JPH06256350A

JPH06256350A - Ｎｇｆ作用増強物質

Info

Publication number: JPH06256350A
Application number: JP5040342A
Authority: JP
Inventors: Yuriko Orii; 由利子折居; Yoji Kawamura; 洋治河村; Fumio Mizobe; 文夫溝部; Noriyoshi Sakai; 則義酒井; Kazunori Hanada; 和紀花田
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-03-02
Filing date: 1993-03-02
Publication date: 1994-09-13

Abstract

(57)【要約】【目的】ＮＧＦ様作用及びＮＧＦの作用増強効果を有す
る新規な生理活性物質を提供する。【構成】式

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】

【０００２】本発明は神経成長因子（以下、ＮＧＦと称
する。）様作用とその作用増強効果を有する新規な生理
活性物質に関する。

【０００３】

【従来の技術】近年増えつつあるアルツハイマー型老年
痴呆においては、大脳基底核神経細胞であるアセチルコ
リン作動性神経の変性、脱落が、記憶障害、知的活動低
下に深く係わっていることが示唆されている［ウィット
ホースら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２１５巻、
第１２３７頁（１９８２年）］。

【０００４】ＮＧＦは、繊維切断によるアセチルコリン
作動性神経の変性、脱落を抑制すること［コーシング
ら、ニューロサイエンスレター（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ
ｎｃｅＬｅｔｔ．）第６６巻、第１７５頁（１９８６
年）］及び老齢ラットの迷路学習障害を改善すると共に
アセチルコリン作動性神経細胞の萎縮を抑制することが
報告されている［茂野卓ら、医学のあゆみ第１４５
巻、第５７９頁（１９８６年）］。これらからＮＧＦが
アルツハイマー型老年痴呆の治療薬となりうることが示
唆される。

【０００５】また、ＮＧＦは、脳虚血スナネズミの海馬
神経細胞脱落を防ぐことも確かめられており、脳卒中後
遺症治療薬となりうることが示唆される。

【０００６】一方、ＮＧＦ様の神経細胞保護活性を示す
生体成分は、いくつか発見されているが、ＮＧＦも含め
そのいずれもがタンパク質である。タンパク質はアルツ
ハイマー型老年痴呆あるいは脳卒中後遺症治療薬として
用いる際、その物状から判断すると直接脳室内投与が必
要となることが予想されるため、より簡単な投与方法が
可能な治療薬が望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＮＧ
Ｆ様作用及びＮＧＦの作用増強効果を有する新規な生理
活性物質を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
の達成のために多数の菌株を土壌より分離し、その菌株
の代謝産物について種々検討した結果、ある種の菌株
が、ＮＧＦ作用増強効果を有する新規な生理活性物質を
生産することを見いだし本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明は、式

【０００９】

【００１０】で表される化合物（以下、これをＮＧ−２
４５と略称する）である。

【００１１】本発明のＮＧ−２４５を生産する菌株は、
本発明者らが、埼玉県大宮市吉野町にて採取した落葉か
ら新たに分離した菌株であり、微生物の名称 Stachybo
trysparvispora F-4708 および微生物寄託番号「微工
研菌寄第１２６６０号（ＦＥＲＭＰ−１２６６
０）」として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。次に、この菌株の菌学的性状を以下に示
す。［形態］本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、オ
−トミ−ル寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地等で良好に生育
し、また胞子の形成も良好である。本菌株がバレイショ
・ブドウ糖寒天培地上、２６℃、１４日間の培養で形成
したコロニ−を光学顕微鏡で観察すると、菌糸は隔壁を
有し高度に分岐しており、ロープ状の菌糸束を多数形成
している。分生子柄は菌糸束から側生し、単生か稀に分
岐する。表面は滑面、無色で隔壁を有し、先端付近に脱
落性の顆粒が多数付着している。高さは４５〜８３μ
ｍ、幅は基部で２．９〜４．８μｍ、先端付近ではやや
先細りとなり１．７〜２．９μｍである。フィアライド
は分生子柄の先端に複数個形成され、棍棒形、表面は滑
面、大きさは６．７〜１１．４×２．９〜４．８μｍ
（膨潤部）である。分生子は長円形、暗灰緑色、大きさ
は３．８〜５．９×２．７〜２．９μｍ、フィアライド
の先端で粘球状の塊となる。また、走査型電子顕微鏡で
分生子の表面を観察すると、わずかに粗面を呈してい
る。

【００１２】なお、培養を３週間に延長したが有性生殖
器官の形成は認められなかった。［培地上での諸性状］各種培地上で、２６℃、１４日間
培養した場合の肉眼的観察結果を次の表１に示した。な
お色の表示は日本規格協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５）
の系統色名を引用した。

【００１３】

【表１】

【００１４】［生理的性質］１）生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ本菌株はＹｐＳｓ液体培地中２６℃においてｐＨ４〜１
０の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜７である。２）生育温度範囲及び最適温度本菌株はｐＨ６．０のサブロ−液体培地において、１２
〜３１℃の範囲で生育し、最適温度は２４〜２７℃であ
る。３）好気性，嫌気性の区別；好気性

