JPH04500314A - 動物の体細胞の粒子媒介形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１、請求の範囲第１項記載の方法により、幾分かの体細胞が形質転換されたヒ ト以外の動物。

１２、外来生物物質を生きた動物の体細胞内に導入する方法であって、 該外来生物物質のコピーを、該動物の細胞の寸法に比して極めて小さな寸法の高 密度物質の担体粒子に被覆する工程と、水滴を介して印加される電位の放電によ り蒸発される該水滴の膨張力により該粒子を加速することのできる装置に該被覆 粒子を設置する工程と、 核装置を介して該放電を開始して、該被覆担体粒子を該動物の細胞に向けてまた は該細胞内に加速する工程を含むことを特徴とする上記方法。

１３、該生物物質が遺伝構造である請求の範囲第１２項記載の方法。

１４、該遺伝構造がＤＮＡである請求の範囲第１３項記載の方法。

１５、該遺伝構造がＲＮＡである請求の範囲第１３項記載の方法。

１６、　Ｎ胞の寸法に比して小さな金の粒子を含有する該細胞と、該細胞内で遺 伝子生成物を表現するのに有効なキメラ遺伝子表現構造とを含むヒト以外の動物 。

１７、動物の内部器官の体細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、 外来遺伝子構造のコピーを、形質転換すべき細胞に比して小さな寸法の担体粒子 上に被覆する工程と、但し該外来遺伝子構造は該動物の細胞内で遺伝子生成物を 表現し得るように構成されており、 該動物の内部器官を外科的に露出する工程と、該被覆担体粒子を、該動物の露出 された器官内に物理的に加速する工程と、 該器官を所定の位置において、該動物を外科的に閉じる工程と、 を含む上記方法。

１８、該担体粒子を加速する力が火花ギャップを横切る高電位電源の放電により 供給される請求の範囲第１７項記載の方法。

１９、該内部器官が肝臓である請求の範囲第１７項記載の方法。

２０、該内部器官が筋肉である請求の範囲第１７項記載の方法。

２１、培養中の類器官の形質転換法であって、異種遺伝子構造のコピーを、該形 質転換すべき細胞よりも小さな寸法の担体粒子上に被覆する工程と、但し該異種 遺伝子構造は該類器官の細胞中で遺伝子生成物を表現し得るように構成されてお り、 該被覆粒子を、ターゲットサイトに物理的に加速し得る装置上に該被覆粒子を配 置する工程と、 該類器官を該装置のターゲットサイトに配置する工程と、該担体粒子を、該装置 を使用して該類器官内に加速する工程と、を含む上記方法。

２２、該類器官が哺乳動物の類器官である請求の範囲第２１項記載の方法。

２３、該類器官がヒトの類器官である請求の範囲第２２項記載の方法。

２４、該類器官由来の初代培養物または該類器官に再構成されたものをターゲッ ト細胞として使用する請求の範囲第２１項記載の方法。

２５、動物の体内に異種遺伝物質を導入する方法であって、該動物から組織サン プルを取り出し、該組織サンプルを類器官にまで培養し、請求の範囲第２１項記 載の方法に従って該類器官を遺伝的に形質転換し、次いで該形質転換された類器 官を該動物の体内に戻すことを特徴とする上記方法。

明　細　書 動物の体細胞の粒子媒介形質転換 技術分野 本発明は、一般的に言えば遺伝的形質転換技術に関し、より詳細には動物の非生 殖細胞系列の細胞の遺伝的形質転換計画に関するものである。

発明の背景 動物のゲノムＤＮＡに外来または異種遺伝子を導入することを可能とする、動物 の遺伝子工学に係わる様々な技術が開発されている。従来技術においては、典型 的にはこのような動物の遺伝的形質転換はマイクロインジェクションにより、あ るいはレトロウィルスを基本とする形質転換ベクタの使用により行われ、その効 果は発生における比較的初期の段階の動物胚を遺伝的に形質転換することにある 。この異種ＤＮＡは該動物胚のゲノムに導入され、次いで該胚から生ずる各娘細 胞のゲノムに導入されることになる。

このような遺伝的形質転換により、該挿入ＤＮＡは、全ての細胞中１．．および 生殖細胞系列の即ち該生物の生殖細胞を包含する、得られる全ての生物中に挿入 される。このことは、この形質転換された動物の正常なメンデル様式による子孫 へのこの遺伝形質の移行を保証する。

動物細胞をその場で形質転換して、該動物の生殖細胞系の遺伝子的構造に影響を 与えずに、遺伝子構造を持つ遺伝子生成物を与え得ることが望ましい場合が往々 にしてみられる。特に、ヒトへの応用の際に、このような体細胞形質転換の利用 は、人類の生殖細胞系へのヒトの介入から起こる倫理上のかつ理性上の問題の大 部分を回避する。これらの遺伝子操作された体細胞は、正常な生物学的機能発現 に必要な酵素の不活化または欠如からなる受け継がれた遺伝的疾患を遺伝子的に 修正する能力を与える。このような体細胞、即ち非生殖細胞系細胞の遺伝的形質 転換はいくつかの治療上の応用において望ましいものであり得る。例えば、患者 に対して治療上の有用性をもたらすいくつかの蛋白は厳密なタイムスケジュール にもとづいて定期的に注射しなければならない。しかしながら、この大量の蛋白 の周期的注射をたとえ頻繁に行っても、注射の直後には該蛋白の供給過多となり 、かつ次回の注射の直前には過少供給となり、これは該注射に伴う有害なショッ クおよび次回の注射の直前の治療効率にとっては不十分な供給を結果する。もう ひとつの方法は、該動物およびヒトの体細胞中に所定の蛋白に対する遺伝子を組 み込み、かくして得られる形質転換細胞が生きながらにして一貫した濃度で該治 療用の蛋白を生成するようにすることである。所定のかつ確認し得る平均余命を 有する体細胞、例えば皮膚細胞などに該形質転換細胞を導入することにより、治 療すべき動物およびヒトへの蛋白の投与においては時間的に限りのあるこの種の インビボ治療生産系を生成することが可能である。獣医学的応用において、動物 の改良、治療または疾病予防の目的で、該動物の体細胞部分に一時的ではなく該 動物と共にその平均余命にわたり留まるホルモンまたは他の成長因子または蛋白 を導入することが望ましい場合がある。

