JPH0499788A - 生理活性物質ｎｇ―０６１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規な生理活性物ｗＮＧ 関する。

０６１に ［従来の技術］ 本発明の生理活性物質ＮＧ−０６１は分Ｊ量２７０、　
　分子式；Ｃ１５８１４Ｎ２０３の新規な物質であり、
これと同一の物理化学的性質、および生理活性物質を有
する物質の存在は知られていない。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、神経成長因子（以下、ＮＧＦと略称す
る。）の作用増強効果を有する新規な生理活性物質を提
供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、上記目的の達成のために多数の菌株を植
物試料より分離し、その菌株の培養物について種々検討
した結果、本発明者らの見出した特定の微生物が、ＮＧ
Ｆの作用増強効果を有する新規な生理活性物質を生産す
ることを見出し本発明を完成するに至った。

本発明のＮＧ−０６１を生産する菌株は、本発明者らが
、新潟市郊外で採取した落葉より新たに分離した菌株で
あり、微生物の名称ｒＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ＋１６４
８）として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

この菌株の菌学的性状を以下に示す。

■　形態 本菌株は麦芽汁寒天培地、バレイショ・ブドウ糖培地、
ツアペック−ドックス寒天培地、オートミール寒天培地
、ＹｐＳｓ寒天培地など、多くのに 寒天培地で良好呑生育し、胞子の形成も極めて良好であ
る。本菌株が麦芽エキス寒天培地上、２５℃、７日間の
培養で形成したコロニーを顕微鏡下で観察すると、菌糸
は隔壁を有し、白色から一部黄色を呈し、高度に分岐し
ている。分生子形成細胞は、基底菌糸あるいは気中菌糸
から分岐して立ち上がった分生子柄の先端にメトレ（ｍ
ｅｔｒｅ）を介して輪生状、二段階に分岐して形成され
ており、ペニシリウム属に特徴的な形態、すなわちベニ
シリ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ）が観察される。分生子柄は
隔壁を有し、表面はほとんどが滑面、希にわずかな粗面
を呈しており、その径は３〜４１Ｊｍ、長さは］ｏＯ〜
２００１．１ｍである。メトレは分生子柄の先端から５
〜６本が対称型、比較的密着して輪生し、同じくその先
端にフィアライドが輪生している。メトレの表面は滑面
を呈し、その大きさは１０〜１４−ｍＸ２〜３μｍであ
る。分生子はほとんどが亜球形、希に球形で、多くは両
端がやや尖っており、表面は滑面、大きさは２〜４（〜
６）１．１ｍｘ２〜３μｍである。

尚、培養を延長して、観察を続けたが、子嚢果の形成は
認められなかった。

■　培地上での諸性状 各培地上で２５℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察
結果を次の第１表に示した。

第１表 ■　生理的的性質 １）生育ｐＨ範囲および最適ｐ）−１ 本菌株はＹｐＳｓ培地においてｐ）−１２〜８で生育し
、最適ｐＨは３〜５である。

２）生育温度範囲および最適温度範囲 本菌株はサブロー培地において１０〜３７℃の範囲で生
育し、最適温度範囲は２６〜３６℃である。

３）好気性、嫌気性の区別、好気性 以上の形態的特徴及び培養上の性状から本菌株が不完全
菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属することが明らかに
なったので、前記諸性状を基に、宇田用俊−１椿啓介編
　「菌類図鑑Ｊ　　（１９７８）およびに、　　Ｂ。

Ｒａｐｅｒ、　ｃ、Ｔｈｏｍ著ｒＡ　　ＭＡＮＵＡＬＯ
Ｆ　　Ｔ）−ＩＥ　　ＰＥＮＩＣＩＬＬＡＪ　　（＋９
４９）およびＪ、１．Ｐｉｔｔ著のｒＡ　　ＬＡＢ○−
ＲＡＴＯＲＹ　　ＧＬＩＩＤＥ　　Ｔｏ　　ＣＯＭＭＯ
ＮＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　　５ＰＥＣＩＥＳＪ　　（
＋９８５）に報告されている多くの既知菌株と比較検討
した。

