JPH0430791A - 構造蛋白質遺伝子、組換えベクター、組換えウイルス、ポリペプチドおよびポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＣ型肝炎の病因であるＣ型肝炎ウィルス（以下
ＨＣＶと略記する場合がある）の構造蛋白質遺伝子領域
をもとに、Ｃ型肝炎患者血清中に存在するＣ型肝炎ウィ
ルスに対する抗体（抗ＨＣＶ抗体）に対して、抗原性を
有するポリペプチドを製造する方法に関するものであり
、具体的に説明すれば、Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質
遺伝子領域を、バキュロウィルスの多角体蛋白質遺伝子
のプロモーターを含む転移ベクターに挿入して組換え転
移ベクターを調製し、ついで該組換え転移ベクターとバ
キュロウィルスとを昆虫細胞に同時感染導入して、該構
造蛋白質遺伝子領域を含む組換えウィルスを調製し、更
に該組換えウィルスを昆虫細胞あるいは昆虫の幼虫に感
染させて、ポリペプチドを得ることを特徴とするポリペ
プチドの製造方法、およびそのポリペプチドに関し、更
に上記構造蛋白質遺伝子、それを含む組換え転移ベクタ
ーおよび組換えウィルスに関する。

〔従来の技術〕

輸血後非Ａ非Ｂ肝炎を起こした患者の血清をもとに、Ｃ
型肝炎ウィルスの遺伝子の一部がクローニングされ、こ
れが米国カイロン社のホートンらによりサイエンスに報
告された［５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ。

２４４、　ｐｐ３５９−３６２．　（１９８９）、　１
゜更に、彼らはＣ型肝炎ウィルスの非構造蛋白質領域を
コードする遺伝子の一部を、酵母の発現ベクターに挿入
し、酵母でこの遺伝子を発現させることに成功した。こ
の方法により生産される非構造蛋白質の一部分は、Ｃ型
肝炎患者血清中に存在する、抗ＨＣＶ抗体に対して抗原
性を有する［Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｖｏｌ、３３５
゜ｐｐ、Ｉ−３，１９９０，１゜この性質により、この
蛋白質はＣ型肝炎の診断用抗原として利用されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

酵母で生産された抗原性蛋白質は、Ｃ型肝炎患者血清中
に存在する抗ＨＣＶ抗体と反応するものの、この抗ＨＣ
Ｖ抗体はＣ型肝炎が発症してなお６力月程度を経て、は
じめて陽性となるものてあることか分かってきた。また
、この抗原を用いて正常人血清あるいはＣ型肝炎患者血
清を試験すると、擬陽性または凝陰性を示す場合がある
ことも分かってきた［Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｖｏｌ
、３３５．　ｐｐ、７５４−７５７゜（１９９０）、お
よび臨床科学、２５巻、７号、８２７ページ、１９９０
年１゜このため、より精度の高い診断が可能となる、新
しい有用な抗原性を有するポリペプチドの開発が求めら
れている。

〔課題を解決するための手段〕

Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウィルスによって引き起こされる
肝炎であり、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎のほとんどは、この肝
炎であるといわれている。そして、その多くは更に肝癌
へと病状か進行する。Ｃ型肝炎ウィルスは遺伝子の長さ
約１０ｋｂ　（１万ヌクレオチド）のＲＮＡウィルスと
考えられ、ワラビウイルスの仲間であると推定されてい
る。このことから考えると、５°末端側から約１．５　
ｋｂ　（約１５００ヌクレオチド）の部分が構造蛋白質
遺伝子部分に相当し、残りが非構造蛋白質遺伝子部分に
相当する。

また約１．５ｋｂの構造蛋白質遺伝子部分は、ワラビウ
イルスの遺伝子構造との比較により、コア蛋白遺伝子領
域（Ｃ）、膜蛋白遺伝子領域（Ｍ）、外皮蛋白遺伝子領
域（Ｅ）の３部分に機能的に分かれるものと考えられて
いる。

Ｃ型肝炎ウィルスの遺伝子の全塩基配列の報告はまだな
いが、非構造蛋白質遺伝子を主体とした配列が、カイロ
ン社によって、ヨーロッパ特許ＥＰ０３１８２１６に報
告されている。

Ｃ型肝炎ウィルスについての総合的な知見はこれまでに
全く得られておらず、こういう状況のもとでは、いかな
る遺伝子領域を、いかなる宿主ベクター系にのせると、
有用な抗原性を有するポリペプチドを、効果的に得られ
るのか全く不明である。我々はこれまでにホートンらに
より利用されてきた非構造蛋白質遺伝子領域ではなく、
新たに構造蛋白質遺伝子領域について、その遺伝子発現
を鋭意研究してきた。その結果、昆虫の宿主ベクータ系
を用いることにより、Ｃ型肝炎患者血清中に存在する抗
ＨＣＶ抗体に対し、特異性の高い有用な抗原性を有する
ポリペプチドを得ることに成功した。

即ち本発明は、次の構成を含むものである。

１、下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＣ
型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子。

ＴｒｐＬｅｕＬｅｕＳｅｒＰｒｏＡｒｇＧｌｙＳｅｒＡ
ｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＧＩｙＰｒ。

ＡｓｎＡｓｐＰｒｏＡｒｇＡｒｇＡｒｇＳｅｒＡｒｇＡ
ｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＶａｌ　ｌ１ｅＡｓ　ｐＴｈｒ
ＬｅｕＴｈｒＣｙｓＧ　１ｙＰｈｅＡ　１ａＡｓ　ｐＬ
ｅｕＭｅ　ｔＧ　１ｙＴｙｒ　Ｉ　ｌｅＰｒｏＬｅｕＶ
ａｌＧｌｙＡｌａＰｒｏＬｅｕＧｌｙＧｌｙＡｌａＡｌ
ａＡｒｇＴｈｒＬｅｕＡｌａＨｉｓＧｌｙＶａｌＡｒｇ
ＶａｌＬｅｕＧＩｕＡｓｐＧｌｙＶａｌＡｓｎＴｙｒＡ
ｌａＴｈｒＧ　１ｙＡｓｎＬｅｕＰｒｏＧ　１ｙｃｙｓ
ｓｅｒＰｈｅｓｅｒ　Ｉ　ｌｅＰｈｅＬｅｕＬｅｕＡｌ
ａＬｅｕＬｅｕＳｅｒＣｙｓＬｅｕＴｈｒｌｌｅＰｒｏ
ＡｌａＳｅｒＡｌａＴｙｒＧｌｕＶａｌＡｒｇＡｓｎＶ
ａｌＳｅｒＧｌｙｌｌｅＴｙｒＨｉｓＶａｌＴｈｒＡｓ
ｎＡｓｐＣｙｓＳｅｒＡｓｎＳｅｒＳｅｒｌｌｅＶａｌ
ＴｙｒＧｌｕＡｌａＡｌａＡｓｐＭｅｔ　ＩｌｅＭｅｔ
ＨｉｓＴｈｒＰｒｏＧｌｙＣｙＳＶａｌＰｒｏＣｙｓＶ
ａｌＡｒｇＧｌｕＳｅｒＡｓｎＰｈｅＳｅｒＡｒｇＣｙ
ｓＴｒｐＶａｌＡｌａＬｅｕＴｈｒＰｒｏＴｈｒＬｅｕ
ＡｌａＡｌａＡｒｇＡｓｎＳｅｒＳｅｒ　Ｉ　１ｅＰｒ
ｏＴｈｒＴｈｒＴｈｒ　Ｉ　ｌ　ｅＡｒｇＡｒｇｌｌ　
ｉ　ｓＶａ　ｌＡｓ　ｐＬｅｕＬｅｕＶａ　ＩＧ　ｌｙ
Ａ　ｌａＡ　１ａＡ　１ａＬｅｕｃｙｓｓｅｒＡ　ｌａ
Ｍｅ　ｔＴｙｒＶａ　ＩＧｌｙＡｓｐＬｅｕＣｙｓＧｌ
ｙＳｅｒＶａｌＰｈｅＬｅｕＶａｌＳｅｒＧｌｎＬｅｕ
ＰｈｅＴｈｒＰｈｅＳｅｒＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒＧ
ｌｕＴｈｒＶａｌＧｌｎＡｓｐＣｙｓＡｓｎＣｙｓＳｅ
ｒｌｌｅＴｙｒＰｒｏＧｌｙＨｉｓＶａｌＳｅｒＧｌｙ
ＨｉｓＡｒｇＭｅｔＡｌａＴ　ｒ　ｐＡｓ　ｐＭｅ　ｔ
Ｍｅ　ｔＭｅ　ｔＡｓｎＴｒ　ｐｓｅｒＰｒｏＴｈｒＴ
ｈｒＡ　１ａＬｅｕＶａ　ｌＶａｌＳｅｒＧｌｎＬｅｕ
ＬｅｕＡｒｇｌｌｅＰｒｏＧｌｎＡＩａＶａｌＶａｌＡ
ｓｐＭｅｔＶａ　ＩＡ　ｌａＧ　ｌ　ｙＡ　１ａｌｌ　
ｉ　５ＴｒｐＧ　Ｉ　ｙＶａ　１ＬｅｕＡ　ｌａＧ　１
ｙＬｅｕＡ　ｌａＴｙｒＴｙｒＳｅｒＭｅｔＶａｌＧＩ
ｙＡｓｎＴｒｐＡｌａＬｙｓＡｌａＰｒｏｌｌｅＶａｌ
ＭｅｔＬｅｕＬｅｕＰｈｅＡ　ｌａＧ　１ｙＶａ　１Ａ
ｓｐＧ　ｌｙＨｉ　５ＴｈｒＨｉ　ｓＶａ　１ＴｈｒＧ
　ｌｙＧｌｙＡｒｇＶａｌＡＩａＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧ
ｌｎＳｅｒＬｅｕＶａｌＳｅｒＴｒｐＬｅｕＳｅｒＧｌ
ｎＧＩｙＰｒｏＳｅｒＧｌｎＬｙｓｌｌｅＧｌｎＬｅｕ
ＶａｌＡｓｎＴｈｒＡｓｎＧ　ｌ　ｙｓｅｒＴｒｐＨｉ
　ｓ　［ＩｅＡｓｎＡｒｇＴｈｒＡ　ｌ　ａＬｅｕＡｓ
ｎＣｙｓＡｓｎＡｓ　ｐＳｅｒＬｅｕＧＩｎＴｈｒＧｌ
ｙＰｈｅｌｌｅＡｌａＡ　ａＬｅｕＰｈｅＴｙｒＡｌａ
ｌｌｉｓＡｒｇＰｈｅＡｓｎＡｌａＳｅｒＧＩｙＣｙｓ
ＰｒｏＧ　ｕＡｒｇＭｅｔＡＩａｓｅｒｃｙｓＡｒｇＰ
ｒｏｌｌｅＡｓｐＧｌｕＰｈｅＡｌａＧｌｎＧｌｙＴｒ
ｐＧｌｙＰｒｏｌｌｅＴｈｒｌｌｉｓＡｓｐＭｅｔＰｒ
ｏＧＩｕＳｅｒＳｅｒＡｓｐＧ　ｎＡｒｇＰｒｏＴｙｒ
ＧｌｙＬｅｕＡｓｐＡｓｐＡｌａＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡ
ｒｇＧｌｙｌｌｅＡｌａＡｌａＡｌａＳｅｒＧＩｎＶａ
ｌＣｙｓＧＩｙＰｒｏＧＩｕＴｙｒＣｙｓＰｈｅＴｈｒ
Ｐｒ。

