JPH0516837B2

JPH0516837B2 -

Info

Publication number: JPH0516837B2
Application number: JP1658984A
Authority: JP
Inventors: Fujio Yamasato; Seiji Morii; Kazuhiko Samejima; Masami Ishihara
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1984-01-31
Filing date: 1984-01-31
Publication date: 1993-03-05
Also published as: JPS60160896A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、基質としてＬ−γ−グルタミル−ｐ
−ニトロアニリドを用いる、γ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼ活性の測定方法に関する。 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下、
γ−GTPと略称する。）の酵素活性の測定は、臨
床的には肝胆道疾患の診断、アルコール飲用者の
スクリーニングなどに広く利用され、種々の方法
が発表されているが、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−
ニトロアニリドを基質とする反応速度測定法が最
も一般的であり、現在も盛んに行なわれている。しかしながら、基質のＬ−γ−グルタミル−ｐ
−ニトロアニリド（以下、本基質という。）は、
基質安定化及び酵素反応の至適PHである中性付近
（PH＝約8.3）に於て極めて溶解性が悪く、そのた
め溶解度が比較的高い低PH域で予め基質を充分に
溶解しておき、使用時、中性付近（PH＝約8.5）
の緩衝液と混合して使用する酸溶解法が一般的な
使用方法である。このため、本基質は、溶解した強酸により加水
分解をうけて、ブランク値が徐々に上昇し、その
製剤の有効期間は調液後約５時間程度である。そこで、本基質の溶解性の改善が種々試みられ
ており、次の(1)〜(3)の方法が夫々提案され、実用
化されている。 (1) カチオン系界面活性剤又はアニオン系界面活
性剤を添加して基質の水に対する溶解性を改善
し、これらイオン系界面活性剤の酵素反応阻害
作用をノニオン系界面活性剤で緩和する方法。 (2) 本基質の−NO₂基のｏ−位に−CO₂H基、−
SO₃H基などの水溶性基を付与し、基質の水に
対する溶解性を改善する方法。 (3) シクロデキストリンの包接力を利用して基質
の水に対する溶解性を改善する方法。しかしながら、これら従来の方法にも種々の欠
点が存在する。例えば、(1)の界面活性剤を用いる方法では、イ
オン系界面活性剤の酵素阻害力が非常に強く、ノ
ニオン系界面活性剤を添加しても、その回復率は
約70〜80％である上、界面活性剤の添加によりヘ
モグロビンの吸収が経時的に変化し、ｐ−ニトロ
アニリンの生成速度を追跡する410nｍでのヘモ
グロビンの吸収が経時的に減少するため、結果的
に、γ−GTPの酵素活性測定値に負誤差を与え、
(2)の水溶性基を付与する方法では、γ−GTPの
酵素活性測定値が高く測定されること及び基質剤
調液後数日で基質が変質し、γ−GTPの酵素活
性測定値の低下が観測され、場合によつては変質
による沈殿が析出する等の問題を生じ、又、(3)の
シクロデキストリンの包接力を利用する方法で
は、ヘモグロビンの影響やγ−GTPの酵素活性
測定値の変動の問題はないが、肝心の水に対する
溶解性の改善が充分ではなく、特に、シクロデキ
ストリンの基質包接化合物を凍結乾燥する場合
は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程度の
濃縮液の製剤の調製が限界であり、これら(1)〜(3)
のいずれの方法も、到底、充分に改善された満足
すべき測定方法であるとはいえない現状にある。かかる状況に於て、本発明者らは、本基質Ｌ−
γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドの水溶性を
充分満足すべき程度に改善する方法として、水溶
性基で修飾されたシクロデキストリンの使用に着
目した。シクロデキストリン（以下、CDと略称する。）
は、Ｄ−グルコピラノースがα−１，４−グルコ
シド結合により環状に結合した環状オリゴ糖同族
体であり、結合したＤ−グルコピラノースが、
６、７及び８個の、α−CD、β−CD及びγ−
CD、の三種のものがよく知られている。これら、一連のCDは、水溶液中で有機化合物
と混合すると速やかに包接体を形成し、製剤の安
定化、溶解性の調節、液状薬品の粉末化、刺激性
や悪臭などのマスク、或いは揮発性の調節等に優
れた効果を有する為に、これらの用途に広く利用
され、その構造は、CD空洞の一端の開口部にグ
ルコピラノースの２−及び３−位の−OHを有
し、他端の開口部に６−位の−OHを有する、疎
水性CD空洞を有する環状構造であることが、そ
のＸ線解析の結果などから推定されている。このCDは、でん粉或いはでん粉の加水分解物
にBMA（Bacillus macerans amylase）を作用
させると、α、β−、γ−の混合物として得られ
るが、近年は、β−CDのみを高収率で与えるCD
生成酵素がBacillus megateriumやBacillus属の
好アルカリ性菌のある種のものから見出され、β
−CDが安価に製造されるようになつた為、研究
対象としては溶解性が高いα−CDを扱つたもの
が多いが、実用的には、製造、分離精製の容易な
β−CDが一般に用いられるようになつている。 β−CDの水に対する溶解度は、α−CD、γ−
CDの溶解度に比べて著しく低く、例えば、α−
CDが0.5℃に於て6.8％、γ−CDは同温度に於て
9.1％溶解するのに対し、β−CDは僅かに0.8％溶
