JPH05142230A - Ｈｃｖ抗体測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス蛋白抗原（ＨＣＶ抗
原）を簡単な操作で、高感度、正確、安価かつ短時間に
測定することのできるリポソームおよびそのリポソーム
を用いた免疫学的測定方法を提供しようとするものであ
る。 【構成】 親水性標識物質を封入し、架橋剤を介して精
製ＨＣＶ抗原を結合させたリポソームおよびこれをＨＣ
Ｖ抗体測定試薬として用いる補体依存性リポソーム膜損
傷反応を利用した免疫学的測定法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＨＣＶ抗体の測定試薬
および測定法、さらにくわしくは、補体依存性リポソー
ム膜損傷反応を利用したＨＣＶ抗体測定試薬および測定
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルス性肝炎にはＡ型肝炎（伝染性肝
炎）とＢ型肝炎（血清肝炎）の２種類があることは古く
から知られていた。これは主として感染経路の相違に基
づいたもので、Ａ型肝炎は経口感染で流行を起こし、Ｂ
型肝炎は血液を介して伝播されるものであることが確認
されていた。これら二つの肝炎の起因ウイルスはすでに
分離同定され、Ａ型肝炎ウイルスは、ピコルナウイルス
に属する、直径27nmのＲＮＡウイルスであり（ファイン
ストン，エス エム(Fineston,S.M.) ら、サイエンス(S
cience) 182 ,1026(1973) ）、一方Ｂ型肝炎ウイルス
は、ヘパドナウイルスに属する直径42nmのエンベロープ
を持つＤＮＡウイルスであることが突き止められた（ダ
ン，オー エス(Dane,O.S.) ら、ランセット(Lancet)I
,695(1970)）。また、現在では、これらの肝炎ウイル
スの免疫血清学診断方法が確立されるにいたっている。

【０００３】これら２つの肝炎ウイルスの確定診断方法
が確率されるにしたがい、このいずれにも属さない非Ａ
非Ｂ型肝炎の存在が明らかになってきた（プリンス，エ
ーエム(Prince,A.M.) ら、ランセットI ,241(1974)）。

【０００４】輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
（HBsAg ）のスクリーニング方法の導入により大幅に減
少したがゼロにはならず、しかも、発生した肝炎患者か
らは、Ａ型、Ｂ型肝炎の感染の証拠はえられなかった。
このことから、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ば
れている。

【０００５】この肝炎は、我が国では散発性肝炎の約50
％、輸血後肝炎の90％以上にのぼり、さらに慢性肝炎、
肝硬変、肝癌の50％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に起因すると
推定されており、大きな社会問題となっている。

【０００６】最近になって、米国カイロン社の研究者
は、非Ａ非Ｂ型肝炎に罹患したチンパンジーの血清から
えたウイルス由来のＤＮＡ断片のクローンを分離するこ
とに成功し（チョー，キュー(Choo,Q)ら、サイエンス
244 ,359-362(1989)およびクオ，ジー(Kuo,G) ら、サイ
エンス 244 ,362-364(1989)）、それから発現される蛋
白（C100-3）に対する抗体が輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎の臨
床例に特異的に関連することを発表した。その後、この
抗体をＨＣＶ抗体と呼ぶようになり、供血血液のスクリ
ーニングならびにＣ型肝炎の診断の補助として臨床応用
されている。

【０００７】現在、ＨＣＶの全遺伝子の塩基配列がほぼ
解明されており、その遺伝子のコードするウイルス関連
蛋白の一部を抗原として用いることによりＣ型肝炎の抗
体診断が可能となっている。Ｃ100 - ３抗原蛋白はＨＣ
Ｖ遺伝子のうち非構造蛋白遺伝子であるＣ-100領域（Ｎ
Ｓ３〜ＮＳ４領域）の363 個のアミノ酸部分をヒトＳＯ
Ｄ(superoxide sisdismutase) との融合蛋白として酵母
で発現された蛋白であり、同じく、ＨＣＶ遺伝子のうち
非構造蛋白遺伝子であるＣ-200領域（ＮＳ３〜ＮＳ４領
域）を使ったＣ-200抗原蛋白や構造蛋白遺伝子であるＣ
22領域（Ｃ領域）を使ったＣ22- ３抗原蛋白などもカイ
ロン社により開発され発売されている。また、構造蛋白
遺伝子であるＣ領域より有馬らによりコードされたクロ
ーン14（有馬ら、ガストロエメロロジアジャパニカ25
(2),218-222(1990)）の組換え蛋白あるいは合成ペプチ
ドなどが抗原として用いられている。

