JP2741031B2

JP2741031B2 - アミラーゼ測定方法

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Publication number: JP2741031B2
Application number: JP63102442A
Authority: JP
Inventors: 信雄久江
Original assignee: Shino Test Corp
Current assignee: Shino Test Corp
Priority date: 1987-05-12
Filing date: 1988-04-27
Publication date: 1998-04-15
Anticipated expiration: 2013-04-15
Also published as: JPS6460400A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、ｐ−ニトロフェニル−マルトオリゴ糖を基
質として用いる体液α−アミラーゼ活性の測定方法に関
する。

［従来の技術］ α−アミラーゼの酵素活性の測定は、臨床的には膵疾
患の診断に利用され、種々の方法が発表されているが、
ｐ−ニトロフェノールをマルトオリゴ糖の還元末端に結
合させた基質（但し、マルトオリゴ糖の非還元末端はベ
ンジリデン基等により修飾されていてもよい）を用い
た、キネティック法が最も一般的であり、現在盛んで行
われている。

しかし、これらの基質を用いた方法において、α−ア
ミラーゼの作用により、最終的に遊離してくるｐ−ニト
ロフェノールを正確に測定するには、まだ若干の問題点
が残されている。即ち、α−アミラーゼ活性測定は通常
pH7付近で行われ、しかも、ｐ−ニトロフェノールのフ
ェノール基のpKaは約7.1であるので、α−アミラーゼ活
性測定のpHでは、ほぼ等量のイオン化型と非イオン化型
のｐ−ニトロフェノールが存在するため、390〜420nmで
キネティックアッセイを行う場合、遊離されてきたｐ−
ニトロフェノールの一部しか検出できない。

このような問題に対し、α−又はβ−シクロデキスト
リン（以下、シクロデキストリンのCDと記す。）を用い
て感度を増大させる方法が報告されており、ｐ−又はｍ
−ニトロフェノールの測定において、α−又はβ−CDの
添加が効果的である（特表昭58−501357）。

しかしながら、それらの溶解度はそれぞれ、20℃では
α−CDが10.1、β−CDが1.55であり、15℃ではα−CDが
8.6、β−CDが1.36であり、0.5℃ではα−CDが6.8、β
−CDが0.80であり、これらα−CDやβ−CDがα−アミラ
ーゼの測定試薬の中に添加される場合は、溶解度が満足
ではない。特に、試薬の製剤化のために凍結乾燥を考え
た場合、凍結乾燥母液の調製は、その試薬中の成分の調
製中の変化を抑えるため10℃〜０℃で行うのが常である
が、このような低温下でのα−又はβ−CDの溶解性は更
に悪化し、従って凍結乾燥用母液を５〜20倍濃縮液（α
−又はβ−CD濃度はこのとき５〜20％となる）とするこ
とは不可能となる。

ちなみに、ｐ−ニトロフェノールの感度増大効果はα
−又はβ−CDが0.5％以上の時に特に好適であり、至適
には１％程度の濃度が要求される。従って、α−アミラ
ーゼ測定試験に１％のα−又はβ−CDを加える時、この
試液の５〜10倍濃縮液とした凍結乾燥母液製剤の調製は
α−又はβ−CDを用いては殆ど不可能であった。

［発明が解決しようとする問題点］本発明は上記したごとく、ｐ−ニトロフェニル−マル
トオリゴ糖を基質として用いるα−アミラーゼの測定法
において、その測定感度の増大のための添加物であるCD
の溶解性の問題点を解決すべくなされたもので、α−ア
ミラーゼの酵素活性を正確に、容易に、定量的に測定す
る方法を提供することを目的とする。

［問題点を解決するための手段］本発明はα−アミラーゼの酵素活性を測定するにあた
り、一般式〔Ｉ〕 α−CD（−OH）_18-n（−OCH₂CHOHCH₃）_ｎ〔但し、ｎ＝１〜10を示す〕又は一般式〔II〕 β−CD（−OH）_21-m（−OCH₂CHOHCH₃）_ｍ〔但し、ｍ＝１〜10を示す〕で表わされる低温での水溶解性に優れた修飾CDの存在
下、還元末端にｐ−ニトロフェノールを結合させたマル
トオリゴ糖を基質として用いることを特徴とするα−ア
ミラーゼ活性測定方法である。

即ち、本発明は、基質として還元末端にｐ−ニトロフ
ェノールを結合させたマルトオリゴ糖を用いるα−アミ
ラーゼの測定方法において、一般式〔Ｉ〕又は〔II〕で
表わされる特定の修飾CDが効果的にｐ−ニトロフェノー
ルの感度の増大作用を示し、かつ、測定しようとするα
−アミラーゼの酵素活性を何ら抑制することがないた
め、上記の特定の修飾CDの存在下、α−アミラーゼの酵
素活性を容易にかつ正確に定量できる。