２、下記の塩基配列を含むＣ型肝炎ウィルスの構造蛋白
質遺伝子。

に　Ｇ　’ｒＡ　ＣＡ　’Ｉ”Ｉ’　Ｃに　１．；　に
　’Ｉ”Ｉ’　ｔｉ　’ｌ’　Ｕ　Ｌｉ　Ｌｉ　にらに
（１：ににＬ：’ｌ’Ａ（、；ＧＡにＬｉＣＧＣ［ＵＣ
ＣＡ　ＧＧＡ　ＣＣＣＴＧ　Ｇ　ＣＧ　ＣＡ　ＴＧＧ　
ＣＧ　ＴＣＣＧ　Ｇ　Ｇ　ＴＴＣＴＧ　ＧＡＧＧ　Ａ　
ＣＧ　Ｇ　ＣＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡ
ＣＡＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＣＧＣＴＣＴＧＡＡ３、Ｃ型
肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子を含む領域を、バキュ
ロウィルスの多角体蛋白質遺伝子のプロモーターを含む
転移ベクターに挿入して得た組換え転移ベクター ４、Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子を含む領域を
、バキュロウィルスの多角体蛋白質遺伝子のプロモータ
ーを含む転移ベクターに挿入して組換え転移ベクターと
バキュロウィルスとを昆虫細胞に感染導入して得た、該
構造蛋白質遺伝子を含む領域を含む組換えウィルス。

５、Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子を含む領域を
、バキュロウィルスの多角体蛋白質遺伝子のプロモータ
ーを含む転移ベクターに挿入して組換えベクターを調製
し、ついて該組換えベクターとバキュロウィルスとを昆
虫細胞に感染導入して、該構造蛋白質遺伝子を含む領域
を有する組換えウィルスを調製し、更に該組換えウィル
スを昆虫細胞あるいは昆虫の幼虫に感染させて、ポリペ
プチドを得ることを特徴とするＨＣＶ抗原活性ポリペプ
チドの製造方法。

６、下記のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプ
チド（Ｉ）。

ＴｒｐＬｅｕＬｅｕＳｅｒＰｒｏＡｒｇＧｌｙＳｅｒＡ
ｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＧｌｙＰｒ。

ＡｓｎＡｓｐＰｒｏＡｒｇＡｒｇＡｒｇＳｅｒＡｒｇＡ
ｓｎＬｅｕＧＩｙＬｙｓＶａｌ　ＩｌｅＡｓｐＴｈｒＬ
ｅｕＴｈｒＣｙｓＧｌｙＰｈｅＡＩａＡｓｐＬｃｕＭｃ
ｔＧｌｙＴｙｒｌｌｃＰｒｏＬｅｕＶａｌＧＩｙＡｌａ
ＰｒｏＬｅｕＧｌｙＧＩｙＡＩａＡｌａＡｒｇＴｈｒＬ
ｃｕＡ　Ｉａｌ！　ｉ　ｓＧ　ｌ　ｙＶａ　ｌＡｒｇＶ
ａ　Ｉ　ＬｅｕＧ　１ｕＡｓ　ｐＧ　１ｙＶａ　１Ａｓ
ｎＴｙｒＡ　１ａＴｈｒＧｌｙＡｓｎＬｅｕＰｒｏＧｌ
ｙＣｙｓＳｅｒＰｈｅＳｅｒＩ　１ｅＰｈｅＬｅｕＬｅ
ｕＡｌａＬｅｕＬｅｕＳｅｒＣｙｓＬｅｕＴｈｒｌ　Ｉ
ｅＰｒｏＡｌａＳｅｒＡＩａＴｙｒＧＩｕＶａｌＡｒｇ
ＡｓｎＶａｌＳｅｒＧｌｙｌｌｅＴｙｒＨｉｓＶａｌＴ
ｈｒＡｓｎＡｓｐＣｙｓＳｅｒＡｓｎＳｃｒＳｅｒＩ　
ＩｅＶａＩＴｙｒＧｌｕＡｌａＡｌａＡｓｐＭｅｔ　［
ｌｅＭｅｔＨｉ　ｓＴｈ　ｒＰｒｏＧ　ｌ　ｙＣｙ　ｓ
　Ｖａ　ｌＰ　ｒｏＣｙ　ｓＶａ　ｌＡｒｇＧ　ｌｕｓ
ｅｒＡｓｎＰｈｅＳｅｒＡｒｇＣｙｓＴｒｐＶａｌ　Ａ
ｌａＬｅｕＴｈｒＰｒｏＴｈｒＬｅｕＡＩａＡＩａ／、
ｒｇＡｓｎＳｅｒＳｅｒ　Ｉ　ｌ　ｅＰｒｏＴｈｒＴｈ
ｒＴｈｒ　Ｉ　ｌｅＡｒｇＡｒｇＨｉ　ｓＶａ　ＩＡｓ
　ｐＬｅｕＬｅｕＶａｌＧｌｙＡｌａＡｌａＡＩａＬｅ
ｕＣｙｓＳｅｒＡｌａＭｅｔ？ｙｒＶａｌＧｌｙＡｓｐ
ＬｅｕＣｙｓＧＩｙＳｅｒＶａｌＰｈｅＬｅｕＶａｌＳ
ｅｒＧ］ｎＬｅｕＰｈｅＴｈｒＰｈｅＳｃｒＰｒｏＡｒ
ｇＡｒｇＴｙｒＧ　１ｕＴｈｒＶａ　ＩＧ　１ｎＡｓｐ
ｃｙｓＡｓｎＣｙｓＳｃｒ　Ｉ　ＩｅＴｙｒＰｒｏＧ　
Ｉ　ｙＨ１ｓＶａ　ｌ５ｅｒＧ　ｌｙＨｉ　ｓＡｒｇＭ
ｅ　ｔＡ　ＩａＴｒｐＡｓｐＭｅｔＭｅｔＭｅｔＡｓｎ
ＴｒｐＳｅｒＰｒｏＴｈｒＴｈｒＡＩａＬｅｕＶａｌＶ
ａｌＳｅｒＧＩｎＬｅｕＬｅｕＡｒｇｌｌｅＰｒｏＧｌ
ｎＡＩａＶａｌＶａｌＡｓｐＭｅｔＶａ　ＩＡ　ｌａＧ
　ｌｙＡ　１ａｌｌ　１ｓＴｒｐＧ　ｌ　ｙＶａ　ｌ　
ＬｅｕＡ　ｌａＧ　ｌ　ｙＬｅｕＡ　ｌａＴｙｒＴｙｒ
ＳｅｒＭｅｔＶａｌＧＩｙＡｓｎＴｒｐＡｌａＬｙｓＡ
ｌａＰｒｏｌｌｅＶａｌＭｅｔＬｅｕＬｅｕＰｈｅＡ　
ＩａＧ　！　ｙＶａ　Ｉ　Ａｓ　ｐＧ　ｌｙＨｉ　５Ｔ
ｈｒＨｉ　ｓＶａ　ＩＴｈｒＧ　ｌｙＧｌｙＡｒｇＶａ
ｌＡＩａＳｃｒＳｅｒＴｈｒＧｌｎＳｅｒＬｅｕＶａｌ
ＳｅｒＴｒｐＬｅｕＳｅｒＧＩｎＧＩｙＰｒｏＳｅｒＧ
ｌｎＬｙｓｌｌｅＧｌｎＬｅｕＶａｌＡｓｎＴｈｒＡｓ
ｎＧＩ　ｙＳｅｒＴｒｐＨｉ　ｓ　Ｉ　ｌ　ｅＡｓｎＡ
ｒｇＴｈｒＡｌａＬｅｕＡｓｎｃｙｓＡｓｎＡｓｐＳｅ
ｒＬｅｕＧｌｎＴｈｒＧｌｙＰｈｅｌｌｅＡＩａＡＩａ
ＬｅｕＰｈｅＴｙｒＡｌａＨｉｓＡｒｇＰｈｅＡｓｎＡ
ｌａＳｅｒＧ］ｙＣｙｓＰｒｏＧｌｕＡｒｇＭｅｔＡｌ
ａＳｅｒＣｙｓＡｒｇＰｒｏｌｌｅＡｓｐＧｌｕＰｈｅ
ＡＩａＧｌｎＧｌｙＴｒｐＧｌｙＰｒｏｌｌｅＴｈｒＨ
ｉｓＡｓｐＭｅｔＰｒｏＧｌｕＳｅｒＳｅｒＡｓｐＧｌ
ｎＡｒｇＰｒｏＴｙｒＧＩｙＬｅｕＡｓｐＡｓｐＡｌａ
ＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＧｌｙ［ｌｅＡｌａＡｌａＡ
ＩａＳｅｒＧＩｎＶａｌＣｙｓＧｌｙＰｒｏＧｌｕＴｙ
ｒＣｙｓＰｈｅＴｈｒＰｒ。

