TWI841147B - 哺乳類細胞株及其用於製造豬瘟病毒可溶性e2重組抗原之方法暨其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種哺乳類細胞株及其用於製造豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之方法。不同細胞代數的哺乳類細胞表現系統可穩定大量表現可溶性CSFV-E2重組蛋白，有效降低生產豬瘟E2蛋白的生產成本，進而應用於生產豬瘟E2蛋白次單位疫苗。
Description
本發明係有關一種哺乳類細胞株，特別是有關於一種穩定大量表現豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之哺乳類細胞株及其用於製造豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之方法暨其應用。
經典豬瘟(Classical swine fever；CSF)又稱古典豬瘟，是一種感染豬隻的高傳染性疾病。一般而言，豬隻高燒、厭食、腹瀉、神經症狀、全身紅斑、大量死亡、母豬流產或產下死豬崽，是一種感染豬隻的高傳染性及高致病性疾病。
經典豬瘟於1903年首次被發現後，流行於世界各地，包括亞洲、非洲、歐洲、中南美洲等地區，一旦爆發疫情，常造成養豬產業重大的經濟損失，甚至影響全球經濟。此經典豬瘟流行的國家必須使用常規疫苗接種來預
防和控制豬瘟的傳播，如果使用得當，疫苗接種可有效限制豬瘟傳播、預防疾病爆發並在未感染豬群中建立保護性免疫。
經典豬瘟的病原為經典豬瘟病毒(Classical Swine fever virus；CSFV)，屬於黃病毒科(Flavivirdae)瘟疫病毒屬(Pestivirus)。CSFV基因組為單股正向的RNA，全長約12.3kb，會轉譯成3898個胺基酸形成多聚蛋白(polyprotein)，再由蛋白酶加工成四種結構蛋白(C、Erns、E1和E2)和八種非結構病毒蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B)，其中E2、Erns和NS3可誘發宿主產生抗體反應。
目前普遍使用之商品化豬瘟疫苗主要有兩種：豬瘟活毒減毒疫苗(modified live vaccine，MLV)及豬瘟病毒套膜蛋白E2次單位疫苗。雖然MLV豬瘟疫苗的價格低廉且有效，然而在血清抗體檢測上，無法鑑別豬隻為接種MLV疫苗或是自然感染產生的免疫反應。豬隻經由MLV豬瘟疫苗接種後，存在環境中的豬瘟病毒可持續感染動物，而動物在自然感染後所產生的免疫反應，仍可能使動物體內仍存在一定程度的低病毒量，導致豬瘟病毒持續存在於環境及宿主體內。為完全撲滅該病毒之感染源，則需於動物養殖場，區別豬隻體內產生之反應是疫苗免疫豬隻或是受到病毒自然感染豬隻，再行撲滅計畫，則需具備有鑑別此兩類型免疫反應之診斷試劑。
市售昆蟲細胞雖可生產E2重組抗原，但其成本高居不下，因此開發低成本的E2次單位疫苗是迫切的課題。有鑑於此，亟需開發一種低成本的E2重組抗原的製造方法，以解決習知技術的種種問題。
因此，本發明之一態樣是提供一種穩定表現豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之哺乳類細胞株。
本發明之另一態樣是提供一種豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之製造方法，其係培養上述之哺乳類細胞株，以提升可溶性E2重組抗原的產量。
本發明之再一態樣是提供一種豬瘟病毒可溶性E2重組抗原，其係由上述之哺乳類細胞株所製造。
本發明之又一態樣是提供一種豬用次單位疫苗組成物，其係以上述之豬瘟病毒可溶性E2重組抗原做為有效成分。
根據本發明之上述態樣，提出一種穩定表現豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之哺乳類細胞株。此細胞株為於2022年11月30日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC，台灣新竹食品路331號)、寄存編號為BCRC 960531的中國倉鼠上皮細胞株(Chinese Hamster Ovary cell)CCC_E2_5E12。
在上述實施例中，前述可溶性E2重組蛋白的胺基酸序列可例如為如序列識別號(SEQ ID NO)：1所示。
在上述實施例中，前述可溶性E2重組蛋白的蛋白濃度可例如為至少800mg/L細胞培養液。在一些例示中，前述可溶性E2重組蛋白的蛋白濃度可例如為至少850mg/L細胞培養液。在另一些例示中，前述可溶性E2重組蛋白的蛋白濃度可例如為850mg/L細胞培養液至950mg/L細胞培養液。