解するにすぎず、又、70℃に於てもα−CDが
87.6％、γ−CDは実に163.7％溶解するのに対し、
β−CDは僅かに15.3％溶解するのにすぎない。このようなβ−CDの水に対する溶解度をモル
濃度に換算すると、0.5℃に於て７ｍＭ、70℃に
於て135ｍＭとなり、ホスト分子β−CDによつて
包接された水難溶性ゲスト分子の水溶解性は、当
然、このβ−CDの溶解度以下に限られる。一方、本基質Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロ
アニリドはCDによつて包接され、本基質単独で
は、水又は緩衝液に対して、精々４ｍＭまでの溶
解性しか示さなかつたのに対し、CD0.3％（Ｗ／
Ｖ）の添加で16ｍＭ（４倍以上）という本基質単
独の場合と比べれば、比較的高い溶解度を得るこ
とができることが知られている。（特開昭57−
74099号公報。）しかしながら、この程度の溶解度では水溶性の
改善は充分ではなく、特に、CD本基質包接化合
物を凍結乾燥する場合は、最終使用液濃度の製剤
乃至はその二倍程度の濃縮液の製剤の調製が限界
であり、到底、満足すべきものではないことは、
既に述べたとおりである。そこで、CDに−SO₃H基、−CO₂H基のような
水溶性基を導入し、CDの水溶解性を改善するこ
とが考えられる。しかしながら、本基質Ｌ−γ−グルタミル−ｐ
−ニトロアニリドがCDによつて包接されたから
といつて、CDに−SO₃H基や−CO₂H基のような
水溶性基を導入した修飾CDが、本基質を必ずし
も効果的に包接することはいえない。即ち、包接体形成機構に関しては、従来から
種々の分子間力の関与が提唱され、CD包接体形
成には分散力、双極子間力、水素結合、疎水結
合、電荷移動力等種々の分子間力の一部またはす
べてが関与している可能性があり、それ故分子の
化学構造が相違すれば、当然、その包接体形成機
構も相違し、又、たとえ包接体が形成されたとし
ても、ゲスト分子である本基質Ｌ−γ−グルタミ
ル−ｐ−ニトロアニリド全体が、或いはγ−
GTPとの酵素反応活性部位が、ホスト分子であ
るCD空洞内に包接され、酵素反応が抑制されて
しまうおそれが存在する。（有機合成化学第35
巻第２号119（37）頁及び123（41）頁（1977）。）このような状況に於て、β−CD（−OH）_21-n
（−OX）ｍ〔但し、CDはシクロデキストリン残
基を、ＸはNO₂、PO₃H、SO₃H、又は式−
（CH₂）_oＹ（Ｙは−SO₃H基又は−CO₂H基を示し、
ｎ＝１〜４の整数を示す。）で表わされる基を示
し、ｍ＝１〜５を示す。〕なる特定の修飾CDが、
本基質Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド
を効果的に包接し、且つ包接された本基質に対す
るγ−GTPの酵素活性は何ら抑制されることな
く、従つてこのような特定の修飾CDの存在下に、
本基質Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド
を基質として用いると、本基質の水溶性が飛躍的
に改善されるばかりでなく、γ−GTPの酵素活
性を容易に定量的に測定することができることが
判明した。本発明は、上記特定の修飾CDを本基質Ｌ−γ
−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド共にγ−
GTPの酵素反応系に存在させる点に特徴を有す
る発明であり、γ−GTPの酵素活性の測定操作
自体は、グリシルグリシンなどのグルタミン酸の
受容体の存在下に汎用の緩衝液（トリスー塩酸緩
衝液など。）中で反応させる一般法に従うことで
足りる。本発明に用いる特定の修飾CD、β−CD（−
OH）_21-n（−OX）ｍ〔但し、CDはシクロデキス
トリン残基を、ＸはNO₂、PO₃H、SO₃H、又は
式−（CH₂）_oＹ（Ｙは−SO₃H基又は−CO₂H基を
示し、６＝１〜４整数を示す。）で表わされる基
を示し、ｍ＝１〜５を示す。〕に於いて、ｍは通
常１〜５、好ましくは1.5〜３であり、Ｘ＝−
（CH₂）_oＹのときのｎは通常１〜４の整数、好ま
しくは２又は３であり、Ｙで表わされる−SO₃H
基及び−CO₂H基のＨは、夫々Na、Ｋ等のアル
カリ金属イオン又はNH₄ ⁺に置き換えられていて
も良い。本発明に用いる特定の修飾CDの代表例を挙げ
ると、例えば、 β−CD（−OH）_21-2（ONO₂）₂、 β−CD（−OH）_21-1.8（OPO₃H）_1.8、 β−CD（−OH）_21-2（OSO₃H）₂、 β−CD（−OH）_21-2.5（−Ｏ−CH₂−CO₂H）_2.5、 β−CD（−OH）_21-1.7（−Ｏ−CH₂CH₂CH₂−
SO₃H）_1.7、 β−CD（−OH）_21-2.5（−Ｏ−CH₂CH₂CH₂−
SO₃H）_2.5、 β−CD（−OH）_21-3.0（−Ｏ−CH₂CH₂CH₂−
SO₃H）_3.0、等であり、これらは、一般的製造方法により容易
に製造することができる。（有機合成化学、第35
巻、第２号、123（41）〜124（42）頁（1977）。）本基質及びこれら本発明に係る特定の修飾CD
を用いるγ−GTPの酵素活性の測定値は、従来
の酸溶解法の測定値とよい相関を示し（第１
図。）、又、現在実用化されている他の三法(1)、(2)
及び(3)の方法と比較して、ヘモグロビンの影響や
γ−GTPの酵素活性値の変動の問題もない。本
発明に係る特定の修飾CDを用いることにより、
極めて効果的に本基質Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−
ニトロアニリドが包接され、飛躍的に基質溶解性
が改善され、且つ溶解後の基質液の安定性も改善
された。又、ｒ−GTPの酵素活性は、これによ
り何らの抑制をもうけず、容易に定量的にγ−
GTPの酵素活性測定値を与え、更に、本基質の
基質溶解性が200ｍＭ以上と飛躍的に改善された
ため、等結乾燥された基質製剤の調製も極めて容
易となつた。（表１参照）又、本発明の意外な効果としては、本基質Ｌ−