７．下記のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプ
チド（ｎ）。

Ｍｅ　ｔＰｒｏＡｓｎＴｙｒＳｅｒＴｙｒＴｈｒＰｒｏ
Ｔｈｒ　Ｉ　ｌｅＧ　ｌｙＡｒｇＴｈｒＴｙｒＶａｌＴ
ｙｒＡｓｐＡｓｎＬｙｓＴｙｒＴｙｒＬｙｓＡｓｎＬｅ
ｕＧ　１ｙｃｙｓＬｅｕ　Ｉ　１ｅＬｙｓＡｓｎＡ　ｌ
ａＬｙｓＡｒｇＬｙｓＬｙｓＨｉ　５ＬｅｕＶａ　ＩＧ
　１ｕｌ（ｉ　ｓＧ　ｌｕＡｒｇＧｌｕＰｈｅＡｒｇＴ
ｒｐＬｅｕＬｅｕＳｅｒＰｒｏＡｒｇＧｌｙＳｅｒＡｒ
ｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＧ　ｌｙＰｒｏＡｓｎＡｓｐＰｒ
ｏＡｒｇＡｒｇＡｒｇＳｅｒＡｒｇＡｓｎＬｅｕＧ　ｌ
ｙＬｙｓＶａｌｌｌｅＡｓｐＴｈｒＬｅｕＴｈｒＣｙｓ
ＧｌｙＰｈｅＡｌａＡｓｐＬｅｕＭｅｔＧｌｙＴｙｒｌ
ｌｅＰｒｏＬｅｕＶａｌＧｌｙＡｌａＰｒｏＬｅｕＧｌ
ｙＧｌｙＡｌａＡｌａＡｒｇＴｈｒＬｅｕＡｌａＨｉｓ
ＧｌｙＶａｌＡｒｇＶａｌＬｅｕＧ１ｕＡｓｐＧｌｙＶ
ａｌＡｓｎＴｙｒＡｌａＴｈｒＧｌｙＡｓｎＬｅｕＰｒ
ｏＧｌｙＣｙｓＳｅｒＰｈｅＳｅｒ　Ｉ　ｌｅＰｈｅＬ
ｅｕＬｅｕＡｌａＬｅｕＬｅｕＳｅｒＣｙｓＬｅｕＴｈ
ｒｌｌｅＰｒｏＡＩａＳｅｒＡｌａＴｙｒＧｌｕＶａｌ
ＡｒｇＡｓｎＶａｌＳｅｒＧｌｙｌｌｅＴｙｒＨｉｓＶ
ａｌＴｈｒＡｓｎＡｓｐＣｙｓＳｅｒＡｓｎＳｅｒＳｅ
ｒｌｌｅＶａｌＴｙｒＧｌｕＡｌａＡｌａＡｓｐＭｅｔ
　ＩｌｅＭｅｔＨｉｓＴｈｒＰｒｏＧｌｙＣｙｓＶａｌ
ＰｒｏＣｙｓＶａｌＡｒｇＧｌｕＳｅｒＡｓｎＰｈｅＳ
ｅｒＡｒｇＣｙｓＴｒｐＶａ　ＩＡ　１ａＬｅｕＴｈｒ
ＰｒｏＴｈｒＬｅｕＡ　ｌａＡ　ｌａＡｒｇＡｓｎｓｅ
ｒｓｅｒ　Ｉ　１ｅＰｒｏＴｈｒＴｈｒＴｈｒ　Ｉ　ｌ
ｅＡｒｇＡｒｇＨｉｓＶａｌＡｓｐＬｅｕＬｅｕＶａｌ
ＧｌｙＡｌａＡｌａＡＩａＬｅｕＣｙｓＳｅｒＡｌａＭ
ｅｔＴｙｒＶａｌＧｌｙＡｓｐＬｅｕＣｙｓＧＩｙＳｅ
ｒＶａｌＰｈｅＬｅｕＶａｌＳｅｒＧ　ｌｎＬｅｕＰｈ
ｅＴｈｒＰｈｅＳｅｒＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒＧ　１
ｕＴｈｒＶａ　ＩＧ　ＩｎＡｓｐＣｙｓＡｓｎＣｙｓＳ
ｅｒｌｌｅＴｙｒＰｒｏＧｌｙＨｉｓＶａｌＳｅｒＧｌ
ｙＨｉｓＡｒｇＭｅ　ｔＡ　ｌａＴｒｐＡｓｐＭｅ　ｔ
Ｍｅ　ｔＭｅ　ｔＡｓｎＴｒｐＳｅｒＰｒｏＴｈｒＴｈ
ｒＡ　１ａＬｅｕＶａ　ｌＶａ　１ｓｅｒＧ　ｌｎＬｅ
ｕＬｅｕＡｒｇ　Ｉ　１ｅＰｒｏＧ　ｌｎＡ　１ａＶａ
　ｌＶａｌＡｓｐＭｅｔＶａｌＡｌａＧｌｙＡｌａＨｉ
ｓＴｒｐＧｌｙＶａｌＬｅｕＡｌａＧｌｙしｅｕＡｌａ
ＴｙｒＴｙｒＳｅｒＭｅｔＶａｌＧＩｙＡｓｎＴｒｐＡ
ｌａＬｙｓＡＩａＰｒ。

１１ｅＶａ　１Ｍｅ　ｔ　ＬｅｕＬｅｕＰｈｅＡ　ｌａ
Ｇ　１ｙＶａ　ＩＡｓ　ｐＧ　ｌ　ｙＨｉ　５ＴｈｒＨ
ｉ　ｓＶａｌＴｈｒＧｌｙＧｌｙＡｒｇＶａｌＡｌａＳ
ｅｒＳｅｒＴｈｒＧｌｎＳｅｒＬｅｕＶａｌＳｅｒＴｒ
ｐＬｅｕＳｅｒＧｌｎＧｌｙＰｒｏＳｅｒＧｌｎＬｙｓ
ｌｌｅＧｌｎＬｅｕＶａｌＡｓｎＴｈｒＡｓｎＧｌｙＳ
ｅｒＴｒｐＨｉｓＪｌｅＡｓｎＡｒｇＴｈｒＡｌａＬｅ
ｕＡｓｎＣｙｓＡｓｎＡｓｐＳｅｒＬｅｕＧ１ｎＴｈｒ
Ｇ１ｙＰｈｅｌｌｅＡｌａＡｌａＬｅｕＰｈｅＴｙｒＡ
ｌａＨｉｓＡｒｇＰｈｅＡｓｎＡｌａＳｅｒＧｌｙＣｙ
ｓＰｒｏＧｌｕＡｒｇＭｅｔＡＩａＳｅｒＣｙｓＡｒｇ
ＰｒｏｌｌｅＡｓｐＧＩｕＰｈｅＡＩａＧｌｎＧＩｙＴ
ｒｐＧＩｙＰｒｏｌｌｅＴｈｒＨｉｓＡｓｐＭｅｔＰｒ
ｏＧｌｕＳｅｒＳｅｒＡｓｐＧｌｎＡｒｇＰｒ。

ＴｙｒＧｌｙＬｅｕＡｓｐＡｓｐＡｌａＰｒｏＡｒｇＰ
ｒｏＡｒｇＧｌｙｌｌｅＡｌａＡＩａＡｌａＳｅｒＧｌ
ｎＶａｌＣｙｓＧｌｙＰｒｏＧｌｕＴｙｒＣｙｓＰｈｅ
ＴｈｒＰｒｏＡｒｇＡｓｎＳｅｒＡｒｇ 本発明でいう構造遺伝子領域とは、Ｃ型肝炎ウィルスの
Ｃ領域、Ｍ領域、Ｅ領域を指すが、非構造遺伝子部分と
構造遺伝子領域の区分は、現在まだはっきりと特定され
てはいない。しかしながらカイロン社の発表した遺伝子
部分は、はぼ非構造蛋白質遺伝子部分に相当すると考え
られており、これより上流の約１．５ｋｂの領域が、構
造蛋白質遺伝子領域とされる。

