MX2010012020A - Estacion de base de radio y metodo de control de comunicacion. - Google Patents

Abstract

Una estación de base de radio incluye: una unidad de medición (11) que mide una cantidad de uso de recurso en cada cuadro de tiempo dentro de un periodo predeterminado; una unidad de transmisión de señal de distribución fija de enlace descendente, la cual transmite a una estación móvil una señal de distribución persistente que indica un momento de inicio de distribución de recurso de radio; y una unidad de comunicación de enlace ascendente que transmite datos de enlace ascendente utilizando el recurso de radio de enlace ascendente que inicia en el momento de inicio de distribución de recurso de radio. La unidad de transmisión de señal de distribución fija de enlace descendente decide el momento de inicio de la distribución de recurso de radio de acuerdo con una cantidad de uso de recurso en cada cuadro de tiempo.

Description

PESTIVIRUS ATENUADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de 1 l y, en particular, a pestivirus atenuados tales clásico de la fiebre porcina (CSFV) , el viru ea viral bovina (BVDV) o el virus de la enfermed era (BDV) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los pestivirus son agentes causantes de enfe micamente importantes de animales en muchos pa . Aislados de virus actualmente conocidos ado en cuatro especies diferentes que juntos f o dentro de la familia Flaviviridae .

El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) -1) y tipo 2 (BVDV-2) causan la diarrea vira nsable de la fiebre porcina clásica (CSF) o na (CP) (Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., El virus de la enfermedad de la frontera ( ntra, típicamente, en ovejas y provoca la enfer ontera (BD) . Tras la infección intrauterina de VEF, pueden nacer corderos persistentemente in son débiles y que muestran distintas deformidad que el síndrome de la "coctelera melenuda" es ido (Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., 19 Los pestivirus son pequeños virus con cubierta a de AR de cadena sencilla de polaridad posi en tanto de secuencias terminales 51 como de se (A) 31. El genoma viral codifica una poliprot imadamente 4000 aminoácidos que da lugar a prod ión final mediante procesamiento co- y post-trad implican proteasas celulares y virales. Las p et al., 1993; Weiland et al., 1990,1992). Erns c claje de la membrana típico y se secreta en ca iderables a partir de las células infectadas; mado que esta proteína exhibe una actividad RNas 1. , 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et al. nción de esta actividad enzimática para el ciclo es desconocida en la actualidad. La a ática depende de la presencia de dos tr ácidos conservados entre el pestivirus Erns y di s conocidas de origen vegetal y fúngico. Es ncias conservadas contienen un resto de h eider et al., 1993). La inactivación de la a que reside dentro de Erns produce un pe geno atenuado que puede usarse como vacu ficada (documento WO 99/64604) .

La glicoproteína Erns de pestivirus se expres Npro representa la primera proteína codificada marco de lectura abierto en el ARN del pestivi senta una proteína no estructural que ti idad proteasa y que se escinde por sí mism roteína naciente (Stark et al., 1993; Wiskerchen , presumiblemente ya durante la traducción. Npr ína proteasa (Rumenapf et al., 1998), que no es la replicación del virus (Tratschin et al., ntemente, se ha demostrado que Nro interfiere con la defensa celular antiviral, de modo que la hipótesis de modular el sistema inmune dent dador infectado (Rüggli et al., 2003) . oradores presentaron indicios de una atenuación consecuencia de una deleción del gen Npro ( ayer ) .

Las presentes vacunas contra el BVDV para la pr alización del virus (Tijssen et al., 1996). La s anticuerpos monoclonales contra cepas del ti n unirse a virus del tipo 2 (Ridpath et al., 1994 Se han generado vacunas que comprenden virus ate os o proteínas virales expresadas en sistemas de e ólogos para el CSFV y el BVDV y actualmente se u acunas vivas de BVDV convencionales típicamente se pases de cultivos celulares que producen vi encia atenuada en las especies diana. No se conoce ctural de la atenuación de BVDV, utilizados como . Por lo tanto, no es posible evaluar la est ular del proceso de atenuación. Estas vacunas, aun adas, la mayoría de las veces están asociadas con p guridad en relación con el uso en animales de c vaccínico pueden atravesar la placenta de dos, p. ej . vacas, y pueden conducir a manifes lo la mutación en la secuencia codificante de Npro c activación del Npro.

Sin embargo, dada la importancia de una profi miento eficaces y seguros, así como detectab ciones por pestivirus, existe una fuerte neces virus atenuados, tales como BVDV, con un cial de inducción de la inmunidad, así como ida de atenuación que también puede distingu virus patógenos, tal como el BVDV, as siciones y vacunas que comprenden los pe ados , tal como el BVDV.