在上述實施例中，前述E2重組蛋白可例如由SEQ ID NO：2所示之核酸序列所編碼。
根據本發明之另一態樣，提出一種豬瘟病毒可溶性E2重組蛋白之製造方法，其係培養如上述之哺乳類細胞株，以製得可溶性E2重組抗原。
根據本發明之再一態樣，提出一種豬瘟病毒可溶性E2重組抗原，其係由如上述之哺乳類細胞株所製造，其中可溶性E2重組蛋白的胺基酸序列可例如為如序列識別號(SEQ ID NO)：1所示。
根據本發明之又一態樣，提出一種豬用次單位疫苗組成物，其係以如上述之豬瘟病毒可溶性E2重組抗原做為有效成分，且此豬用次單位疫苗組成物對受試對象的有效施用次數可例如為一次。
在上述實施例中，前述E2重組蛋白之有效劑量可例如為25μg/mL至50μg/mL。
應用本發明之哺乳類細胞株及其用於製造豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之方法，其可利用不同細胞代數的哺乳類細胞表現系統大幅提升豬瘟病毒可溶性E2重組抗
原的產量，可有效降低豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的生產成本，進而應用於生產豬瘟E2蛋白次單位疫苗。
可以理解的是，前述的概括說明及下述的詳細說明僅為例示，旨在對要求保護的發明提供進一步的解釋。
101,201,203,301:箭頭
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：[圖1A]及[圖1B]係分別顯示根據本發明一實施例之轉染CHO細胞培養液之SDS-PAGE之膠體影像(圖1A)與西方墨點法(圖1B)之呈色影像。
[圖2A]至[圖2B]係分別顯示根據本發明一實施例之CHO細胞株CCC_E2_5E12表現的E2重組蛋白的SDS-PAGE之膠體影像(圖2A)與西方墨點法(圖2B)之呈色影像。
[圖3A]至[圖3B]係分別顯示根據本發明一實施例之不同細胞代數的CHO細胞株CCC_E2_5E12於細胞液中表現E2重組蛋白在純化前的SDS-PAGE之膠體影像(圖3A)與西方墨點法(圖3B)之呈色影像。
[圖4A]至[圖4B]係分別顯示根據本發明一實施例之不同細胞代數的CHO細胞株CCC_E2_5E12於細胞液中表現的E2重組蛋白在純化後的SDS-PAGE之膠體影像(圖4A)與西方墨點法(圖4B)之呈色影像。
[圖5]係顯示根據本發明一實施例之不同細胞代數的
CHO細胞株CCC_E2_5E12的細胞液在純化後的E2重組蛋白的蛋白濃度直條圖。
倘若引用文獻對一術語的定義或用法，與此處對該術語的定義不一致或相反，則適用此處對該術語的定義，而不適用該引用文獻對該術語的定義。其次，除非上下文另有定義，單數術語可包括複數，而複數術語亦可包括單數。
如前所述，本發明是提供一種哺乳類細胞株及其用於製造豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之方法，其可利用哺乳類細胞表現系統大量生產出豬瘟病毒可溶性E2重組抗原。
本文所稱之「重組蛋白」、「重組抗原」、「蛋白質」、「胜肽」及「外源多肽」是可互換的，指的是胺基酸的聚合物，通常藉由肽鍵或二硫鍵連接在一起。「胜肽」亦可用於其中一個或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸及其聚合物、或者對應於天然存在的胺基酸之類似物或模擬物的胺基酸聚合物。「胜肽」更包括經修飾的胺基酸聚合物，例如，具有碳水化合物殘基之醣蛋白，或被磷酸化的胜肽。胜肽、外源多肽及蛋白質可利用液相合成、固相合成或利用基因工程、重組細胞、原核表現系統、真核表現系統產生。在一實施例中，本文所稱之重組抗原係由哺乳類細胞表現系統生產可溶性豬瘟病毒E2
(CSFV-E2)重組蛋白。
此處所稱之「胺基酸」與「殘基」是可互換的，當與胜肽併用時，指的是天然存在及合成的胺基酸、胺基酸類似物、胺基酸模擬物及化學上與天然存在的胺基酸相似的非天然存在的胺基酸。
此處所稱之「豬瘟病毒」，其病毒株種類並無特別限制，可例如豬瘟病毒2.1a亞群。然而在其他實施例中，前述豬瘟病毒亦可使用其他病毒株，端視實際需求而定。
此處所稱之「E2重組蛋白」可例如為全長的E2重組蛋白，如序列識別號(SEQ ID NO)：1所示之胺基酸序列，或者由如SEQ ID NO：2所示之核酸序列所編碼之胺基酸序列，其胺基酸序列由N端至C端依序為信號肽(有利於轉譯後的E2蛋白分泌到培養液中)、序列修飾之E2蛋白(HS2 strain，約342a.a.)、蛋白酶切割位點(有利於切除組胺酸標籤)以及組胺酸標籤(His tag，有利於純化蛋白)。SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列可依據Pan(2005)等人公開之豬瘟病毒(Classical swine fever virus)2.1a基因亞型的基因序列(GenBank編號：AY526726.1)，擷取E2之基因片段[相當於第1267-2292個核苷酸；對應的E2胺基酸片段為完整序列(GenBank編號：AAS20410.1)第423-764個胺基酸]，修飾成適合經由哺乳類細胞表現系統生產之序列。在一些具體例中，為了方便構築重組質體，E2重組基因
