JPH0417633B2

JPH0417633B2 -

Info

Publication number: JPH0417633B2
Application number: JP29315388A
Authority: JP
Inventors: Yoshiji Kosugi; Hideoki Tanaka; Masaru Shiraki; Katsuo Takahashi; Isao Maeda; Koichi Shimotomai
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1988-11-19
Filing date: 1988-11-19
Publication date: 1992-03-26
Also published as: JPH02138975A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の移用分野）本発明は固定化リパーゼの製造方法、詳しくは
陰イオン交換体にリパーゼを吸着さて固定化リパ
ーゼを調製するにあたり、その固定化率を高め高
活性の固定化リパーゼを大量生産するに有効な固
定化リパーゼの製造方法に関するものである。この固定化リパーゼは、これを使用すればエス
テル分解、エステル交換、エステル合成、ラセミ
体の光学分割等を行うことができると共に、酵素
利用工業、油脂工業、食品工業、医薬品工業など
の分野に広く応用できるものである。（従来の技術）近年、油脂の加水分解を始めとして酵素の利用
が注目されており、特に工業的に入手が容易であ
り、油脂分解力が高いことからリパーゼが広く用
いられている。しかし遊離のリパーゼでは長時間
の繰り返し使用に難があり、またカラムを用いた
連続反応に使用することができないため、工業的
利用を進めるには経済的観点からもリパーゼを固
定化する必要があり、その技術開発が求められて
いる。ところで、リパーゼの一般的な固定化方法とし
ては共有結合法、包活法、吸着法など、種々の方
法が知られているが、なかでも工業的実施可能な
方法としてイオン交換樹脂による吸着法は着目さ
れ、幾つかの方法が提案されて来た。例えば基体
表面に陰イオン交換基が存在するように固定化す
る方法であり、この固定化リパーゼを用いると高
濃度の脂肪酸存在下でも高活性が維持できること
が分かり、特開昭59−17909号（特公昭63−18476
号）として提案された。そして、その後、ムコール由来のリパーゼを弱
塩基性陰イオン交換樹脂に吸着させる方法（特開
昭60−98984号広報参照），活性水素を有しない塩
基性イオン交換樹脂のマクロポア内に多価アルデ
ヒドを用いて固定化する方法（特開昭60−30683
号公報参照）、（特開昭61−15690号公報参照）、ア
ミノ基及びポリエーテル基を官能基として有する
樹脂を用い、これに酵素を吸着させ、さらに多官
能性架橋剤で固定化すする方法（特開昭62−
155089号公報参照）及びカンジダ層の酵母由来の
リパーゼの固定化法（特開昭63−160583号公報参
照）なども提案されて来た。また、リパーゼを固定化する際の方法として特
開昭62−179388号公報には疎水性微孔性ポリマー
を極性溶媒で予備湿潤し、リパーゼが固定化され
る速度を著しく促進した例が報告されている。し
かし、この例はイオン交換基の存在しない疎水性
ポリマーに対する固定化であり、固定化速度の改
善効果のみしか得られなかつた。（発明が解決しようとする課題）ところで、特公昭63−18476号で開示された前
記提案に係る方法は、リパーゼの固定化にそれな
りの効果を有しているが、より高い活性の固定化
リパーゼを大量に製造するためには不充分であつ
た。ここで用いる固定化リパーゼを大量生産するた
めには高度に精製したリパーゼが大量に必要とな
る。また、陰イオン交換基が結合している高分子基
体は疎水性であるため、リパーゼ酵素溶液との混
合がうまくゆかなかつた。即ち、固定化率を固定化に用いた酵素量に対す
る固定化された量で表現すると、固定化率は固定
化リパーゼの生産量を増やす毎に悪くなり、また
混合条件によつて非常にバラツキが大きくなる問
題があつた。本発明はかかる問題に着目し、特にリパーゼ酵
素溶液のイオン強度、極性溶媒濃度などを特定す
ることにより、また更に吸着後の処理を見出すこ
とによりリパーゼの固定化率を上昇させ高活性の
固定化リパーゼを大量に調製可能ならしめること
を目的とするものである。（課題を解決するための手段）上記目的を達するため本発明においては陰イオ
ン交換体にリパーゼを吸着させて固定化リパーゼ
を調製するにあたり、リパーゼ酵素溶液をイオン
強度0.1以下にすると共に水に混和する極性溶媒
を該溶液に対し40〜70容量％加える。また、上記リパーゼ酵素溶液をイオン強度0.1
以下にすると共に水に混和する極性溶媒を該溶液
に対し40〜70容量％添加し吸着させた後、多価性
反応試薬で処理する。ここで、上記本発明におけるリパーゼは微生物
や高等動植物で生産される酵素で、エステル結合
に作用してエステル分解やエステル交換あるいは
エステル合成作用を触媒する生体高分子である。上記の作用を有するものであれば、エステラー
ゼとかホスホリパーゼと呼ばれるものも包含す
る。とくに牛脂などの高融点の油脂を分解する場