培養による動物生体または動物細胞の形質転換を意図する大多数の努力はマイク ロインジェクション法またはレトロウィルス形質転換ベクターの使用に向けられ ているが、本発明による形質転換法で使用する装置は、全く異なる異種ＤＮＡを 形質転換すべき体細胞のゲノムに形質転換する方法論にもとづいている。従来技 術の装置においては、本発明の装置の現在の使用を特に適したものとする特徴の 幾つかを含む一つの示唆がある。クライン（Ｋｌｅｉｎ）等（Ｎａｔｕｒｅ、　 １９８７．３２７．　ＰＰ、　７Ｏ−７３）が述べているように、ＤＮＡを担持 する極めて小さな金属粒子の加速装置が、培養中の植物細胞の形質転換に有効で あることが立証された。この形質転換ＤＮＡは物理的に加速された極めて小さな 粒子上に被覆されて、実際に弾道状発射体として形質転換すべき組織内に打ち込 まれる。この装置が、培養中の植物細胞の形質転換において有用であることが立 証されてはいるが、該粒子の衝撃力の調節可能性に欠け、このこまは、形質転換 すべきａｉｓに該粒子を挿入するための広範囲のエネルギ゛−に渡る該装置の生 物の形質転換への使用を困難にするという欠点を構成する。

発明の概要 本発明は、インビボで動物の体細胞を形質転換する方法を提供することを目的き し、該方法では、該動物の体細胞中で表現しようとする蛋白をコードする外来Ｄ ＮＡを、該動物細胞中にその生物学的機能を破壊せずに導入するのに十分率さな 寸法を有する小さな微粒子上に被覆し、動物をターゲ７）位置に置き、該粒子を 調節可能な放電により加速して、該粒子を該ターゲットに向けて加速１２、かつ 該ターゲット動物の細胞に該粒子を打ち込み、かくしてこのように処理した該細 胞の一部を遺伝的に形質転換し、インビボで該動物中の多数の細胞を形質転換し て、該外来遺伝子でコードされた蛋白を生成する。

本発明のもうひ・七つの目的は、動物を外来遺伝子で処理しで、表現外来遺伝子 構造−−該遺伝子構造を該動物細胞中に持ち込むための極めて小さな金属物質の 粒子とを該動物の体細胞中に含ましめた該動物を提供することにある。

更に別の本発明の目的は、動物体の表皮細胞を形質転換して、該表皮細胞が通常 の生物学的様式で脱落するまでの限られた時間に渡り該動物中で蛋白を生成する 方法を提供することにある。

本発明の他の目的、利点および特徴は、添付図面を参照して記載される以下の明 細書の記述から明らがとなろう。

図面の簡単な説明 第１図は本発明の方法を実施するために使用する装置の分解斜視図であり、 第２図は第１図の装置の放電室の平面図である。

好ましい態様の説明 本発明は動物または人類の体細胞の形質転換を目的きする。ここで使用する「体 細胞」なる用語は、形質転換された場合に、該生物の全ての生殖細胞が遺伝的特 性または構成に変化を受けず、従って該動物またはヒトの正常な生物学的生殖の 様式に従って生殖を行った場合に、該導入された外来遺伝子物質が該生物の生物 学的子孫には移行されないような、動物または人類のこの種の細胞を意味する。

形質転換された動物の体細胞は該ターゲット動物の任意の型の適当な組織であり 得る。好ましいターゲット組織は皮膚、筋肉組織および内部器官の組織を包含し 、その全てがインビボで形質転換し得る。該動物中で通常露出していない組織の 体細胞、即ち内部器官は簡単な形質転換手続きのために一時的に外科手術により 露出させることが可能である。体細胞形質転換に適したターゲット器官は肝臓、 膵臓、膵臓、心臓、腎臓、脳、骨髄、乳腺、生殖器官、胸腺および胃腸管などを も包含する。他の組の適当な動物体細胞は以下のものを包含する。

（］）ヒトまたは動物から新たに単離した細胞、（２＞　（１）に記載の細胞で あって、後に短時間にわたり（数分から４週間）培地中で培養または処理したも の（これらは、特に初代培養物と呼ばれる）、および （３）長期間←−・箇月乃至数年）培養により育成した細胞。