Por lo tanto, el problema técnico en el que se nte invención consiste en proporcionar nuevos pe ados, preferiblemente un BVDV atenuado, para as atenuadas vivas. Los pestivirus atenuados m ste tipo, preferiblemente BVDV, deberían espec La Fig. 2 muestra la puntuación clínica media 1/2/3 La Fig. 3 muestra la temperatura corporal me 1/2/3 La Fig. 4 muestra la temperatura corporal del tado con TF #283 (1) La Fig. 5 muestra la temperatura corporal del tado con EP #82 (4) La Fig. 6 muestra la temperatura corporal del tado con TF #1347 / TF #230 / 3 La Fig. 7 muestra el recuento de glóbulos blancos del La Fig. 8 muestra el recuento de glóbulos blancos del La Fig. 9 muestra el recuento de glóbulos blancos del BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS Todas las subsiguientes secuencias representan las midas con guiones ( d) , que también están n (CSFV_S) secuencia de aminoácidos de comprende una sustitución de cisteín en la posición de aminoácido comparación con la SEC ID N°:l (BVDV_Ke9_wt) secuencia de aminoácidos de tipo 1 de tipo silvestre (BVDV_ e9_d) secuencia de aminoácidos de tipo 1 que comprende una deleeion cisteína en la posición de aminoácid comparación con la SEC ID N°:4 (BVDV_Ke9_S) secuencia de aminoácidos de tipo 1 que comprende una sus cisteína/serina en la posición de am 441 en comparación con la SEC ID N°:4 (BVDV_NY_wt) secuencia de aminoácidos de tipo 2 de tipo silvestre de tipo silvestre D N°:ll (BDV_x818_d) secuencia de aminoácidos que comprende una deleción de una cis la posición de aminoácido 439 en com con la SEC ID N° : 10 D N°:12 (BDV_x818_S) secuencia de aminoácidos que comprende una sustitución cisteín en la posición de aminoácido comparación con la SEC ID N° : 10 SXJMARIO DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto que, sorprendentement icación en la región codificante de la glicoprot n pestivirus que tiene como resultado la f ción de un homodímero de la glicoproteína Erns, c estivirus atenuado. Estos pestivirus atenuados e como vacuna viva modificada para la profil o de la glicoproteína Er así como en la prot ran un mayor nivel de seguridad en términos nción de las infecciones fetales por el viru a. Por lo tanto, de acuerdo con otro aspe nte invención también se refiere a pestivirus at los pestivirus atenuados no producen una glico dimérica y tienen al menos una mutación en la donde la mutación en la proteína Npro condu ivación de la proteína Npro. Preferiblement virus se selecciona entre el grupo consistente y BDV, incluyendo cualquier subtipo de cualq pestivirus.

Cualquiera de los pestivirus atenuados men iormente es un candidato de vacuna adecua rollar una vacuna viva modificada para la profil miento de infecciones por pestivirus. De esta ma De acuerdo con otro aspecto, la presente i én se refiere a un método para atenuar un pestiv ende modificaciones en la glicoproteína virus, de tal manera que el pestivirus ate zea una glicoproteína Erns dimérica. Preferib pestivirus se selecciona entre el grupo consis , BVDV y BDV, incluyendo cualquier subtipo de cu tos pestivirus .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN ICIONES DE TÉRMINOS USADOS EN LA DESCRIPCIÓN: Antes de las modalidades de la presente invenci rse que como se usan en este documento y ndicaciones añadidas, las formas singulares "un" a (el) " incluyen la referencia plural a menos xto dicte claramente otra cosa. Así, por ej encia a "un BVDV" incluye una pluralidad BVDV resente invención, se describen ahora los sitivos y materiales preferidos. Todas las publi onadas en esta memoria se incorporan como refe ines de describir y exponer las líneas de célu res y las metodologías según se reseñan caciones que podrían utilizarse en relación ción. Nada en esta memoria debe ser interpret admisión de que la invención no tiene derecho a dente de tal descripción en virtud de la i ior .

El término "pestivirus " , según se utiliza ia, se refiere a todos los miembros del virus, incluidos el BVDV, CSFV y VEF, dentr ia Flaviviridae .

El término "CSFV", tal como se utiliza en esta efiere a todos los virus que pertenecen a las adas pero distintivas en las secuencias de núcle ácidos.

El término "Npro" , tal como se entiende en esta efiere a la primera proteína codificada por el ra abierto viral y se escinde por sí mismo del oliproteína sintetizada (Stark, et al., J. 88-7093 (1993); Wiskerchen, et al., Virol . 65:4 ) ) . El término, dependiendo del contexto, puede irse a los restantes aminoácidos "Npro" tras la a secuencia de nucleótidos codificante o la secu ótidos codificante de la proteína propiame vidad proteasa que reside en Npro" se refie idad de escisión del polipéptido de la Npro.

T,Erns" , tal como se utiliza en esta memoria, se r licoproteína Erns que representa un componente est irión del pestivirus (Thiel et al., 1991). Erns c ucleótidos codificante de la proteína propiame vidad R asa que reside en la glicoproteína re a la actividad de escisión del ARN proteína, es decir la capacidad de la glicoprot drolizar ARN. La expresión 11 inactivación de la a que reside en la glicoproteína" se refier acidad o capacidad reducida de una glicoprote icada de hidrolizar ARN en comparación el tipo s dificado de la glicoproteína Erns .

Atenuación: "Un pestivirus o partícula ado", tal como se utiliza en esta memoria, signi e una diferencia estadísticamente significativa encia de pestivirus o partículas de BVDV atenuad nte invención, donde las partículas virales aten atenuado mediante un método descrito en esta me virus de tipo silvestre o aislados de BVDV de lo tadas en un ensayo de RNasa según se describe e l . , 1999. "No significativamente por encima de o para células control no infectadas en un en , según se describe en Meyers et al., 1999, si ejemplo, que la actividad JSfasa es menor qu rada con las células control no infestadas .

Inactivación de Npro, tal como se utiliza ia, significa la prevención o una considerable r la actividad inmunomoduladora probable de ión. En una modalidad preferida, esta mutación e considerablemente la interferencia de Npro ción de una respuesta de interferón por parte as infestadas, según se describe por Rüggli ). En este caso, la inactivación de Npro permiti a montar una respuesta normal de interferón.

El término "glicoproteínas Erns diméricas" sign ncia de aminoácidos de la región del gen de E La expresión "glicoproteína Erns no diméric encia, pero sin limitación, a una glicoproteína ede formar una cantidad detectable de homodímero da glicoproteína Erns. Preferiblemente, la e oproteína Erns no dimérica" hará referencia, p ación, a una glicoproteína Erns que no puede n homodímero con una segunda glicoproteína Erns .

"Señal de procesamiento", tal como se utiliza ia, se refiere a una sustancia que asegura la ge extremo N funcional de la proteína C del pes riblemente del BVDV, en particular una s cionada del grupo de ubiquitina, LC3 , SUMO-1, 16 y GABA(A)RAP. También proteasas selecciona de inteína, picornavirus 3C, caridovirus 2A y de la enfermedad hemorrágica del conejos se co "Proteína C", "proteína C" o T,proteína-C" , tal za en esta memoria, se refiere a un co ctural del virión del pestivirus (Thiel et al., proteína C" es la proteína de la cápsida del n virus. El término, dependiendo del contexto, referirse a la "Proteína C" con uno o cambios de aminoácidos que resultan de la mutaci ncía de nucleótidos codificante.