【表】 γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを基質とす
るγ−GTPの酵素活性測定法に於て、本発明に
係る特定の修飾CDを剤させることにより、防腐
剤として用いるヒドロキシ安息香酸エステルの溶
解度をも改善し、防腐剤としての効果を増大さ
せ、試液の安定化に寄与するところ大ならしめた
点である。（表２参照）即ち、ヒドロキシ安息香酸エステル類は、毒性
の少ない防腐剤として知られ、食品添加物や各種
製剤の防腐剤として幅広く利用されているが、抗
菌力が特に強いといわれているエステルの炭素数
が３及び４のものは水に対する溶解度が低く、必
要量溶解させることが出来ないのが現状であつ
た。（表２に示す如く、例えばプロピルエステル
の場合、５ｍＭ用いたとすると重量％濃度は
0.090％となるが、このものの20℃及び25℃に於
ける溶解度は夫々0.03％及び0.05％であるから、
20〜25℃に於ては必然的に0.06〜0.04％相当分は
不溶分として残る。）。然しながら、本発明によ
り、即ち本発明の特定の修飾CDを用い

【表】ることにより、その抗菌、防腐作用を何ら阻害せ
ず、又何らの障害も発生させることなしに、これ
ら水難溶性物質の溶解度を飛躍的に増大させ、そ
の結果として試液の安定性向上に顕著な効果をも
たらした。以上申し述べたとおり、本発明は、現在盛んに
行なわれている、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニト
ロアニリドを基質とするγ−GTPの酸素活性測
定法に於て、本発明に係る特定の修飾CDを用い
ることにより、従来の方法を極めて効果的に改良
したものであり、斯業に貢献するところ大なるも
のである。以下に実施例を示す。実施例１ (1) 試薬の調製基質緩衝液 β−CDスルホプロピルエーテル（ｍ＝2.5
置換体）10ｍＭ、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−
ニトロアニリド５ｍＭを溶解した0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH8.40）を調製する。グリシルグリシン溶液塩酸でPH8.40に調整したグリシルグリシン
162ｍＭ溶液を調製する。 (2) 測定操作試料50μに基質緩衝液2.0mlを加え、37℃
で３分間予備加温し、これにグリシルグリシン
溶液0.5mlを加えてよく混合後、分光光度計
で410nmの吸光度の増加を測定し、活性値を算
出する。 (3) 活性値単位時間（１分間）当りの吸光度の増加
ΔE／minに相当する活性値（mIU）は次式で
与えられる。活性値（mIU）＝ΔE／min×１×2.55×1000／8.8×10⁶
×10^-6×0.05 比較例１ (1) 試薬の調製基質液：Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロ
アニリド１ｍＭ（285mg）を0.5N塩酸10mlに
溶解し、水で全量50mlとする。（20ｍＭ溶液）緩衝液：グリシルグリシン40ｍＭを溶解し
た0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.40）を調製
する。 (2) 測定操作試料50μに緩衝液2.0mlを加え、37℃で３
分間予備加温し、これに基質液0.5mlを加え
てよく混合後、分光光度計で410nmの吸光度の
増加を測定する。実施例１、及び比較例１、の方法により、同一
の30検体の活性値を求め、それらの相関関係を第
１図に示す。第１図から明らかなように、本発明による測定
値は、従来の酸溶解法の測定値とよい相関を示し
ている。（γ＝0.9987、Ｙ＝1.022X−2.121）実施例２ (1) 試薬の調製基質緩衝液 β−CDカルボキシメチルエーテル（ｍ＝
2.5置換体）10ｍＭ、Ｌ−γ−グルタミル−
ｐ−ニトロアニリド５ｍＭを溶解した0.1M
トリス塩酸緩衝液（PH8.40）を調製する。グリシルグリシン溶液塩酸でPH8.40に調整したグリシルグリシン
162ｍＭ溶液を調製する。 (2) 測定操作試料50μに基質緩衝液2.0mlを加え、37℃
で３分間予備加温し、これにグリシルグリシン
溶液0.5mlを加えてよく混合後、分光光度計