このような細胞は形質転換後練動物中に再導入できる。このようなインビボでの 動物細胞培養の有利な形式は類器官培養と言われる。類器官とは、インビトロ培 養で生成でき、かつ生きた動物中に再度外科的に導入できる、細胞クラスタの器 官状の構造または組織である。このような類器官培養は哺乳類において有効に利 用され、ヒトでは遺伝療法および他の治療上の用途において、形質転換された体 細胞を患者に戻すのに有効である。

本発明は外来遺伝子構造、しばし７ばキメラ遺伝子構造を動物の体細胞に導入す ることを目的とする。このような外来遺伝子構造は種が同一もしくは異なってい る、他の生物のＤＮＡからなり、これは人為的処置を介して形質転換すべき生物 中に、該形質転換すべき生物の細胞中に人工的に導入するなどにより導入される 。

この外来遺伝子構造は、通常転写生成物または対象とする蛋白のコード配列を、 近接調節配列と共に含む。後者は生物の該形質転換細胞の該コード配列によりコ ードされた該蛋白または転写生成物の表現を生ずるのに有効である。近接調節配 列は、例えば転写を開始するのに十分なプロモータ配列および転写または翻訳の 終止のいずれであれ、該遺伝子によりコードされた該遺伝子生成物を終止するの に十分なターミネータ配列である。翻訳欠損の適当な転写エンハンサを該外来遺 伝子構造に誘発して、全体としての転写過程の効率を更に助長することができ、 かつ該蛋白の表現は形質転換された細胞を与える。蛋白以外の遺伝子生成物も該 挿入された遺伝子構成により表現することもできる。例えば、この挿入された構 造は、元の遺伝子の表現を抑え、もしくは病理的疾患を阻害するのに有効な負の ＲＮＡストランドを表現できる。この挿入された構造は、該遺伝生成物の一過性 の表現のみが所望である場合には、それ自体ＤＮＡに代わるものとしてのＲＮＡ である。

本発明では、特別に小さな粒子に被覆したＤＮＡを物理的に加速して、動物体細 胞中に挿入するための調節可能な放電を利用する装置を使用する。本発明で使用 するのに適した装置は第１図に示されている。この装置は火花放電室１２からな り、該火花放電室には２つの電極１４が挿入されており、該電極は約１．−２　 ｍｍの間隔で隔置されている。この火花放電室は上方端部における２つの開口１ ６と１８とを有する水平に伸びた矩形のものである。開口１８はアクセス板２０ により閉じられている。電極１４の反対側に位置する他の開口はキャリヤシート ２２により閉じられるようになっている。

電極１４は適当な放電電位の調節可能な電源に接続されている。このような放電 電位の電源は、好ましくは１〜２μＦのキャパシタに接続された適当な電気スイ ッチを含んでおり、該キャパシタに導入される電荷の電位の量は、例えば単巻変 圧器の使用により、例えば１〜５０．０ＯＯＶの範囲内で調節可能である。適当 なスイッチは、該キャパシタが使用者により安全かつ有利に電極１４を介して放 電し得るように与えられる。

該キャリヤシート２２は火花放電室１２０開口Ｉ８上に配置されるようになって おり、好ましくはアルミ鍍金したサラン被覆マイラーのシートである。該火花放 電室の開口の上方には、保持スクリーン２４がその上方約５〜１０ｍｍの位置に 配置されている。該保持スクリーンの上方約５〜２５ｍｍにはターゲット表面２ ６が配置されている。

その使用に際して、動物の体細胞内に形質転換しようとする外来異質遺伝子構造 を、当業者には周知の適当なりＮＡ調製法により調製し、金などの耐性材料の小 さな粒子上で乾燥する。この粒子は典型的には１〜３μの寸法を有している。上 部に乾燥されたＤＮＡを有するこの担体粒子は次いで該キャリヤシート２２上に 置かれ、該シートは該火花放電室１２の頂部に挿入される。ターゲット組織、例 えば生きたまたは麻酔された動物を次に該ターゲット表面２６に近接して配置す る。次いで、水の小滴（寸法的２〜４μりを該電極１４の両端を橋絡するように 配置する。アクセス板カバー２０を、次いで該火花放電室１２の頂部上に置く。

この時点で、該キャリヤシート２２と該ターゲットとの間の雰囲気は、該装置お よび該ターゲットを包囲し、かつ該雰囲気ガスの大部分を置き換えるのに十分な 量のヘリウムを該囲い内に導入することにより、その大部分をヘリウムで置換す る。

この時点で、該電極間での火花放電を、適当な電気スイッチの使用により開始し 得る。この電気放電の力は該電極間の該火花放電を橋絡し、これらの間に置かれ た水の小滴は瞬間的に蒸発する。

この水の蒸発力は該火花放電室１２内に衝撃波を生じ、外側のあらゆる方向に放 射される。この衝撃波の該キャリヤシート２２に与える衝撃は、該キャリヤシー ト２２を大きな速度で上方に推進する。

この上方に移動するキャリヤシート２２は保持スクリーン２４と接触するまで上 方に加速される。ヘリウムの存在は該キャリヤシートから逃散する薬剤を少なく し、同様にターゲットまで伝播する衝撃波の力を小さくする。保持スクリーン２ ４の位置において、キャリヤシート２２は保持され、かつ予めＤＮＡで被覆され た粒子は該キャリヤシートから飛び出して該ターゲット表面を自由に移動する。

