JPH07233168A

JPH07233168A - 生理活性物質ｎｇ−３１１

Info

Publication number: JPH07233168A
Application number: JP6025311A
Authority: JP
Inventors: Fumio Mizobe; 文夫溝部; Yuriko Nozawa; 由利子野沢; Noriyoshi Sakai; 則義酒井; Kyoko Yamamoto; 京子山本; Takako Sugawara; 孝子菅原; Shigeo Morimoto; 繁夫森本
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-02-23
Filing date: 1994-02-23
Publication date: 1995-09-05

Abstract

(57)【要約】【目的】ＮＧＦ様作用を有する新規な生理活性物質を
提供する。【構成】式

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は神経成長因子（以下、Ｎ
ＧＦと称する。）様作用を有する新規な生理活性物質に
関する。

【０００２】

【従来の技術】近年増えつつあるアルツハイマー型痴呆
においては、大脳基底核神経細胞であるアセチルコリン
作動性神経の変性、脱落が、記憶障害、知的活動低下に
深く係わっていることが示唆されている。また、神経栄
養因子と呼ばれている生体成分が数多く見つかってお
り、神経細胞の生存・機能維持作用あるいは変性修復活
性を示すことが明らかになっている。その神経栄養因子
のひとつであるＮＧＦは、繊維切断による中枢性アセチ
ルコリン作動性神経の変性・脱落を抑制すること、及
び、老齢ラットの迷路学習障害を改善すると共にアセチ
ルコリン作動性神経細胞の萎縮を抑制することが報告さ
れている。さらに、ＮＧＦは、脳虚血スナネズミの海馬
神経細胞死を防ぐ作用および末梢神経損傷の回復を早め
る作用を持つことも確かめられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】神経栄養因子と呼ばれ
る生体成分は、ＮＧＦを含めその何れもがタンパク質で
ある。そのため、神経栄養因子を中枢性神経障害治療薬
として用いる場合、直接脳室内投与が必要となり、実用
上問題が多い。従って、より簡単な投与方法が可能な、
神経栄養因子作用、特にＮＧＦ様作用を持つ低分子化合
物が望まれている。本発明の目的は、ＮＧＦ様作用を有
する新規な生理活性物質を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、式

【０００５】

【０００６】で表されるＮＧ−３１１化合物である。

【０００７】本発明の生理活性物質ＮＧ−３１１を生産
する菌株は、本発明者らが新たに分離した菌株であり、
微生物の名称「糸状菌 TF-0407」および微生物受託番号
「ＦＥＲＭＰ−１４１３４」として，工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている。

【０００８】この菌株の菌学的性状を以下に示す。１）形態本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地で良好に生育
し、胞子の形成はバレイショ・ブドウ糖、オートミー
ル、麦芽エキス、ＹｐＳｓ、ツァペック、三浦寒天培地
等で良好である。本菌株が三浦寒天培地上、２６℃、２
０日間の培養で形成したコロニーを光学顕微鏡で観察す
ると、分生子形成細胞（フィアライド）を伴う栄養菌糸
が培地表面及び培地中の各所に認められ、コロニー表面
（特に中心付近）ではこれら栄養菌糸がさらに緩く集合
し球塊状を呈する部分が多数認められる。栄養菌糸は複
雑に湾曲、分岐し、幅は１．３〜２．０μｍ、先端及び
側面からフィアライドが生じる。分生子は通常フィアラ
イドの先端で直径３．５〜８．０μｍの粘塊となり Acr
emonium属様を呈するが、栄養菌糸が集合した箇所では
さらに集合体の内外で形成された分生子が相互に粘着
し、直径３０〜２５０μｍの球塊状となる。フィアライ
ドは無色、表面は平滑、アンプル形から円筒形で先細
り、多くは湾曲している。長さはアンプル形の場合４．
０〜８．０μｍ、円筒形の場合１．０〜３０．０μｍ、
幅は１．０〜１．８μｍ、多くは先端部が非常に細く針
状である。分生子は無色、１細胞、表面はわずかに粗面
を呈し、亜球形から楕円形で長さは１．２〜２．８μ
ｍ、幅は１．２〜２．０μｍ。また、走査電子顕微鏡に
よる観察では分生子表面がいぼ状を呈していた。なお、
培養を３週間に延長したがテレオモルフの形態は認めら
れなかった。

【０００９】２）培地上での生育状態各種培地上で、２６℃、１４日間培養した場合の肉眼的
観察結果を次の表１に示した。なお色の表示は日本規格
協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引用し
た。

