JPH047195B2

JPH047195B2 -

Info

Publication number: JPH047195B2
Application number: JP27027284A
Authority: JP
Inventors: Satomi Takahashi; Yoshibumi Yanagida; Yukio Yamada; Yasuyoshi Ueda; Yoshio Shimada; Kyoshi Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1984-12-20
Filing date: 1984-12-20
Publication date: 1992-02-10
Also published as: JPS61146191A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、γ−ハロ−アセト酢酸エステルの微
生物的不斉還元を利用した光学活性（Ｓ）−γ−
ハロ−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法に関
し、医薬、農薬などとして有効な生理活性を示す
光学活性化合物ないしはその合成中間体の合成原
料を極めて有利に製造することを目的とする。〔従来の技術〕光学活性なβ−ヒドロキシ酸またはそのエステ
ルの製造法として、１，３−ジオール類の微生物
酸化、β−ケト酸類の微生物による不斉還元、脂
肪酸のβ−酸化などの方法が知られている。アセ
ト酢酸エステル類の微生物、特にパン酵母を用い
た不斉還元によるβ−ヒドロキシ酪酸エステル合
成については種々検討され、簡便な二官能性光学
活性化合物の調製法として、生理活性化合物の有
用な合成中間体合成手法として利用されている。
しかし、こうした検討にもかかわらず、従来、γ
−位置換体、特にハロゲン原子の置換したγ−ハ
ロ−β−ヒドロキシ酪酸およびそのエステルの合
成研究はほとんど行なわれることなく、わずかに
チヤールズ・ジエイ・シー（Charles J.Sih）ら
により、γ−置換（ハロゲン原子、或いは水酸
基）アセト酢酸誘導体の酵素的不斉還元を利用し
た光学活性（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪
酸誘導体の合成が報告されているのみである（J.
Am.Chem.Soc.1988、105、5925.および特開昭59
−118093）。彼らはＬ−カルニチンの効率的な合
成を目的に、特異的に（Ｒ）体のγ−置換−β−
ヒドロキシ酪酸誘導体を生成するＬ−β−ヒドロ
キシアシルCoAデヒドロゲナーゼ〔EC.1.1.1.35〕
産生微生物を見いだし、Ｌ−カルニチンの合成前
駆体と考えられる（Ｒ）−γクロル−β−ヒドロ
キシ酪酸エステルなどの合成に有効に利用できる
ことを明らかにしている。また、その際、エステ
ル鎖長を長くする程、目的とする（Ｒ）−体の光
学純度が向上し、C₆以上ではほぼ100％光学純度
のものが得られるが、鎖長を短かくするにつれ、
光学純度が低下し、エステル鎖の炭素数が１〜４
の場合には、目的とは反対の低光学純度の（Ｓ）
体が生成することを報告している。〔発明が解決しようとする問題点〕本発明者らは、光学活性γ−ハロ−β−ヒドロ
キシ酪酸エステルが、Ｌ−カルニチンの合成原料
としてのみならず三官能性の光学活性合成原料と
して、抗コレステロール剤などの医薬およびフエ
ロモン類などの農薬の合成に極めて有用な化合物
群であることに着目した。生理活性化合物の合成
検討においては、（Ｒ）体のみならず（Ｓ）体も
必要である。特に生体との親和性の面では（Ｓ）
体が有効な場合が多く、効率的な（Ｓ）体の製法
が望まれている。一般に、γ−ハロ−β−ヒドロ
キシ酪酸誘導体においては、γ−位のハロゲン原
子が塩基に対して不安定なため、通常の化学的合
成法で得られるラセミ体を光学分割することは困
難で、現在まで有効な（Ｓ）−γ−ハロ−β−ヒ
ドロキシ酪酸エステルの合成法はない。〔問題を解決するための手段〕本発明者らは、上述の背景のもとに効率的な