序列之兩端可選擇性添加限制酶切位，其中限制酶切位之種類並無特別限制，端視要構築的質體序列而定，可例如Bam HI及Not I之限制酶切位。另外，為了方便後續純化蛋白，E2重組蛋白之C端可選擇性添加人鼻病毒3C蛋白酶(human rhinovirus3C protease；HRV 3C protease)切割位點(cleavage site，約8a.a.，有利於切除組胺酸標籤)及組胺酸(His)標籤[His tag；或稱聚組胺酸(polyhistidine)]，其中His標籤可包含但不限於6至10個組胺酸殘基。因此，上述所得的E2重組蛋白為可溶性蛋白。
在一些實施例中，上述CSFV-E2重組蛋白可利用習知方法或下述方法製造。首先，對原核轉形細胞進行蛋白表現步驟，其中原核轉形細胞可包含第一重組質體，其含有如SEQ ID NO：2所示核酸序列之重組基因，以表現如序列識別號(SEQ ID NO)：1所示之胺基酸序列之CSFV-E2重組蛋白。為了後續純化重組蛋白，上述重組基因的3’端可選擇性添加編譯His標籤的核酸序列。在一些例子中，前述編譯His標籤的核酸序列可例如由市售質體提供，並設計成與上述重組基因的3’端連接。有關His標籤的核酸序列乃本發明所屬技術領域之通常知識，在此不另贅述。
接著，抽取前述原核轉形細胞之第一重組質體，以限制酶切下E2重組基因後，構築至適用於哺乳類細胞表現系統的第二重組質體中，並將第二重組質體轉染哺乳
類細胞，大量表現E2重組蛋白並分泌至細胞培養液後，回收並純化可溶性E2重組蛋白。
在上述實施例中，哺乳類細胞的種類並無特別限制，可例如為市售中國倉鼠上皮細胞株(Chinese Hamster Ovary cell，CHO cell)。此細胞株為於2022年11月30日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC，台灣新竹食品路331號)、寄存編號為BCRC 960531的中國倉鼠上皮細胞株(Chinese Hamster Ovary cell)CCC_E2_5E12。
在上述實施例中，回收E2重組蛋白後，可選擇性對CSFV-E2重組蛋白進行習知的管柱純化步驟，以獲得純化之CSFV-E2重組蛋白。
大體而言，上述哺乳類細胞之不同細胞代數的細胞可穩定表現且大幅提升豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的產量，其中CSFV-E2重組蛋白之生產量在每公升細胞培養液中可得到至少800毫克(mg)的可溶性CSFV-E2重組蛋白，或至少850mg，抑或850mg至950mg的可溶性CSFV-E2重組蛋白。值得一提的是，哺乳類細胞表現系統生產的E2重組蛋白可分泌至細胞培養液中，可有效提升E2重組蛋白的產量，其產量是其他表現系統(例如桿狀病毒感染昆蟲細胞的表現系統)之產量的至少80倍至100倍。其次，哺乳類細胞表現系統生產的E2重組蛋白，其可溶性蛋白的比例較高，至少95%的E2重組蛋白為可溶性蛋白，故可使用成本較低的製程回收及純化E2
蛋白，進而大幅降低生產豬瘟E2重組蛋白的生產成本。再者，哺乳類細胞表現系統生產的可溶性E2重組蛋白的比例較高，可有效提高所製得的疫苗有效性，在一些實施例中，施打單劑可溶性E2重組蛋白製成的疫苗即可達到保護力100%。相較之下，其他表現系統(例如桿狀病毒感染昆蟲細胞的表現系統)生產的E2重組蛋白，其中約50%至80%的E2重組蛋白為不可溶性蛋白，其可溶性蛋白的產量較低，無法進行純化。以未純化的E2重組蛋白製得的疫苗，不僅有效性較低，使用抗原劑量也較高，必須施打兩劑(即需要追加接種)才可達到保護力100%，換言之，其他表現系統(例如桿狀病毒感染昆蟲細胞的表現系統)生產的E2重組蛋白的使用劑量，為哺乳類細胞表現系統生產的可溶性E2重組蛋白之使用劑量的二倍。而且其他表現系統(例如桿狀病毒感染昆蟲細胞的表現系統)生產的E2重組蛋白無法進行純化，其中可能含有致過敏原，由此製得的疫苗接種動物後，部分動物可能會引起部分動物的副作用(例如過敏性反應甚至致死)，從而降低疫苗的安全性。
上述可溶性CSFV-E2重組蛋白可與其他抗原蛋白組成雙價或多價抗原，且僅須單劑接種即可提供有效免疫保護力。此處所述之「單劑接種」係指以豬用次單位疫苗組成物對受試對象的有效施用次數為一次，毋需補強免疫，又無副作用，更可有效簡化接種流程。