【００１０】

【表１】

【００１１】３）生理的性質生育温度範囲及び最適温度本菌株はｐＨ６．０のサブロー液体培地において、１１
〜３５℃の範囲で生育し、最適温度は２６〜３０℃であ
る。生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ本菌株はＹｐＳｓ液体培地中２６℃においてｐＨ２〜１
０の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜７である。４）好気性，嫌気性の区別；好気性

【００１２】上記の形態的特徴および培養上の性状か
ら、本菌株が不完全菌亜門中の１属であることが明かと
なり、宇田川俊一、椿啓介編『菌類図鑑』（1978
年）、J . W. Carmichael, W. Bryce Kendrick, I. L.
Conners, Lynne Sigler 共著『Genera of Hyphomycete
s』（1980年）に報告されている多くの既知菌種と比較
検討したが該当する属は見つからなかった。尚、分生子
形成に関する形態を部分的に捕らえた場合、本菌は糸状
不完全菌綱の Acremonium 属に非常に類似した性質を示
しており、また球状の集合体を不完全な分生子果と考え
た場合、分生子果不完全菌綱の一菌種である可能性も示
唆される。そこでさらに、W. Gams 著『Cephalosporiu
m-artige Schimmelpilze 』 (1971年)、及び B. C. Sut
ton 著『The Coelomycetes』（1980年）に報告されて
いる多くの既知菌種と比較検討したが、いずれにおいて
も該当する属は認められなかった。以上の理由から、本
菌株を「糸状菌 TF-0407」と命名した。

【００１３】ＮＧ−３１１の生産は、大略一般の発酵生
成物を生産する場合に準じ、各種の栄養物質を含む培地
で糸状菌 TF-0407を好気的条件下で培養することによ
り行う。培地は主として液体培地を用い、炭素源、窒素
源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先駆物
質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは６前後に調整す
る。炭素源としては、例えばグルコース、マルトース、
デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまたは混
合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカ
ー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混合して
用いる。無機塩としては、例えば燐酸一カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを
単独かまたは混合して用いる。消泡剤としてはアデカノ
ール、シリコン化合物などを用いることができる。培養
方法としては振盪培養、通気撹拌培養などの好気的培養
が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３０℃で３〜５日
間、望ましくはｐＨ５〜７、２５〜２７℃で４日間培養
する。

【００１４】この培養により生産されたＮＧ−３１１を
単離するには、発酵生産物を採取する一般的な方法に準
じて行えばよい。すなわち、培養終了後、遠心分離また
は濾過により分離した菌体からＮＧ−３１１を低級アル
コール、アセトンなどの有機溶媒で抽出し、この抽出液
を減圧濃縮し有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、ベン
ゼン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、
これを減圧濃縮してシロップ状とする。このシロップを
再度酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、
メタノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルを用い
たカラムクロマトグラフィー、逆相分配用シリカゲルＯ
ＤＳを充填した高速液体クロマトグラフィー及びゲル濾
過カラムクロマトグラフィーに付すことによりＮＧ−３
１１を精製、単離することができる。

【００１５】以上の精製によって得られた本発明の目的
物質であるＮＧ−３１１は、その分子量、紫外線吸収ス
ペクトル、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル、¹³Ｃ−ＮＭＲスペ
クトル等の解析結果より式（Ｉ）のように構造式が決定
された。ＮＧ−３１１の理化学的性質は以下の通りであ
る。（ａ）ＥＩマススペクトル：ＥＩｍ／ｚ２４７（Ｍ）⁺ （ｂ）ＨＲ−ＥＩマススペクトルＦｏｕｎｄｍ／ｚ２４７．１５７０Ｃａｌｃｄｍ／ｚ２４７．１５７２（Ｃ₁₅Ｈ₂₁ＮＯ
₂として計算）（ｃ）分子量：２４７（ｄ）分子式：Ｃ₁₅Ｈ₂₁ＮＯ₂ （ｅ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２１５ｎｍ（ε＝２１７００）２８６ｎｍ（ε＝４７００）（メタノール溶液中で測定）（ｆ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：ＤＭＳＯ−ｄ₆中、４０
０ＭＨｚで測定した結果を図１に示す。（ｇ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：ＤＭＳＯ−ｄ₆中、１
００ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。（ｈ）ＩＲ吸収スペクトル：臭化カリウム錠中で測定し
た結果を図３に示す。（ｉ）溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノール、
アセトンに可溶ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶水に不溶（ｊ）呈色反応；陽性：Ｉ₂ 陰性：ニンヒドリン、Ｈ₂ＳＯ₄、アンスロン（ｋ）塩基性、酸性、中性の区別：中性（ｌ）物質の色：白色粉末