（Ｓ）−γ−ハロ−β−ヒドロキシ酪酸エステルの
製造法を開発することを目的に生化学的な手法に
ついて鋭意検討を行なつた。その結果、微生物の
中にはγ−ハロ−アセト酢酸エステルを基質に
（Ｓ）−立体特異的な還元作用を示して、対応する
極めて高い光学純度の（Ｓ）−γ−ハロ−β−ヒ
ドロキシ酪酸エステルを効率的に生成する能力を
有する微生物が存在することを見いだし、本反応
が（Ｓ）−γ−ハロ−β−ヒドロキシ酪酸エステ
ルの有効な工業的製造法となることを明らかにし
て本発明を完成した。本発明の概略は次の式で表
わされる。すなわち、本発明は一般式（）（式中、Ｘは
塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子、Ｒはアル
キル基、アリール基またはそれらの置換体を表
す）で示されるγ−ハロ−アセト酢酸エステル
に、β−位カルボニル基に対して、（Ｓ）−立体特
異的な還元能を示す微生物を作用させて、（Ｓ）
配位を有するβ−ヒドロキシル化合物〔一般式
（）〕に変換する光学活性（Ｓ）−γ−ハロ−β
−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法である。以
下、本発明を詳細に説明する。本発明で、基質として用いられるγ−ハロ−ア
セト酢酸エステルのハロゲン原子としては、塩
素、臭素、ヨウ素等が用いられるが、操作性、反
応性等から塩素原子が好ましい。又、上記一般式
中、Ｒで表わされるアルキル基としては、いずれ
をも使用できるが、収率よく高純度の（Ｓ）体を
得るには炭素数１〜４のアルキル基、例えばメチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプ
ロピル基等が望ましい。またアリール基として
は、フエニル基、トリル基、等が、またこれらの
置換体としてはフルオロフエニル基、クロロフエ
ニル基等が用いられる。 γ−ハロ−アセト酢酸エステルは、ジケテン
（）を出発化合物として、これにハロゲンを作
用させγ−ハロ−アセト酢酸クロライド（）と
した後、これにアルコールを作用させるか、或い
はアセト酢酸エステル（）の直接γ位ハロゲン
化などにより極めて容易に合成することができ
る。本発明で使用する微生物は、γ−ハロ−アセト
酢酸エステルの３位カルボニル基に対して（Ｓ）
−立体特異的な不斉還元能を有するものであれば
何でもよく、こうした能力をもつ微生物の分布は
相当広範囲の種属にわたつていることが判明し
た。例えば酵母に属するものとして、キヤンデイ
ダ属（Candida）、デバリオマイセス属
（Debaryomyces）、デイポダスカス属
（Dipodascus）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、ピ
チア属（Pichia）、サツカロマイセス属
（Saccharomyces）、トルロプシス属
（Torulopsis）、トリコスポロン属
（Trichosporon）属などがある。これら微生物の培養は通常液体栄養培地で行な
われる。培地には、資化し得る炭素源、窒素源、
生育に必須のビタミン及び無機栄養素を含有させ
た培地、たとえばグルコース、ポリペプトン、酵
母エキス等からなる培地を用い、通気下、20〜40
℃、PH４〜９の条件で培養を常法通り行なうこと
ができる。 γ−ハロ−アセト酢酸エステルの微生物的不斉
還元は、通常上記培養条件で得た微生物生菌体
を、0.5〜10％（ｗ／ｖ）の基質を含む緩衝液
（培養液量の1/10量）に懸濁し、PH５〜８で20℃
〜40℃の条件下２〜18時間反応することによつ
て、ほぼ定量的に行うことができる。また、微生
物の培養液に基質とグルコースを添加して、PHを
５〜８に保ちつつ20〜40℃の条件下、20〜30時間
培養することによつても定量的に不斉還元を行う
ことができる。また反応系に基質を逐次添加する
ことにより高濃度に（Ｓ）体を蓄積させることも
できる。これらの不斉還元能を有する微生物を、架橋