かくして、該粒子は該ターゲット表面を突き抜けて該ターゲット細胞内に侵入す る。該粒子が該ターゲット生物または組織の表面に衝撃を与えた際の、該粒子の 運動量は電極１４に印加された初期放電電位にもとづいて調節することができる 。かくして、該電極１４を通しての電気エネルギーの放出量の変動により、該粒 子が該ターゲットに衝撃を与える速度は調節でき、即ちターゲットの組織内への 該粒子の侵入深度は、該電極１４全体にわたる放電の調節範囲に渡り連続的に調 節できる。

第１図の装置は、培養中の細胞塊および全成長生物を含む様々な形態の分化また は未分化の組織の形質転換に有用であることが既に立証されている。ここで議論 する研究を通して、該装置は同様に培養中の動物細胞の形質転換または動物の体 組織の形質転換のいずれに対しても適していることがわかった。細胞を形質転換 しようきする場合、逆転させることができ、かつ第１図の装置における該ターゲ ット表面２６として利用し得るベトリ皿または他の手段に、該細胞を配置するこ とができる。また、動物の種および型に応じて該動物を麻酔し、次いでターゲッ ト表面として機能することになる平坦な表面に設けた穴に該麻酔した動物を配置 することにより、該動物の一部分のみを形質転換することも可能である。ターゲ ット表面２６中の穴を介して露出した該動物の部分がこの形質転換法により形質 転換されるターゲット組織となる。

実施例 ａ）使用するベクター 以下の例では動物内に酵素、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ 、を表現するように構築された一対のキメラ表現ベクターを使用し、該酵素は該 抗生物質クロラムフェニコール耐性を付与する。これらいずれのキメラ遺伝子表 現プラスミドも動物の形質転換において有効であることが既に記載され、かつ立 証されている。プラスミドｐｓＶ２ｃａｔはゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）等の論文 （Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｏｉｌ、、　１９８２．２　、　ｐ９．１０４４−１ ０５１）に記載されており、表現ベクターｐＲＳＶｃａｔはウォーカー（Ｉｌａ ｌｋｅｒ）等の論文（Ｎａｔｕｒｅ、　１９８３．３０６．　ＰＩＴ、　５５７ −５６１）に記載されている。このプラスミドｐＳＶ２ｃａｔはシミアンウィル ス４０（ＳＶ　４０）初期プロモータ、プラスミドｐＢＲ３２２−Ｔｎ９からの 該クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード領域、ＳＶ４０　を −抗原イントロンおよびｐＢＲ３２２ベクターの担持するＳＶ　４０初期ポリア デニル化領域を含むキメラｃａｔ遺伝子構造にある。

このプラスミドは完全なＳＶ　４０ウイルスゲノムを含んでおらず、かつ感染性 ではない。該プラスミドｐＲＳＶｃａｔはｐＢＲ３２２の基本プラスミドでもあ り、該プラスミドはキメララウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）の長い末端繰り返しお よびプロモータフラグメント、Ｔｎ９からのｃａｔコード領域、マウスβ−グロ ブリン遺伝子およびＳＶ４０初期転写単位のポリアデニル化領域を含む。このプ ラスミドもウィルスゲノムを含んでおらず、かつ感染性ではない。

同様に使用される関連プラスミドはｐＲｓｖＮＰＴＩ　Ｉと記述され、ラウス肉 腫ウィルスプロモータ、ネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼ−ＩＩ遺伝 子のコード領域、抗生物質カナマイシンおよびＧ４１８をコードする領域、およ びＳＶ４０からのポリアデニル化領域を含む。このプラスミドもウィルスゲノム を含んでおらず、かつ感染性ではない。

ｂ）培養中の哺乳類（ヒト）の細胞 ヒト乳腺の上皮細胞由来のＭＣＰ−７と呼ばれるセルラインを得た。このセルラ インを、１０％の子牛血清を補充したＲＰＭＩ成長培地によりインビトロで増殖 させた。次いで、このセルラインの細胞を３５ｍｍの培養物となるようにカバー グラス（２Ｘ２ｃ＋＋ｆ）上に塗布し、８０％の密集率となるまで育成して、カ バーグラス当たり約５Ｘ１０’個の細胞を得た。

次いで、カバープレート上の細胞の単層をプラスミドｐＲｓＶＮＰＴｌｌおよび 第１図および第２図に示した形質転換装置を使用した放電粒子−媒介形質転換に より形質転換した。このＤＮＡは、全結晶ビーズ上に、全結晶ビーズ１ｍｇ当た りＤＮＡ０．５μｇなる密度で被覆した。この装置は０（コントロール：加速粒 子なし）、６および８ＫＶなる火花放電レベルで操作した。

この形質転換操作後、該細胞を培地に戻し、標準的条件下、即ち選択することな しに、２日間育成した。この期間中、細胞の成長を顕微鏡で観察したところ、正 常であることが分かった。

２日後、トリプシンを該細胞培養物に適用して、該カバープレートから該細胞を 分離し、かつ該細胞を７２５培養フラスコに塗布した。この培地に、選択剤とし て６４１８を２５０μｇ７ｍｌの濃度で添加した。該トリプシン処理した細胞の ５０％〜７０％が該フラスコのプラスチック培養基板に付着し、１時間以内に該 表面に広がり、これらの細胞が依然として生きていることを示した。