合、耐熱性にすぐれ、脂質との親和性が良く、反
応の起ち上がりが早く、脂質を高分解率まで分解
するシユードモナス・フルオレツセンス由来のリ
パーゼは最も好適である。本発明の固定化リパーゼの担体としては、ポリ
スチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリ
レートとジビニルベンゼンの共重合体、フエノー
ル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂等の疎水性
の基体にできるだけ多くの陰イオン交換基を導入
した陰イオン交換体を用いる。陰イオン交換体は
リパーゼ結合面積を増加させるため、マクロポー
ラスな多孔性担体が望ましい。この場合、マクロ
ポーラス担体の細孔直径は用いるリパーゼ分子の
10〜100倍である10²〜10⁴オングストロームのも
のが用いられる。このような担体として具体的に
はダウエツクスMWA−１（ダウケミカル社製）、
ダウエツクス66（ダウケミカル社製）、ダイヤイオ
ンWA−30（三菱化成工業社製）などがあげられ
る。又、用いる極性溶媒としては水に混和し、酵素
を失活させない極性溶媒であれば良く、具体的に
はエタノール、イソプロピルアルコール等があげ
られる。そして、固定化リパーゼの製造にあたつては、
先ずイオン強度0.1以下に脱塩したリパーゼ酵素
溶液に水と混和する極性溶媒を40〜70容量％加え
て遠心等により不純タンパクを除いた後、担体と
接触させると、一般に酸性タンパクであるリパー
ゼは陰イオン交換体にイオン結合するほか、疎水
性アミノ酸に富むリパーゼタンパクは疎性水性担
体と強固に疎水結合する。その後、未固定のリパ
ーゼを洗浄することにより、容易に固定化リパー
ゼを得ることができる。なお、より強固に固定化する場合にはグルタル
アルデヒド等の多価性反応試薬で処理する。しか
し多価性反応試薬は食品等に混入すると好ましく
ないので、反応終了後、未反応の多価性反応試薬
を還元剤等で完全に除去した後、充分に水洗す
る。更に本リパーゼによる固定化量は、リパーゼ１
分子に対し1000個以上の陰イオン交換基が存在す
る様に結合させる。実際にはできるだけ多くのイ
オン交換基を導入した担体にリパーゼを吸着させ
る。リパーゼの吸着量を増していくと未吸着のリ
パーゼも除々に増加するが、ある量以上になると
急に増大する。その量以下にリパーゼ吸着量を押
さえれば前記の目的を確実に達成することができ
る。（作用）本発明はイオン強度を0.1以下に低下させて、
担体とリパーゼタンパクのイオン結合作用により
リパーゼが担体に吸着するものである。イオン強
度を0.1以上にすると、担体とリパーゼタンパク
のイオン結合が弱まり、リパーゼの吸着量も減少
し、高活性の固定化リパーゼが得られなくなる。
従つて、0.1以下とすることにより高活性の固定
化リパーゼを得る。又、本発明は極性溶媒を40〜70容量％リパーゼ
酵素溶液に加えることにより陰イオン交換体の基
体である疎水性のポリスチレン等がリパーゼ酵素
溶液と混合吸着しやすくなり、リパーゼタンパク
と疎水性基体の疎水結合は低下するにもかかわら
ず、固定化率が大幅に向上する。その上、極性溶
媒を40〜70容量％添加するとリパーゼ以外の夾雑
タンパクの除去が容易にできる。夾雑タンパクを
除去した酵素液より固定化を行えば、夾雑タンパ
クが固定化担体に吸着する量が少なくなるためリ
パーゼタパクの吸着量が増加し、高活性のリパー
ゼが得られることになる。なお、極性溶媒が40％
以下では夾雑タンパクの除去が難しく、また極性
溶媒が70％以上になると、極性溶媒の体積が増加
することにより、リパーゼタンパク濃度が減少
し、大量のリパーゼタンパクを固定化担体に吸着
させることが困難になり実用に適合しなくなる。（実施例）以下、更に本発明の実施例について説明する。
なお、実施例中におけるリパーゼ活性はNordら
の変法（山田浩一、大田安英、町田晴夫、日農化
36巻860（1962））によつて測定を行い、60℃でPH
7.0で１分間に１マイクロ当量の酸を遊離する酵
素量を１単位とした。又表中の固定化率は固定化前及び固定化後の酵
素液中のリパーゼ活性を測定し下記式により産出
した。固定化率（％）＝固定化前酵素液のリパーゼ活
性−固定化後酵素液のリパーゼ活性／固定化前酵素液の
リパーゼ活性×100 用いたリパーゼ溶液は、シユウドモナス・フル
オレツセンス・バイオタイプ−No.1021（微工研
菌寄第5495号）の培養液上澄みを脱塩濃縮したも
のを用いた。実施例１シユウドモナスフルオレツセンスバイオタ
イプの培養上澄み液を脱塩濃縮した液（以下pf
−ｃと略する）を用いて、ダウエツクス−66にリ
パーゼを固定化した。固定化はpf−ｃに種々の濃
度のエタノールを加え5000RPMで20分遠心後上
澄み40ｇを取りダウエツクス−66、10ｇに加え８
℃にて１夜しんとう処理して固定化を行つた。固
定化後グルタルアルデヒド（25％）1.6ｇを加え
８℃で10分しんとう後、20％亜硫酸水素ナトリウ
ム２ｇ加え更に８℃で10分しんとう処理を行い、
余分のグルタルアルデヒドを除いた後、水で良く
洗浄して固定化リパーゼを得た。示したようにエタノールを40％以上添加する事
に依り固定化率が90％以上示した。