法、物理的吸着法、包括法等公知の固定化方法で
固定化した固定化微生物をもちいて反応を行うこ
とも可能である。また、上記の不斉還元反応を行
う際、エネルギー源として、反応液にグルコー
ス、シユクロース等を数％〜10％程度添加するこ
とにより酵素活性の維持等を行うこともできる。
また微生物の培養中にγ−ハロ−アセト酢酸エス
テルを添加して、培養と酵素反応を同時に行なう
こともできる。反応後、生成したγ−ハロ−β−ヒドロキシ酪
酸エステルは、たとえば遠心分離等による除菌
後、反応液よりクロロホルム、ジエチルエーテル
などを用い抽出した後、シリカゲルカラムクロマ
トグラフイーなど通常の分離操作を行ない、純品
として単離することができる。生成物の光学純度は、光学活性な有機酸（例え
ば、（＋）−ａ−メトキシ−ａ−トリフルオロメチ
ルフエニル酢酸（MTPA）、或いはメントールな
ど）とのエステルを合成し、ジアステレオアイソ
マー化合物とした後、高速液体クロマトグラフイ
ーにより光学異性体を分離、定量して容易に測定
することができる。また更に簡便には、純品の比
旋光度の明らかなγ−ハロ−β−ヒドロキシ酪酸
エステルについては、生成物の比旋光度を求める
ことにより光学純度を知ることができる。〔実施例〕以下に実施例をあげて本発明を説明する。本発
明はもとよりこれに限定されるものではない。基質の製造例１ジケテン45.7ｇを塩化メチレン500mlに溶解後、
内温を−20℃に保つて攪拌しつつ、塩素ガス38.7
ｇを導入吸収させた。ついで、同温度で１時間攪
拌を続けた後、エタノール25.1ｇを注ぎ入れ、室
温で一晩攪拌した。塩化メチレンを減圧下留去
後、残渣を減圧蒸留し、γ−クロロアセト酢酸エ
チル62.3ｇを得た。基質の製造例２ジケテン4.57ｇを塩化メチレン50mlに溶解後、
内温を−20℃に保つて攪拌しつつ、塩素ガス3.87
ｇを導入吸収させた。ついで同温度で１時間攪拌
を続けた後、メタノール1.75ｇを注ぎ入れ、室温
で一晩攪拌した。塩化メチレンを減圧下溜去後、
残渣を減圧蒸溜し、γ−クロロアセト酢酸メチル
4.56ｇを得た。基質の製造例３ジケテン4.57ｇを塩化メチレン50mlに溶解後、
内温を−20℃に保つて攪拌しつつ塩素ガス3.87ｇ
を導入吸収させた。ついで、同温度で１時間攪拌
を続けた後、ｎ−プロピルアルコール3.8ｇを注
ぎ入れ室温で一晩攪拌した。塩化メチレンを減圧
下溜去後、残渣を減圧蒸溜し、γ−クロロアセト
酢酸ｎ−プロピル3.28ｇを得た。基質の製造例４ジケテン22.0ｇを四塩化炭素60mlに溶解後、内
温を約−10℃に保つて攪拌しつつ、臭素42.0ｇを
四塩化炭素20mlに溶かした溶液を滴下した。つい
で同温度で30分間攪拌を続けた後、エタノール
12.2ｇを注ぎ入れ、室温で一晩攪拌した。四塩化
炭素を減圧下留去後、残渣を減圧蒸留し、γ−ブ
ロムアセト酢酸エチル35.1ｇを得た。基質の製造例５アセト酢酸エチル41.2ｇを二硫化炭素80mlに溶
解後、内温を約10℃に保つて攪拌しつつ臭素50.7
ｇを１時間かけて滴下した。ついで室温で約３時
間攪拌を続けた後、二硫化炭素を減圧下留去し
た。残渣を減圧蒸留し、γ−ブロムアセト酢酸エ
チル45.9ｇを得た。実施例１下記組成からなる栄養液体培地を調製し、綿栓
した500ml容肩付フラスコに50mlずつ分注後、120
℃で20分間蒸気殺菌を行なつた。培地組成：ポリペプトン 0.5％（重量％以下同じ）酵母エキス 0.3％粉末麦芽エキス 0.3％グルコース 2.0％（PH6.5）予め、麦汁寒天スラントで30℃、24時間培養し
た表−１に示す酵母を上記栄養液体培地に一白金
耳接種して30℃で22時間好気的に培養を行なつ
た。これらの培養液40mlを用い、遠心分離して得
た生菌体を更に同量の0.9％食塩水で洗浄したの
ち、再び遠心分離して集菌し、洗浄生菌体を得
た。この生菌体に、γ−クロロ−アセト酢酸エチ
ルを3.0％（ｗ／ｖ）含む0.1M−リン酸緩衝液
（PH6.5）4.0mlを加え、よく混合した後、30℃に
て振盪しつつ３時間反応させた。なお対照として