この領域は、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者［血液中のアラニ
ンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）値が１５０を示
した患者］の血清を用いて作成したｃＤＮＡライブラリ
ーから、得ることが出来る。

具体的には、患者血清からＲＮＡを分離し、該ＲＮＡに
対して逆転写酵素を使用して、−重鎖のｃＤＮＡを合成
、更にカイロン社の発表［ＥＰ　０３１８２１６］　し
た塩基配列の１４〜７３番目まで（コーディング鎖）を
持つブライマーと、２９７〜３２１番目まで（速鎖）を
持つブライマーとをセットしてＰＣＲ法による遺伝子増
幅を行い、得られた遺伝子のクローンの塩基配列を解析
する。次に、それをもとにカイロン社の塩基配列１７１
−１９０に相当する、新しい塩基配列のブライマーを作
成し、λｇｔｌｌファージを利用して、患者の血清のｃ
ＤＮＡライブラリーを調製する。次に、カイロン社の１
４７〜１７１番目の塩基配列を持つプローブを作成し、
そのＣ・ＤＮＡライブラリーに対して、ブラークハイプ
リダイセーションを行なうことにより得られるものであ
る。

Ｃ型肝炎ウィルスの遺伝子の塩基配列については、これ
までに数例の報告しかないか、その中で加藤、大連、下
遠野らは、１９８９年に日本のＣ型肝炎ウィルスとアメ
リカのＣ型肝炎ウィルスとの塩基配列の相違を指摘し、
日本型とアメリカ型のＣ型肝炎ウィルスか存在すること
を報告している。

［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｊａｐａｎ
　Ａｃａｄｅｍｙ、　Ｖｏｌ、６５゜Ｓｅｒ、　Ｂ、　
Ｎ（１９，ｐｐ、２１９〜２２３　（１９８９）、１゜
本発明に用いるＣ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子領
域は、日本型、アメリカ型を問わず、全てのＣ型肝炎ウ
ィルスの遺伝子が、広く利用できる。但し、日本型Ｃ型
肝炎ウィルスの遺伝子を用いれば、日本型のＣ型肝炎ウ
ィルスに感染したＣ型肝炎の診断に特に有用となり、抗
ＨＣＶ抗体に対して抗原性を有する有用なポリペプチド
が得られる。ここで、該構造蛋白質遺伝子領域はクロー
ニングによって得られたものでも良く、また有機合成的
に合成されたものであっても良い。

本発明でいう構造蛋白質遺伝子領域とは、Ｃ型肝炎ウィ
ルスの約１．５　ｋｂの構造蛋白質遺伝子部分であれば
日本型、アメリカ型を問わず、また位置も長さも特に限
定されない。但し、第１図に示す１２５１塩基の構造蛋
白質遺伝子領域の全部または一部の領域を用いる場合は
、特に有用な抗原性を有するポリペプチドを得ることか
できる。

第１図に示す１２５１塩基の配列は、日本人のＣ型肝炎
の患者血清よりクローニングして得たＨＣＶＳＰ４断片
の塩基配列を示しており、日本型Ｃ型肝炎ウィルスに由
来する遺伝子である。そのため、第１図の配列は特に日
本型Ｃ型肝炎ウィルスの抗体を検出するのに有用な領域
である。

第１図に１２５１塩基の構造蛋白質遺伝子領域のＤＮＡ
塩基配列と、対応するアミノ酸への翻訳配列を示すが、
第１図は本発明にいう構造蛋白質遺伝子領域を示す例で
あり、本発明は何等この配列に限定されない。更に、第
１図に示された領域は、遺伝子地図上で同一な位置づけ
をされる、他の日本型あるいはアメリカ型のＣ型肝炎ウ
ィルスの構造蛋白質遺伝子の領域をも代表して示すもの
であり、それらについても本発明に含まれる。

また第１図に示す構造蛋白質遺伝子領域の全部あるいは
一部について、その塩基配列の一部の領域か、置換ある
いは挿入、欠失したものであっても、その遺伝子発現に
より生産される有用な抗原性を有するポリペプチドの性
質が、本配列によって示されるものと実質的に同等であ
る場合は、本発明に含まれる。更に第１図の配列につい
て、コドンのゆらぎの範囲内、即ち第１図のアミノ酸配
列を変えない範囲内で塩基が変化した配列については、
第１図の塩基配列と実質的に同一と見なされ、本発明に
含まれる。

本発明でいうバキュロウィルスには種々あるか、本発明
ではＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　
ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ
やＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙ
ｈｃｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓか利用でき、それぞれの
ウィルスは宿主昆虫として５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒ
ｕｇｉｐｅｒｄａやＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉに感染する
。このうち、Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉｎｕｃｌｅａｒ　
ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ＣＪＪ下、Ｂ
ｍＮＰＶと略す場合かある）は、カイコ核多角体病ウィ
ルスとして知られており、このウィルスはカイコＢｏｍ
ｂｙｘ　　ｍｏｒｉに感染するため、宿主としてカイコ
か好適に利用できる。

本発明でいうＢｍＮＰＶは養蚕業者に広く知られており
、前田、古沢らの分離した代表的な株にＴ３株かあり、
このウィルスのＤＮＡは米国ＡＴＣＣにＮα４０１８８
どして寄託されている。またＢｍＮＰＶに感染したカイ
コから、公知の方法によって分離することもできる。こ
のＢｍＮＰＶの遺伝子ＤＮＡのうち、本発明においてＣ
型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子領域と組換えられる
部分は、多角体蛋白質遺伝子の一部である。本発明を完
成させる際にもちいたＢｍＮＰＶについて、遺伝子地図
と制限酵素地図を第２図に示す。

多角体蛋白質遺伝子のプロモーターを含む転移ベクター
は特に限定されるものではなく、Ａｕｔ。

ｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａ
ｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓやｒｌｏｍ
ｂｙｘ　ｍｏｒｉ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓについて、これまでに開発されて
きた種々の転移ベクターも利用可能である。Ｃ型肝炎ウ
ィルスの構造蛋白質遺伝子領域は、多角体蛋白質遺伝子
のプロモーターの下流に挿入される。但し、第１図に示
す１２５１塩基の領域を遺伝子発現させる場合は、この
領域か遺伝子の翻訳のための開始コドンを持たないため
、転移ベクターの内部、即ち多角体蛋白質遺伝子のプロ
モーターの下流に開始コドンを持つ転移ベクターか好適
に利用できる。その目的のためには、前田らか開発した
ｐＰＥベクター特開昭６４−７４９９０号に示されるｐ
ＢＦベクターか好適に利用できる。

ｐＢＦベクターはＢｍＮＰＶの多角体蛋白質遺伝子のプ
ロモーター、および多角体蛋白質遺伝子の一部すなわち
多角体蛋白質遺伝子の前後と、大腸菌用ヘクターとして
知られるｐＵＣベクターから構成されている。この様に
ｐＢＦベクターは大腸菌ベクターｐＵＣに由来する大腸
菌体内での複製開始領域を含んでおり、そのため大腸菌
を使った通常の遺伝子操作を行うことにより、組換え転
移ベクターを得ることが出来る。

第１図に示す１２５１塩基の領域を遺伝子発現させる場
合、ｐＢＦベクターのうち、特にｐ　Ｂ　Ｆ　１２４は
、該構造蛋白質遺伝子領域と蛋白質翻訳のフレームが一
致するために優れている。転移ベクターｐ　Ｂ　Ｆ　１
２４の構造を第３図に示す。

転移ベクターｐＢＦを利用する場合、Ｃ型肝炎ウィルス
の構造蛋白質遺伝子領域を、ｐＢＦ転移ベクターのクロ
ーニング部位に挿入して、組換え転移ベクターを調製す
る。ｐＢＦベクターのクロニング部位にはＥｃｏＲＩ、
　ＸｂａｌＳＳｔｕｌ制限部位があるが、途中に終止コ
ドンが入らない限り、そのどれを用いる事もできる。特
にＣ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子領域として、１
２５１塩基の断片を用いる場合は、その両末端にＥｃｏ
ＲＩリンカ−を結合させ、ｐＢ　Ｆ　１２４のＥｃｏＲ
１部位に挿入することが出来る。

このようにして１２５１塩基の両末端にＥｃｏＲＩリン
カ−を接続し、これを転移ベクターｐ　Ｂ　Ｆ　１２４
のＥｃｏＲ１部位に、遺伝子の向きを順方向に向けて挿
入して得た組換え転移ベクターはｐ　ＨＣ１２４４と名
付けられ、更にこの組換え転移ベクターを用いて大腸菌
ＪＭ１０９を形質転換した具体例は、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＨＣＶ１２
４４であり、この菌は茨城系つくば市東１丁目１番３号
の通商産業省工業技術院微生物工業技術試験所に平成２
年５月２２日付で寄託され、徽工研菌寄第１１４７１号
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１４７１）なる番号が付されている
。

本発明では、組換え転移ベクターとＢｍＮＰＶとを、カ
イコ樹立細胞にカルシウム沈澱法を用いて同時に感染さ
せ（コトランスフェクション）、組換え転移ベクターと
ＢｍＮＰＶの両方に存在する、塩基配列の相同性の高い
対立遺伝子領域の間で、遺伝子の相同組換えを起こさせ
る。この方法により、ＢｍＮＰＶの核多角体蛋白質の一
部が、Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子領域に置き
換えられた、組換えウィルスを得ることか出来る。

