KR101153396B1 - 버퍼혼합시스템을 이용하여 리파아제를 담체에 고정화시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리파아제의 고정화 공정에 버퍼혼합시스템을 개발하여 고활성과 고안정성의 고정화 리파아제들과 동시고정화 리파아제를 생산하는 방법에 관한 것으로, 효소의 활성을 증가시켜주는 양쪽성이온 계열의 버퍼와 효소의 활성을 유지시켜주는 인산염계열의 버퍼를 혼합하여 담체의 포어 크기를 조절하거나 다른 첨가제를 사용하는 등 복잡한 방법을 사용하지 않으면서도 고활성 및 고 안정성의 고정화 및 동시고정화 리파아제를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 상기와 같이 버퍼혼합시스템을 이용하여 고정화 및 동시고정화 된 리파아제를 여러 번 재사용 할 경우에도 리파아제의 활성이 완벽하게 유지되어 경제적으로 값비싼 효소를 반복적으로 재사용할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있으므로 산업상 매우 유용한 발명이다.

Description

버퍼혼합시스템을 이용하여 리파아제를 담체에 고정화시키는 방법 {Methods for immobilizing lipase on carrier using buffer mixed system}

본 발명은 버퍼혼합시스템을 이용하여 리파아제를 담체에 고정화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 리파아제를 담체에 고정화시키는 방법에 있어서, 오일과 반응시키는 전처리 과정을 거친 리파아제와 알데히드기가 부착된 담체를 양쪽성 이온계열의 버퍼와 인산염 계열의 버퍼를 혼합한 버퍼혼합시스템에서 공유결합시킴으로써 리파아제를 담체에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 리파아제의 고정화 방법에 관한 것이다.

효소를 이용한 생물공정은 화학공정에 비해 온화한 반응조건에서 반응이 진행되어 화학공정에 비해 에너지가 절약되며, 공정이 단순하여 공정비용이 적게 드는 장점이 있다. 하지만 이용되는 효소의 가격이 고가이며, 효소의 낮은 안정성이 낮은 것이 극복해야 할 단점이다. 이러한 문제를 해결하고 공정비용의 감소를 위해 효소의 고정화가 널리 이용되고 있다. 효소를 고정화하면 반응에 사용한 효소를 다음 반응에 재사용할 수 있어 효소의 높은 가격 문제를 해결하여 공정비용을 감소시킬 수 있으며, 고정화하지 않는 효소보다 안정성이 증대되어 공정에 더 효율적으로 이용할 수 있다.

효소의 고정화 방법은 아민을 가교시키기 위해서 글루타르알데히드와 같은 과량의 이기능제로 처리된 알루미나와 같은 금속산화물에 폴리아민을 흡착시키고, 금속 산화물의 세공에 이결과의 중합체를 포괄하고, 결합 알데히드기와 효소의 아미노기 사이에서 공유결합이 형성되도록 효소와 덩어리를 접촉시키는 것으로서 레비와 푸시에 의한 미국 특허 제4,141,857호에 기술되어 있다. 고정화 효소 시스템의 유효 수명은 효소활성도의 계속적인 감소로 제한된다. 이 시스템에서 효소를 불활성화로 이끄는 많은 메커니즘은 효소가 원료 중의 불순물로 저해를 받거나, 사용기간 동안 효소의 다른 화학적 변이가 발생하거나, 효소가 변성되거나, 효소의 분해를 가져오는 효소 결합기와 효소와의 결합이 파열이 되거나 결합기와 중간결합층사이의 결합이 분해되거나, 지지체에 효소를 결합시키는 화학결합분해 또는 물리적 절단에 의한 결합층의 상실에 그 원인이 있다.

리파아제는 동, 식물성 기름의 가수분해(Hydrolysis), 그 역반응인 에스테르화(Esterification), 그리고 알코올과 기름을 트랜스에스테르화(Transesterification)하여 에스테르(Ester)를 생성하는 반응 등 다양한 반응을 일으킬 수 있는 효소로서 바이오디젤을 생산하는 효소적 공정에 많이 사용된다. 뿐만 아니라 이부프로펜계열인 (R, S)-나프록센과 (R, S)-케토프로펜 과 같은 광학이성질체의 분리, 생산에도 이용되는 등 그 산업적 가치는 날로 증가하고 있다. 이러한 리파아제가 실제 산업에 쓰이기 위해서는 고정화 리파아제의 제조가 필수적이다.