在一些實施例中，上述豬用次單位疫苗組成物的
CSFV-E2重組蛋白之有效劑量可例如為每劑可例如為2mL，每劑含有25μg/mL至50μg/mL。在一些具體例中，CSFV-E2重組蛋白之有效劑量可例如為25μg/mL。
可以理解的是，下述特定的重組蛋白序列、特定的配方、特定的使用劑量、特定的檢測方式、觀點、例示及實施例僅供舉例說明，並非做為本發明的限制條件。在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的主要特徵可用於各種實施例。因此本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可輕易確定本案的必要技術特徵，對本發明作各種更動及潤飾，以適用不同的用途及條件。
實施例：製備豬瘟病毒E2重組蛋白
1.豬瘟病毒E2重組基因之構築
豬瘟病毒E2重組蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，是依據Pan(2005)等人公開之豬瘟病毒(Classical swine fever virus)2.1a基因亞型的基因序列(GenBank編號：AY526726.1)，擷取E2之基因片段[相當於第1267-2292個核苷酸；對應的E2胺基酸片段為完整序列(GenBank編號：AAS20410.1)第423-764個胺基酸]，委由明欣科技公司合成並修飾成適合經由哺乳類表現系統表現之序列，於兩端設計帶有Bam HI及Not I之限制酶切位、N端加上訊號胜肽
(protein-tyrosine phosphatase，PTP；共21a.a.，有利於轉譯後的E2蛋白分泌到培養液中)、C端加上HRV 3C蛋白酶切割位點(共8a.a.，有利於切除組胺酸標籤)以及組胺酸標籤(His tag，共8a.a.，有利於純化蛋白)後，選殖到pcDNA3.4表現載體上，並命名為PTP-E2，其核酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.篩選穩定表現豬瘟病毒E2重組蛋白的細胞株
此實施例使用市售哺乳類細胞表現系統，例如市售CHO細胞表現系統(ExpiCHOTM表現系統，產品型號A29129，Thermo Fisher Scientific)，根據Thermo公司的操作手冊(Pub.No MAN0017764，Rev.3.0)，生產E2重組蛋白。
首先，將PTP-E2/pcDNA3.4的質體，利用SspI限制酶(BioLabs,R0132S)將載體切成線性載體後，利用ExpiFectamineTM CHO轉染試劑(thermo，A29129)轉染到ExpiCHOTM-S細胞內。轉染後的ExpiCHOTM-S細胞先培養於含有200μg/mL之G418硫酸鹽(G418 sulfate，友和，G8168)的ExpiCHOTM表現培養基(ExpiCHOTM Expression Medium，型號A2910001，thermo)中。另外，轉染後的ExpiCHOTM-S細胞以3×105細胞/mL的細胞密度，種入含30mL之ExpiCHOTM表現培養基的搖瓶(125mL)內，於第3、5、7天加入4g/mL的葡萄糖，並在第0、3、5、7、10、12和14天取細胞培養液分析E2重組蛋白的表現量。
利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)膠體電泳及蛋白質轉漬(Transfer)之西方墨點法(Western blot)分析第2.1節所得的重組蛋白，其結果如圖1A(SDS-PAGE：E2)、圖1B[西方墨點法：E2，利用抗-E2抗體(產品名：WH303，型號：RAE0826，賀浚)檢測]所示。
請參閱圖1A及圖1B，其係分別顯示根據本發明一實施例之轉染CHO細胞培養液之SDS-PAGE之膠體影像(圖1A)與西方墨點法(圖1B)之呈色影像。
圖1A的結果顯示，E2重組蛋白順利表現於上清液中，如圖1A的箭頭101(E2單體，E2 monomer，46kDa)所示。圖1B的結果顯示，轉染CHO細胞表現的重組蛋白確認為E2重組蛋白(其序列如SEQ ID NO：1所示)。
接下來，透過有限稀釋克隆(limiting dilution cloning)分離單一細胞，再經過細胞擴增，以獲得穩定表現豬瘟病毒E2重組蛋白的細胞株。
申言之，將細胞連續稀釋到1000細胞/mL的細胞濃度後，取0.1mL的細胞液加上39.9mL的表現培養液，以每孔約200μL的體積加入96孔盤內，培養在37℃、8%二氧化碳濃度中。培養至第17天，再將每孔含有細胞的培養液轉移到24孔盤內，每孔再加300μL的表現培養液，每孔含有約0.5mL培養液，培養在37°