【００１６】

【発明の効果】本発明の化合物ＮＧ−３１１は、外傷
性、アルコールや抗癌剤などの薬剤性、炎症性、糖尿病
などに見られる代謝性、さらには特発性の末梢性神経変
性に伴う症状・疾患の改善・治療薬として、また、中枢
性神経変性に伴う症状・疾患、例えば、アルツハイマー
型及び脳血管性痴呆、ダウン症候群、パーキンソン病、
ハンチントン舞踏病、脳虚血・脳梗塞・脳出血・頭部外
傷などの後遺症、健忘症、脊髄性神経麻ひ症などの改善
・治療薬として有用である。

【００１７】

【実施例】以下、実施例及び試験例を示し、本発明を更
に詳細に説明する。実施例１００ｍｌ当りグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５
ｇ、酵母エキス０．２ｇ、リン酸一カリウム０．１ｇ、
硫酸マグネシウム０．０５ｇからなるｐＨ６の無菌液体
培地に糸状菌 TF-0407株を接種し、２６℃、９６時間振
盪培養した。次に５０Ｌ容培養タンク１基を用いて、種
培養と同じ組成の無菌培地３０Ｌに前記種培養液３００
ｍｌを接種し２６℃、７２時間撹拌通気培養した。培養
終了後吸引濾過により菌体と上澄液に分けた。得られた
菌体を１０Ｌのアセトンで２回抽出した。また得られた
上澄液を１．５ＬのＨＰ−２０（商品名、三菱化成社
製）に吸着させた後、３Ｌのメタノールで２回溶出し
た。これらを合わせ、減圧下溶媒溜去後の水層を１．５
Ｌの酢酸エチルで３回抽出した。この抽出液を合わせ無
水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し褐色のシロ
ップ状物質１３．０ｇを得た。

【００１８】この褐色シロップをクロロホルムに溶解
し、クロロホルムで調製したシリカゲル［ワコーゲルＣ
−２００（商品名、和光純薬社製）］の８００ｍｌカラ
ムに吸着させた。クロロホルムで洗浄後、クロロホルム
−メタノール（１００：０，９８：２）の混合溶媒で順
次溶出を行い、これらの区分を除去した。次にクロロホ
ルム−メタノール（９６：４）の混合溶媒で溶出し、得
られた画分を合わせ減圧濃縮乾固し褐色物質２．２３ｇ
を得た。シリカゲルカラム精製で得られた褐色物質を少
量のヘキサン−アセトン（８：２）の混合溶媒に溶解
し、同溶媒で調製したシリカゲル［ワコーゲルＣ−２０
０（商品名、和光純薬社製）］の２００ｍｌカラムに吸
着させた。ヘキサン−アセトン（６：４）の混合溶媒で
溶出し、得られた活性区分を集め減圧濃縮乾固して褐色
物質５５５．８ｍｇを得た。

【００１９】得られた褐色物質を少量のクロロホルム−
メタノール−ヘキサン（５：１：５）に溶解し、セファ
デックスＬＨ−２０を用いクロロホルム−メタノール−
ヘキサン（５：１：５）の混合溶媒でゲル濾過し、得ら
れた活性画分を集め減圧濃縮乾固してＮＧ−３１１の粗
精製物質８６．０ｍｇを得た。

【００２０】この粗精製物質を少量のメタノールに溶解
し、５５％アセトニトリルを移動相とした分取高速液体
クロマトグラフィー［使用装置：センシュー科学社製３
１１０；カラム：センシューパックＯＤＳ−４２５１−
Ｎ（１０φ×２５０ｍｍ）］を用いて精製した。ＵＶ
（２１５ｎｍ）でモニターしながら、流速４．５ｍｌ／
ｍｉｎの条件下で１２．０〜１４．４ｍｉｎに流出され
るピークを分取し、減圧濃縮乾固してＮＧ−３１１の白
色粉末１０．４ｍｇを得た。