Un "fragmento" de acuerdo con la invención es c idad de una molécula de polinucleótido de acuerd ción, es decir cualquier subconjunto. Para el entó se caracteriza por ser más corto que el el genoma viral de longitud completa.

Una "variante funcional" de la molécula de nucle rdo con la invención es una molécula de nucleó una actividad biológica (ya sea funci on infeccioso o una cepa de vacuna, o incluso ex idad biológica mejorada. "Posee una actividad b s esencialmente similar" significa, con relació virus provistos de la misma, por ejemplo, virus está atenuado de una manera como la des memoria y da como resultado un virus no ado para la producción del virus vivo atenua e capacidad de atravesar la placenta, pero que espuesta inmune después de la vacunación.

Una "variante basada en la naturaleza degenera o genético" es una variante que resulta del hech eterminado aminoácido puede estar codificado po etes diferentes de nucleótidos. La variante cons en parte, su actividad biológica, o incluso ex idad biológica mejorada.

Una molécula es "esencialmente similar" a otra re a modificaciones en las moléculas de ácidos n codifican las proteínas / aminoácidos de acuerd ción. Las mutaciones se refieren, pero n adas a sustituciones (reemplazo de uno o ótidos/pares de bases) , deleciones (eliminación s nucleótidos/pares de bases), y/o inserciones no o varios nucleótidos/pares de bases) . Tal za en esta memoria, la mutación puede ser una lla o varias mutaciones, por lo tanto, a me za el término "mutación (es) " y se refiere tant ión sencilla como a varias mutaciones. Las mu yen, pero no se limitan a mutaciones p ciones de un solo nucleótido) o mutaciones , p. ej . , partes de las moléculas de ácido ficantes están suprimidas, sustituidas y/o está i ácido nucleico codificador adicional. Las mu no necesariamente uno o más componentes adicion rzan la actividad inmunológica del componente vacuna puede comprender, adicionalmente , com onales típicos de las composiciones farmacéuti nente inmunológicamente activo de una vacun ender partículas de virus completas, ya sea en nal o como partículas atenuadas en una denominad modificada (WM) o partículas inactivadas por iados en una denominada vacuna muerta (VM) . , el componente inmunológicamente activo de un comprender elementos apropiados de los or nas subunidad) , donde estos elementos se uyendo la partícula completa o los cult rollo que contienen partículas de este nalmente, subsiguientes etapas de purificac rcionan la o las estructuras deseadas, o por pro lementos descritos anteriormente. El término " omo se entiende en esta memoria, es una vacuna inario que comprende sustancias antigénicas istra con el fin de inducir una inmunidad espe a frente a una enfermedad provocada por una i estivirus, preferiblemente por una infección p estivirus atenuados, en particular el BVDV aten se describe en esta memoria, confieren una i a que puede ser transferida pasivamente a tr uerpos maternos contra los inmunógenos que co as veces también contra organismos antigén ionados. Una vacuna de la invención se refier a según se define antes, donde un co ológicamente activo es un BVDV o de origen pest ado de una secuencia de nucleótidos que ti ogia mayor que 70% con cualquier secuencia de pe la respectiva inducción por componentes adició tipo, tales como, peo no limitados a inter leuquinas o factores de crecimiento.

Una "composición farmacéutica" consiste esencial o más ingredientes capaces de modificar f lógicas, p. ej . funciones inmunológicas del org que se les administra, o de organismos que viv el organismo. El término incluye, pero no se ióticos o antiparasitarios, así como ituyentes habitualmente utilizados para consegu minados objetivos, pero no limitados a ra samiento, esterilidad, estabilidad, capaci istrar la composición por las vías enté teral, tales como oral, intranasal, intr muscular, subcutánea, intradérmica u otra vía a ancia tras la administración y propiedades de li iones no acuosas (por ejemplo, emulsión de ante basado en aluminio) .

La solución al problema técnico anterior se cons escripción y las modalidades caracterizadas ndicaciones .

Como se ha mencionado anteriormente, al menos se ha demostrado que la última cisteína C-termin proteína Erns está implicada en la formación ímero de dos monómeros de la glicoproteína itución de esta última cisteína C-terminal po itución cisteína/serina) produce un pestivirus q formar homodímeros de la glicoproteína Erns (va al., 2005) . Ahora se ha descubiert endentemente, un pestivirus que carece de la C ormar homodímeros de la glicoproteína Erns ta geno para su hospedador. Por consiguien el grupo consistente en CSFV, BVDV y BDV, in uier subtipo de cualquiera de estos pestivirus.

De acuerdo con otro aspecto, el pestivirus que c apacidad de formar homodímeros de la glicoprot establecerse por técnicas de bioin binante . Por ejemplo, una deleción o sustituci una cisteína en la posición de aminoácido virus CSFV (de acuerdo con la SEC ID N°:l ra de una manera ilustrativa) produce un pestivi ado recombinante que carece de la capacidad d ímeros de Erns, porque la glicoproteína Erns ya r enlaces disulfuro intermoleculares entre dos m rns. Con respecto al pestivirus BVDV (tipo 1 y/o ión o sustitución de al menos la cisteína en la inoácido 441 del pestivirus BVDV (de acuerdo co °:4 (BVDV-1) o la SEC ID N°:7 (BVDV de tipo 2) én está dentro del alcance de la presente i uier otra sustitución de la última cisteína C- o de la glicoproteína Erns (por ejemplo, Cys438 1 de BVDV de tipo 1 ó 2, Cys439 de BDV) .

