JPH0748397A

JPH0748397A - ステロイド化合物

Info

Publication number: JPH0748397A
Application number: JP5194969A
Authority: JP
Inventors: Yuriko Orii; 由利子折居; Fumio Mizobe; 文夫溝部; Noriyoshi Sakai; 則義酒井; Kazunori Hanada; 和紀花田
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-08-05
Filing date: 1993-08-05
Publication date: 1995-02-21

Abstract

(57)【要約】【目的】ＮＧＦ様作用を有する新規な生理活性物質を
提供することにある。【構成】式

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は神経成長因子（以下、Ｎ
ＧＦと称する。）様作用を有する新規な生理活性物質に
関する。

【０００２】

【従来の技術】近年増えつつあるアルツハイマー型痴呆
においては、大脳基底核神経細胞であるアセチルコリン
作動性神経の変性、脱落が、記憶障害、知的活動低下に
深く係わっていることが示唆されている。また、神経栄
養因子と呼ばれている生体成分が数多く見つかってお
り、神経細胞の生存・機能維持作用あるいは変性修復活
性を示すことが明らかになっている。その神経栄養因子
のひとつであるＮＧＦは、繊維切断による中枢性アセチ
ルコリン作動性神経の変性・脱落を抑制すること、及
び、老齢ラットの迷路学習障害を改善すると共にアセチ
ルコリン作動性神経細胞の萎縮を抑制することが報告さ
れている。更に、ＮＧＦは、脳虚血スナネズミの海馬神
経細胞死を防ぐ作用及び末梢神経損傷の回復を早める作
用も確かめられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】神経栄養因子と呼ばれ
る生体成分は、ＮＧＦを含め何れもがタンパク質であ
る。そのため、神経栄養因子を中枢性神経障害治療薬と
して用いる場合、直接脳室内投与が必要となり、実用上
問題が多い。従って、より簡単な投与方法が可能な神経
栄養因子作用、特にＮＧＦ様作用を持つ低分子化合物が
望まれている。本発明の目的は、ＮＧＦ様作用を有する
新規な生理活性物質を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
の達成のために多数の菌株を土壌または植物より分離
し、その菌株の代謝産物について種々検討した結果、あ
る種の菌株が、ＮＧＦ様作用を有する新規な生理活性物
質を生産することを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、式

【０００５】

【０００６】で表される化合物（以下、ＮＧ−１８７と
称する。）である。

【０００７】本発明の新規生理活性物質ＮＧ−１８７を
生産する菌株は本発明者らが新たに分離した菌株であ
り、微生物の名称「Acremonium sp. TF-0356」および
「ＦＥＲＭＰ−１３６９７」として、工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている。この菌株の菌学
的性状を以下に示す。１）形態本菌株は、オートミール、ＹｐＳｓ寒天培地等で良好に
生育し、胞子の形成はこれら２種の寒天培地に加えバレ
イショ・ブドウ糖、ＬＣＡ（三浦）寒天培地等で良好ま
たは中程度である。本菌株がＬＣＡ（三浦）寒天培地
上、２６℃、２０日間の培養で形成したコロニーを光学
顕微鏡で観察すると、菌糸は隔壁を有し高度に分岐して
おり、気生菌糸の側面より分生子形成細胞が直接に単生
し、その先端にフィアロ型分生子を形成する。分生子は
透明、１細胞、表面は平滑、長楕円形で、長さは通常
４．５〜６．０μだが稀に１４μｍに至るものもあり、
幅は１．５〜２．０μｍである。分生子形成細胞（フィ
アライド）は透明、隔壁はなく、表面は平滑、先細りの
円筒形で、長さは３５〜６０μｍであり、幅は基部で
２．５〜３．５μｍ、先端部で１．０〜１．５μｍであ
る。分生子はフィアライドの先端部で球状の粘塊とな
り、その直径は６〜１９μｍである。

【０００８】なお、培養を３週間に延長したが有性生殖
器官の形成は認められなかった。２）培地上での生育状態各種培地上で、２６℃、１４日間培養した場合の肉眼的
観察結果を次の表１に示した。なお色の表示は日本規格
協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引用し
た。