この細胞を選択条件下で３週間生育させた。大多数の細胞が始めの一週間以内に 死滅することが観測された。

３週間経過時点で、クラスタ状の５０〜５．０００細胞からなる各細胞コロニー がこの形質転換された細胞培養物中に観測された。

形質転換処理には掛けられていないが、６４１８選択挫作には掛けられたコント 「】−小細胞培養物中には何等生きたコロ；−一は観察ｉ″！れなかっｌ’−ｎ 次いで、この形質転換された培養物を更に３週間選択冬（′１下に維持ｊ１．た 後、Ｊ　Ｕ　：−−一数を計数した１、選択培地中で６週間培養した後に、該形 質転換−」ロニ−を１−リグシン処理し、プールし、かつＴ　２５培地に塗布し た。細胞は、−の選択培地中で生育し続けた。形質転換後１０週間目に約２千万 の細胞が各形質転換培養物から生成し２かくして安定に該形質転換さｔ’ｉた肛 ドア細胞が原培養物として連続的に生育できた。

６週間目のコ）に一計数の結果を、テスト・シた該形質転換条件下での形質転換 頻度の評価のために利用１．た。結果は以下の通りであった。

形質転換工程条件　耐性：］　Ｄ　＝　−１０，５Ｘ　１０’細胞０（形質転換 せず）　０ この結果は、該形質転換工程に掛けた細胞に対１−で、約５．２〜６．４　Ｘ　 １０−’細胞の範囲内の形質転換頻度が達成されたことを示している。

Ｃ）インビボでの補乳類体細胞 マウスをクロ【】ホルムで麻酔した。各マウスの毛を剃って、その側部に約ｌｅ ｄの領域を形成した。次に、このマウスを、窓を設けたべ１−り皿上に、その尼 を剃った部分が該窓にくるようにして配置した。

次いで、ｐＲ３Ｖｃａ、ｔのＤさＩＡを・１　＝−３μの金粒子に、咳金粒子ｌ 閂当たりＤＮＡ０１１．１．ｇなろ割合で被覆した。該ＤＮＡは６％ポリエチＴ ノングリコール（ｍ、　ｖ、　＝３．０００）を含み、かつ最終、濃度が０．６ ＭとなるようにＣａ口、４添加した２５ｍ＋Ｍのスペア１ベジンで沈澱させるこ とにより該金粒−３＝１−！、Ｚ被覆した。このＤＮＡ被覆被覆−ビーズに１０ ０％エタ、ノール中で洗浄し、１タノール懸濁液としてキャリヤシー１−１ｒｆ ｆｌ当たり乾燥金ビーズ０．０５＋＋ｔｇなる濃度で該キャリヤシートに適用し た。

該マウスを配置した咳べＩ・り皿を、ターゲット表面とし２て、第１図および第 ２図に示し５た装置に設置した。電気火花放電に先立って、該キャリヤシートと 該ターゲットとの間の領域を１５５秒間ベリラムフラッシングして該キャリヤシ ート上の大気超厚の薬物および起こり得るあらゆる該動物に対する衝撃波損傷を 減じた。

この形質転換処理後、該動物は全て害を受けておらず、かつ完全に回復したよう に見えた。いかなる種類の傷も出血も見られなかった。２４時間後、該マウスを 層殺し、該皮膚部分を取り出し、ｃａｔ活性につき検定した。この検定は、アセ チル化活性をテストするこ吉により実施し、その際ＣＩ４による放射性標識を利 用した。かくして、このＴセチル化生成物の放射性崩壊を形質転換された酵素の 尺度として利用することができる。

種々の放電レベルで行ったテストおよび使用したコントロールのテスト結果は以 下に記載の通りである。

電圧：　１２ＫＶ；　ｌ　μｍ６，６８６　４．４　３７９２電圧：１６にｖ； １μ　６，２８１　５．６　１１２１電圧：１２にν；１μ　１５．９３７　５ ．６　２８５４電ＪＪＥ：　１２ＫＶ；　ｌ　ｕ　１４，９６９　３．５　４２ ７６ＤＮＡなしくコントロール＞１１９５゜６２１これらの結果はｃａｔ活性が バックグラウンドレベルの少なくとも１００倍であることを示している。かくし て、該動物に何等害および損傷を与えることなしにその体細胞内に異種遺伝子が 導入され、表現された。

ｄ）インビボでの両種類の体細胞 蛙（ツ〆ガエル）を４℃まで冷却することにより麻酔し、この冷却蛙を、ペトリ 皿に形成した窓の部分に配置し２、これを第１図１５よび第２図に示した形質転 換装置内に、マウスの場合と同じ様式で入れた。

マウスに対して使用した条件および手順を、以下の点を除いて、繰り返し、た。

使用し７たＤＮＡはｐＳν２ｃａ　ｔであった。この［）ＮＡで被覆した金ビー ズを０．１ｍｇ／ｃａｔなる密度でキャリヤシートに載せた。

この場合にも、形質転換工程の後、該動物は全く害されるこ乏はなか、った。ま た、該動物には傷も出血も見られなかった。

２４時間後、この蛙を殺し、形質転換した１ｃｄの部分を取り出し、虱活性につ き検定した。この結果を以下の表に纏めた。

電圧：　１６ＫＶ　（背部）　１７．５７０　４．０　４３９２コントロール（ 腹部’）　１５３　１．４　１０９コントロール（背部）　１４５　４．１．　 ３２かくして、本例ではｃａ、を活性のレベルがバックグラウンドレベルの少な くとも５０倍を越えることが観測された。かくして、異種遺伝子の導入および表 現が、該動物に認識し得る程の損傷または傷害を与えることなく、体細胞内で起 こった。