El elemento clave de la presente invenc rcionar un pestivirus que ya no pueda formar hom a glicoproteína Erns. La formación de homodímer nirse por una deleción o sustitución de al a cisteína C-terminal dentro de la glicoprote se ha descrito anteriormente, porque cualquiera virus ya no puede formar enlaces d moleculares entre dos monómeros de glicoprote e de la deleción o sustitución de la última cis nal de la glicoproteína Erns, la homodimerizaci onómeros de la glicoproteína Erns también puede i una modificación del entorno aminoacídico de l a que pueda formar enlaces disulfuro intermol na segunda glicoproteína Erns. Además, las modifi ntorno de cisteína que tienen como resultado un idad positiva o negativa del entorno (por ejem ción o sustitución por aminoácidos ivamente tales como arginina, lisina y/o histid ción o sustitución por aminoácidos ivamente tales como aspartato o glutamato) an inhibir la formación de enlaces d moleculares entre dos glicoproteínas Eras . a, la presente invención no sólo se refiere a pe ados recombinantes , donde la última cisteína C- glicoproteína Erns se ha delecionado o sustituid distinto de una cisteína, sino que también se r uier pestivirus atenuado modificado, donde la f omodímeros de la glicoproteína Erns del pesti (2005) enseña a un especialista en la técnica có ar la dimerización de la glicoproteína Erns.

De esta manera, un aspecto de la presente inve re a un pestivirus atenuado recombinante , d virus atenuado no produce una glicoproteí ica .

De acuerdo con otro aspecto, el carboxi termina proteína Erns del pestivirus atenuado está modifi eleción, inserción o sustitución.

De acuerdo con otro aspecto, al menos el último ína C-terminal de la glicoproteína Erns del pe ado se ha delecionado o sustituido por u acídico que no es Cys .

De acuerdo con otro aspecto, está delecionado ltimo resto de cisteína de la glicoproteína virus atenuado.

De acuerdo con otro aspecto, el pestivirus ate stivirus BVD de tipo 1 y/o de tipo 2.

De acuerdo con otro aspecto, al menos el r ína en la posición de aminoácido 441 de acuerd D N°: 4 (BVDV de tipo 1) o la SEC ID N°:7 (BVDV la glicoproteína Erns del BVDV atenuado se ha del tituido por un resto distinto de cisteína.

De acuerdo con otro aspecto, el pestivirus ate stivirus BDV.

De acuerdo con otro aspecto, al menos el r ína en la posición de aminoácido 439 de acuerd D N° : 10 de la glicoproteína Erns del BDV atenua ionado o sustituido por un resto distinto de cis En el documento WO 99/64604 se describe ivación de la actividad AR sa que reside dentr én produce un pestivirus apatógeno atenuado q , H300L, H300R, H300del, W303G, P304del, E305A, , E345del, W346G, K348A# H349K, H349L, H349del/ V (mutación H349S e inserción de V) , K348R, , W351L, W351K, W351H; las sustituciones/de s: H300L/H349L, 348del/H349del , H349del/ el/H349del, W303G/E305A, H300K/H349 , H300K/H349 iones triples: L299del/H300del/ el/H349del/G350del . La numeración está de acuerd ncía de aminoácidos publicada de CP7 de BVDV pa mutantes listados anteriormente (los números i 3 corresponderían a los restos equivalente ncia de aminoácidos de Alfort/Tübingen de CSF mutantes indicados anteriormente se ensayaron los mutantes CSFV o BVDV respectivos. Por ejem cumento WO 99/64604, que se incorpora en esta me otalidad, se proporcionan mutantes adecuados n SLHGIWPEKICTG y/o LQRHEWNKHGWCNWY IEPW, y t/Tübingen de BVDV SLHGIWPEKICKG WNKHGWCNWY IDP ) . Así, preferiblemente, la inve re, además, a un BVDV de acuerdo con la invenció las mutaciones en la secuencia codificante proteína Erns están situadas en la secue ótidos que codifica la secuencia de Erns co WPEKICTG y/o LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW . Estas se sentan el sitio activo putativo de la RNa ncías SLHGIWPEKIC y RHEWNKHGWCNW del sitio ivo de Erns están incluso más conservadas en virus.

Por la solicitud de patente internacional WO200 abe que los pestivirus atenuados por una modi o de la glicoproteína Erns así como en la prot ran un mayor nivel de seguridad en términos La inactivación de la Npro se consigue en pestiv cular BVDV de la fórmula especificada descrita ie más abajo, donde están presentes entre 0 y t ácidos de Npro; y está presente o ausente ubiq u otra secuencia que sirva como señal de proce ejemplo SUMO-I, NEDD8, GATE-16 , GABA (A) RAP, o p como, por ejemplo, Inteína, picomavirus 3C, car pl5 del virus de la enfermedad hemorrágica de c ncías tales como aftovirus 2A que conducen cción discontinua) . En el caso de que esté pres de procesamiento, la secuencia codificante de rocesamiento está insertada en o cerca del ex nal de la proteína Npro (parte restante de la en el caso de que esté presente una s samiento, puede estar presente cualquier nú ácidos que codifican Npro (= aminoácidos de Npro) mutadas, o pueden también tener mutaciones pró mo N-terminal de la proteína C. Un cierto nú idades más específicas según se describen más lifican esto.

Así, la invención se refiere a un pestivi cular a BVDV de acuerdo con la invención, donde iones en la secuencia codificante de Npro conduc roteína codificada, según se caracteriza ente fórmula: x- [PS]y- [C-term] de : [Npro] se refiere a la porción Npro de la polip "x" representa el número de aminoácidos de nte en la poliproteína ; [PS] se refiere a una señal de proce cionada de: ubiquitina, LC3 , SUMO-1, NEDD8, G [C-term] se refiere al pestivirus comple cular a la poliproteína completa de BVDV, exce que incluye la proteína (C) de la cápsida y c proteína presente en la poliproteína del pestiv cular en la poliproteína de BVDV, incluida xi -terminal . Preferiblemente, la glicoproteína rm] está mutada, de modo que está inacti idad RNasa que reside en la glicoproteína sión "cualquier otra proteína presente roteína de pestivirus /poliproteína de BVDV" se s, El, E2, p7, NS2, NS3 , NS4A, NS4B y NS5A, proteína Erns está mutada, preferiblemente s ibe en esta memoria (véase antes) , de manera ivada la actividad RNasa que reside en la glico Preferiblemente, el pestivirus, en particular el do con la invención tiene una proteína C que ces "x" es O a 168; (significa que no está pre ácido específico de Nro ni 1 a todos los 168 ami ro, preferiblemente del extremo N de Npro) .