【０００８】ＨＣＶ抗原の検査方法には、交差免疫電気
泳動法（ＣＩＥ）、二次元免疫拡散法（ＭＯ）、受身赤
血球凝集反応（ＰＨＡ）、免疫粘着赤血球凝集反応（Ｉ
ＡＨＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相放射免疫測
定法（ＲＩＡ）などが知られている。現在では、主に酵
素免疫測定法（ＥＩＡ）が用いられている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】このうち、ＣＩＥおよ
びＭＯは測定時間が長く、感度も低い。またＰＨＡおよ
びＩＡＨＡは安定した抗原被膜赤血球を用意することが
困難であり、試薬価格も高い。さらに、ＥＩＡおよびＲ
ＩＡは感度の高い点ではＭＯの5,000 〜50,000倍にもな
るが、試薬価格が高く、測定に数日かかるという欠点を
有している。

【００１０】また、前述のようなＨＣＶ抗体の臨床上の
重要性に鑑み、測定法の自動化が望まれている。

【００１１】したがって、本発明は簡単な操作で、高感
度、正確、安価かつ短時間にＨＣＶ抗体を測定すること
ができ、その自動化も可能である免疫学的測定法を提供
することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、標識物質を内
包したＨＣＶ抗原結合リポソームおよび補体の存在下で
ＨＣＶ抗体と反応させることを特徴とする免疫学的測定
法に関する。

【００１３】

【実施例】つぎに本発明のＨＣＶ抗原結合リポソームに
ついて説明する。

【００１４】本発明のＨＣＶ抗原結合リポソームに用い
られるＨＣＶ抗原としては、ＨＣＶ遺伝子のコードする
ウイルス関連蛋白の一部を有するものが用いられる。た
とえば、前述のＣ100-３抗原蛋白、Ｃ-200抗原蛋白、Ｃ
22- ３抗原蛋白、前記のクローン14の組換え蛋白または
合成ペプチドなどがあげられる。

【００１５】本発明のＨＣＶ抗原結合リポソームにおい
て、リポソームはリン脂質およびコレステロールを主要
構成成分とするものであれば、従来使用されているいず
れのものでもよく、とくに限定されることはない。しか
し、リン脂質とコレステロールの比が１：１前後である
とき、安定なリポソームがえられやすい。リン脂質とし
ては、動物や微生物などの細胞膜に広く存在するリン脂
質、たとえばホスファチジルエタノールアミン類、ホス
ファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、スフィ
ンゴミエリン類などの各種リン脂質があげられる。もち
ろん、天然の卵黄、牛脳や大豆などからえられるホスフ
ァチジルコリンも適用できる。このようなリン脂質中の
脂肪酸の種類には各種の飽和または不飽和脂肪酸が含ま
れ、たとえばホスファチジルコリンについては、ジヘプ
タノイルホスファチジルコリン、ジカプロイルホスファ
チジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ジ
ラウロイルホスファチジルコリン、ジヘプタデカノイル
ホスファチジルコリン、ジベヘノイルホスファチジルコ
リン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミ
トイルホスファチジルコリンなどがあげられる。前述の
その他のリン脂質にも同様に各種飽和および不飽和脂肪
酸が含まれる。

【００１６】本発明のリポソームの形状は、多重層リポ
ソーム（multi lamellar vesicle、以下ＭＬＶと略
す）、小さな一枚膜リポソーム（small unilamellar ve
sicle 、以下ＳＵＶと略す）、大きな一枚膜リポソーム
（large unilamellar vesicle 、以下ＬＵＶと略す）の
いずれであってもよい。

【００１７】リポソーム内に封入される標識物質は、リ
ポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなければ
ならない。かかる物質としては、たとえば、ラジオイム
ノアッセイで用いられる ¹²⁵Ｉや ¹³¹Ｉなどの放射性同
位元素；低濃度域（10^-3M 以下）でも非常に強い蛍光を
発するカルボキシフルオレセイン、フルオレセインイソ
チオシアネートのような蛍光性化合物；リポソーム外で
の酸化反応により発光するルミノールやルシフェリンの
ような発光性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な
吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素など）；酸化
酵素の作用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素
生成をもたらすグルコースおよびスクロースなどの糖
類；テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きな
イオン性化合物；カルシウムイオンなどの金属；ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のような補
酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカル化合
物；酵素免疫測定法などで用いられるβ−ガラクトシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素類などが好ましい。
標識物質としてカルシウムイオンを用いたばあいにはカ
ルシウム依存性酵素（カルバイン、プロテインキナーゼ
Ｃ、トランスグルタミラーゼなど）を、酵素を用いたば
あいには基質（上述の酵素に対する基質としては、それ
ぞれ４−メチルウムベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシ
ド、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸があげられ
る）を、リポソーム破壊によりこれらの物質が放出され
た際に用いることによりはじめて、定量が可能となる。