C、8%二氧化碳濃度中。最後，獲得共235個細胞殖株(clones)的細胞庫，依照蛋白產量評估，選出重組蛋白表現量最高的細胞株(即穩定表現豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之哺乳類細胞株)，寄存於台灣新竹食品路331號中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，名稱為中國倉鼠上皮細胞株(Chinese Hamster Ovary cell)CCC_E2_5E12，寄存日期為2022年11月30日，寄存編號為BCRC 960531，並於2022年12月16日確認該細胞株存活。
3.E2重組蛋白的表現與純化
在轉染前，將上述CHO細胞株CCC_E2_5E12(細胞密度達3×105細胞/mL)，共30mL的穩定培養基(ExpiCHOTM Stable Production AGT Medium，型號A3711101，thermo)培養在37℃、8%二氧化碳濃度中。在培養第3、5、7天，加入最終濃度4g/L的葡萄糖。在培養第14天，以2000g之轉速離心15分鐘，分離細胞並取出上清液(培養液的部分)。之後，將硫酸銨(Sigma,CAS no.A4915)加入上清液進行沈澱，以獲得20-40%的沈澱物。然後，上述沈澱物以100mL緩衝液A[含有50mM三羥甲基胺基甲烷(Tris)及500mM氯化鈉(NaCl)]回溶，其酸鹼值為pH 7.5。接下來，上述回溶物經0.45μm的過濾膜的過濾後，進行管柱純化步驟，將培養液注入Ni-NTA管柱中，再利用流洗液(含有50mM之Tris、500mM之氯化鈉及250mM咪唑)
將E2重組蛋白流洗出來，以獲得高純度的E2重組蛋白。
4.驗證重組蛋白的表現
利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)膠體電泳及蛋白質轉漬(Transfer)之西方墨點法(Western blot)分析第2.1節純化所得的重組蛋白，其結果如圖2A(SDS-PAGE：E2)、圖2B[Western blot：E2，利用抗-E2抗體(產品名：WH303，型號：RAE0826，賀浚)檢測]所示。
將上述含有E2重組蛋白的SDS-PAGE膠片轉印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(GE healthcare，台灣進階)上，與20mL之阻隔緩衝溶液[blocking buffer，含有聚山梨醇酯20(Tween 20)之Tris緩衝鹽溶液(Tris Buffered Saline with Tween 20，TBST)及5%之牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)]於室溫(約25℃)反應2小時。然後，移除阻隔緩衝溶液，將PVDF膜與10mL之抗His標籤的抗體溶液[稀釋倍數1：1000之抗體與TBST緩衝溶液(添加0.1% Tween-20之1x PBS)]在4℃反應16至18小時。之後，移除抗His標籤的抗體溶液，以10mL之TBST緩衝溶液潤洗PVDF膜三次，每次潤洗20分鐘。然後，將PVDF膜與抗-小鼠抗體(anti-mouse antibody，稀釋倍數1：10000)的TBST
緩衝溶液，在室溫反應1小時。之後，移除含抗體的TBST緩衝溶液，加入10mL之TBST緩衝溶液清洗PVDF膜三次後，每次20分鐘。而後，PVDF膜利用呈色劑(ECL stain kit，台灣進階)進行呈色，其結果如圖2B所示。
請參閱圖2A至圖2B，其係顯示根據本發明一實施例之CHO細胞株CCC_E2_5E12表現的CSFV-E2重組蛋白的SDS-PAGE之膠體影像(圖2A)與西方墨點法(圖2B)之呈色影像。圖2A由左至右的第1道(Lane1)為蛋白質標記(Marker)；第2道(Lane2)為純化後但未加β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)處理的CSFV2 E2重組蛋白(E2雙體，E2 dimer；-β-ME)；第3道(Lane3)為純化後且添加β-ME處理的CSFV2 E2重組蛋白，其分子量為46kDa。
圖2A的結果顯示，CHO細胞株CCC_E2_5E12的上清液確實可純化出CSFV-E2重組蛋白，如圖2A的箭頭201(E2單體，E2 monomer，分子量46kDa；加β-mercaptoethanol處理，+ β-ME)、箭頭203(E2雙體，E2 dimer，分子量92kDa；未加β-ME處理，- β-ME)所示。圖2B的結果顯示，CHO細胞株CCC_E2_5E12的上清液純化出的蛋白確認為CSFV E2重組蛋白(其序列如SEQ ID NO：1所示)。