基質溶液に生菌体を加えないものを同様に反応条
件下においた。反応後、反応液全体に10mlのクロ
ロホルムを加え、充分攪拌混合後、クロロホルム
層を分離した。このクロロホルム抽出操作を２回
繰り返し、抽出液を減圧乾固後、再びクロロホル
ムを加え全体量を５mlに調整した。このクロロホ
ルム溶液を用い、ガスクロマトグラフイーにより
生成γ−クロロ−β−ヒドロキシ酪酸エチルを定
量するとともに（測定条件：カラム、
Chromosorb Ｗ（AW−DMCS）H₃PO₄、4.0mm
ID×1.0ｍ；カラム温度、140℃；キヤリアーガ
ス、窒素；検出、FID）旋光度を測定し、比旋光
度を算出した。結果を表−１に示す。

【表】

【表】実施例２ 500ml容肩付フラスコ中に、グルコースを別殺
菌して加えた下記組成より成る栄養液体培地50ml
を調製した。培地組成：グルコース 4.0％酵母エキス 0.3％（NH₄）₂HPO₄ 1.3％ KH₂PO₄ 0.7％ MgSO₄・7H₂O 0.1％微量成分（ZnSO₄・7H₂O 60ppm、FeSO₄・
7H₂O 90ppm、CuSO₄・5H₂O 5ppm、MnSO₄・
4H₂O 10ppm、NaCl 1000ppm）（PH7.2）上記培養フラスコ10本に、それぞれ予め麦汁寒
天スラントで30℃、24時間培養したキヤンデイ
ダ・パラプシロシス IFO 0708（Candida
parapsilosis）を一白金耳接種して30℃で22時間
培養を行なつた。培養液を合せ遠心分離して得た生菌体を0.9％
食塩水で洗浄した後、再び遠心分離して集菌し洗
浄生菌体を得た。この生菌体にγ−クロロ−アセ
ト酢酸エチルを3.0ｇ、およびグルコース2.0ｇを
含む0.1M−リン酸緩衝液（PH6.5）100mlを加え
よく混合した後、30℃にて振盪しつつ18時間反応
させた。反応後、遠心分離して上清を得た後、再
び菌体を同量の0.1M−リン酸緩衝液（PH6.5）で
洗浄、遠心分離して洗浄液を得た。この上清と洗
浄液をあわせ、200mlのクロロホルムを用い抽出
操作を２回繰り返した。抽出クロロホルム相を飽
和食塩水400mlで洗浄した後、無水硫酸ソーダ上
で乾燥し、ついでクロロホルムを減圧下溜去して
油状残渣2.7ｇを得た。こうして得られた残渣を
シリカゲルカラムクロマトグラフイー（カラム：
5.5×30cm、溶出溶媒、ベンゼン：酢酸エチル＝
７：２）により精製して2.3ｇの油状目的物質
（Ｓ）−γ−クロロ−β−ヒドロキシ酪酸エチルを
得た。〔α〕²⁵ _D＝−21.1（ｃ＝1.5、CHCl₂） NMRδppm（CDCl₃）：1.3（3H、ｔ、CH₃）、2.6
（2H、ｄ、CH₂）、3.3（1H、ｄ、OH）、3.6
（2H、ｄ、CH₂）、4.0〜4.4（3H、ｍ、CH＋
CH₂） IRcm^-1（neat）：3450、2970、1720、1370、1300、
1260、1190、1150、1090、1050、1030 なお、（＋）−α−メトキシ−α−トリフルオロ
メチルフエニル酢酸とのジアステレオマーエステ
ルを形成させ高速液体クロマトグラフイーにより
分離・定量するMTPA法（カラム：PARTISIL
−５（5μｍ）、ガスクロ工業株式会社、4.6×250
mm、移動相、ヘキサン−エテル20：１、流速2.0
ml／min）による本品の光学純度は94.7％e.e.で
あつた。実施例３培地組成がポリペプトン0.5％、酵母エキス0.3
％、粉末麦芽エキス0.3％、グルコース2.0％、PH
6.5からなる栄養液体培地を調製し、、綿栓した
500ml容肩付フラスコに50ml分注後、120℃で20分
間蒸気殺菌を行つた。予め、麦汁寒天スラントで
30℃、24時間培養したデイポダスカス・テトラス
ペルマ（Dipodascus tetrasperma）CBS 765.70
を上記栄養液体培地に一白金耳接種して、30℃で
振盪培養しつつ、培養開始後16時間目に、この培
養液に、別殺菌しておいた50％（ｗ／ｖ）グルコ
ース水溶液１mlとγ−クロロ−アセト酢酸エチル