【表１】

【０００９】

【００１０】３）生理的性質生育温度範囲及び最適温度本菌株はｐＨ６．０のサブロー液体培地において、１３
〜３４℃の範囲で生育し、最適温度は２５〜３０℃であ
る。生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ本菌株はＹｐＳｓ液体培地中２６℃においてｐＨ４〜１
０の範囲で生育し、最適ｐＨは６〜８である。４）好気性，嫌気性の区別；好気性以上の形態的特徴および培養上の性状から、本菌株が不
完全菌亜門中の、１属菌であることが明かとなり、宇田
川俊一，椿啓介編『菌類図鑑』（1978年）、J. W. C
armichael, W. Bryce Kendrick, I. L. Conners, Lynne
Sigler 共著『Genera of Hyphomycetes』（1980年）、
W. Gams 著『Cephalosporium-artige Schimmelpilze』
（1971年）に報告されている多くの既知菌株と比較検討
した。その結果、本菌株はアクレモニウム属の一菌種で
あることが明かとなったが、種を決定するには至らなか
ったので本菌株を「Acremonium sp. TF-0356」と命名
した。ＮＧ−１８７の生産は、大略一般の発酵生成物を
生産する場合に準じ、各種の栄養物質を含む培地で Acr
emonium sp. TF-0356を好気的条件下で培養することに
より行う。

【００１１】培地は主として液体培地を用い、炭素源、
窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先
駆物質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは６前後に調
整する。炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまた
は混合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混
合して用いる。無機塩としては、例えば燐酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウ
ムなどを単独かまたは混合して用いる。消泡剤としては
アデカノール、シリコン化合物などを用いることができ
る。

【００１２】培養方法としては振盪培養、通気撹拌培養
などの好気的培養が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３
０℃で３〜５日間、望ましくはｐＨ５〜７、２５〜２７
℃で４日間培養する。この培養により生産されたＮＧ−
１８７を単離するには、発酵生産物を採取する一般的な
方法に準じて行えばよい。

【００１３】すなわち、培養終了後、遠心分離または濾
過により分離した菌体からＮＧ−１８７を低級アルコー
ル、アセトンなどの有機溶媒で抽出し、この抽出液を減
圧濃縮し有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、ベンゼ
ン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、こ
れを減圧濃縮してシロップ状とする。このシロップを再
度酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、メ
タノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルを用いた
カラムクロマトグラフィー、逆相分配用シリカゲルＯＤ
Ｓを充填した高速液体クロマトグラフィー及びゲル濾過
カラムクロマトグラフィーに付すことによりＮＧ−１８
７を単離精製することができる。

【００１４】以上の精製によって得られた本発明の目的
物質であるＮＧ−１８７は、その分子量、紫外線吸収ス
ペクトル、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル、¹³Ｃ−ＮＭＲスペ
クトル等の解析結果より構造式が決定された。ＮＧ−１
８７の理化学的性質は以下の通りである。（ａ）ＦＡＢマススペクトル：ＦＡＢｍ／ｚ５０３（Ｍ−Ｈ）^- （ｂ）分子量：５０４（ｃ）分子式：Ｃ₃₀Ｈ₄₈Ｏ₆ （ｄ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２０６ｎｍ（ε＝１７００）２７７ｎｍ（ε＝１００）（メタノール溶液中で測定）（ｅ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：ＤＭＳＯ−ｄ₆中、４０
０ＭＨｚで測定した結果を図１に示す。（ｆ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：ＤＭＳＯ−ｄ₆中、１
００ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。（ｇ）ＩＲ吸収スペクトル：臭化カリウム錠中で測定し
た結果を図３に示す。（ｈ）溶剤に対する溶解性：エタノール、アセトンに可溶メタノール、ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶水に不溶（ｉ）呈色反応；陽性：Ｈ₂ＳＯ₄、Ｉ₂ 陰性：ニンヒドリン（ｊ）塩基性、酸性、中性の区別：中性（ｋ）物質の色：無色針状結晶

【発明の効果】本発明の化合物ＮＧ−１８７は、外傷
性、アルコールや抗癌剤などの薬剤性、炎症性、糖尿病
などに見られる代謝性、さらには特発性の末梢性神経変
性に伴う症状・疾患の改善・治療薬として、また、中枢
性神経変性に伴う症状・疾患、例えば、アルツハイマー
型及び脳血管性痴呆、ダウン症候群、パーキンソン病、
ハンチントン舞踏病、脳虚血・脳梗塞・脳出血・頭部外
傷などの後遺症、健忘症、脊髄性神経麻ひ症などの改善
・治療薬としても有用である。

