬社製）］の１２０ｍｌ
カラムに吸着させた。クロロホルム２４０ｍｌで洗浄
後、クロロホルム−メタノール（９９：１）の混合溶媒
で溶出し、この区分を除去した。次にクロロホルム−メ
タノ−ル（９８：２，９６：４，９０：１０）の混合溶
媒で順次溶出を行い、１フラクション８０ｍｌずつ分画
した。これらの分画をＦｒ．１（混合溶媒比９８：
２）、Ｆｒ．２（混合溶媒比９６：４〜９０：１０）と
し、それぞれを減圧乾固し褐色物質８３．４ｍｇ、３８
６．５ｍｇを得た。

【００３４】シリカゲルカラム精製で得られたＦｒ．１
を少量のメタノ−ルに溶解し、セファデックスＬＨ−２
０（商品名：ファルマシア社製）を用いメタノ−ルでゲ
ル濾過し、得られた活性区分を集め減圧乾固し褐色物質
９．７ｇを得た。

【００３５】ゲル濾過で得られた褐色物質をメタノ−ル
に溶解し、この溶液を７０％メタノ−ルを移動相とした
分取高速液体クロマトグラフィ−［使用装置：センシュ
−科学社製３１１０；カラム：センシュ−パックＯＤＳ
−４２５１−Ｎ（１０φ＊２５０ｍｍ）］を用い、ＵＶ
吸収２１５ｎｍでモニタ−しながら流速５ｍｌ／ｍｉｎ
条件で２５．０〜２７．５ｍｉｎに溶出されるピ−クを
分取した。

【００３６】分取で得られた区分を合わせ減圧濃縮乾固
してＮＧ−１２１の白色粉末３．４ｍｇを得た。

【００３７】また先に得られたＦｒ．２を少量のメタノ
−ルに溶解しセファデックスＬＨ−２０を用いメタノ−
ルでゲル濾過し、得られた分画を集めて減圧乾固し褐色
物質１１０．６ｍｇを得た。

【００３８】ゲル濾過で得られた褐色物質をジクロロメ
タン−ヘキサン−メタノ−ル（５：５：１）の混合溶媒
に溶解し、セファデックスＬＨ−２０を用いジクロロメ
タン−ヘキサン−メタノ−ル（５：５：１）の混合溶媒
でゲル濾過し、得られた分画を集め減圧乾固しＮＧ−１
２２の粗精製粉末３５．８ｍｇとＮＧ−１２３の粗精製
粉末１１．０ｍｇを得た。

【００３９】ＮＧ−１２２の粗精製粉末を少量のアセト
ニトリルに溶解し、この溶液を６０％アセトニトリルを
移動相とした分取高速液体クロマトグラフィ−を用いて
ＵＶ吸収２１５ｎｍでモニタ−しながら流速４．５ｍｌ
／ｍｉｎ条件で１０〜１２ｍｉｎに溶出されるピ−クを
分取した。

【００４０】分取で得られた区分を合わせ減圧濃縮乾固
してＮＧ−１２２の白色粉末９．２ｍｇを得た。

【００４１】またＮＧ−１２３の粗精製粉末を少量のア
セトニトリルに溶解し、この溶液を５５％アセトニトリ
ルを移動相とした分取高速液体クロマトグラフィ−を用
いてＵＶ吸収２１５ｎｍでモニタ−しながら流速４．５
ｍｌ／ｍｉｎ条件で１２〜１４ｍｉｎに溶出されるピ−
クを分取した。

【００４２】分取で得られた区分を合わせ減圧濃縮乾固
してＮＧ−１２３の白色粉末３．７ｍｇを得た。

【００４３】試験例１ ［ＮＧＦ作用増強効果試験］ ＮＧＦ作用増強効果は、ＰＣ−１２細胞の突起伸長で評
価した。

【００４４】ＰＣ−１２細胞は、ＮＧＦに反応して神経
突起の伸長、神経伝達物質の生合成に関する酵素活性の
上昇などを示し、神経様細胞へと分化する。この性質を
利用し、本培養細胞へＮＧＦと本発明化合物を同時添加
して本発明化合物のＮＧＦ作用増強効果を調べた。 （検体）実施例で得られた白色粉末をメタノ−ルに溶解
し、ＮＧ−１２１，ＮＧ−１２２を３００μｇ／ｍｌ〜
１ｍｇ／ｍｌ，ＮＧ−１２３を１ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／
ｍｌとした。 （試験細胞）ＰＣ−１２細胞 ラット褐色細胞腫（ＮＧ
Ｆ応答細胞）

【００４５】（試験方法）ＰＣ−１２細胞を１０％牛胎
児血清、５％馬血清、５０ユニット／ｍｌペニシリン、
５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッ
コ改変イーグル培地（Gibco社製，高グルコース含有）
にて、２×１０⁴細胞／ｍｌに調製し、コラーゲンコー
ト２４孔プレート（培養孔あたりの面積２cm²,Corning
社製）へ、０．５ｍｌ／孔ずつまき、３７℃、５％ＣＯ
² で培養した。２４時間後、プレ−ト下部に付着したＰ
Ｃ−１２細胞を残して、ＮＧＦ（Sigma社製、２．５
ｓ）と各種濃度の検体１％を含む上記培地０．３ｍｌ／
孔と交換し、各種サンプルを調製した。ここで、ＮＧＦ
は０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳに溶解し、培
地に溶かした最終濃度が０．５ｎｇ／ｍｌとなるように
添加した。また、本発明化合物はメタノールに溶解し、
培地に溶かした最終濃度が下記表２に示す各種濃度とな
るように添加した。なお、比較としてＮＧＦ，本発明化
合物共に加えない無添加サンプル、本発明化合物のみ加
えない対照サンプルも調製した。

【００４６】このようにして調製した各種サンプルを４
８時間培養した後、ＰＣ−１２細胞の神経突起の伸長
を、顕微鏡下に観察した。

【００４７】観察結果を細胞の突起長で４段階に分類
し、形態変化のない細胞を０点、突起の伸長を伴わず形
態変化を起こした細胞を１点、細胞体の直径以内の突起
を持つ細胞を２点、細胞体の直径以上の突起を持つ細胞
を３点とし、１００細胞の合計点を突起伸長活性とし
た。 （結果）結果を表２に示す。

【００４８】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＤＣｌ₃中、４００ＭＨｚで測定したＮＧ−
１２１の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図２】ＣＤＣｌ₃中、１００ＭＨｚで測定したＮＧ−
１２１の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図３】ＣＨＣｌ₃中で測定したＮＧ−１２１の赤外線
吸収スペクトルを示す。

【図４】ＣＤＣｌ₃中、４００ＭＨｚで測定したＮＧ−
１２２の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図５】ＣＤＣｌ₃中、１００ＭＨｚで測定したＮＧ−
１２２の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図６】ＣＨＣｌ₃中で測定したＮＧ−１２２の赤外線
吸収スペクトルを示す。

【図７】ＣＤＣｌ₃中、４００ＭＨｚで測定したＮＧ−
１２３の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図８】ＣＤＣｌ₃中、１００ＭＨｚで測定したＮＧ−
１２３の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図９】ＣＨＣｌ₃中で測定したＮＧ−１２３の赤外線
吸収スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 491/052 7019−4Ｃ 493/04 １０６ Ｃ 7329−4Ｃ Ｃ１２Ｐ 7/24 8114−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 溝部 文夫 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 酒井 則義 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 花田 和紀 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 で表される化合物。
2. 【請求項２】 で表される化合物。
3. 【請求項３】 で表される化合物。