También más preferiblemente, la invención se r estivirus, en particular a BVDV de acuerdo ción, donde la o las mutaciones en la s icante de Npro conducen a una poliproteína cod se caracteriza por la siguiente fórmula: i- [PS]0[C-term] onde las definiciones son como se han iormente .

Más adelante se describe un ejemplo específico e etionina N-terminal va seguida de la proteí uier otra proteína presente en la poli yendo el NS5B carboxi terminal . Por lo tan riblemente, la invención se refiere a un pestiv ción, donde la o las mutaciones en la s icante de Npro conducen a una poliproteína cod se caracteriza por la siguiente fórmula: 3- [PS] o [C-term] onde las definiciones son como se han iormente .

Se describe a continuación un ejemplo especí donde a la metionina N-terminal le sigue la s Npro y la proteína C y cualquier otra proteína a poliproteína incluyendo la NS5B carboxi -termi anto, lo más preferiblemente, la invención se r VDV de acuerdo con la invención, donde la iones en la secuencia codificante de Npro conduc roteína codificada, según se caracteriza ente fórmula: [C-term] iormente .

Se describe a continuación un ejemplo especí donde a la metionina N-terminal le sigue la s e Npro y la proteína C y cualquier otra proteína a poliproteína incluyendo la NS5B carboxi -termi anto, lo más preferiblemente, la invención se r VDV de acuerdo con la invención, donde la iones en la secuencia codificante de Npro conduc roteína codificada, según se caracteriza ente fórmula: [C-term] onde las definiciones son como se han iormente .

También más preferiblemente, la invención se r estivirus, en particular a BVDV de acuerdo ción, donde la o las mutaciones en la s , lo más preferiblemente, la invención se refie de acuerdo con la invención, donde la o las mu la secuencia codificante de Npro conducen roteína codificada, según se caracteriza ente fórmula: N- [C-term] las definiciones son como se han iormente .

También más preferiblemente, la invención se r estivirus, en particular a BVDV de acuerdo ción, donde la o las mutaciones en la s icante de Npro conducen a una poliproteína cod se caracteriza por la siguiente fórmula: 4- [PS] o- [C-term*] de las definiciones son como se definen anteri to por el hecho de que está cambiada la part roteína codificada, según se caracteriza ente fórmula: [C-term*] , en la proteína C, el aminoácido en la posición a N# y donde las definiciones son como se han iormente .

También más preferiblemente, la invención se r estivirus, en particular a BVDV de acuerdo ción, donde la o las mutaciones en la s icante de Npro conducen a una poliproteína cod se caracteriza por la siguiente fórmula: ?- [PSh- [C-term] , las definiciones son como se han iormente , nde PS es cualquiera de los PS descritos anteri riblemente seleccionados del grupo de ubiquitina itina o LC3 o 29- [PS] i- [C-term] , donde preferiblemente, la itina o LC3.

Ubiquitina es una proteína celular de 76 aminoác rvada y bien conocida. Entre otras funció itina es un jugador clave en el catabol ínas, ya que la conjugación con ubiquitina pued proteína para la degradación a través del pro itina conjugada con o condensada a otras pro s de la glicina carboxi -terminal puede ser sepa ión por parte de proteasas celulares específ itina. Así, la fusión de una proteína al nal de ubiquitina darán como resultado, habitú escisión proteolítica definida de la proteína d s componentes cuando se expresa en una célula.

LC3 (proteínas de cadena ligera 3 asociadas proteína condensada al carboxi terminal de ará por escisión por parte de una proteasa cel osición definida .

También más preferiblemente, la invención se r estivirus, preferiblemente a BVDV de acuerdo ción, donde la o las mutaciones en la s icante de Npro conducen a una poliproteína cod se caracteriza por la siguiente fórmula, selec rupo de : [Npro] 2- [PS] y- [C-terrn] y preferiblemente M [C-term] ; [Npro] 5- [PS]y- [C-term] y preferiblemente MELF [C-term] ; [Npro] 7- [PS]y [C-term] y preferiblemente I [PS] r [C-term] ; [Npro] 8- [PS] y- [C-term] y preferiblemente M onde las definiciones son como se han iormente. Las modalidades preferiblemente descr ren a BVDV.

Lo más preferiblemente, y es 0 (no está presente De acuerdo con otro aspecto, la invención se r estivirus, preferiblemente a BVDV de acuerdo ción, donde la o las mutaciones en la s icante de Npro conducen a una poliproteína cod se caracteriza por la siguiente fórmula, selec rupo de : M- [PS] o- [C-term] ; MEL- [PSjo- [C-term] ; MELF- [PS] o- [C-term] ; MELFS- [PS] o- [C-term] ; MELFSN- [PS] o- [C-term] ; MELFSNE- [PS] 0- [C-term] ; se caracteriza por la siguiente fórmula, selec rupo de : MELI - [PS] o- [C-term] .