為了確認不同細胞代數之CHO細胞株CCC_E2_5E12的CSFV E2重組蛋白的表現量是否穩
定，分別取CHO細胞株CCC_E2_5E12的第二代、第四代、第六代、第八代及第十代的培養液，進行SDS-PAGE膠體電泳及蛋白質轉漬之西方墨點法分析，其結果分別如圖3A及圖3B所示。
請參閱圖3A至圖3B，其係分別顯示根據本發明一實施例之不同細胞代數的CHO細胞株CCC E2 5E12於細胞液中表現E2重組蛋白在純化前的SDS-PAGE之膠體影像(圖3A)與西方墨點法(圖3B)之呈色影像。
圖3A及圖3B的結果顯示，不同細胞代數之CHO細胞株CCC E2 5E12的上清液在純化前，E2重組蛋白確實能穩定表現於上清液中，如圖3A及圖3B的箭頭301所指的色帶訊號相近。
請參閱圖4A至圖4B，其係分別顯示根據本發明一實施例之不同細胞代數的CHO細胞株CCC_E2_5E12於細胞液中表現的E2重組蛋白在純化後的SDS-PAGE之膠體影像(圖4A)與西方墨點法(圖4B)之呈色影像。
圖4A及圖4B的結果顯示，不同細胞代數之CHO細胞株CCC_E2_5E12的上清液經純化後，E2重組蛋白確實能穩定表現於上清液中，如圖4A及圖4B的色帶訊號相近。
另外，利用市售電泳膠體密度測定法(densitometry method)，檢測不同細胞代數的CHO
細胞株CCC_E2_5E12經純化後的E2重組蛋白濃度，其結果如圖5所示。
請參閱圖5，其係顯示根據本發明一實施例之不同細胞代數的CHO細胞株CCC_E2_5E12的細胞液在純化後的E2重組蛋白的蛋白濃度直條圖。圖5的結果顯示，不同細胞代數之CHO細胞株CCC_E2_5E12的上清液在純化後，不同細胞代數之CHO細胞株的E2重組蛋白表現量無統計學上顯著差異(T-test統計分析，P>0.05)，其中E2重組蛋白的平均蛋白濃度為至少800mg/L細胞培養液，較佳為至少850mg/L細胞培養液，更佳為850mg/L細胞培養液至950mg/L細胞培養液。
上述實施例證實，不同細胞代數之哺乳類細胞表現系統可穩定表現且大幅提升豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的產量，有效降低生產豬瘟E2蛋白的生產成本，進而應用於豬瘟E2蛋白次單位疫苗的生產。
綜言之，本發明以特定的胺基酸序列、特定的細胞株、特定的製造方法或特定的評估方法僅用於例示說明哺乳類細胞株及其用於製造豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之方法。然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，在不脫離本發明的精神及範圍內，其他的胺基酸序列、其他的製造方法或其他的評估方法亦可用於哺乳類細胞株及其用於製造豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之方法，並不限於上述。
根據上述實施例，本發明的哺乳類細胞株及其用
於製造豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之方法，其優點在於利用不同細胞代數的哺乳類細胞表現系統，可大幅提升豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的產量，有效降低豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的生產成本，進而應用於生產豬用次單位疫苗組成物。
雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但其他實施例亦有可能。因此，本發明後附請求項之精神及範圍不應限於這裡包含的實施例所述。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記)
中國倉鼠上皮細胞株(Chinese Hamster Ovary cell)CCC_E2_5E12係寄存於台灣新竹食品路331號中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存日期為2022年11月30日，寄存編號為BCRC960531，並於2022年12月16日確認該細胞株存活。
國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無
TWI841147B_111149970_SEQL.xml
Claims (11)