本発明における還元末端にｐ−ニトロフェノールを結
合させたマルトオリゴ糖とは、マルトオリゴ糖の還元末
端にｐ−ニトロフェノールを結合させたもの、或いはマ
ルトオリゴ糖の還元末端にｐ−ニトロフェノールを結合
させ、その非還元末端をベンジリデン基、アルキル基等
で修飾させたものをいう。例えば、４−ニトロフェニル
−マルトヘプタオース（PNP−G₇）、或いはベンジリデ
ン−４−ニトロフェニル−マルトヘプタオシド、エチリ
デン−４−ニトロフェニル−マルトヘプタオシド（修飾
PNP−G₇）等を挙げることができる。

測定用の共役酵素としては、α−グルコシダーゼ、β
−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼより選択される
一種又は二種以上を用いることができる。

本発明における特定の修飾CDとは、α−又はβ−CDを
アルカリ性水溶液条件下でプロピレンオキサイドと反応
させることにより合成し、ヒドロキシプロピル化させた
もので、平均置換数ｍであるヒドロキシプロピル−α−
シクロデキストリンを、ここではHP−α−CD（ｍ）と称
し、平均置換数ｎであるヒドロキシプロピル−β−シク
ロデキストリンをHP−β−CD（ｎ）と称する。これら
は、例えばInternational Journal of Pharmaceutics,V
ol.29,p.73〜82（1986）に記載の一般的製造方法によ
り、容易に製造することができる。

これらの修飾CDを添加したα−アミラーゼ測定用試薬
のための凍結乾燥母液としては、通常５〜20倍程度の濃
厚液が必要とされる。そして、ｐ−ニトロフェノール
（PNP）の感度増大が達成されるための修飾CDの必要濃
度は、HP−α−CD又はHP−β−CDを用いるとき約１％で
ある。従って、このとき凍結乾燥母液中の修飾CD濃度は
５〜20％になり、本発明の修飾CDを用いることにより、
溶解性に優れた試薬の調製が可能となった。

又、これらの修飾CDを添加したα−アミラーゼ測定試
薬の安定性は当該CD無添加試薬と比較して、試薬ブラン
クの上昇を抑制する効果が認められた。その結果、安定
性は２〜３倍も良好となった。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は
これらに限定されるものではない。

実施例１（１）試薬の調製緩衝液。PIPES−Na50mmol/、NaCl50mmol/を水に
溶かし、希塩酸又は希水酸化ナトリウム水溶液にてpH6.
95（20℃）とした。

PNP水溶液（1mM）。1mmol/のｐ−ニトロフェノール
を水に溶かして調製した。

（２）測定操作法上記緩衝液に、１％となるようにそれぞれα−CD、HP
−α−CD（2.4）、HP−α−CD（3.1）、HP−α−CD（4.
8）、HP−β−CD（3.4）を加えた溶液を調製し、この4m
lに上記PNP水溶液0.1mlを加え、30℃405nmにおける吸光
度を測定し、それぞれの修飾CDの存在下でのｐ−ニトロ
フェノールの分子吸光係数を求めた。

この結果を第１表に示す。HP−α−CDは無添加に比べ
て約２倍、HP−β−CDは約1.4倍のｐ−ニトロフェノー
ルの感度増大効果を示した。

実施例２（１）試薬の調製 4,6−ベンジリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトヘプタオシド2mmol/、NaCl50mmol/酢酸カル
シウム5mmol/、グルコアミラーゼ20U/ml、α−グルコ
シダーゼ10U/ml、グッド緩衝液（PIPES−Na）50mmol/
を溶解し、pH6.95に調製した。

（２）測定操作法上記試液に、更に各種CDをそれぞれ１％添加してα−
アミラーゼ測定液とした。このα−アミラーゼ測定液1m
lに検体血清20μを加え、30℃でレートアッセイを行
った。活性値は３分後から６分後までの３分間の吸光度
変化（ΔA/分）を測定して、１分間に１μmolのｐ−ニ
トロフェノールを遊離させる量を1Uとした。

この時の活性値を第２表に示す。HP−α−CD又はHP−
β−CDの添加はα−CDの添加と同程度にα−アミラーゼ
活性を抑制することなく測定が可能であった。

実施例３実施例２で用いた試液に、HP−α−CD（3.1）を１％
加えたもの、又はα−CDを１％加えたもの、無添加のも
のの３種類のα−アミラーゼ測定液を調製し、検体血清
18種類を用いて、それぞれの測定液で測定した。