0.5ｇをそれぞれ添加し、培養と酵素反応を同時
に進行させた。その後、６時間おきに２回、グル
コース水溶液１mlとγ−クロロ−アセト酢酸エチ
ル0.5ｇをそれぞれ１回目と同様に添加して28時
間反応を行なわせた。なおその際、培養液のPHが
5.5以下にならないよう10％NaOH水溶液を用い
調整しながら行つた。反応液の抽出、精製は、実
施例２の操作に従い、目的とする油状物質（Ｓ）
−γ−クロロ−β−ヒドロキシ酪酸エチル1.2ｇ
を得た。〔α〕²⁵ _D＝21.0（ｃ＝1.5、CHCl₃） MTPA法による光学純度 94.2％e.e. 実施例４デイポダスカス・テトラスペルマ
（Dipodascus tetrasperma）CBS 765.70を実施
例１と同様に培養し、培養液500mlを得た。この
培養液を遠心分離して得た生菌体にγ−クロロ−
アセト酢酸メチル1.5ｇを含む0.1M−リン酸緩衝
液（PH6.5）50mlを加え混合した後、30℃にて振
盪しつつ５時間反応させた。反応後、遠心分離し
て得た上清をクロロホルム抽出し、抽出クロロホ
ルム相を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ソー
ダ上で乾燥し、ついで減圧下クロロホルムを溜去
して油状残渣1.1ｇを得た。こうして得られた残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフイー（カラ
ム：3.0×30cm、溶出溶媒ベンゼン：酢酸エチル
＝７：２）により精製して0.85ｇの油状目的物質
（Ｓ）−γ−クロロ−β−ヒドロキシ酪酸メチルを
得た。〔α〕²⁵ _D＝−22.3（ｃ＝１、CHCl₃） MTPA法による光学純度 94.9％e.e. 実施例５基質にγ−クロロ−アセト酢酸−ｎ−プロピル
を用い実施例３と同様の操作により（Ｓ）−γ−
クロロ−β−ヒドロキシ酪酸−ｎ−プロピル1.05
ｇを得た。〔α〕²⁵ _D＝−19.8（ｃ＝１、CHCl₃） MTPA法による光学純度 92.1％e.e. 実施例６微生物にキヤンデイダ・パラプシロシス
（Candida parapsilosis）IFO 0708、基質として
γ−ブロム−アセト酢酸エチルを用いたほかは、
実施例３と同様にして目的とする（Ｓ）γ−ブロ
ム−β−ヒドロキシ酪酸エチルを得た。（発明の効果）本発明によれば、従来有効な手段のなかつた光
学活性（Ｓ）−γ−ハロ−ヒドロキシ酪酸エステ
ルを、微生物の有する立体特異的不斉加水分解能
を利用して高純度に製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（）（式中、Ｘは塩素原子、臭素原子またはヨウ素原
子であり、Ｒはアルキル基、アリール基またはそ
れらの置換体である。）で示されるγ−ハロ−アセト酢酸エステルのβ位
カルボニル基に対して、（Ｓ）−立体特異的な不斉
還元能を有するキヤンデイダ（Candida）属、デ
バリオマイセス（Debaryomyces）属、デイポダ
スカス（Dipodascus）属、ハンゼヌラ
（Hansenula）属、ピチア（Pichia）属、サツカ
ロマイセス（Saccharomyces）属、トルロプシ
ス（Torulopsis）属及びトリコスポロン
（Trichosporon）属からなる群から選ばれる酵母
を該γ−ハロ−アセト酢酸エステルに作用させ、
一般式（）（式中、ＸおよびＲは前記に同じ）で示される（Ｓ）−γ−ハロ−β−ヒドロキシ酪
酸エステルに微生物不斉還元することを特徴とす
る（Ｓ）−γ−ハロ−β−ヒドロキシ酪酸エステ
ルの製造法。２Ｒが炭素数１〜４の低級アルキル基である特
許請求の範囲第１項記載の製造法。３Ｘが塩素原子であり、Ｒがエチル基である特
許請求の範囲第１項または第２項記載の製造法。４微生物不斉還元を単離した生菌体を用いて行
う特許請求の範囲第１項ないし第３項いずれかの
項記載の製造法。５培養系にγ−ハロ−アセト酢酸エステルを添
加しつつ、培養と不斉還元を同時に行う特許請求
の範囲第１項ないし第３項いずれかの項記載の製
造法。