이처럼 다양한 분야에서 사용되고 있는 리파아제의 고정화를 위한 다양한 연구가 이루어져 왔으며, 대표적으로 흡착법 및 공유결합법이 이용되고 있다. 흡착법에 의한 리파아제 고정화는 리파아제의 활성이 높은 장점이 있으나, 리파아제의 유실이 쉽게 일어나 고정화의 주목적인 재사용에는 적합하지 못하다. 그러나 공유결합법에 의한 리파아제 고정화는 리파아제의 유실이 거의 일어나지 않아 여러 번 재사용에 적합한 고정화 방법이다. 공유결합법은 글루타르알데히드를 담체에 부착한 뒤에 형성된 담체의 알데히드기와 리파아제에 존재하는 아미노기와 반응하여 이민그룹을 형성시키는 방법이 이용된다. 그러나 알데히드기의 높은 반응성 때문에 이민그룹이 형성되지 않고 중합반응이 주로 일어나서 고정화반응이 거의 일어나지 않는 현상이 발생하게 된다. 그러므로 글루타르알데히드의 반응성을 최소화시키면서 고정화를 진행하게 된다. 더욱이 리파아제의 활성부위 부근의 아미노기가 담체의 알데히드기와 공유결합된다면, 리파아제의 활성부위가 제대로 작동하지 못하거나, 기질에 접촉하기가 어려워 그 활성이 현저히 떨어지게 된다. 따라서 기존에는 고정화시의 리파아제의 활성 저하를 막기 위하여 담체의 포어 크기를 조절하거나 효소활성이 없는 다른 단백질을 함께 고정화시키는 등 복잡한 방법에 의존하고 있다 (Cleide M. F Soares et al., Biotechnol. Prog., 19, pp 803-807, 2003). 이에 따라 본 발명자들은 리파아제의 고정화시에 담체의 포어의 크기나 다른 첨가제를 사용하지 않으면서도 간단한 방법으로 리파아제를 담체에 고정화시키기 전에 전처리과정을 거침으로서 높은 효소의 활성을 유지할 수 있도록 할 수 있는 방법을 개발하였다 (등록특허 10-0817775).

이에 따라 본 발명자들은 효소의 활성은 극대화시키고 고정화의 링커인 글루타르알데히드의 경우 활성을 극소화시키는 완충용액을 개발할 경우 고정화리파아제의 활성이 더욱 증가할 것이라는 점에 착안하여, 높은 활성과 안정성을 나타내는 완충용액을 선별하여 고정화과정에서 발생할 수 있는 글루타르알데히드의 중합반응을 최소화시켜 고활성의 리파아제를 생산할 수 있는 버퍼시스템을 제공하고 이러한 고정화공정을 통해 생산된 고정화 및 동시고정화 리파아제를 수회 반복 재사용 할 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 리파아제를 담체에 고정화시킬 때 효소의 활성과 안정성을 나타내는 버퍼혼합시스템을 개발하여 고정화 및 동시고정화 된 리파아제의 활성을 높게 유지할 수 있을 뿐만 아니라 여러 번 재사용 시에도 활성을 높게 유지할 수 있는 리파아제를 담체에 고정화시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 리파아제를 담체에 고정화시키는 방법에 있어서, 오일과 반응시키는 전처리 과정을 거친 리파아제와 알데히드기가 부착된 담체를 양쪽성 이온계열의 버퍼와 인산염 계열의 버퍼를 혼합한 버퍼혼합시스템에서 공유결합시킴으로써 리파아제를 담체에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 리파아제의 고정화 방법을 제공한다.

본 발명자들은 이전 연구에서 리파아제의 고정화시에 담체의 포어의 크기나 다른 첨가제를 사용하지 않으면서도 간단한 방법으로 리파아제를 담체에 고정화시키기 전에 전처리과정을 거침으로서 높은 효소의 활성을 유지할 수 있도록 할 수 있는 방법을 개발하였다 (등록특허 10-0817775). 이에 따라 본 발명자들은 효소의 활성은 극대화시키고 고정화의 링커인 글루타르알데히드의 경우 활성을 극소화시키는 완충용액을 개발할 경우 고정화리파아제의 활성이 더욱 증가할 것이라는 점에 착안하여, 추가적인 연구를 통해 높은 활성과 안정성을 나타내는 완충용액을 선별하여 고정화과정에서 발생할 수 있는 글루타르알데히드의 중합반응을 최소화시켜 고활성의 리파아제를 생산할 수 있는 버퍼시스템을 제공하고자 본 연구를 수행하였다. 따라서 본 명세서에 참조로서 편입된 선행문헌들로부터 리파아제를 담체에 고정화시키는 방법을 인용할 수 있으며, 본 발명은 고정화시 사용되는 새로운 버퍼혼합시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서, 상기 리파아제는 담체에 고정화시키기 전에 리파아제의 기질인 지방산을 리파아제의 활성부위에 결합시키기 위하여 리파아제를 지방산이나 오일과 반응시키는 전처리 과정을 거친다.