ELIS- [PS] o- [C-term] ; MELISN- [PS] o- [C-term] ; MELISNE- [PS]0- [C-term] ; MELISNEL- [PS] 0- [C-term] ; MELISNELL- [PS] 0- [C-term] ; MELISNELLY- [PS] 0- [C-term] ; MELISNELLY - [PS] 0- [C-term] ; MELISNELLYKT- [PS] 0- [C-term] ; De acuerdo con otro aspecto, la invención se r estivirus, preferiblemente a BVDV de acuerdo ción, donde la o las mutaciones en la s ficante de Npro conducen a una poliproteína cod se caracteriza por la siguiente fórmula, selec Otro aspecto importante de la invención descrita ía son composiciones inmunogénicas que compre virus, en particular un BVDV de acuerdo con la i na solución. El especialista conoce com onales que pueden estar contenidos en la com e también Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. Mack Publ . , Easton) . El especialista puede iones estériles inyectables conocidas, fisiológ ables. Para preparar una solución lista para el ción parenteral o infusión, están fácilmente dis iones isotónicas acuosas, tales como, p. ej . , a o correspondientes soluciones de proteínas a. Las composiciones farmacéuticas pueden ntes en forma de liofilizados o preparaciones se s se pueden reconstituir con una solución in ida, directamente antes del uso bajo con ión acuosa entre pH 7 y 8. El pH se puede est un tampón farmacéuticamente aceptable. La én puede contener agentes estabilizadores adic como un detergente, tal como Tween 20, albú , tal como BSA (albúmina de suero bovina) bico y/o espermidina. La composición tambié ender adyuvantes, p. ej . hidróxido de aluminio, ales u otros aceites o moléculas auxiliares añ cuna o generadas por el cuerpo después de la re ción por componentes adicionales de este tipo pero no limitados a interferones , interleuq res de crecimiento .

Por ejemplo, en una composición inmunogénica de la invención, el pestivirus, en particular el BV disuelto en: rógeno-fosfato de pot 0, 516 mg to dipotásico 1,254 mg para inyección csp 2 mi Si la composición inmunógénica se liofiliza o de ro por otros métodos, entonces, antes de la vac omposición se rehidrata en soluciones acuosas ión salina, STP (solución salina amortigu to)) o no acuosas (p. ej . emulsión en aceite (b e mineral o basada en al/metabolizable/basado en emulsión sencilla o o en aluminio, adyuvante basado en carbomero) .

La composición inmunógénica de acuerdo con la i apaz de inducir una respuesta inmunógénica en un anera más preferida, la composición inmunogé do con la invención es una vacuna. Una vacuna, como p-hidroxibenzoatos , estabilizadores, tal de metales alcalinos de ndiaminotetraacético, que posiblemente también c ionante y/o dispersante.

La composición inmunogénica según la invenció arse por vía oral, intradérmica , intratra vaginal . Preferiblemente, la composición s ar por vía intramuscular o intranasal . En el un animal, puede resultar ventajoso aplic siciones inmunogénicas , como se han iormente, mediante una inyección intravenosa ción directa en los tejidos diana. Para la ap tnica, se prefieren las vías intr vascular, intramuscular, intranasal, intraa peritoneal , oral o intratecal . Se puede efect cación más local por vía subcutánea, intra La invención también se refiere al uso de un pes articular BVDV de acuerdo con la invenció icación de una vacuna para la profilaxi amiento de infecciones por pestiviru icular de infecciones por BVDV.

Otra parte importante de la invención cula de pol inucleót ido que comprende el eico que codifica un pestivirus , en partic de acuerdo con la invención, o un fra ante funcional, variante basada en el erativo de ácidos nucleicos, molécula de f derivado químico del mismo. Pre f eriblemen cula de pol inucleót ido es AD . er iblement e , la molécula de pol inuc le t ido una modalidad más preferida, la moléc nucleótido comprende también la secuen de la enfermedad de la frontera BD31 N° de acceso a NCBI GenBank X818 N° de acceso a NCBI 7405] de la diarrea viral bovina 1 NADL N° de acceso a NCBI 7405] Osloss N° de acceso a NCBI 87] SD-1 N° de acceso a NCBI GenBank CP7 N° de acceso a NCBI GenBank de la diarrea viral bovina 2 890 N° de acceso a NCBI GenBank C413 N° de acceso a NCBI 2227] New York' 93 N° de acceso a NCBI Las mutaciones/modificaciones de acuerdo ción relacionadas con la secuencia codificante e describen anteriormente con mayor detalle. P información, un especialista en la técnica es zar la fabricación de cualquier polinucleóti ico que codifica un pestivirus de acuerdo nte invención. Además, esta persona es capaz de stivirus atenuado de acuerdo con la invención. U ular para introducir una mutación en una secu ucleótido, la clonación y amplificaci ucleótido mutado se proporcionan, por ejemp ook et al. 1989 o Ausubel et al. 1994.

Otro aspecto importante de la invención es u atenuar un pestivirus que produce un pesti do con la invención, que comprende modif proteína Erns del pestivirus de tal manera virus. De acuerdo con otro aspecto, el pestiv ciona entre el grupo consistente en CSFV, BVDV d , y BDV. De acuerdo con otro aspecto, el pesti stivirus CSF. De acuerdo con otro aspecto, al de cisteína en la posición de aminoácido 438 de la SEC ID N°: 1 de la glicoproteína Erns del pe se ha delecionado o sustituido por un resto dis ína. De acuerdo con otro aspecto, el pestiviru virus BVD de tipo 1 y/o de tipo 2. De acuerdo to, al menos el resto de cisteína en la posi ácido 441 de acuerdo con la SEC ID N° : 4 (BVDV la SEC ID N°:7 (BVDV de tipo 2) de la glicoprot DV se ha delecionado o sustituido por un resto steína. De acuerdo con otro aspecto, el pestivir virus BD. De acuerdo con otro aspecto, al menos isteína en la posición de aminoácido 439 de acu ciona entre el grupo consistente en CSFV, BVDV yendo cualquier subtipo de los mismos.

De acuerdo con otro aspecto, la presente i rciona un método para atenuar un pes terizado por que la glicoproteína Erns se modif deleción, inserción o sustitución de tal forma virus ya no puede formar ningún dímero de Ern de la modificación de la proteína Npro por una d ción o sustitución de tal forma que la proteína ivada .

De acuerdo con otro aspecto, el método compre s : a) transcripción inversa de una secuen nucleótidos de pestivirus de tipo silvestr ADNc; b) clonación del ADNc; del ADNc de pestivirus en ARN in vitro o de la infección de células adecuadas .