ｅ）インビボでの両種類の体細胞−全身処理した生成物ツメガエルに関する第２ の実験では、上記と同様な条件下で、但し同一の蛙に２回（背部に電圧１６ＫＶ でおよび腹部に１２ＫＶで）形質転換を行った。この場合、０．１■／ＣＩｌ＋ なる密度の代わりに僅かに０．０５■／ＣＩｌ＋の密度のＤＮＡ被覆被覆−ビー ズ用した。この畦を２０時間後に殺し、形質転換された皮膚の部分を採取した。

更に、形質転換されていない皮膚の部分（噴射の際に遮蔽した）をもｃａｔ活性 検定のために採取した。得られた結果を以下の表に纏めた。

電圧：　１２ＫＶ　（腹部）　２．０８５　７．５　２７８電圧＝１６にＶ（背 部）　９．３４３　８．６　１０８６該形質転換した皮膚部分の全活性は低いビ ーズの担持密度の故に減少したが、非形質転換皮膚サンプルは明らかに前の実験 と同様に非形質転換動物の皮膚の少なくとも２倍の評価を与えた。このこきは、 該形質転換された皮膚部分における生産された酵素の全身的蓄積を示している。

ｆ）インビボ形質転換 ホルッマン（Ｈｏｌｔｚｍａｎ）ラットを麻酔にがけた。この麻酔にかけたラッ トの腹腔を外科的に開いて、該動物の肝臓を露出させた。かくして露出した肝臓 をもつこの生きた動物を次に粒子−媒介形質転換工程にかけた。ここで、該動物 はその露出した肝臓がターゲット表面２６となるように、第１図および第２図に 示した装置に設置した。

このラット肝臓の形質転換工程において使用したＤＮＡは、金粒子に１μｇ／ｍ ｇの割合で被覆したｐＲ３Ｖｃａｔであった。この被覆は２０ｕｇのＤＮＡを１ ００μｆの緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ；　１０ｍＭのＴｒｉｓ；　ｐＨ８， ０）　、５０ｔｔ１１のＣａＣｌ２（２，５Ｍ）および２０ｍｇの寸法１μの金 粒子を併合することにより行った。次に、この混合物を遠心分離し、乾燥し、キ ャリヤシートに担持する前にエタノール中に再度懸濁させた。該キャリヤシート 上での担持率は乾燥金粒子基準で０．０５　ｍｇ／　ｃｒｊであった。

該キャリヤシートを所定の場所に配置した後、かつ該ラットをその器官を露出し た状態で所定の位置に配置した後、該粒子の移動する領域に大気圧下で２ｊ！／ ｍｉｎのヘリウムを流した。真空封止は何等行わなかった。該ラットの肝臓を１ ０および１４ＫＶの火花放電電位にて形質転換操作にかけた。

付着している肝臓は摘出せず、露出させただけである。次に、このラットの腹腔 を縫合により閉じた。該動物を該外科手術および形質転換手続きから回収した。

術後の動物の肝臓からの出血は全く見られなかった。

２日後、この動物を殺し、かつ該肝臓を摘出した。この摘出した肝臓組織をｃａ ｔ活性につき分析した。該金粒子は該肝臓組織の深さ３００μまで侵入している ことがわかった。

触媒作用を受けた基質の割合および旦活性の規定された標準単位の割合として示 したｃａｔ活性のレベルにより、上記の手続きの結果を以下に纏めた。

肝臓（電圧：　ｌ０ＫＶ）　２．６　１．３８肝！ｉｌ　（を圧：　１４ＫＶ） 　２．２　１．０６１　ＣＡＴ　１１位３７．６　１単位（定ＩＩ）肝臓以外に 、マウスの腹筋組織をも肝臓につき上記したのと同様に遺伝子転移のために処理 した。結果は以下に示す通りである。

サンプル　転化率（％）　ＣＡＴ単位（活性／ｍｇ蛋白）筋肉−１（電圧：　１ ５ＫＶ）　１．５　０．７筋肉−２（電圧：　１５ＫＶ）　０．９４　０．３４ １　ＣＡＴ単位　３３　１単位（定義）かくして、これらの実施例は、本発明の 形質転換技術により、インビボおよびその場での内部器官の一部として存在する 体細胞の形質転換を実施し得ることを立証している。この形質転換遺伝子の一時 的活性は少なくとも１〜４週間に及ぶことが期待され、かつ数箇月に及ぶより低 いレベルでの安定な表現も達成し得る。

ｇ）類器官の形質転換 類器官はインビトロで培養された器官−状の細胞のクラスタまたは組織であり、 これは動物器官から単離し、次いで組織培養処理することにより、あるいは予め インビトロで培養した哺乳類細胞の初代培養により得られる。類器官は体細胞形 質転換用の興味ある対象である。と言うのは、これらが生きた哺乳動物に再度移 植した際に、生存性および血管形成能を維持していることが以前に立証されてい るからである。

類器官を生成するために、組織サンプルを雌ラットの乳腺組織から、０．２〜０ ．４−のクランプ（ｃｌｕｍｐ）として外科的に摘出した。この組織をビーカー 内の哺乳動物組織用培地（ＲＰＭＩ；１０％子牛血清；および成長因子（例えば 、インシュリン）を含む）に添加した。この培地に、更に「支質」組織を消化し て、管状構造としての乳腺を除去するために、コラ−ゲナーゼおよびヒアルロニ ダーゼ酵素を添加した。得られた培養物を遠心分離し、次いでナイロンメツシュ を通して篩分けして、０．１〜１．０ｍｍの乳腺類器官を、より小さな（５〜３ ０μ）繊維芽細胞および他の型の細胞から分離した。