오일을 리파아제와 반응시켜 오일의 가수분해 반응을 유도하면 오일은 리파아제에 의해서 글리세롤(glycerol)과 지방산으로 분해된다. 이때 생성된 지방산은 친유성이기 때문에 수용액 상으로의 확산이 어려워 일부가 리파아제의 활성부위에 남아 있게 되고, 이것이 추후 고정화시 리파아제의 활성부위를 보호하여 고정화된 리파아제가 높은 활성을 갖도록 해준다.

뿐만 아니라, 리파아제는 구조상 리드(Lid)를 가지고 있어 기질이 리드와 결합할 경우 활성이 증가하게 되는 표면활성(Interfacial activation) 이라는 특징을 가지고 있다. 본 발명의 전처리 과정을 통해서 리파아제를 표면 활성이 일어난 상태로 만들게 되고 추후 고정화에 리파아제가 이러한 상태로 고정화가 되어 고정화시 높은 활성을 갖도록 해줄 수 있다.

본 발명에서, 상기 담체는 글루타르알데히드를 담체와 반응시켜 담체에 알데히드기를 부착하는 과정을 거친다. 상기와 같이, 전처리 과정을 거친 리파아제와 알데히드기가 부착된 담체를 버퍼시스템에서 공유결합시킴으로써 리파아제를 담체에 고정화시키게 된다.

본 발명의 리파아제 고정화 방법은 리파아제를 담체에 공유결합법으로 고정화시키는 방법으로 당업계에 알려진 것이면 어느 것이나 사용 가능하며 담체 역시 당업계에 알려진 것이면 어느 것이나 가능하다. 구체적인 예로는 실리카 겔 등을 들 수 있다.

공유결합법에 의한 리파아제 고정화는 리파아제의 유실이 거의 일어나지 않아 여러 번 재사용에 적합한 고정화 방법이다. 공유결합법은 글루타르알데히드를 담체에 부착한 뒤에 형성된 담체의 알데히드기와 리파아제에 존재하는 아미노기와 반응하여 이민그룹을 형성시키는 방법이 이용된다. 그러나 알데히드기의 높은 반응성 때문에 이민그룹이 형성되지 않고 중합반응이 주로 일어나서 고정화반응이 거의 일어나지 않는 현상이 발생하게 된다. 그러므로 글루타르알데히드의 반응성을 최소화시키면서 고정화를 진행하게 된다.

본 발명자들은 이와 같은 글루타르알데히드의 반응성을 최소화하면서도 고정화 리파아제의 활성을 증가시킴과 동시에 리파아제의 활성을 오랫동안 유지시킬 수 있는 새로운 버퍼혼합시스템을 개발하였다.

본 발명의 리파아제의 고정화 방법에서, 리파아제의 활성부위를 그 기질로 전처리하고 담체의 알데히드기와 리파아제의 아미노기가 공유결합함으로써 고정화가 수행되므로 상기 리파아제는 생물공정에 사용될 수 있는 리파아제라면 어느 것이라도 가능하나, 바람직하게는 실제 생물공정에 가장 많이 사용되고 있는 켄디다 루고사(Candida rugosa) 리파아제 또는 리조포스 오라이제(Rhizopus oryzae) 리파아제이다.

본 발명의 리파아제의 고정화 방법에서, 상기 켄디다 루고사 리파아제와 리조포스 오라이제 리파아제를 활성을 더욱 향상시키기 위하여 두 리파아제를 동시에 고정화할 수 있다.