組換え転移ベクターとＢｍＮＰＶとを、カイコ樹立細胞
にカルシウム沈澱法を用いて同時に感染させる方法は、
前田らか特開昭６１−９２９７号公？１７に発表してい
る方法で行うことか出来る。また、同時感染により得ら
れた反応液の上清から組換えウィルスを分離する方法は
、プラークアッセイ法［Ｊ、５ｅｒｉｃ、　Ｓｃｉ、　
Ｊｐｎ、　Ｖｏｌ、５３．　ｐ、５４７（１９８４）、
に示される］や、リミティング希釈法［特願昭６３−１
５２３７５号に示される１により分離することか出来る
。

本発明てはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ　ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉ
ｒｕｓやＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　ｎｕｃｌｅａｒｐｏ
ｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　　などのバキュロ
ウィルスか利用できるか、それぞれのウィルスは宿主昆
虫として５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ
　　やＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉに感染する。特にＢｏｍ
ｂｙｘ　ｍｏ口ｎｕｃｌｅａｒ　　ｐｏｌｙｈｃｄｒｏ
ｓｉｓ　ｖｉｒｕｓを利用する場合は、このウィルスか
カイコＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉに感染するため、カイコ
樹立培養細胞あるいはカイコ幼虫が利用される。

カイコ樹立培養細胞としては、ＢｍＮＰＶが増殖可能な
ものであれば特に制限なく利用できるか、ＡＴＣＣ，Ｎ
αＣＲＬ−８９１０株や、前田らの開発したＢｍ−Ｎ２
株、Ｂｍ−Ｎ４株などは好適に利用でき、取り扱いの容
易さの点からＢｍ−Ｎ４株は特に好適に利用てきる。カ
イコ樹立培養細胞は公知の方法、例えば牛脂児血清を含
むＴＣ−１０培地中で培養するなどの方法により、培養
できる。

本発明では、組換えウィルスを昆虫細胞あるいは昆虫の
幼虫に感染させて、目的とする有用な抗原性を有するポ
リペプチドを得ることかできる。

組換えウィルスのカイコ樹立培養細胞への感染方法は、
例えばカイコ樹立培養細胞の培養液を容器にいれ、該細
胞の容器の底面に沈着させて後、容器の底面に付着して
いるカイコ樹立培養細胞かはかれないように、古い培養
液を抜取り、組換えウィルス液を滴下し、室温で１時間
程度静置した後、牛脂児血清を含む新しいカイコ培養培
地を添加するという、公知の方法か一般的である。その
後例えば２７度で組換えウィルスを培養後、遠心分離し
て、培養細胞を沈澱物として得る。この細胞は、抗ＨＣ
Ｖ抗体に対して抗原性を有する有用なポリペプチドを含
有するので、これを精製することにより、目的のポリペ
プチドを得ることが出来る。

組換えウィルスをカイコ幼虫に感染させる方法は、特に
限定されないか、感染させる幼虫としてはカイコ５令幼
虫が好ましい。感染方法としては経皮注射が一般的であ
る。

カイコの飼育期間は、組換えウィルスに感染後、３〜５
日が目安であり、抗ＨＣＶ抗体に対して抗原性を有する
有用なポリペプチドは、カイコ幼虫を解剖し、下腹部に
蓄積している脂肪体を取り出すか、あるいはカイコ幼虫
をすりつぶすなどの作業の後、通常の蛋白質の分離精製
システムを利用して精製後、得ることができる。

転移ベクターとしてｐＢＦベクターを用いた場合は、調
製された組換えウィルスは、多角体蛋白のＮ末端から始
まる一部の遺伝子領域の後ろに、Ｃ型肝炎ウィルスの構
造蛋白質遺伝子領域が融合している。このため数組換え
ウィルスがカイコ細胞あるいは幼虫に感染すると、多角
体蛋白質遺伝子のプロモーターか作用し、多角体蛋白質
の一部分とＣ型肝炎ウィルスの構造蛋白質との融合蛋白
質が作られることになる。

こうして出来た融合蛋白質は、抗ＨＣＶ抗体に対して抗
原性を有する有用なポリペプチドとして利用でき、通常
はその遺伝子構造から予想される分子量、即ち開始コド
ンから終止コドンまでの分子量に相当する蛋白質が得ら
れる。しかしながら、例えば１２５１塩基の塩基配列を
持つ構造蛋白質遺伝子領域など、構造蛋白質遺伝子領域
の中の同じフレーム上に存在する、コア蛋白遺伝子領域
、膜蛋白遺伝子領域、外皮蛋白遺伝子領域の境界にまた
がる様な長い遺伝子領域を用いて、カイコで発現させる
場合には、開始コドンから終止コドンまでに対応する分
子量の大きな蛋白質以外に、分子量の小さな断片が得ら
れることがある。この原因は不明であるが、ひと続きの
長い構造遺伝子領域がカイコなどの真核細胞内で遺伝子
発現すると、翻訳後にコア蛋白部分、膜蛋白部分、外皮
蛋白部分なとの境界領域や、その他分解され易い場所で
、プロテアーゼによる切断が起こるのかもしれない。

こうして得られる小さなポリペプチドは、いずれも抗Ｈ
ＣＶ抗体に対して抗原性を有する有用なポリペプチドと
して利用てきる。

〔発明の効果〕

本発明によりＣ型肝炎ウィルスの抗体に特異的に反応す
る有用な抗原性を有するポリペプチドを効率よく生産す
ることが出来る。こうして得られたポリペプチドは、Ｃ
型肝炎の診断薬として利用できるか、Ｃ型肝炎の診断薬
として完全なものかない現在、本発明はきわめて大きい
意義を持つ。

本発明により得られた有用な抗原性を有するポリペプチ
ドは、Ｃ型肝炎の患者血清中に存在する抗Ｃ型肝炎ウィ
ルス抗体を特異的に認識するため、凝集法による診断用
抗原や、酸素抗体法（ＥＬＩＳＡ）による診断用抗原と
して応用できる。

〔実施例〕

以下に本発明を具体的に例示するために実施例を示すか
、本発明の範囲はこの実施例に限定されるものではない
。

実施例１ （ＲＮＡの調製） 輸血後非Ａ非Ｂ患者血清３０００ｍｆｆを１９．　ＯＯ
Ｏｒｐｍで１６時間超遠心し、沈澱を得た。該沈澱物を
ＧＩＴＣ溶液１００ｙｎｌに溶解し、該溶解物ｌｏｏｍ
ｌに対して、１００ｍ１のフェノール−クロロホルム（
１：１）を加え、１５分間室温で振盪後、３０００ｒｐ
ｍ、　１５分間遠心した。該反応液の水層を取り出し、
水層１００ｍ＋／に対して、１ｓｏｐｒｏｐｙｔ　ａｌ
ｃｏｈｏｌ　ｔｏｏ　ｍｌを加え、−２０°Ｃに３時間
放置した。放置後、３０００ｒｐｍ、　１５分間遠心し
、沈澱物を得た。

該沈澱物に対して、ＧＩＴＣ溶液１０ｍ１を加え、溶解
させる。該溶解液に対して、１０ｍｊ’のフェノール−
クロロホルム（１：１）を加え、１０分間室温で振盪後
、３０００ｒｐｍ、　１５分間遠心した。該反応液の水
層を取り出し、水層１０ｍｊ’に対して、クロロホルム
２０ｍ１を加え、５分間振盪した。振盪後、３０００ｒ
ｐｍ、　５分間遠心し、水層１０ｍ１を得た。該水層１
０７７１１を取り出し水層１０ｍ１に対して、５ＭＮａ
Ｃ１溶液０．４ｍｌを加えた。

混合した後、３０ｍ１の水冷エタノールを添加し、２０
°Ｃで１２時間放置した。放置後、３０００ｒｐｍ、　
１５分間遠心し、沈澱物を得た。該沈澱物を７５％エタ
ノールで洗浄し、乾燥後、蒸留水２００μｌに溶解し、
ＲＮＡ溶解液を得た。

尚、ＧＩＴＣ溶液の組成は、４Ｍグアニジウムイソチオ
シアネート（フルカー製）　、　２５ｍＭ　　クエン酸
ソーダ、０．５％サルコシル、　　０．１Ｍメルカプト
エタノールである。

（ＰＣＲ法による遺伝子増幅） 得られたＲＮＡ溶液４μｌに、逆転写酵素反応液［２５
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）、　３７５
ｍＭ　ＫＣＩ、　５０ｍＭＤＴＴ、　１５ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２］　２　ｉｔ　ｌ、塩基配列か（５’）　ＡＧＴＴ
ＣＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡ（３°）
で示される２５塩基のプライマー溶液１　ｕ　１　（１
００ｎｇ／μｌ　）　、４種類のデオキシヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ、各
１５ｍＭ］を各０．５μｍつづ加えて、９μｌの溶液を
作った。

これにミネラルオイルを加えて、７０°Ｃ１２分間加熱
し、ついで３７°Ｃに冷却し、逆転写酵素１μ１（ＢＲ
Ｌ社製品）を加え、３７°Ｃて６０分反応させた。

この反応液（１０μｌ）に、更にＰＣＲ反応液［４００
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ（ｐＨ８，８）、　１００ｍ
Ｍ硫酸アンモニウム、　４０ｍＭ塩化マグネシウム、　
６０ｍＭメルカプトエタノール、０．１％Ｂ５Ａｌ　８
．３μｆ、４種類のデオキシヌクレオチド［ｄＡＴＰ、
　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ、各１５ｍλ（１
を各５μｆづつ、塩基配列（５°）　ＡＧＧＣＴＡＧＣ
ＣＡＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＣＣＴＴＡＣＣＧＡＴＴＴＴ
ＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＴ
Ａ（３”）で示される６０塩基のブライマー溶液ｌμＡ
’　（１００ｎｇ／μＩ！　）　、塩基配列（５’）　
ＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡ
（３°）で示される２５塩基のプライマー溶液１　ｌｌ
ｆ　（１００ｎｇ／、ｃｚ　Ｉ！　）　、水０．７μｍ
を加え、全量４９μｌの溶液とした。