【００１８】本発明のＨＣＶ抗原結合リポソームは、た
とえばつぎの方法で製造される。

【００１９】まずリン脂質とコレステロールをフラスコ
に入れ、溶媒を加えて反応させたのち、溶媒を留去し、
吸引乾燥する。しかるのちに、壁面に薄膜が形成された
フラスコ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密栓をし
て振盪し、標識物質封入リポソームをえる。

【００２０】一方、ＨＣＶ抗原と架橋剤とを緩衝液中で
反応させて架橋基を導入し、しかるのち、必要であれ
ば、架橋基を還元する試薬（たとえばジチオスレイトー
ル：ＤＴＴ）と反応させて、修飾抗原をえる。

【００２１】最後に、標識物質封入リポソームと修飾抗
原とを緩衝液中で反応せしめることにより、本発明のＨ
ＣＶ抗原結合リポソームがえられる。かかるＨＣＶ抗原
結合リポソームは、通常、標識物質を内包し、表面に固
定化された抗原を担持したマイクロカプセルとしてえら
れる。

【００２２】前記製造法における架橋剤としては、たと
えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジ
ル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰ
Ｂ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）アセテート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−スクシンイミジル
４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート（ＳＭ
ＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシ
ンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイ
ルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、ジサクシンイ
ミジルスベレート（ＤＳＳ）、グルタルアルデヒド（Ｇ
Ａ）、フタルアルデヒド、テレフタルアルデヒド、フタ
ル酸、テレフタル酸、次式 ＨＯＯＣ−（ＣＨ₂ ）_ｎ−ＣＯＯＨ （式中、ｎは１以上の整数を表わす）で示される脂肪族
ジカルボン酸などがあげられる。

【００２３】本発明の免疫学的測定法は、つぎのような
操作手順で行なわれる。すなわち、このようにして調製
した本発明のＨＣＶ抗原結合リポソームをＨＣＶ抗体測
定試薬として用いて、被検体中にその試薬および補体を
加え、抗原−抗体と補体との結合反応を引き起こさせ
る。すると、補体活性化によりリポソーム膜損傷反応が
起こり、かかる反応量に比例して、リポソーム内から標
識物質が放出されてくる。ついで、この標識物質に応じ
た分析方法（たとえば、標識物質が蛍光物質であれば、
蛍光分析法）により定量を行ない、たとえば、予め作成
した検量線により、試料中の抗体の量を測定することが
できる。

【００２４】この測定操作において使用する補体は、と
くに限定されないが、通常、モルモット血清が用いられ
る。しかし、ウサギ、マウス、ヒトなどの血清を使用し
てもよい。

【００２５】つぎに本発明を実施例をあげて説明する
が、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではな
い。

【００２６】実施例１ ＨＣＶ抗原結合リポソームの調製 （１）リポソームの調製 Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチレート（ＳＭＰＢ）28.1μmol とジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）20μmol を
クロロホルム 4.5mlと無水メタノール 0.5mlとの混合液
に溶解した。これにトリエチルアミン20μmol を添加
し、チッ素封入下室温で２時間撹拌し反応させた。反応
終了後、メタノール 3.5ml、蒸留水２mlを加え、よく振
盪した。これを静置し、クロロホルム相をとり、溶媒を
蒸発させたのち、約５mlのクロロホルムを添加し溶解し
た。この溶液を、150 ℃で12時間以上乾燥させクロロホ
ルムで平衡化した10ml容量のシリカゲル（Wakogel C-10
0 、和光純薬工業（株）製）カラムに負荷し、クロロホ
ルム−メタノール（20：１，v/v ）40〜50mlで洗浄し
た。クロロホルム−メタノール（５：１，v/v ）により
溶出する画分を集め、溶媒を蒸発させたのち、新たに５
mlのクロロホルムに溶解した。以上の操作により、Ｎ−
（４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル）ジパルミ
トイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＤＰ
ＰＥ）を調製した。