【００２１】試験例１［ＮＧＦ様作用試験］ＮＧＦ様作用は、ＰＣ−１２細胞の突起伸張で評価し
た。

【００２２】ＰＣ−１２細胞は、ＮＧＦに反応して神経
突起の伸張、神経伝達物質の生合成に関する酵素活性の
上昇などを示し、神経様細胞へと分化する。この性質を
利用し、本培養細胞へ本発明化合物を作用させ、本発明
化合物のＮＧＦ様作用を調べた。（検体）実施例で得られたＮＧ−３１１をメタノールに
溶解し、０．３ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌとした。（試験細胞）ＰＣ−１２細胞ラット褐色細胞腫（ＮＧ
Ｆ応答細胞）（試験方法）試験方法は、「ＮＧ−００１ and ＮＧ−
０１２，Novel Potentiators of Nerve Growth Factor
」（M.ITOら，J.Antibiotics，第45巻，第1559〜1565
ページ，1992年）の記載に従って行った。ＰＣ−１２細
胞を１０％牛胎児血清、５％馬血清、５０ユニット／ｍ
ｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含
有するダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製，高グ
ルコース含有）にて、２×１０⁴細胞／ｍｌに調製し、
コラーゲンコート２４孔プレート（培養孔あたりの面積
２cm²,コーニング社製）へ、０．５ｍｌ／孔ずつまき、
３７℃、５％ＣＯ₂で培養した。２４時間後、培地を除
き、新たに各種濃度の検体を含む上記培地０．３ｍｌ／
孔を加えた。ここで、本発明化合物はメタノールに溶解
し、最終濃度が下記表２に示す各種濃度となるように添
加した。なお、比較として、本発明化合物を加えない対
照培地も調製した。

【００２３】このような各種培地下で４８時間培養した
後、ＰＣ−１２細胞の神経突起の伸張を、顕微鏡下に観
察した。観察結果を細胞の突起長で４段階に分類し、形
態変化のない細胞を０点、突起の伸張を伴わず形態変化
を起こした細胞を１点、細胞体の直径以内の突起を持つ
細胞を２点、細胞体の直径以上の突起を持つ細胞を３点
とし、１００細胞の合計点を突起伸張活性とした。（結果）結果を表２に示す。

【００２４】

【表２】

【００２５】試験例２［神経栄養因子作用試験］神経栄養因子作用は、以下の方法を用いて評価した。（検体）実施例で得られたＮＧ−３１１をメタノールに
溶解し、０．１５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌとした。（試験細胞）胎生１８日ラット大脳皮質由来神経細胞（試験方法）試験細胞を、２０％牛胎児血清を含有する
ダルベッコの最少必須培地（ギブコ社製）及びハムＦ−
１２培地（ギブコ社製）を等量混合したＤＦ培地にて、
１．６×１０⁶細胞／ｍｌに調製し、ポリエチレンイミ
ンを塗布した２４孔プレ−ト（培養孔あたりの面積２cm
²、コーニング社製）へ、０．５ｍｌ／孔ずつまき、３
７℃、５％ＣＯ₂で培養した。２４時間後、培地を除
き、新たに各種濃度の検体、５μｇ／ｍｌトランスフェ
リン、５μｇ／ｍｌインスリン、２０ｐｍｏｌｅ／ｍｌ
プロゲステロンを含有する無血清の上記ＤＦ培地０．５
ｍｌ／孔を加えた。ここで、本発明化合物はメタノール
に溶解し、最終濃度が下記表３に示す各種濃度となるよ
うに添加した。なお、比較として、メタノールのみを加
えた培地も調製した。この段階で、同じプレートを２枚
用意した。各種培地にて７２時間培養後、１枚のプレー
トに対しＮ₂−Ｏ₂−ＣＯ₂インキュベーター（タバイ社
製、ＢＮＰ−１００型）により、酸素濃度を最低設定濃
度の１％に下げ４時間培養する低酸素負荷を施した。も
う一枚のプレートは負荷をかけずに、５％ＣＯ₂、９５
％Ａｉｒのまま培養を続けた。さらに４８時間培養し、
生細胞数を定量した。培地を除き、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｉ
ｅｎＤｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤＡ）試薬を作用させ
た。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、蛍光強度
（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５３０）を測定した（ミリポア社
製、ＣｙｔｏＦｌｏｕｒ２３００）。本発明化合物の神
経栄養因子活性は、対照（メタノール添加）の蛍光強度
を１．０としたときの比で表した。（結果）結果を表３に示す。

【００２６】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＭＳＯ−ｄ₆中、４００ＭＨｚで測定したＮ
Ｇ−３１１の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図２】ＤＭＳＯ−ｄ₆中、１００ＭＨｚで測定したＮ
Ｇ−３１１の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図３】臭化カリウム錠中で測定したＮＧ−３１１の赤
外線吸収スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山本京子東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内 (72)発明者菅原孝子東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内 (72)発明者森本繁夫東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式で表されるＮＧ−３１１化合物。