この溶液９２°Ｃ１５分間処理し、室温に冷却してＴａ
ｑポリメラーゼｔμＩ！（２単位、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製品）を加えた。以下、アニール
（５５°Ｃ１４５秒）、ポリメラゼーシヨン（７２°Ｃ
，２分）、変性（９０°Ｃ，１分）を、３５回繰り返し
て、ＤＮＡの増幅を行った。なお、本方法で使用したブ
ライマーを、カイロン社がＥＰＯ３１８２１６に発表し
たＨＣＶの遺伝子の塩基配列番号で示せば、以下の通り
である。まず６０塩基のものは、１４〜７３番目のコー
ディング鎖に相当し、つぎに２５塩基のものは２９７〜
３２１番目の連鎖に相当する。

以下、ＰＣＲ法により増幅した遺伝子産物のクローニン
グについて述べるが、このクローニングの方法はマニア
ティスらの方法［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）、　］
に従って行った。まず増幅した遺伝子産物（３０７塩基
対）をア・ガロースゲル（２％）で電気泳動し、これか
ら目的の長さのＤＮＡを回収した。ついでこれをＫｌｅ
ｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ酵素処理し、ＤＮＡの末端を
平滑に揃え、更にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより
、５°末端をリン酸化した。

これをプラスミドベクターｐ　Ｔ　Ｚ　１９Ｒの１Ｉｉ
ｎｃｌＩ部位に挿入し、遺伝子のクローン化を行った。

ついで、得られたクローンの３０７塩基の配列を決定し
た。

決定した塩基配列をもとに、２０塩基のオリゴヌクレオ
チド（５°）ＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴ
Ａ（３°）［カイロン社の発表した配列の１７１−１９
０番目の連鎖に相当するＪと、２４塩基のオリゴヌクレ
オチド（５゛）ＧＣＧＴＣＧＧＡＧＧＴＧＴＧＴＧＧＴ
ＣＣＡＧＴＧ（３°）［カイロン社の発表した配列の１
４７〜１７０番目のコーディング鎖に相当する］の２種
類を合成した（アブライドバイオシステムズ社製品、３
４０Ａ型機を使用した）。

（ｃＤＮＡライブラリーの構築） ｃＤＮＡ合或はＢＲＬ社の合成キットを使用した。その
方法はｃＤＮＡ合成マニュアル［ＢＲＬ／コスモバイオ
社Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃａｔ、
　Ｎα８２６７ＳＡ］に従って行った。本実施例の（Ｒ
ＮＡの調製）の項で、非Ａ非Ｂ患者血清より調製した１
本鎖ＲＮＡ溶液５μｌに、２０塩基のオリゴヌクレオチ
ドを５μｌ　（１００μＭ）加え、逆転写酵素反応を行
わせて、ＲＮＡ／ＤＮＡの２本鎖とした。次いて大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼ■と、大腸菌ＲＮＡ分解酵素Ｈとを
加え、ＤＮＡ／ＤＮＡ２本鎖とした。

次に、こうして得られた２本鎖ＤＮＡの両末端にＥｃｏ
ＲＩ　リンカ−を結合させた。この処理には宝酒造の酵
素を用い、宝酒造の酵素に添付されている反応条件で反
応を行った。まず２本鎖ＤＮＡ約１８ｇを用いて、Ｅｃ
ｏＲＩ　メチラーゼ処理を行い、その後Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーゼ反応によりＥｃｏＲＩ　リンカ−ｄ　（ＧＧＡＡ
ＴＴＣＣ）を結合させた。最後に得られた反応液をＥｃ
ｏＲＩで切断し、ＥｃｏＲＩ断片を回収した。

最後にこのＥｃｏＲＩ断片をλｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ部
位に挿入し、組換えλｇｔｌｌファージを作成したが、
これにはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のキットＧＩＧＡＰＡ
ＣＫＩＩ　ＧＯＬＤを用い、方法はキットに添付されて
いるマニュアル［Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／Ｉｎ５ｔｒｕｃｔ
ｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃａｔ、　＃２００２１４゜２
００２１５、２００２１６．　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　６．
１９８９］に従った。

まずλｇｔｌｌのＥｃｏＲ１部位にＥｃｏＲＩ断片を挿
入し、これをＴ４リガーゼにより結合させた。得られた
組換えファージＤＮＡ溶液をＧＩＧＡＰＡＣＫ　ＩＩ　
ＧＯＬＤのＩｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｋ
ｉｔを用いて、ファージに戻した。この時のタイターを
滴定した所１．２×１０１であった。このタイター値は
、独立したクローンの数を示す。

（プラークハイブリダイゼーション） プラークハイブリダイゼーションの方法はマニアティス
らの方法［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉａｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）、　］に従
って行った。まず大腸菌Ｙ１０９０をホストとし、直径
１５ｃｍのプレート１０枚に、得られた組換えλｇｔ１
１ファージ５ＸｌＯｓ相当を出現させた。得られたプラ
ークを、ニトロセルロースに写し取り、２４塩基のオリ
ゴヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイゼーショ
ンを行った。こうして、ｌｋｂ以上の挿入断片をもつク
ローン８株を選択し、この中で最も長い断片を持つクロ
ーンを１株選び出した。

そして、このクローンのＤＮＡをとり、ＥｃｏＲＩで切
断して、約１．２ｋｂの断片を回収した。この断片はプ
ラスミドベクターｐ　Ｔ　Ｚ　１９ＲのＥｃｏＲ１部位
にのせ換えた。

この組換えプラスミドをｐＨＣＶＳＰ４と名付け、更に
このプラスミドのＥｃｏＲＩ断片の塩基配列を直接調べ
た。このためにプリージョンプラスミドを構築したが、
これはヤニシュ・ペロンらの方法［Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌ
、３３．　ｐｐ、１０３−１１９　（１９８５）、１に
従い、またプラスミド法による塩基配列の決定は版部ら
の方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、１５
２．　ｌ）ｐ、２３２−２３８（１９８６）、　］に従
った。こうしてｐＨＣＶＳＰ４のＥｃｏＲＩ断片、約１
．２ｋｂの塩基配列を決定した。この結果を第１図に示
す。なお、第１図には、対応するアミノ酸配列も示す。

この遺伝子断片のＥｃｏＲＩリンカ−を除いた領域をＳ
Ｆ３と呼び、この領域は１２５１塩基から成る。

実施例２ （組換え転移ベクターの製造） 第１図に示すＨＣＶ構造遺伝子領域ＳＰ４が、大腸菌ベ
クターｐＴＺ１９のＥｃｏＲ１部位に挿入された、プラ
スミドｐＨＣＶＳＰ４を大量調製し、その２００μｇを
第１表のＮａ　１に示す組成の溶液に溶解し、次いでＥ
ｃｏＲＩ制限酵素（宝酒造■社製Ｎ（ＬＩＯ４０Ｓ）を
断続的に９時間添加していき、切断反応を行った。

アガロースゲル電気泳動により切断反応の終了を確認後
、該ＨＣＶＳＰ４切断溶液に対してラージスケールのア
ガロースゲル電気泳動を行った。

そして、ＨＣＶ構造遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ断片に相当するバンド部分の寒天片を切り出し、電気
泳動による溶出によって該断片を抽出した。次いて、抽
出液を更にフェノール抽出し、エタノール沈澱してＨＣ
Ｖ構造遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を５０
ｇｇ得た。

第１表 一方、カイコの発現系ベクターｐＢＦ　１２４．１０ｇ
ｇを第１表Ｎａ　ｌに示す組織の溶液に溶解し、次いで
ＥｃｏＲＩ制限酵素を断続的に９時間添加していき、切
断反応を行った。

次いで得られた反応液にアルカリフォスファターゼ（宝
酒造■製Ｎα２１２０）　１μｌを加え、６０°Ｃで３
０分間反応させた。アルカリフォスファターゼ反応停止
後、該反応液をフェノール抽出、エタノール沈澱し、Ｅ
ｃｏＲＩ制限酵素で切断されたｐ　Ｂ　Ｆ　１２４５μ
ｇ得た。

そして、該ベクター０．２μｇと前記ＨＣＶ構造遺伝子
を含むＥｃｏＲＩ　ＥｃｏＲＩ断片２μｇとをＤＮＡラ
イゲーションキット（宝酒造■製Ｎα６０２１）を用い
てライゲーションを行った。

そして該操作により得られた接続反応液２５μｌを大腸
菌ＪＭ１０９株コンピテントセル懸濁液２００μｌに添
加し、氷上で３０分放置した。その後４２°Ｃで２分間
ヒート・ショックし、更に氷上で５分間放置した後、Ｌ
Ｂ液体培地８００μｌを添加し、３７℃で１時間おだや
かに振盪培養した。

該液体培地１００μｌをアンピシリン１００μｇ　／　
ｍｅを含むＬＢ液体培地１．５−に接種し、３７°Ｃで
８時間培養した。それぞれの液体培地からｌ　ｍｌずつ
採取し、各採取培地中の大腸菌内に所在するプラスミド
をミニプレバレージョン法により抽出した。