【００２７】100ml ナス型フラスコに、ジパルミトイル
ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）75μｌ、コレステロ
ール75μｌ、リン酸ジセチル（ＤＣＰ）7.5 μｌ、ＭＰ
Ｂ−ＤＰＰＥ 7.5μmol をとり、約10mlのクロロホルム
に溶解し、42℃以上の水溶液中にてロータリーエバポレ
ーターで溶媒を除去したのち、残った脂質薄膜に、標識
物質水溶液として自己消光性の蛍光物質である0.2Mカル
ボキシフルオレセイン（ＣＦ）15mlを加えてボルテック
ス（Vortex）ミキサーで10分間振盪撹拌しＭＬＶを調製
した。これを15分間プローブ型超音波発振装置（（株）
日本精機製作所製、US-300）で超音波処理することによ
って均一化したＳＵＶにした。ついでリポソームに封入
されなかったＣＦを除去するため Sephadex G-25（商品
名、ファルマシア社製）カラムにてクロマト分離し、反
応性リポソームをえた。

【００２８】（２）ＨＣＶ抗原結合リポソームへの感作 ５mg／mlのＨＣＶ抗原（C100-3（米国カイロン社））の
リン酸緩衝生理食塩水溶液５mlに 10mM Ｎ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネイト
（ＳＰＤＰ）エタノール溶液を0.1ml加え、室温で５分
間撹拌し反応させた。未反応のＳＰＤＰを除くために、
0.1M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（0.15MNaCl含有、pH
4.5 ）で平衡化したSephadex G-25 カラムでクロマト分
離した。最初のピーク部分を集め、これに50mMになるよ
うにジチオスレイトール（ＤＴＴ）を固体のまま加えて
溶解し、チッ素封入下室温で30分間放置した。反応終了
後リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（pH7.4 ）で平衡化
したSephadex G-25 カラムでクロマト分離し、最初のピ
ーク部分を集めた。以上の操作によりＳＰＤＰを通じて
ＨＣＶ抗原にSH基を導入し、SH基導入ＨＣＶ抗原を調製
した。

【００２９】つぎに、反応性リポソームを２倍に希釈し
たものと前記操作でえたSH基導入ＨＣＶ抗原を１：１
（v/v ）の割合で混合し、チッ素封入下４℃で12時間放
置し反応させたのち、リポソームに結合しなかったＨＣ
Ｖ抗原を除くためSephacryl S-1000 （商品名、ファル
マシア社製）カラムでクロマト分離し、ＨＣＶ抗原結合
リポソームをえた。

【００３０】前記の抗原結合リポソームを、その初期蛍
光強度が適当なものとなるように、0.5mM MgCl₂ および
0.15mM CaCl₂ を含有したゼラチンベロナール緩衝液
（ＧＶＢ²⁺）で100 倍程度に希釈したもの４mlに、ＨＣ
Ｖ抗体測定試薬（ＨＣＶ・ＥＩＡ「アボット」（ダイナ
ボット株式会社製））により陽性と判断された血清（Ｈ
ＣＶ抗体血清）を倍々希釈したものを50μｌ加え37℃で
60分間放置して反応させた。そののち、モルモット全補
体（220 CH₅₀／ml、石津製薬（株）） 50μｌを加え、3
7℃で60分間放置して反応させたのち、各試料の蛍光強
度を分光蛍光光度計（ RF-5000、（株）島津製作所製）
で測定した（励起波長 490nm、蛍光波長 518nm）。な
お、測定値は、測定終了後測定試料に１−プロパノール
（ｎ−プロピルアルコール）を4.1ml 加えリポソームを
完全に破壊したのちの蛍光強度を２倍したものと、ＨＣ
Ｖ抗体血清の代りにゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶ
Ｂ）を0.1ml 添加したものの差を100 ％として、各被検
試料の蛍光強度を相対的に換算したものを標識物質遊離
率（％）とした。

【００３１】結果を、図１に示す。

【００３２】このように、希釈倍率８から1024の範囲で
ＨＣＶ抗体が定量可能であることがわかる。

【００３３】

【発明の効果】上述のように、本発明のＨＣＶ抗原結合
リポソームをＨＣＶ抗体測定試薬として使用すれば、簡
単な操作で、高感度、正確、安価かつ短時間に被検体中
のＨＣＶ抗体を測定することができ、しかもその自動化
が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＨＣＶ抗原結合リポソームをＨＣＶ抗
体測定試薬として用いて測定した、検体中のＨＣＶ抗体
濃度と標識物質遊離率との関係を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標識物質を内包したＨＣＶ抗原結合リポ
   ソーム。
2. 【請求項２】 補体の存在下でＨＣＶ抗体と反応させる
   ことを特徴とする請求項１記載のＨＣＶ抗原結合リポソ
   ームを用いた免疫学的測定法。