新たに単離したラットの乳腺からの約１００の類器官をピペットで３５１ｎＩＩ ＋の皿に分取した。過剰の培地を除去した。該皿内の該類器官を、β−ガラクト シダーゼ遺伝子（クローンチック（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ））に接合したマウス組織 特異的プロモータであるｐＲ５ＶｃａｔまたはＭＭ’１ＶＬＴＲ−Ｂ−Ｇａｌ　 （Ｄイずれかを使用して、１５ＫＶｌ：で形質転換処理に付した。

次いで、培地を該類器官と共に該皿に戻した。更に、該類器官を２日間培養した が、その問いくらかの類器官は利用し得る基質に付着したが、残りの類器官は自 由に浮遊していた。次に、この類器官を収穫し、適当にＣＡＴまたはＢ−Ｇａ　 １活性を検定した。

これらの付着したおよび浮遊していた両方の型の類器官は明らかにＣＡＴ活性を 示した。同様な結果はＢ−Ｇａｌ活性の検定からも観察された。

この手続きをラット乳腺（類器官）の上皮細胞の５日−齢の初代培養物について も実施した。該細胞は電圧３ＫＶ、６ＫＶ、１２ＫＶおよび１５ＫＶにて、ｐＲ ＳＶＣＡＴを使用して形質転換した。形質転換後の培養の３日目に該類器官を検 定した。全ての電位レベルにおいて、形質転換活性が見られたが、３ＫＶでは明 らかに量的に劣っていた。

ヒト乳腺上皮細胞初代培養物を使用した同様な複製を８ＫＶおよびｌ０ＫＶにて 、ｐＲＳＶＣＡＴを使用して実施した。同様に培養の２日後に検定を実施したと ころ、ＣＡＴ活性がみられた。

同様な類型官のＭＭＴＶ−Ｂ−Ｇａｌを使用した同様な形質転換プ】′Ｖら、− ・時的に形質転換された細胞の割合の近似をめることができた。該う・ノ１の乳 腺」−皮細胞は約５％がＢ−Ｇａ　Ｉを表現した。、初代培養物中のヒト乳腺上 皮細胞は約３％が正の１（０ａ　ｌ活性を示すこ乏が検定により分か−、た。ヒ １−乳腺癌・Ｄ」・ルライン（ＭＣＦ−７）を使用しまた場合には、約５％の該 細胞が形質転換されＣいた。Ｂ−Ｇａｌを表現するのにより強力なブ［！モータ （ザ、イトメガロウ・１ルス：　ＣＭＶ＞を使用した場合には、２０〜３５％の 細胞がＢ−Ｇａｉ活性を示すごとが分かった。

このことは、類型官がこの粒子−媒介形質転換法に極めて敏感で“あるこ々を立 証している。この証拠４基にし７丁、他の型の組織または器官（例えば、肝臓） からのオルガノイドが同様に形質転換５■能であるものと予想することは論理的 に妥当である。

該形質転換された類型官は生存性を維持しており、かつ動物内に再度移植して、 形質転換遺伝子の利点を得ることが可能である。同様なｆ順は他の再移植可能な 組織に対しても利用できる。

ｈ）初代細胞培養 ラットの乳腺類器官を、子牛血清、イン′／；、リンおよび上皮成長因」：を含 むＲＰＭＩ培地に塗ｎｉ　Ｌだ。３〜１０日後、該類型１イの１−４皮および部 上皮細胞を、単層培地で生育中の該基質１−に展開した。これらの初代培養物を 、トリプシンで処理し７、かつ新たな皿に再付着させることにより、３〜４回継 代培養した。

初代培養ご増殖させたう７）の乳腺」−皮細胞４　ｐＲｓＶｃＡＴを用いて；う 、６．８．１２および１５にｖニテ、およびＭＭＴＶ−Ｂ−Ｇａ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　 Ａを使用Ｌ７”〔８およびＩＯＫνにて形質転換処理した。該形質転換の前に該 培地を取り出し、その後置換した。この処理した細胞を２〜３日間不変の条件下 で培養し、次いで検定した。３〜１５ＫＶの放電電位の下で形質転換ｊ−だ細胞 は高レベルのＣＡＴ活性を１ミし、またＢ−Ｇａｌ検定は、集団中の３へ一５％ の学−細胞がＢ−Ｇａｌを表現するこ・とを示（７た。

このことは、哺乳動物細胞の初代細胞培養がこれらの手続きにより容易に形質転 換（−得るこＬを１でしている１、このよ・プな初代細胞培養が様々な臨床的応 用と１．て掛案されているので、このような応用においては、所定の異種蛋白の トランスジェニックな表現をも含めることが今や可能である。