Otra modalidad importante de la invención es u el tratamiento de enfermedades causadas virus, en el que un pestivirus de acuerdo ción o una composición de acuerdo con la inve istra a un animal que lo necesita a una dosis a como se conoce por el especialista y se cons ción de síntomas de la infección por pestivirus.

Otra modalidad importante de la invención es u el tratamiento de enfermedades causadas por BVD n BVDV de acuerdo con la invención o una compos do con la invención se administra a un animal ita a una dosis adecuada, tal como se conoce na experta y se consigue la reducción de síntom ción por BVDV, tal como viremia y leucopenia y/o te Alfort/Tubingen de CSFV que presentaba una codón de cisteína en la posición 438 en el pol en la secuencia de Erns) . Esta mutación prev ización de Erns (EP #82(4)). Como controles se us nte negativa para R asa de CSFV Alfort/Tubin ión H297K y virus de tipo silvestre.

En este estudio, 12 animales con un p imadamente 20 kg se dividieron en tres grupos d les cada uno. Los mutantes de CSFV (primer g (1) / segundo grupo: EP #82(4)) y el virus CSFV stre (tercer grupo: EP #98(1)) se aplicaron muscular e intranasal el día 0 (0 ,dpi) . Cad ió 106 ID50 de virus en 1,5 mi de DMEM . Despu ción, los animales se controlaron durante 22 d traron las temperaturas rectales diariamente o u ro no. La puntuación clínica se determinó de acu ar en comparación con la cepa parental . Ten arse en otros experimentos si esta difere ficativa (Fig. 1) .

Los mutantes de CSFV (primer grupo: TF #283(1) / : EP #82 (4)) y virus CSFV de tipo silvestre (EP plicaron por vía intramuscular y por vía intra 0 (0 dpi) . Cada animal recibió 106 KID50 de viru DMEM. Dos tercios de la suspensión se aplicaron nasal (0,5 mi por orificio nasal). Para un ación i.m., los últimos 0,5 mi de virus se re 2 mi con DMEM y se inyectaron en el iocef lico .

Para la confirmación del título del virus de exp ecogió 1 mi de suspensión de virus después de di s de dilución y transporte: a) virus original (solución madre) Después de volver del establo, esta muestra se c inmediatamente. La confirmación del título aún nado . 1: Título de preparaciones de virus de exposició directamente a -70°C después de la primera e ión (para aplicación intranasal) etorno al hielo les se registraron diariamente o, en la última imento, un día sí y otro no. 57 grupos diferentes de 4 animales. Después de seis atación, los animales se infectaron con lo tes y de tipo silvestre. 3 : asignación de los animales y virus de exposició grupos En los cerdos se observó diariamente el estado al . Los animales del grupo n° 3 expuestos al virus stre tuvieron que sacrificarse prematuramente el dí blandas, cantidad normal = 0; cantidad reducida secas / finas = 1; sólo una pequeña cantidad , cubiertas de fibrina, o diarrea = 2; sin heces, m >, o diarrea acuosa o con sangre = 3) para evaluar l ógicos .