【００１５】以上の形態的特徴および培養上の性状か
ら、本菌株が不完全菌亜門、Stachybotrys 属の１菌種
であることが明らかであり、宇田川俊一、椿啓介
編『菌類図鑑』（1978年）、M. B. Ellis 著『DEMATIAC
EOUS HYPHOMYCETES』（1971年）および『MORE DEMATIA
CEOUS HYPHOMYCETES』（1976年）、Jong and Davis, M
YCOTAXON, 3, PP409-485（1976）に報告されている多く
の既知菌株と比較検討した。その結果、本菌株は Stach
ybotrys parvispora hughesに最も近い性状を示すこと
が明かとなり、本菌株を「Stachybotrys parvispora F
-4708」と命名した。

【００１６】ＮＧ−２４５の生産は、大略一般の発酵生
成物を生産する場合に準じ、各種の栄養物質を含む培地
で Stachybotrys parvispora F-4708 を好気的条件下で
培養することにより行う。

【００１７】培地は主として液体培地を用い、炭素源、
窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先
駆物質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは６前後に調
整する。炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまた
は混合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混
合して用いる。無機塩としては、例えば燐酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウ
ムなどを単独かまたは混合して用いる。消泡剤としては
アデカノール、シリコン化合物などを用いることができ
る。

【００１８】培養方法としては振盪培養、通気撹拌培養
などの好気的培養が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３
０℃で３〜５日間、望ましくはｐＨ５〜７、２５〜２７
℃で４日間培養する。この培養により生産されたＮＧ−
２４５を単離するには、発酵生産物を採取する一般的な
方法に準じて行えばよい。

【００１９】すなわち、培養終了後、遠心分離または濾
過により分離した菌体及び上澄液からＮＧ−２４５を低
級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出し、この
抽出液を減圧濃縮し有機溶媒を除去した後、酢酸エチ
ル、ベンゼン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に
転溶し、これを減圧濃縮してシロップ状とする。このシ
ロップを再度酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、ア
セトン、メタノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲ
ルを用いたカラムクロマトグラフィー、逆相分配用シリ
カゲルＯＤＳを充填した高速液体クロマトグラフィー及
びゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付すことにより
ＮＧ−２４５を精製、単離することができる。

【００２０】以上の精製によって得られた本発明の目的
物質であるＮＧ−２４５は、その分子量、紫外線吸収ス
ペクトル、 ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル、¹³Ｃ−ＮＭＲスペ
クトル等の解析結果より式（Ｉ）のように構造式が決定
された。

【００２１】ＮＧ−２４５の理化学的性質は以下の通り
である。（ａ）ＨＲＥＩマススペクトル：実測値５０５．２８１２理論値５０５．２８２８（Ｃ₃₁Ｈ₃₉ＮＯ₅として
計算）（ｂ）ＥＩマススペクトル：ＥＩｍ／ｚ５０５（Ｍ⁺）（ｃ）分子量：５０５（ｄ）分子式：Ｃ₃₁Ｈ₃₉ＮＯ₅ （ｅ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２２２ｎｍ（ε＝２７８００）２６１ｎｍ（ε＝１０５００）２８５ｎｍ（ε＝４９００）２９６ｎｍ（ε＝４７００）（メタノール溶液中で測定）（ｆ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：ＤＭＳＯ−ｄ₆中、４０
０ＭＨｚで測定した結果を図１に示す。（ｇ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：ＤＭＳＯ−ｄ₆中、１
００ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。（ｈ）ＩＲ吸収スペクトル：臭化カリウム錠中で測定し
た結果を図３に示す。（ｉ）溶剤に対する溶解性：メタノ−ル、エタノ−ル、アセトンに可溶ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶水に不溶（ｊ）呈色反応；陽性：Ｈ₂ＳＯ₄、Ｉ₂、ＦｅＣｌ₃ 陰性：ニンヒドリン（ｋ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性（ｌ）物質の色：無色針状結晶

【００２２】

【発明の効果】ＮＧＦ様作用及びＮＧＦ作用増強効果を
有する本発明の化合物ＮＧ−２４５は、アルツハイマ
ー型老年痴呆などの抗痴呆薬及び脳卒中後遺症治療薬な
どに有用であり、用いる際の投与方法もタンパク質では
ないことから簡便である。

【００２３】

【実施例】以下、実施例及び試験例を示し、本発明を更
に詳細に説明する。

【００２４】実施例１００ｍｌ当りグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５
ｇ、酵母エキス０．２ｇ、リン酸一カリウム０．１ｇ、
硫酸マグネシウム０．０５ｇからなるｐＨ６の無菌液体
培地に Stachybotrys parvispora F-4708株を接種し、
２６℃、９６時間振盪培養した。次に５０Ｌ容培養ジャ
ー３基及び２００Ｌ容培養タンクを用いて、種培養と同
じ組成の無菌培地２１０Ｌに前記種培養液２．１Ｌを接
種し２６℃、９６時間撹拌通気培養した。培養終了後遠
心分離機で上澄液と菌体に分離した。得られた上澄液を
ＨＰ−２０（商品名、三菱化成社製）の１０Ｌカラムに
通過吸着させた。水５Ｌでカラムを洗浄後、アセトン３
０Ｌで溶出し、これを濃縮後その濃縮液を半量の酢酸エ
チルで４回抽出した。この抽出液を合わせ無水硫酸ナト
リウムで脱水後、減圧濃縮乾固し褐色シロップ１１４．
６ｇを得た。