本発明は上記の特定の態様または実施例により何隻制限されず、以下の請求の範 囲に含まれるこれらの態様または実施例のあらゆる改良をも包含する。

国際調査報告 、、、、　、、　、、　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０３５２２ｌ＋１＋＋ｌＡ　、　 ＋ｉ＋Ｎ＋　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０３５２２国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．動物の体細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、該動物の細胞内で遺伝 子生成物を表現し得るように構築された外来遺伝子構造のコピーを、該動物の細 胞の寸法に比して極めて小さな寸法の高密度物質の担体粒子に被覆する工程と、 平坦なキャリヤシート上に該被覆担体粒子を層状に展開する工程と、 該キャリャシートを火花放電室に設置する工程と、隔置された一対の電極の端部 間に、該電極間のギャップを橋絡するように水滴を配置する工程と、 該動物細胞を該キャリヤシートの移動する方向に設置する工程と、 電弧が該電極間のギャップを橋絡するように、高電位電源の放電を開始し、該水 溜を蒸発させ、かつ該キャリヤシートを該動物細胞の方向に加速して、該キャリ ヤシートが該動物細胞を打撃するのを回避するが、該担体粒子を該動物細胞内に 侵入せしめ、該担体粒子が該動物細胞を打撃する力は、該電極に印加される該高 電位電源の電圧を調節することにより、該外来遺伝子構造が該動物細胞中に導入 され、一方で該細胞の損傷が最小限度となるように、調節可能であることを特徴 とする上記遺伝的形質転換法。
2. ２．該外来遺伝子構造が蛋白をコードするＤＮＡ配列および該動物細胞内で該蛋 白を表現するのに有効な近接調節配列を含む請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該外来遺伝子構造が、該動物細胞内で負のＲＮＡストランドを表現し、在来 の遺伝子の表現を阻止し、あるいは疾病の進行を阻止するのに有効なＤＮＡ配列 である請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．該動物細胞が、該動物の体外で培養されたものである請求の範囲第１項記載 の方法。
5. ５．該動物細胞が生きた動物中でインビボ状態にあり、かつ該生きた動物全体が 該キャリヤシートの移動方向に配置されている請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．形質転換される該動物細胞が該動物の皮膚にある請求の範囲第５項記載の方 法。
7. ７．保持スクリーンが該火花放電室と該動物細胞との間に配置されていて、該キ ャリヤシートが該動物細胞に向けて加速された後に該シートを保持する請求の範 囲第１項記載の方法。
8. ８．更に、該放電を開始する工程に先立って、該火花放電室と該動物細胞との間 の領域にヘリウムガスを導入する工程を含む請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．該担体粒子が１〜３μの金粒子である請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．請求の範囲第１項記載の方法により形質転換されたヒト以外の動物の体細 胞。
11. １１．請求の範囲第１項記載の方法により、幾分かの体細胞が形質転換されたヒ ト以外の動物。
12. １２．外来生物物質を生きた動物の体細胞内に導入する方法であって、 該外来生物物質のコピーを、該動物の細胞の寸法に比して極めて小さな寸法の高 密度物質の担体粒子に被覆する工程と、水滴を介して印加される電位の放電によ り蒸発される該水滴の膨張力により該粒子を加速することのできる装置に該被覆 粒子を設置する工程と、 該装置を介して該放電を開始して、該被覆担体粒子を該動物の細胞に向けてまた は該細胞内に加速する工程を含むことを特徴とする上記方法。
13. １３．該生物物質が遺伝構造である請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．該遺伝構造がＤＮＡである請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．該遺伝構造がＲＮＡである請求の範囲第１３項記載の方法。
16. １６．細胞の寸法に比して小さな金の粒子を含有する該細胞と、該細胞内で遺伝 子生成物を表現するのに有効なキメラ遺伝子表現構造とを含むヒト以外の動物。
17. １７．動物の内部器官の体細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、 外来遺伝子構造のコピーを、形質転換すべき細胞に比して小さな寸法の担体粒子 上に被覆する工程と、但し該外来遺伝子構造は該動物の細胞内で遺伝子生成物を 表現し得るように構成されており、 該動物の内部器官を外科的に露出する工程と、該被覆担体粒子を、該動物の露出 された器官内に物理的に加速する工程と、 該器官を所定の位置において、該動物を外科的に閉じる工程と、 を含む上記方法。
18. １８．該担体粒子を加速する力が火花ギャップを横切る高電位電源の放電により 供給される請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．該内部器官が肝臓である請求の範囲第１７項記載の方法。
20. ２０．該内部器官が筋肉である請求の範囲第１７項記載の方法。
21. ２１．培養中の類器官の形質転換法であって、異種遺伝子構造のコピーを、該形 質転換すべき細胞よりも小さな寸法の担体粒子上に被覆する工程と、値し該異種 遺伝子構造は該類器官の細胞中で遺伝子生成物を表現し得るように構成されてお り、 該被覆粒子を、ターゲットサイトに物理的に加速し得る装置上に該被覆粒子を配 置する工程と、 該類器官を該装置のターゲットサイトに配置する工程と、該担体粒子を、該装置 を使用して該類器官内に加速する工程と、を含む上記方法。
22. ２２．該類器官が哺乳動物の類器官である請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．該類器官がヒトの類器官である請求の範囲第２２項記載の方法。
24. ２４．該類器官由来の初代培養物または該類器官に再構成されたものをターゲッ ト細胞として使用する請求の範囲第２１項記載の方法。
25. ２５．動物の体内に異種遺伝物質を導入する方法であって、該動物から組織サン プルを取り出し、該組織サンプルを類器官にまで培養し、請求の範囲第２１項記 載の方法に従って該類器官を遺伝的に形質転換し、次いで該形質転換された類器 官を該動物の体内に戻すことを特徴とする上記方法。