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 841 842 843 844 847 848 849 850 574 576 5 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 5 2 2 3 2 5 3 3 3 3 3 3 6 0 0 0 0 1 0 4 0 3 3 3 4: El animal se sacrificó con puntuación clínica 1/2/3 ele acuerdo con Mittelholzer Las temperaturas rectales se registraron -3 y amente o un día sí y otro no desde 0 dpi hasta grupo 1 y 2 cada animal alcanzó la temperatura medio de aislamiento de virus en preparad is de leucocitos. 5: preparación de frotis de leucocitos El animal se sacrificó cuento de glóbulos blancos 6 : recuento de glóbulos blancos = no determinado imal se sacrificó 7: Títulos de anticuerpo contra SP50 determinado no determinado Se proporcionan los valores recíprocos de diluc que neutralizan aprox 100 TCED50 de SP50. nclusion Es evidente que la deleción de cisteína n° 438 la prevención de la formación de dímeros de E ímicos disponibles) conduce a la atenuación de CS ación casi nunca puede deberse a un retraso del cre ones biológicas pero no la actividad enzim tica s, puede proponerse la hipótesis de que la atenú como consecuencia de la prevención de la form os de Ems y la anulación de la actividad RNasa se mismos principios de la interacción entre el vi dador, particularmente el bloqueo del efecto RNasa Sta manera, lo más probable es que la prevenci ción dé dímeros sea equivalente al bloqueo de la , aunque el virus pueda expresar una RNasa activa. endas bel, F.M. et al., Current Protocols in molecular biology. New York : Greene Publis iates and Wiley-Interscience. 1994 (updated) , J.C. 1987. Bovine viral diarrhea virus; a review. J. Am. Vet. Med.Assoc. 190: I r, P., Kónig, M., Patón, D.J., Thiel, H.J., 1995, Further characterization of b e virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the g iros. Virology 209 (1), 200-206.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, o conocido por la solicitante para llevar a la itada invención, es el que resulta claro de la ipción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : 1. Una composición inmunogénica que compr ivirus atenuado, caracterizada porque el pe ado no produce una glicoproteína Erns dimérica. 2. La composición inmunogénica de conformida ndicación 1, caracterizada porque el carboxi te licoproteína Erns del pest vxrus atenuado está mo na deleción, inserción o sustitución. 3. La composición inmunogénica de conformida ndicación 1 ó 2, caracterizada porque al menos e de cisteína de la glicoproteína Erns del pe ado se ha delecionado o sustituido por u s de la enfermedad de la frontera (BDV) . 6. La composición inmunogénica de conformida indicación 5 caracterizada porque a. al menos el resto de cisteína glicoproteína Erns del BVDV atenuado en la de aminoácido 441 de acuerdo con las SEC ID 7 se ha delecionado o sustituido con un r no es cisteína; b. donde al menos el resto de cisteín glicoproteína Erns del CSFV atenuado en la de aminoácido 438 de acuerdo con la SEC ID ha delecionado o sustituido con un resto q cisteína; c. donde al menos el resto de cisteín glicoproteína Erns del BDV atenuado en la de aminoácido 439 de acuerdo con la SEC I pro conducen a una poliproteína codificada, cteriza por la siguiente fórmula: ]x- [PS]y- [C-term] nde : ] se refiere a la porción Npro de la poliproteín representa el número de aminoácidos de la Npro pre oliproteína ; y donde se refiere a una señal de procesamiento seleccio o consistente en: ubiquitina, LC3, SU O-1, NEDD8 , .BA (A) RAP) , inteína, picornavirus 3C, caridovir de virus de la enfermedad hemorrágica del conejo; puede ser = 0, lo que significa que no está pres 1 de procesamiento, o "Y" puede ser = 1, lo que s está presente una señal de procesamiento, y donde erm] se refiere a la poliproteína completa de pto Npro, pero que incluye la proteína (C) de la 9. La composición inmunogénica de conformida indicación 8, caracterizada porque la o las mutac pro conducen a una poliproteína codificada, s teriza por la siguiente fórmula: ]4- [PS]0[C-term] 10. La composición inmunogénica de conformida indicación 8, caracterizada porque la o las mutae pro conducen a una poliproteína codificada, s teriza por la siguiente fórmula: ] 4- [PS] o- [C-term*] . de [C-term] * es = [C-term] donde en la proteí ácido en la posición 2 está cambiada de D a N. 11. La composición inmunogénica de conformida ndicación 8, caracterizada porque el virus ate y donde la o las mutaciones en la Npro conduc roteína codificada según se caracteriza por una ] 22- [PS C-term] de PS es ubiquitina o LC3. 13. La composición inmunogénica de conformida ndicación 12, caracterizada porque [PS] 0 lazado por [PS]i, y donde el PS se selecciona que consiste en: ubiquitina, LC3 , SUMO-1, NEDD GABA(A)RAP, inteína, picornavirus 3C, caridov irus 2A y pl5 de virus de la enfermedad hemorrá jo. 14. La composición inmunogénica de conformi uiera de las reivindicaciones 1 a 13, carac e la composición comprende, además, un veh iente farmacéuticamente aceptable . 15. La composición inmunogénica de conformi uiera de las reivindicaciones 1 ó 14, carac e la composición comprende al menos dos pe e revertir a un pestivirus patógeno por recombina 18. Las composiciones inmunogénicas ele conform uiera de las reivindicaciones 1 a 17, caract e la composición inmunogénica es una vacuna laxis de una infección por pestivirus. 19. Un pestivirus atenuado, caracterizado p ivirus atenuado no produce una glicoproteína Erns ene al menos una mutación en la proteína Npro, ción en la proteína Npro conduce a la inactivaci eína Npro. 20. El pestivirus atenuado de conformidad indicación 19, caracterizado porque el carboxi a glicoproteína Ens está modificado por una rción o sustitución, y la mutación en la cciona entre el grupo de deleciones, mutaci rción y/o mutaciones de sustitución. frontera (BDV) . 23. El pestivirus atenuado de conformidad ndicación 22, caracterizado porque a. al menos el resto de cisteína glicoproteína Erns del BVDV atenuado en la de aminoácido 441 de acuerdo con las SEC ID 7 se ha delecionado o sustituido con un r no es cisteína; b. donde al menos el resto de cisteín glicoproteína Erns del CSFV atenuado en la de aminoácido 438 de acuerdo con la SEC ID ha delecionado o sustituido con un resto q cisteína; c. donde el resto de cisteína de la glico Erns del BDV atenuado en la posición de am 439 de acuerdo con la SEC ID N° : 10 representa el número de aminoácidos de la Npro pre oliproteína; y donde se refiere a una señal de procesamiento seleccio o consistente en: ubiquitina, LC3 , SU O-1, NEDD8, ABA(A)RAP, inteína, picornavirus 3C, caridovi irus 2A o pl5 de virus de la enfermedad hemorrá jo; y donde puede ser = 0, lo que significa que no está pres l de procesamiento, o "Y" puede ser = 1, lo que s está presente una señal de procesamiento, y donde erm] se refiere a la poliproteína completa de to Npro, pero que incluye la región de la proteín ápsida, la proteína E™5 modificada y cualqu eína presente en la poliproteína del virus, inc carboxi - terminal ; y donde y" es = 0, entonces "x" es 0 a 12, (significa que [PS] otC-term] 26. El virus atenuado de conformidad ndicación 24, caracterizado porque la o las mu a Npro conducen a una poliproteína codificada, COT íente fórmula: ] 4- [PS] o- [C-term*] , nde [C-term] * es = [C-term] donde en la proteí ácido en la posición 2 está cambiada de D a N. 27. El virus atenuado de conformidad indicación 24, caracterizado porque la o las mu a Npro conducen a una poliproteína codificada, cteriza por la siguiente fórmula: x- [PS] !- [C-term] de PS se selecciona del grupo de ubiquitina o LC 28. Un BVDV atenuado recombinante , caracterizad DV atenuado no produce una glicoproteína Erns dim 31. El BVDV atenuado recombinante de conform uiera de las reivindicaciones 28 a 30, carac e al menos el resto de cisteína en la pos ácido 441 de acuerdo con la SEC ID N° : 4 ó ionado o sustituido con un resto que no es ciste 32. Un método para atenuar un pestivirus, carac e comprende modificar la glicoproteína Ems del pe al manera que el pestivirus atenuado no prod proteína Erns dimérica. 33. El método de conformidad con la reivindica terizado porque el carboxi terminal de la glico del pestivirus atenuado está modificado por una d rción o sustitución. 34. El método de conformidad con la reivindicac caracterizado porque al menos el último resto de la glicoproteína Erns del pestivirus atenuado