【００２５】この褐色シロップ状物質をクロロホルムに
溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［ワコーゲ
ルＣ−２００（商品名、和光純薬社製）］の３．５Ｌカ
ラムに吸着させた。クロロホルムで洗浄後、クロロホル
ム−メタノール（９８：２、９６：４）の混合溶液で溶
出し、この区分を除去した。次にクロロホルム−メタノ
−ル（９２：８、９０：１０）の混合溶液で順次溶出を
行い、これら区分を減圧濃縮乾固し褐色物質３．８ｇを
得た。

【００２６】シリカゲルカラム精製で得られた褐色物質
を少量のヘキサンーアセトン（９０：１０）の混合溶媒
で調製したシリカゲル［ワコーゲルＣ−２００（商品
名、和光純薬社製）］のカラム２４０ｍｌに吸着させ
た。ヘキサンーアセトン（９０：１０、８０：２０、７
０：３０）の混合溶媒で順次溶出しこの区分を除去し
た。次にヘキサンーアセトン（５０：５０）の混合溶媒
で溶出を行い、この区分を減圧濃縮乾固し褐色物質５７
０ｍｇを得た。

【００２７】この褐色物質を少量のメタノールに溶解
し、この溶液を５０％アセトニトリルを移動相とした分
取高速液体クロマトグラフィ−［使用装置：センシュ−
科学社製３１１０；カラム：センシュ−パックＯＤＳ−
４２５１−Ｎ（１０φ×２５０ｍｍ）］を用い、ＵＶ吸
収２１５ｎｍでモニタ−しながら流速４．５ｍｌ／ｍｉ
ｎで２２．２〜２５．２ｍｉｎに溶出されるピ−クを分
取した。この区分を減圧濃縮乾固しＮＧ−２４５の粗精
製粉末６２．３ｍｇを得た。

【００２８】ＮＧ−２４５の粗精製粉末を少量のメタノ
ールにより再結晶し、ＮＧ−２４５の無色針状結晶２０
ｍｇを得た。

【００２９】試験例［ＮＧＦ作用増強効果試験］ＮＧＦ作用増強効果は、ＰＣ−１２細胞の突起伸張で評
価した。

【００３０】ＰＣ−１２細胞は、ＮＧＦに反応して神経
突起の伸張、神経伝達物質の生合成に関する酵素活性の
上昇などを示し、神経様細胞へと分化する。この性質を
利用し、本培養細胞へＮＧＦ存在下で本発明化合物を作
用させ、本発明化合物のＮＧＦ作用増強効果を調べた。
（検体）実施例で得られたＮＧ−２４５の無色針状結晶をメタノ
−ルに溶解し、１ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌとした。（試験細胞）ＰＣ−１２細胞ラット褐色細胞腫（ＮＧＦ応答細胞）

【００３１】（試験方法）ＰＣ−１２細胞を１０％牛胎
児血清、５％馬血清、５０ユニット／ｍｌペニシリン、
５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッ
コ改変イーグル培地（Gibco社製，高グルコース含有）
にて、２×１０⁴細胞／ｍｌに調製し、コラーゲンコー
ト２４孔プレート（培養孔あたりの面積２cm²,Corning
社製）へ、０．５ｍｌ／孔ずつまき、３７℃、５％ＣＯ
₂で培養した。２４時間後、培地を除き、新たにＮＧＦ
（Sigma社製、２．５ｓ）と各種濃度の検体を含む上記
培地０．３ｍｌ／孔を加えた。ここで、ＮＧＦは最終濃
度が０．５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。また、本
発明化合物はメタノールに溶解し、最終濃度が下記表２
に示す各種濃度となるように添加した。なお、比較とし
て、ＮＧＦ，本発明化合物共に加えない培地、本発明化
合物のみ加えない対照培地も調製した。

【００３２】このような各種培地下で４８時間培養した
後、ＰＣ−１２細胞の神経突起の伸張を、顕微鏡下に観
察した。

【００３３】観察結果を細胞の突起長で４段階に分類
し、形態変化のない細胞を０点、突起の伸張を伴わず形
態変化を起こした細胞を１点、細胞体の直径以内の突起
を持つ細胞を２点、細胞体の直径以上の突起を持つ細胞
を３点とし、１００細胞の合計点を突起伸張活性とし
た。（結果）結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＭＳＯ−ｄ₆中、４００ＭＨｚで測定したＮ
Ｇ−２４５の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図２】ＤＭＳＯ−ｄ₆中、１００ＭＨｚで測定したＮ
Ｇ−２４５の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図３】臭化カリウム錠中で測定したＮＧ−２４５の赤
外線吸収スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｄ 309:00） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者酒井則義東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内 (72)発明者花田和紀東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式で表される化合物。