得られた各プラスミドのそれぞれをＥｃｏＲＩ制限酵素
で切断反応を行った。反応後、各反応液をアガロースゲ
ル電気泳動し、ＨＣＶ構造遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片がｐＢＦ１２４に挿入しているプラスミド
を見出した。

そして、更にＨＣＶ構造遺伝子を含むＥｃｏＲＩＥｃｏ
ＲＩ断片がｐＢＦ１２４に挿入しているプラスミドを第
１表Ｎα２に示す組織の溶液に溶解し、次いで、Ｓｍａ
　Ｉ制限酵素（宝酒造■製Ｎ（Ｌ１０８５Ａ）およびＨ
ｐａ　Ｉ制限酵素（宝酒造■製Ｎ（Ｌ１０６４Ｓ）の両
制限酵素を同時に添加して、切断反応を行った。反応後
、各反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＨＣＶ構造遺
伝子を含むＥｃｏＲＩ−Ｐ：ｃｏＲＩ断片がｐ　Ｂ　Ｆ
　１２４に正しい方向に挿入しているプラスミドを確認
した。

この確認したプラスミドを所有している大腸菌が存在す
る培養液から０．２ｍｌを採取し、アンピシリン１１０
０ｕ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５０ｍ１に接種後、３７
°Ｃて１２時間培養した。

該液体培地中の大腸菌内に存在するプラスミドをミデイ
アム・プレバレージョン法により抽出し、組換えベクタ
ー１）　ＨＣ１２４４２００μｇを得た。

以上の工程を第５図に示す。

（組換えウィルスの製造） ＢｍＮＰＶ　Ｔａ株のウィルスＤＮＡと前記組換えベク
ターｐ　ＨＣ１２４４とか１：１００のモル比に調合さ
れた第２表の組成液　１２４５μｌを第２表の組成液■
２５５μｌと混合した。

第２表 組成液Ｉ 生じた懸濁液０．５ＨｍｌをＴＣ−１０（第３表）培地
で培養しているカイコ樹立培養細胞Ｂｍ　Ｎ４液（４Ｘ
１０’Ｂｍｃｅｌｌｓ／ｍｊ’）５ｍｊ’に加え、２７
°Ｃ１３時間の培養により、１）　ＨＣ１２４４とＢｍ
　ＮＰＶ　ＤＮＡのカイコ樹立細胞への導入を行った。

該ＤＮＡか導入された８ｍＮ４細胞にＴＣ−１０培地の
交換を行った後、２７°Ｃて５日間培養した。次いてこ
の培養物を遠心分離（１５００ｒｐｍ、　１０分間）し
、得られた培養上清を組換えウィルスクローニング用反
応液とした。

該当クローニング用反応液をＴＣ−１０培地で１０−＠
１０−７１０−”に希釈し、それぞれ１０ｍ（’の希釈
反応液とした。該希釈反応液１０ｍ１に対して、それぞ
れカイコ樹立培養細胞８ｍＮ４液（１０’Ｂｍｃｅｌｌ
ｓ／ｍ／）　１０ｔｎｌを混合し、該混合液を２００μ
βずつ９６穴のマイクロタイター・トレーの中に文注し
、２７°Ｃで５日間培養した。５日間培養後、マイクロ
タイター・トレーを検鏡し、細胞表面か粗く変形し、ウ
ィルスか感染した形態を示しているカイコ樹立培養細胞
で且つ該細胞内に多角体タンパクが検出されないつエル
を見い出し、そこから培養物を回収した。得られた培養
ものを遠心分離し、上清１５０μｌを組換えウィルスの
ポリペプチド発現用反応液とした。

該反応液は、プラーク検定でｌ　Ｘ　１０”ＰＦＵ／ｍ
ｌＯ力価を示す組換えウィルス液であった。尚、このポ
リペプチド発現用反応液を用い、組換えウィルスのカイ
コ樹立細胞ＢｍＮ４への感染、培養を行い、組換えウィ
ルスを増殖させた。この組換えウィルスの増殖操作は、
培養物の遠心分離（１５００ｒｐｍ、　１０分）による
上清液１４ｍ１が、プラーク検定でｌ　Ｘ　１０＠ＰＦ
Ｕ／ｍｅの力価を有するまでくり返し行った。

上記ＴＣ−１０の培地は、第３表の培地９００ｍ１に対
し硫酸カナマイシン（萬有製薬■製）６０■を添加し、
次いで、ｐＨ６，３０〜６．３５に調整し、濾過滅菌後
、牛胎児血清１００ｍ１を添加することにより調整され
る。

（本頁以下余白） 第３表 培地組織 ａＣ１ にＣｌ ＣａＣ１ｔ　＠　２Ｈ２０ ＭｇＣ１ｔ・６Ｈ２０ ＭｇＣ１ｔ・７Ｈ２０ Ｔｒｙｐｔｏｓｅ デキストロース （ｇｌｕｃｏｓｅ） Ｌ−ｇｌＬＩｔａｌｉｎｅ ｓｏｌｎ　Ａ” ５ｏｌｎ　Ｂ” ５ｏｌｎ　Ｃ”” ＮａＨｚＰ０４”　２ＨｔＯ （０，８９１ｇ　／１００ｍＡ’） ＮａＨＣＯ＝ （０，３５ｇ／１００７７＋／） Ｈ２Ｏで全量９００−とする ０、５ｇ ２、８７　ｇ １．３２ｇ ２、２８　ｇ ２、７８　ｇ ２．０ｇ １．１ｇ ０．３ｇ ００ｍ１ ００　ｍｅ 一 １０〇− １０〇− ５ｏｌｎ　Ａの組成 １−Ａｒｇｉｎｉｎｅ １−ＡＳｐａｒｔｉＣａｃｉｄ １−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　　−Ｈ２Ｏ２−Ａｌａｎｉ
ｎｅ β−Ａｌａｎｉｎｅ １−Ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ １−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ １−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ １−１ｓｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｌｙｓｉｎｅ　・ＩＩＣＩ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｐｒｏｌｉｎｅ −Ｐｈｅｎｙ　ｌａ　ｌａｎ　１ｎｅ ＤＬ−３ｅｒｉｎｅ １−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ １−Ｖａｌｉｎｅ ５、７９　ｇ ３．５ｇ ３．９８ｇ ２、２５　ｇ ２、Ｏｇ ６．０ｇ ３．０ｇ ６．５ｇ ２５．０ｇ ０．５ｇ ０、７５　ｇ ６、２５　ｇ ０．５ｇ ３．５ｇ １．５ｇ １１．０ｇ １．７５ｇ １．０ｇ ＨｔＯで全量１０００　ｍｌとする ｓｏｌｎ Ａの組成 １−Ｃｙｓｔｉｎｅ １−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ ｔ−’ｒｙｒｏｓｉｎｅ ０、２５　ｇ １、Ｏｇ ０．５ｇ １１２０て全ｆｆｉ１０００ｍｌとする”５ｏｌｎＡの
組成 Ｔｈｉａｍｉｎｅ　・ｔｌｃｌ Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎｅ Ｄ−Ｃａ　ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ Ｐｒｙｄｏｘｉｎｅ−ＨＣＩ Ｐａｒａ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄＦｏｌ
ｉｃ　ａｃｉｄ Ｎｉｃｏｔｉｎｉｔｏｌ Ｉｓｏ−１ｎｏｓｉｔｏｌ １ｏｔｉｎ Ｃｈｏｌｉｎｅ　Ｃ１ ２，０■ ２．０■ ２．０■ ２．０■ ２．０■ ２．０■ ２．０■ ２．０■ １．０■ ２０．０■ Ｈ２Ｏで全量１０００　ｍｌとする （ポリペプチドの製造） カイコ樹立培養細胞ＢｍＮ４を７５ｃ＆の培養フラスコ
（コーニング■製）で培養し、３　ｘ　１０”Ｂｍｃｅ
ｌｌｓ／フラスコになるまで２７°Ｃで培養する。次い
で、培養したカイコ樹立培養細胞ＢｍＮ４か客器の底面
からはがれないように培地を抜きとり、更に、上記増殖
させた組換えウィルス液５ｒｎｌを添加し、室温で１時
間感染する。感染後、ＴＣ−１０培地１０ｍ１を添加し
、２７°Ｃ１５日間培養した。５日間培養後培養物を回
収し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、　１５分）した。

沈澱物（ウィルス成熟細胞）をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐｔ１７．４）ｌ（Ｗに
懸濁、ソニケーション後、延伸分離（８０００ｒｐｍ、
　２０分）した。沈澱物として得られたポリペプチド９
０μｇにレムリ緩衝液２００μｌを添加、懸濁したもの
を、煮沸し、遠心した上清をＳＤＳゲル電気泳動の試料
とした。

こうしてＳＤＳ電気泳動を行ったゲルを用いて、ウェス
タンブロッティング分析を行った。ゲルからの蛋白質の
ブロッティングは、アトー社製製品ホライズプロット装
置を用いて電気的に行い、膜はイモピロンＰＶＤＦ　）
ランスファーメンブレン（ミリポア社製品）を用いた。

また、その方法はアンダーセンらの方法［Ｊ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｍｅｔｈｏｄｅ、Ｖｏｌ、１０．　ｐ２０３（１９８４
）暑に従って行った。