その結果、本菌株はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　　ｍｉｎ
ｉｏｌｕｔｅｕｍに最も近い性状を示すことが明かとな
った。以上の結果から本菌株をｒＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ　　ｍｉｎｉｏｌｕｔｅｕｍＦ−４６２７Ｊと命名し
た。

次に、生理活性物質の生産は、大略して、一般発酵生産
物を生産する場合に準じて行われる。

即ち、各種の栄養物質を含む培地でを好気的条件下で培
養する。

培地は主として液体培地を用い、炭素源としてはグルコ
ース、廃蜜糖、スターチなどを単独菰たは混合して用い
ることができる。窒素源としては、ポリペプトン、大豆
粉、酵母エキスなどを単独または混合して用いることが
できる。その他、菌株の生育を助は生理活性物質の生産
を促進する有機物および無機塩を必要により添加するこ
とができる。

培養法は振盪培養、通気攪拌培養などの好気的培養が適
しており、ｐＨ５〜７．２５〜３０℃で、２〜４日間培
養する。

この培養液中に生産された生理活性物質ＮＧ０６１を単
離するには、発酵生産物を採取する船釣な方法に準じて
行えば良い。すなわち培養終了後、違・し・分離または
濾過により培養液を得、ポリスチレン樹脂に吸着させた
後、低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒でＮＧ−
〇６１を溶出させる。菌体はアセトンなどの有機溶媒で
抽出する。

次いでこの菌体抽圧液及び吸着樹脂からの溶出液を合わ
せて濃縮後、酢酸エチルエステル、クロロホルムなどの
非水溶性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状
とする。

このシロップを再度クロロホルム、メタノールなどの有
機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー
、中低圧カラムクロマトグラフィーにより、生理活性物
質ＮＧ−〇６１を精製単離することができる。

以上の精製法によって得られた生理活性物質ＮＧ−０６
１の理化学的性質は、次の通りである。

ＮＧ−０６１の理化学的性質 （１）外観：淡黄色粉末 （２）融点、１９３〜１９５℃ （３）元素分析値 ＣＩ６Ｈ１４Ｎ　２０３　として、 計算値：　Ｃ；６６．６６％、Ｈ，５，２２％、Ｎ、Ｉ
０．３６％。

実測値　Ｃ，６５，＋９％、Ｈ；５１４％、Ｎ；１０．
３０％（４）Ｅｌマススペクトル ｍ／ｚ　　２７０（Ｍ）’″ （５）ＦＡＢマススペクトル ｍ／ｚ　　２７１（Ｍ十Ｈ）” （６）高分解能マススペクトル 実測値：２７０　１００２ 計算値（Ｃ１５１”’１Ｉ４Ｎ２０３として）：２７０
．＋ｏｏａ （７）分子式：　Ｃｌ６ＨＩ４Ｎ２０３（８）分子量：
２７０ （９）［Ｑ］Ｄ　　−３゜ （ｃ＝０．Ｉ、　　メタノール溶液） （＋０）ＵＶ吸収スペクトル　メタノール溶液で測定し
た結果、 入ｒｌ、、＝＝　　２０７ｎｍ（ε＝１５ｊｏｏ）３４
０ｎｍ（ε＝３０３００） （１１）ｌＲ吸収スペクトル ＫＢｒ錠で測定したスペクトルを第１図に示す。

（＋　２）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル： 重ジメチルスジメチルスルフオキシド中Ｈｚで測定した
スペクトルを第２図に示す。

（＋　３）’３Ｃ−ＮＭＲスペクトル 重ジメチルスルフオキシド中、＋ＯＯＭＨｚで測定した
スペクトルを第３図に示す。

（１４）溶解性 メタノール、エタノール、アセトンに可溶。

酢酸エチルエステル、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、
ベンゼンに離溶。

水に不溶。

（１５）呈色反応。

陽性　硫酸、ヨウ素 （１６）塩基性、酸性、中性の区別　中性（１７）薄層
クロマトグラフィ Ｒｆ値、０２１ 吸着剤１シリカゲルプレートＮ０．５７１５（メルク社
製） 展開溶媒、ベンセン−アセトン（５１）［発明の効果］ 近年増えつつあるアルツハイマー型痴呆症は、前脳基底
野のコリン作動性神経細胞が選択的に脱落するために起
こるといわれている。