【００１５】

【実施例】以下、実施例及び試験例を示し、本発明を更
に詳細に説明する。

【００１６】実施例１００ｍｌ当りグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５
ｇ、酵母エキス０．２ｇ、リン酸一カリウム０．１ｇ、
硫酸マグネシウム０．０５ｇからなるｐＨ６の無菌液体
培地にAcremonium sp. TF-0356株を接種し、２６℃、９
６時間振盪培養した。次に２００Ｌ容培養タンク１基を
用いて、種培養と同じ組成の無菌培地１２０Ｌに前記種
培養液１．２Ｌを接種し２６℃、９６時間撹拌通気培養
した。培養終了後吸引濾過により菌体と上澄液に分け
た。得られた菌体を３６Ｌのアセトンで２回抽出した。
また得られた上澄液を６ＬのＨＰ−２０（商品名、三菱
化成社製）に吸着させた後、９Ｌのメタノールで２回溶
出した。これらを合わせ、減圧下溶媒溜去後の水層を１
０Ｌの酢酸エチルで４回抽出した。この抽出液を合わせ
無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し褐色のシ
ロップ状物質７６．０５ｇを得た。この褐色シロップを
クロロホルムに溶解し、クロロホルムで調製したシリカ
ゲル［ワコーゲルＣ−２００（商品名、和光純薬社
製）］の１．４Ｌカラムに吸着させた。クロロホルムで
洗浄後、クロロホルム−メタノール（９９：１〜９６：
４）の混合溶媒で順次溶出を行い、得られた画分を合わ
せ減圧濃縮乾固し褐色物質２５ｇを得た。シリカゲルカ
ラム精製で得られた褐色物質を少量のヘキサン−アセト
ン（６：４）の混合溶媒に溶解し、逆相シリカゲル［Ｏ
ＤＳ−Ａ６０（商品名、ワイエムシィ社製）］の高圧ガ
ラスカラム（５０φ×５０ｃｍ）に吸着させた。ヘキサ
ン−アセトン（６：４）の混合溶媒で溶出し、得られた
活性区分を集め減圧濃縮乾固して褐色物質を得た。逆相
シリカゲルカラム精製で得られた褐色物質を少量のクロ
ロホルム−メタノール（１：１）の混合溶媒に溶解し、
セファデックスＬＨ−２０を用いクロロホルム−メタノ
ール（１：１）の混合溶媒でゲル濾過し、得られた活性
区分を集め減圧濃縮乾固して褐色物質３６０ｍｇを得
た。得られた褐色物質を少量のクロロホルム−メタノー
ル−ヘキサン（５：１：５）に溶解し、セファデックス
ＬＨ−２０を用いクロロホルム−メタノール−ヘキサン
（５：１：５）の混合溶媒でゲル濾過し、得られた活性
画分を集め減圧濃縮乾固してＮＧ−１８７の粗精製物質
を得た。この粗精製物質をメタノールにより再結晶し、
ＮＧ−１８７の無色針状結晶６４．２ｍｇを得た。

【００１７】試験例［ＮＧＦ様作用試験］ＮＧＦ様作用は、ＰＣ−１２細胞の突起伸張で評価し
た。ＰＣ−１２細胞は、ＮＧＦに反応して神経突起の伸
張、神経伝達物質の生合成に関する酵素活性の上昇など
を示し、神経様細胞へと分化する。この性質を利用し、
本培養細胞へ本発明化合物を作用させ、本発明化合物の
ＮＧＦ様作用を調べた。（検体）実施例で得られたＮＧ−１８７をメタノールに
溶解し、０．３ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌとした。（試験細胞）ＰＣ−１２細胞ラット褐色細胞腫（ＮＧ
Ｆ応答細胞）（試験方法）ＰＣ−１２細胞を１０％牛胎児血清、５％
馬血清、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍ
ｌストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグ
ル培地（ギブコ社製，高グルコース含有）にて、２×１
０⁴細胞／ｍｌに調製し、コラーゲンコート２４孔プレ
ート（培養孔あたりの面積２cm²,コーニング社製）へ、
０．５ｍｌ／孔ずつまき、３７℃、５％ＣＯ₂で培養し
た。２４時間後、培地を除き、新たに各種濃度の検体を
含む上記培地０．３ｍｌ／孔を加えた。ここで、本発明
化合物はメタノールに溶解し、最終濃度が下記表２に示
す各種濃度となるように添加した。なお、比較として、
本発明化合物を加えない対照培地も調製した。

【００１８】このような各種培地下で４８時間培養した
後、ＰＣ−１２細胞の神経突起の伸張を、顕微鏡下に観
察した。

【００１９】観察結果を細胞の突起長で４段階に分類
し、形態変化のない細胞を０点、突起の伸張を伴わず形
態変化を起こした細胞を１点、細胞体の直径以内の突起
を持つ細胞を２点、細胞体の直径以上の突起を持つ細胞
を３点とし、１００細胞の合計点を突起伸張活性とし
た。（結果）結果を表２に示す。

【表２】

【００２０】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＭＳＯ−ｄ₆中、４００ＭＨｚで測定したＮ
Ｇ−１８７の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図２】ＤＭＳＯ−ｄ₆中、１００ＭＨｚで測定したＮ
Ｇ−１８７の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図３】臭化カリウム錠中で測定したＮＧ−１８７の赤
外線吸収スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者花田和紀東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式で表される化合物