で410nmの吸光度の増加を測定し、活性値を算
出する。実施例２によつても、実施例１と同様な結果
が得られた。実施例３ (1) 試薬の調製基質液：Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロ
アニリド200ｍＭ、β−CDカルボキシメチル
エーテル（ｍ＝2.5置換体）400ｍＭの混合液
を２mlずつ分注し凍結乾燥して基質剤得る。
これを、使用時、0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH8.40）20mlに溶解し、基質液を調製する。緩衝液：グリシルグリシン40ｍＭを溶解し
た0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.40）を調製
する。 (2) 測定操作試料50μに緩衝液2.0mlを加え、37℃で３
分間予備加温し、これに基質液0.5mlを加え
てよく混合後、分光光度計で410nmの吸光度の
増加を測定する。実施例４ (1) 試薬の調製基質液：Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロ
アニリド200ｍＭ、β−CDスルホプロピルエ
ーテル（ｍ＝2.5置換体）400ｍＭの混合液を
２mlずつ分注し、凍結乾燥して基質剤を得
る。使用時、0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.40）20mlに溶解し、基質液を調製する。緩衝液：グリシルグリシン40ｍＭを溶解し
た0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.40）を調製
する。 (2) 測定操作試料50μに緩衝液2.0mlを加え、37℃で３
分間予備加温し、これに基質液0.5mlを加え
てよく混合後、分光光度計で410nmの吸光度の
増加を測定し活性値を算出する。実施例３及び４からも明らかなように、本発
明の修飾CDは、400ｍＭ以上の非常に高い溶解
度を有していて、ゲスト分子である本基質γ−
グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを、200ｍＭ
と、飛躍的に可溶化することができる。実施例５（ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルの可溶化）緩衝液：１トリスヒドロキシアミノメタン 100ｍＭ β−CDカルボキシメチルエーテル（ｍ＝2.5置換体） 20ｍＭｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル 10ｍＭグリシルグリシン 40ｍＭ塩酸でPHを9.0に調整する。本溶液は室温で１年間安定である。基質緩衝液Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド
１ｍＭを0.5N−H₂SO₄10mlに溶解し、上記
緩衝液190mlと混合する。本溶液は２〜10℃保存で２週間使用可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法で得られたγ−GTP
の酵素活性値と従来の酸溶解法で得られたγ−
GTPの酵素活性値との相関を表わし、横軸Ｘは
酸溶解法の活性値（mIU）を、縦軸Ｙは本発明
の方法の活性値（mIU）を表わす。

Claims

【特許請求の範囲】

１ γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素
活性を測定するに当り、β−CD（−OH）₂₁−ｍ
（−OX）ｍ［但し、CDはシクロデキストリン残
基を、ＸはNO₂、PO₃H、SO₃H、又は式−
（CH₂）nY（Ｙは−SO₃H基又は−CO₂H基を示
し、−SO₃H基及び−CO₂H基のＨは、夫々Na、
Ｋ等のアルカリ金属イオン又はNH₄ ⁺に置き換え
られていても良い。ｎ＝１〜４の整数を示す。）
で表わされる基を示し、ｍ＝１〜５を示す。］な
る修飾シクロデキストリンの存在下に、Ｌ−γ−
グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを基質として用
いることを特徴とする、γ−グルタミルトランス
ペプチダーゼ活性の測定方法。