본 발명자들은 켄디다 루고사 리파아제와 리조포스 오라이제 리파아제의 최적 고정화 조건이 동일함을 발견하고 추가적으로 효소 활성의 증가를 위해 동시고정화 공정을 수행하였다. 몇몇의 연구에 따르면, 동시고정화의 경우 중간체를 생성하는 반응에서 두 효소의 거리가 짧아 반응의 유발효과를 유도할 수 있어 각각의 고정화 효소의 활성보다 훨씬 더 높은 활성을 나타낼 수 있다고 보고되어 있다 (Romero C et. al., Enzyme and Micribial Technology 11, pp837-843. Suman and Pundir CS, Current Applied Physics 3, pp129-133. Torabi SF et, al., Journal of Biotechnology 131 pp 111-120). 따라서 본 발명에서는 최적화된 고정화조건에 켄디다 루고사 리파아제와 리조포스 오라이제 리파아제의 동시고정화를 적용하여 활성을 조사한 결과, 최적 조건에서 단독으로 고정화한 경우 켄디다 루고사 리파아제의 활성(910.2 U/g), 리조포스 오라이제의 활성 (880.3 U/g)와 비교하여 현저히 상승된 활성을 나타내었다 (도 5 내지 도 7 참조). 또한 두 가지 리파아제의 혼합비율에 따라 활성에 차이가 있었으며 켄디다 루고사 리파아제와 리조포스 오라이제 리파아제의 혼합비율이 1:1 내지 3:1에서 그 화성이 높은 상승효과를 나타내었으머, 특히 두 리파아제를 동일 비율로 동시고정화한 경우에서 가장 높은 동시고정화 리파아제의 활성(4126.4 U/g)을 나타내었다 (도 7 참조).

본 발명의 리파아제의 고정화 방법에서, 상기 고정화에 사용되는 버퍼는 리파아제의 활성을 증가시켜 주는 양쪽성 이온계열의 버퍼와 효소의 활성을 유지시켜주는 인산염계열의 버퍼를 혼합한 버퍼혼합시스템이다. 상기 양쪽성 이온계열의 버퍼는 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼 또는 Tris-HCl과 NaOH 버퍼이고, 인산염계열의 버퍼는 인산나트륨 버퍼 또는 인산칼륨 버퍼일 수 있다. 바람직하게는 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼이다.

본 발명에서, 용어 “MOPs-HCl과 NaOH 버퍼”는 MOPs 버퍼의 pH를 조절하기 위해 HCl 및/또는 NaOH을 사용한 것을 의미한다. 버퍼분야에서 원하는 pH 조건에 따라 HCl 및/또는 NaOH를 당업자가 용이하게 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 리파아제의 고정화 방법에서, 상기 버퍼혼합시스템은 양쪽성 이온계열의 버퍼와 인산염 계열의 버퍼를 효소의 활성 증가 또는 효소의 활성 유지 둘 중 어느 장점을 더 목적으로 하느냐에 따라 적절하게 혼합비율을 조정함으로써 목적으로 하는 고정화된 리파아제를 얻을 수 있다. 바람직하게는 동일한 비율로 혼합한 버퍼혼합시스템을 사용함으로써 효소의 활성 증가 및 효소의 활성 유지된 고정화 리파아제를 얻을 수 있다. 본 발명의 실험예에서는 효소의 활성 증가 및 효소의 활성 유지 두 장점이 모두 향상됨을 증명하기 위하여 상기 두 가지 버퍼를 동일한 비율로 혼합한 것을 사용하였다.

본 발명의 리파아제의 고정화 방법에서, 상기 고정화는 pH 6.0-7.0 및 이온강도 0.2-0.3 M의 버퍼혼합시스템에서 20-30시간 수행될 수 있다. 본 발명의 실험예 3에서, 리파아제의 고정화에 대한 최적 조건을 탐색한 결과 상기 조건에서 가장 높은 활성을 나타냄을 확인하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 효소의 활성을 증가시켜주는 양쪽성이온 계열의 버퍼와 효소의 활성을 유지시켜주는 인산염계열의 버퍼를 혼합한 버퍼혼합시스템을 이용하여, 담체의 포어 크기를 조절하거나 다른 첨가제를 사용하는 등 복잡한 방법을 사용하지 않으면서도, 고활성 및 고안정성의 고정화 및 동시고정화 된 리파아제를 생산할 수 있다. 또한 본 발명의 버퍼혼합시스템을 이용하여 고정화 및 동시고정화 된 리파아제를 여러 번 재사용 할 경우에도 리파아제의 활성이 완벽하게 유지되어 경제적으로 값비싼 효소를 반복적으로 재사용할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있으므로 화학산업상 매우 유용한 발명이다.