【表】実施例２十分脱塩処理したpf−ｃに対してエタノールを
5.0％添加後遠心処理した上澄みに食塩を種々の
濃度添加してイオン強度０から0.5の酵素溶液を
調製した。前法に従つてこの酵素溶液をダウエツ
クス−66に固定化した。なお得られた固定化リパーゼを用いて油脂分解
能を測定した。すなわち固定化リパーゼ１ｇにオリーブオイル
１ｇ、水１ｇ加え60℃で48時間反応後油脂加水分
解率を測定した。油脂加水分解率（％）＝（酸化／けん化価）×100
より油脂加水分解率を求めた。結果は第２表に示したようにイオン強度０から
0.1の酵素溶液を用いた場合は固定化率が95％以
上であり、油脂分解活性が高い固定化リパーゼが
得られた。

【表】

【表】実施例３ pf−ｃに(1)水、(2)メタノール、(3)エタノール、
(4)イソプロピルアルコール、(5)アセトンを50％加
え5000RPMで20分遠心後上澄み液を用いてダウ
エツクス−66に酸素を固定化した。結果を第３表
に示す。

【表】実施例４ pf−ｃに等容のエタノールを加え、混合液を
4000RPMで20分間遠心分離した。上澄み液800ｇ
（330単位／ｇ）にダウエツクス−66、200ｇを加
え８℃にて１夜浸透処理して固定化を行つた。固定化後グルタルアルデヒド（25％）32ｇ加え
８℃で10分しんとう処理を行い、余分のグルタル
アルデヒドを除いた後、水で良く洗浄して固定化
リパーゼを得た。固定化率は82.7％で、油脂分解能は92.5％であ
つた。この例により固定化リパーゼを大量調製しても
高活性のリパーゼがえられることが分かつた。（発明の効果）本発明は以上のように陰イオン交換体にリパー
ゼを吸着させて固定化リパーゼを調製するにあた
り、リパーゼ酵素溶液のイオン強度0.1以下に低
下させ極性溶媒を40〜70容量％加える方法であ
り、イオン強度を0.1以下に低下させることによ
り担体とリパーゼタンパクのイオン結合作用によ
りリパーゼが担体に吸着しリパーゼの吸着量を十
分に確保することができると共に、極性溶媒の所
定量の添加により陰イオン交換体の基体である疎
水性樹脂がリパーゼ酵素溶液と混合吸着し易くな
り、リパーゼタンパクと疎水性基体の疎水結合は
低下するにかかわらず、固定化率を大幅に向上す
ることができる。しかも、極性溶媒の添加により
リパーゼ以外の夾雑タンパクの除去が容易にで
き、夾雑タンパクの吸着量が減少してより高活性
のリパーゼが得られ、本発明方法は従来法に比し
固定化率の高い、しかも高活性の固定化リパーゼ
を大量に調製できる顕著な効果を奏する。特に請求項２記載の如く多価性反応試薬で処理
するときはより強固に固定化することができる。また上記得られた固定化リパーゼは安定で、長
時間連続使用しても高活性が維持でき、実用上極
めて有利である。

Claims

【特許請求の範囲】１陰イオン交換体にリパーゼを吸着させて固定
化リパーゼを調製するにあたり、リパーゼ酵素溶
液をイオン強度0.1以下にすると共に、水に混和
する極性溶媒を該溶液に対し40〜70容量％添加す
ることを特徴とする固定化リパーゼの製造方法。２陰イオン交換体にリパーゼを吸着させて固定
化リパーゼを調製するにあたり、リパーゼ酵素溶
液をイオン強度0.1以下にすると共に、水に混和
する極性溶媒を該溶液に対し40〜70容量％加えて
吸着させた後、多価性反応試薬で処理することを
特徴とする固定化リパーゼの製造方法。３陰イオン交換体の基体としてマクロポーラス
な疎水性樹脂を用いる請求項１又は請求項２記載
の固定化リパーゼの製造方法。４リパーゼ吸着量が陰イオン交換容量の1000分
の１以下である請求項１，請求項２又は請求項３
記載の固定化リパーゼの製造方法。