ＮＧＦは、この神経細胞の脱落を抑制する作用があるこ
とから、その作用増強効果を有する本発明の化合物ＮＧ
−０６４は、抗痴呆薬として利用できる。

［実施例］ 以下、実施例および試験例を挙げて本発明を具体的に説
明する。

実施例（ＮＧ−０６１の単離、精製） （＋）　　　１００ｍ１当り、グルコース２９、酵母エ
キス０２ｇ、硫酸マグネシウム００５９、ポリペプトン
０．５９、リン酸水素−カリウム０１９を含むｐｉ−１
６の無菌液体培地にＦ４６２７株を接種し、２８℃、７
２時間振とう培養し、種培養液とした。次に、内容Ｈ５
ｏ１のジャーファーメンタ−を用いて、種培養と同じ組
成の無菌培地３０λに前記種培養液３００ｍ１を接種し
、２８℃、４８時間通気攪拌、培養した。

（２）　培養終了後、培養液２７１を遠心分離機で上溝
と菌体に分け、菌体は７０％含水アセトン１ｏｚで抽出
した。上清は、ダイヤイオンＨＰ−２０（ポリスチレン
樹脂の商品名、三菱化成社製）のカラム（容量１５りに
吸着させた後、精製水３１で洗浄後、メタノール２）で
活性物質を溶出した。先の菌体アセトン抽出液と合わせ
、溶媒留去後、残渣を、酢酸エチルエステル１ノで４回
抽出した。この酢酸エチルエステル画分を無水硫酸ナト
リウムで脱水後、濃縮し褐色のシロップ状物質８．８９
を得た。

（３）　シロップ状物質をクロロホルム１０１に溶解し
、クロロホルムで調製したシリカゲル（商品名；シリカ
ゲル６０．メルク社製）を充填した４００ｍ１のカラム
に吸着させた。　クロロホルム８００ｍ１で洗浄後、ク
ロロホルム−メタノール（９９：１）の混合溶媒９００
ｍ１で溶出される区分を除いた。次いで、クロロホルム
−メタノール（９８：２）の混合溶媒９ｏ０１で溶出を
行い、濃縮乾固し、褐色のシロップ状物質９９６ｍＱを
得た。

（４）　前項のシロップ状物質９９６ｍ９を、熱メタノ
ール５１に溶解し、以下の条件で行った中低圧カラムク
ロマトグラフィーの試料とした。

カラムサイズ２２φＸ　３００ｍｍ 担体　　　　ＯＯＳシリカゲル （Ｃ，１，Ｇ、草野科学器械製） 溶媒組成　　３５％アセトニトリル、６５％水流速　　
　　　５ｍｌ／ｍｉｎ 活性画分を合わせて濃縮し、黄色粉末６６ｍ９を得た。

（５）　前項の黄色粉末６６ｍ９を熱メタノール５１に
溶解し、急冷することによりＮＧ−０６１の淡黄色粉末
４２ｍ９を得た。

試験例　（ＮＧＦ作用増強効果） （検体） 実施例で得られた淡黄色粉末をメタノールに溶解し、１
００μｇ／＋ｎｌ　〜１ｍｇ／＋ｎｌとした。

（試験細胞） ＰＣ−１２細胞　ラット褐色細胞腫 （ＮＧＦ応答細胞） （使用した培地） １０％熱非働化（５６℃、３０分処理）牛胎児血清（ｆ
ｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、Ｆ　Ｂ　Ｓ、　
Ｇｉｂｃｏ社）、５％熱非働化馬血清（ｈｏｒｓｅ　ｓ
ｅｒｕｍ、　ＨＳ、　Ｇｉｂｃｏ社）５０Ｕ／ｉｆペニ
シリン、５０μｇ／ＩＩＩｔストレプトマイシンを含有
するダルベツコ改良型イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ
ｏｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ、
　ＤＭ　ＥＭ。