こうして蛋白質がブロッティングされたイモピロンＰＶ
ＤＦ　）ランスファーメンブレンに対して、−次抗体と
して正常人血清、または輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者血清を
それぞれ反応させ、更にアビジン／ビオチン化酵素複合
体法により、分析を行った。この実験はトービンらの方
法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　Ｖｏｌ、７６
、　ｐ４３５０（１９７９）、１に従って行った。

（本頁以下余白） 第 表 その結果、正常人血清を使用した場合には陽性なバンド
は見られなかったが、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者血清使用
した場合には、分子量約５０キロダルトン（ｋｄ）に相
当するバンド、約４５ｋｄに相当するバンド、約２１ｋ
ｄに相当するバンドか検出された。

なお、５０ｋｄの分子量は、遺伝子構造から推定される
融合蛋白質の分子量、すなわちｐＢＦ１２４に由来する
カイコ多角体蛋白質遺伝子かコードする蛋白質部分の分
子量と、ＨＣＶ構造蛋白質遺伝子領域に由来する蛋白質
部分の分子量の合計分子量に相当する。

実施例３ 実施例１て得た増殖させた組換えウィルス液を、５０μ
βずつ５令１日目のカイコ１００匹に、それぞれ経皮的
に接種し、２７°Ｃて１４日間、桑葉のペースト片を与
えて飼育後、解剖し、脂肪体を集めた。

この脂肪体にリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）１
０ｍｌを加えて洗浄後、再度５０ｍＭ　Ｔｒｉｓｌ（Ｃ
Ｉ（＋）Ｉ（７，４）をｌ０ｍ１加えて懸濁し、超音波
枠抜、遠心分離して沈澱物２０■を得た。

この沈澱物に対し、実施例１と同じ方法により、ＳＯ３
電気泳動を行い、更にウェスタンブロッティング分析を
行った。この分析に用いた抗体は、１次抗体２次抗体と
も、実施例１と同じものを用いた。

その結果、正常人血清を使用した場合には陽性なバンド
は見られなかったか、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者血清を使
用した場合には、分子量約５０キロダルトン（ｋｄ）に
相当するバンド、約４５ｋｄに相当するバンド、約２１
ｋｄに相当するバンドが検出された。

実施例４ （ポリペプチドの分析） カイコ樹立培養細胞ＢｍＮ　４を２２５ｃｔの培養フラ
スコ（コーニング株製）で培養し、ｌ　Ｘ　１１０７Ｂ
　ｃｅｌｌｓ／フラスコになるまで２７°Ｃて培養した
。それを３０フラスコ用意した。次いで、培養したカイ
コ樹立培養ＢｍＮ　４が容器の底面からはかれないよう
に培地を抜きとり、更に増殖させた組換えウィルス（Ｂ
ｍＮＰＶ　Ｆ４）液１５ｍ１をそれぞれ添加し、室温で
１時間感染した。感染後、ＴＣＩＯ培地３０ｍ１をそれ
ぞれ添加し、２７°Ｃ，５日間培養した。

５日間培養後、培養物を回収し、遠心分離（１５００ｒ
ｐｍ、　１５分）した。得られた沈澱物をＰ［３Ｓ緩衝
液で洗浄し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・１１ＣＩ（ｐＨ７，
４）　２０（７に懸濁し、ソニケーション後、遠心分離
（８０００ｒｐｍ、　２０分）した。

該沈澱物に対して、ＲＩＰＡ（−３ＤＳ）緩衝液２０Ｃ
Ｊｒｎｌに再懸濁し、ソニケーションした後、遠心分ｗ
ｔ（８０００ｒｐｍ、　２０分）した。該沈澱物に対し
てレムリ緩衝液３ｍｌを添加、懸濁したものを煮沸し、
遠心した（８０００ｒｐｍ、　２０分）遠心した上清に
対して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。電気泳動後、ゲルを２ＭＫＣｌ溶液に浸漬し、分子
量５０ｋｄの位置に出現した白色バンドを切り出し、０
．ＩＭＦリス、０．１Ｍ）リシン、０．１％ＳＤＳの溶
出液を使用して電気的に溶出した。これによって、２■
のポリペプチドを含む溶液か得られた。

該溶液１■分をイモピロンＰＶＤＦ）ランスファーメン
ブレン（ミリポア社製）に５ｐｏｌ、アトー社製品ホラ
イズプロット装置を用いてプロッティングを行った。ま
た、その方法はＰａｕｌＭａｔｓｕｄａｉｒａの方法［
Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ＶＯｌ、２６２．　Ｎ（１２１
，ｐｐ、１００３５〜１００３８（１９８７）、　］に
従って行った。

クーマシープルー　Ｒ−２５０（Σ社製）で染色された
スポットを切り出し、ＡＢＩ　ｍｏｄｅｌ　４７７Ａ／
１２ＯＡアミノ酸配列決定システム（ＡＢ１社製）使用
したアミノ酸配列を決定した。尚、キャリヤーとしてバ
イオブレンプラス（ＡＢ１社製）を用いた。

またポリペプチド溶液１■分を凍結乾燥した。

該凍結乾燥物に対して６ＮＨＣ１を加えて溶解し、１０
５°Ｃ９２２時間加水分解した。

該加水分解物に対して日立８３５型アミノ酸分析システ
ム（日立製作所■製）を使用して、アミノ酸組成を分析
した。

尚、ＲＩＰＡ−（ＳＤＳ）緩衝液の組成は、１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐｔ（７，４）、　　Ｉ％ＮＰ−４
０，０，１％Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙ　ｃｈ。

１ａｔｅ、　Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ
、　　２ｍＭ　ＰＭＳＰ、　　１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、
　　１　ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ
）である。

こうして決定されたポリペプチドのＮ末端から３４残基
まてのアミノ酸配列の結果を下に示すか、これは遺伝子
から予想される配列と同一である。

Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ
　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　
ＴｙｒＴｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｘｘ
ｘ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＡｌａ　Ｌｙｓ　
Ａｒｇ　Ｌｙｓ またアミノ酸組成の分析結果を以下に示すか、これも遺
伝子構造から予想されるものとほぼ同じであった。以下
、アミノ酸の種類、１分子あたりのアミノ酸組成の実測
値（配列からの予想値）の順に示すと、Ｇｌｙ　３．７
５（３８）、Ａｌａ　４２（４１）、Ｖａｌ　３３（３
５）、Ｌｅｕ　４０（７ＩＯ）、ｌｉｅ　１９．５（２
０）、λ（ｅｔ　１５（１４）、Ｐｈｅ　　１５（１４
）、Ｐｒｏ　３０（２９）、Ｓｅｔ　３８（３９）、Ｔ
ｈｒ　２７（２７）、Ａｓｐ　１９（１９）、Ｇｌｕ　
１２（１２）、Ｌｙｓ　１０（９）、Ｉｔ　ｉ　５１４
（１４）、Ａｒｇ　３２（３４）、Ｔｙｒ　２０（１９
）であった。以上の結果から、得られたポリペプチドは
第４１図に示すアミノ酸配列をもつポリペプチドと確認
された。

なお、第４図に対応する遺伝子構造も示した。

この図の、遺伝子の塩基番号１〜１２６まてはｐＢＦＩ
２４に由来するカイコ核多角体蛋白質の遺伝子領域であ
り、番号１２７〜１３３と番号１３８５〜１３９１の２
箇所はλｇｔｌ１組換えファージ作成の時に用いた［Ｅ
ｃｏＲＩリンカ−に由来する遺伝子領域であり、１３４
〜１３８４まての１２５１塩基はＣ型肝炎ウィルス構造
蛋白質遺伝子領域であり、番号１３９２〜１３９８はｐ
ＢＦベクターのカイコ核多角体遺伝子の最後の領域に相
当するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＣＶの構造蛋白質遺伝子及びそれに対応する
アミノ酸配列を示す図、第２図はＢｎ＋ＮＰＶの遺伝子
地図と制限酵素地図を示す図、第３図は転移ベクターｐ
ＢＦ１２４の構造を示す図、第４図はカイコ核多角体蛋
白質の遺伝子の一部を付加したＨＣＶの構造蛋白質遺伝
子およびそれに対応するアミノ酸配列を示す図、第５図
は組み換えベクターｐＨｃ１２４４の構築図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＣ
   型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ２、下記の塩基配列を含むＣ型肝炎ウィルスの構造蛋白
   質遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ３、Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子を含む領域を
   、バキュロウイルスの多角体蛋白質遺伝子のプロモータ
   ーを含む転移ベクターに挿入して得た組換え転移ベクタ
   ー。 ４、Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子を含む領域を
   、バキュロウイルスの多角体蛋白質遺伝子のプロモータ
   ーを含む転移ベクターに挿入して組換え転移ベクターと
   バキュロウイルスとを昆虫細胞に感染導入して得た、該
   構造蛋白質遺伝子を含む領域を含む組換えウィルス。 ５、Ｃ型肝炎ウィルスの構造蛋白質遺伝子を含む領域を
   、バキュロウイルスの多角体蛋白質遺伝子のプロモータ
   ーを含む転移ベクターに挿入して組換えベクターを調製
   し、ついで該組換えベクターとバキュロウイルスとを昆
   虫細胞に感染導入して、該構造蛋白質遺伝子を含む領域
   を有する組換えウィルスを調製し、更に該組換えウィル
   スを昆虫細胞あるいは昆虫の幼虫に感染させて、ポリペ
   プチドを得ることを特徴とするＨＣＶ抗原活性ポリペプ
   チドの製造方法。 ６、下記のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプ
   チド（ I ）。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ７、下記のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性ポリペプ
   チド（II）。 【遺伝子配列があります】