この時の結果を第１図のＡとＢに示す。第１図ＡはHP
−α−CD添加法でのα−アミラーゼ酵素活性値とCDの無
添加で得られたα−アミラーゼの酵素活性値との相関を
表わし、横軸Ｘ、縦軸Ｙはともに活性値（U/L）を表わ
す。第１図Ｂはα−CD添加法でのα−アミラーゼ酵素活
性値とCDの無添加で得られたα−アミラーゼの酵素活性
値との相関を表わし、横軸Ｘ、縦軸Ｙはともに活性値
（U/L）を表わす。相関係数はＡで0.9993、Ｂで0.9987
であり、回帰式はＡでＹ＝0.875X＋1.821、ＢでＹ＝0.8
93X＋2.675となり、HP−α−CD添加試薬はα−CD添加試
薬と同様に良好であった。

実施例４実験方法 α−アミラーゼ測定試薬（凍結乾燥品）のための母液
調製法の検討のために、実施例２に示したα−アミラー
ゼ測定液の10倍濃厚液を調製することを試みた。

4,6−ベンジリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトヘプタオシド20mmol/、グルコアミラーゼ200U/
ml、α−グルコシダーゼ100U/ml、NaCl500mmol/、酢
酸カルシウム50mmol/、グッド緩衝液（PIPES−Na）50
0mmol/となるように溶解し、pHを6.95に合わせた。

この溶液を100mlずつ取り、それぞれ、無添加、1
0％HP−α−CD（3.1）添加、10％HP−α−CD（4.8）
添加、10％HP−β−CD（3.4）添加、10％α−CD添
加の溶液を作製し、この間５〜10℃に保って、ゆるやか
に撹拌した。

その結果、、、、は全て透明な溶液となった
が、の場合は一様な溶液とならず、１日後でも溶液は
白濁した状態であり、不溶物が残った。

、、、について、それぞれ2mlずつバイアル
瓶に分注後、凍結乾燥して酵素基質試薬を得た。これら
を使用時、精製水又はpH6.95の50mMグッド緩衝液（PIPE
S−Na）20mlに溶解し、α−アミラーゼ測定液を調製し
た。

実施例５（１）試薬の調製 4,6−ベンジリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトヘプタオシド1mmol/、NaCl20mmol/酢酸カル
シウム2mmol/、グルコアミラーゼ20U/ml、α−グルコ
シダーゼ10U/ml、グッド緩衝液（PIPES−Na）100mmol/
を溶解し、pH7.0、37℃に調製した。

（２）測定操作法上記試液に、HP−α−CD（3.1）を1.1％添加したもの
と無添加のものの２種類のα−アミラーゼ測定液を調製
し、10℃の冷蔵庫に33日間保存して、両試液の安定性を
比較検討した。α−アミラーゼ活性測定は、前記測定液
2mlに検体血清32μを加え、37℃でレートアッセイを
行った。この時の結果を第３表に示す。

修飾CDを添加した測定液は無添加に比べて、初期吸光
度は、17日〜33日間10℃で保存のときに約1/2と低く、
ｐ−ニトロフェノールの分子吸光係数を考慮して計算す
ると、保存中に生成されたｐ−ニトロフェノールの量は
約1/3と小さかった。試薬の初期吸光度の値は、約0.300
以下が期待される。もし0.300以上の時、たとえば0.600
にもなった場合、測定値の上限活性値がそれだけ低下す
ることになるからである。保存中の初期吸光度の上昇が
小さく抑えられたことは、それだけ基質の分解が抑えら
れたことを意味し、従って測定液の保存性にとって好適
になった。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａは、実施例３（本法）で得られたHP−α−CD添
加法でのα−アミラーゼ酵素活性値とCDの無添加で得ら
れたα−アミラーゼの酵素活性値との相関を表わし、横
軸Ｘ、縦軸Ｙはともに活性値（U/L）を表わす。第１図Ｂは、実施例３で得られたα−CD添加法でのα−
アミラーゼ酵素活性値とCDの無添加で得られたα−アミ
ラーゼの酵素活性値との相関を表わし、横軸Ｘ、縦軸Ｙ
はともに活性値（U/L）を表わす。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】α−アミラーゼの酵素活性を測定するにあ
たり、部分ヒドロキシプロピル化α−又はβ−シクロデ
キストリンの存在下に、還元末端にｐ−ニトロフェノー
ルを結合させたマルトオリゴ糖を基質として用いること
を特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法。
【請求項２】還元末端にｐ−ニトロフェノールを結合さ
せたマルトオリゴ糖を基質としてα−アミラーゼの酵素
活性を測定するにあたり、部分ヒドロキシプロピル化α
−又はβ−シクロデキストリンとして、それぞれ一般式
〔Ｉ〕 α−CD（−OH）_18-n（−OCH₂CHOHCH₃）_ｎ〔但し、ｎ＝１〜10を示す〕又は一般式〔II〕 β−CD（−OH）_21-m（−OCH₂CHOHCH₃）_ｍ〔但し、ｍ＝１〜10を示す〕で表わされる修飾シクロデキストリンを用いることを特
徴とするα−アミラーゼの測定法。