高グルコース含有、　Ｇｉｂｃｏ社） （試験方法） ＰＣ−１２細胞を、上記培地にて、２Ｘ＋０４ｃｅｌｌ
ｓ　／ｍｌに調製し、コラーゲンコート２４孔プレート
（２ｃｍ２．　Ｃｏｒｎｉｎｇ社）へ、０．５ｍｌ／ｗ
ｅずつまき、３７℃、５％ＣＯスで培養した。２４時間
後、プレート下部に付着した細胞を残して、０　、５　
ｎｇ／　ｍｌ　Ｎ　Ｇ　Ｆ　（Ｓｉｇｍａ社、５０ｎｇ
／ｍｌの　０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝生
理食塩水溶液を１％）と各種濃度の検体１％を含む上記
培地　０　、３　ｍｌ／ｗｅｌｌと交換した。さらに４
８時間培養後、細胞の突起伸長を、顕微鏡下に観察した
。

観察結果を細胞の突起長で４種類に分類し、形態変化の
ない細胞を０点、突起の伸長を伴わず形態変化を起こし
た細胞を１点、細胞体の直径以内の突起を持つ細胞を２
点、細胞体の直径以上の突起を持つ細胞を３点とし、１
００細胞の合計点を突起伸長活性とし、３視野を平均し
た。

（結果） 結果を第２表に示す。

第　　２　　表

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＫＢｒ錠にて測定したＮＧ−ＯａｔのＩＲス
ペクトルを示す。 第２図は重ジメチルスルフオキシド中、４００ＭＨｚで
測定したＮＧ−０６１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す
。　第３図は重ジメチルスルフオキシド中、１００ＭＨ
ｚで測定したＮＧ−０６１の１３Ｃ−ＮＭＲスペク トルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記理化学的性質を有する生理活性物質 ＮＧ−０６１化合物。 （１）外観：淡黄色粉末 （２）融点：１９３〜１９５℃ （３）元素分析値；Ｃ＿１＿５Ｈ＿１＿４Ｎ＿２Ｏ＿３
   として、計算値：Ｃ；６６．６６％、Ｈ；５．２２％、
   Ｎ；１０．３６％、実測値：Ｃ；６６．１９％、Ｈ；５
   ．１４％、Ｎ；１０．３０％、（４）Ｅｌマススペクト
   ル ｍ／ｚ２７０（Ｍ）＾＋ （５）ＦＡＢマススペクトル ｍ／ｚ２７１（Ｍ＋Ｈ）＾＋ （６）高分解能マススペクトル 実測値：２７０．１００２ 計算値（Ｃ＿１＿５Ｈ＿１＿４Ｎ＿２Ｏ＿３として）：
   ２７０．１００４ （７）分子式：Ｃ＿１＿５Ｈ＿１＿４Ｎ＿２Ｏ＿３（８
   ）分子量：２７０ （９）［ａ］＾２＾６＿Ｄ：−３゜ （ｃ＝０．１、メタノール溶液） （１０）ＵＶ吸収スペクトル：メタノール溶液で測定し
   た結果、 λ＿Ｍ＿ａ＿ｘ＝２０７ｎｍ（ε＝１５１００）３４０
   ｎｍ（ε＝３０３００） （１１）ｌＲ吸収スペクトル：ＫＢｒ錠で測定したスペ
   クトルを第１図に示す。 （１２）＾１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重ジメチルスルフ
   ォキシド中、４００ＭＨｚで測定したスペクトルを第２
   図に示す。 （１３）＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重ジメチルス
   ルフォキシド中、１００ＭＨｚで測定したスペクトルを
   第３図に示す。 （１４）溶解性：メタノール、エタノール、アセトンに
   可溶。 酢酸エチルエステル、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、
   ベンゼンに難溶。 水に不溶。 （１５）呈色反応：陽性：硫酸、ヨウ素 （１６）塩基性、酸性、中性の区別：中性 （１７）薄層クロマトグラフィーＲｆ値；０．２１ 吸着剤；シリカゲルプレートＮｏ．５７１５（メルク社
   製） 展開溶媒；ベンゼン−アセトン（５：１）