- 一種穩定表現豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之哺乳類細胞株，其為於2022年11月30日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC，台灣新竹食品路331號)、寄存編號為BCRC 960531的中國倉鼠上皮細胞株(Chinese Hamster Ovary cell)CCC_E2_5E12，且該豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的一胺基酸序列為如序列識別號(SEQ ID NO)：1所示。
- 如請求項1所述之穩定表現豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之哺乳類細胞株，其中該豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的蛋白濃度為至少800mg/L細胞培養液。
- 如請求項1所述之穩定表現豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之哺乳類細胞株，其中該豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的蛋白濃度為至少850mg/L細胞培養液。
- 如請求項1所述之穩定表現豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之哺乳類細胞株，其中該豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的蛋白濃度為850mg/L細胞培養液至950mg/L細胞培養液。
- 如請求項1所述之穩定表現豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之哺乳類細胞株，其中該豬瘟病毒可溶性E2 重組抗原是由如SEQ ID NO：2所示之一核酸序列所編碼。
- 一種豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之製造方法，其係培養如請求項1所述之哺乳類細胞株，以製得該可溶性E2重組抗原。
- 如請求項6所述之豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之製造方法，其中該豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的蛋白濃度為至少800mg/L細胞培養液。
- 一種豬瘟病毒可溶性E2重組抗原，其係由如請求項1所述之哺乳類細胞株所製造，其中該豬瘟病毒可溶性E2重組抗原的一胺基酸序列為如序列識別號(SEQ ID NO)：1所示。
- 如請求項8所述之豬瘟病毒可溶性E2重組抗原，其中該豬瘟病毒可溶性E2重組抗原是由如SEQ ID NO：2所示之一核酸序列所編碼。
- 一種豬用次單位疫苗組成物，其係以如請求項8所述之豬瘟病毒可溶性E2重組抗原做為一有效成分，且該豬用次單位疫苗組成物對一受試對象的一有效施用次數為一次。
- 如請求項10所述之豬用次單位疫苗組成物，其中該豬瘟病毒可溶性E2重組抗原之一有效劑量為25μg/mL至50μg/mL。
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Applications Claiming Priority (1)
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| TW111149970A TWI841147B (zh) | 2022-12-26 | 2022-12-26 | 哺乳類細胞株及其用於製造豬瘟病毒可溶性e2重組抗原之方法暨其應用 |
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| CN107674883A (zh) * | 2016-08-01 | 2018-02-09 | 浙江海隆生物科技有限公司 | 重组猪瘟e2蛋白及其亚单位疫苗的制备方法和应用 |
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2023
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Patent Citations (1)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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