도 1은 다양한 버퍼용액들의 pH에 따른 켄디다 루고사(Candida rugosa) 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 다양한 버퍼용액들의 pH에 따른 리조포스 오라이제(Rhizopus oryzae) 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 다양한 버퍼혼합시스템의 pH에 따른 켄디다 루고사(Candida rugosa) 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 다양한 버퍼혼합시스템의 pH에 따른 리조포스 오라이제(Rhizopus oryzae) 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 다양한 버퍼혼합시스템의 이온강도에 따른 켄디다 루고사(Candida rugosa) 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 다양한 버퍼혼합시스템의 이온강도에 따른 리조포스 오라이제(Rhizopus oryzae) 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 켄디다 루고사와 리조포스 오라이제 리파아제의 비율에 따른 동시고정화 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 MOPs-HCl 버퍼에서 12시간 고정화공정을 수행한 후의 고정화 및 동시고정화 리파아제의 활성 및 고정화율을 각각 나타낸 그래프이다.
도 9a와 9b는 버퍼혼합시스템에서 고정화시간에 따른 켄디다 루고사 및 리조포스 오라이제와 동시고정화 리파아제의 활성 및 고정화율을 각각 나타낸 그래프이다.
도 10은 켄디다 루고사, 리조포스 오라이제 및 동시고정화 리파아제의의 재사용 가능성을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 리파아제의 준비

무위치 특이성 리파아제인 켄디다 루고사 (Candida rugosa) 리파아제는 미국의 시그마 (Sigma Co., USA)사에서 구입하였으며, 1,3-위치특이성 리파아제인 리조포스 오라이제 (Rhizopus oryzae) 리파아제는 독일의 플루카 (Fluka Co., Germany)에서 구입하였다.

실시예 2. 리파아제 고정화를 위한 담체의 제조

담체로는 활성화된 실리카 겔을 제조하였다. 먼저, 건조된 실리카 겔 1g을 10%(v/v) 3-아미노프로필트리에톡시실란의 아세톤 용액 20 mL과 혼합한 다음 일정하게 교반하면서 50℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기와 같이 반응된 실리카 겔을 물로 세척한 후 2시간 동안 60℃에서 건조시켰다. 건조된 실리카 겔을 다양한 버퍼의 다양한 pH (6.0 ~ 8.0)와 이온강도 (0.1M ~ 1.25M)에서 20 mL로 현탁하였다. 25%(w/v) 글루타르알데히드 용액 2 mL을 상기 실리카 겔 현탁액에 첨가한 다음 실리카 겔이 활성화되도록 20℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 활성화된 실리카 겔을 물로 세척한 후 60℃에서 2시간 동안 건조시켰다.

실시예 3. 리파아제의 전처리 공정

130 U/mg의 켄디다 루고사(Candida rugosa) 리파아제와 41.6 U/mg의 리조포스 오라이제(Rhizopus oryzae) 리파아제를 용해시킨 각각의 수용액 10 ml을 대두유 (Soybean oil) 10 ml과 30분 동안 반응시켜 대두유의 가수분해 반응을 유도함으로써 리파아제를 전처리하였다.

실시예 4. 버퍼혼합시스템을 이용한 리파아제의 고정화 및 동시고정화

상기 실시예 2에서 제조한 실리카 겔 500 mg과 상기 실시예 3에서 전처리한 각 리파아제 즉, 켄디다 루고사 리파아제 용액 또는 리조포스 오라이제 리파아제 용액 10 ml을 혼합한 다음, 0.1 M 농도의 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼(MOPS(3-morpholinopropanesulfonic acid) buffer; Sigma-Aldrich)와 0.1 M 농도의 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)를 동일한 pH에서 동일비율로 혼합하여 구성한 버퍼혼합시스템(Buffer mixture system)에서 고정화를 위하여 20℃에서 반응시켰다. 상기 반응액을 여과하고 물로 세척한 후 실온에서 하룻밤 동안 건조시킴으로써 각각의 고정화된 리파아제를 회수하였다.

또한, 0.1 M 농도의 Tris-HCl과 NaOH 버퍼(Tris buffer; Sigma-Aldrich)와 0.1 M 농도의 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)를 동일한 pH에서 동일비율로 혼합하여 구성한 버퍼혼합시스템(Buffer mixture system)을 사용하는 것을 제외하고 상기 공정과 동일하게 리파아제를 고정화하였다.

또한 동시고정화는 켄디다 루고사 리파아제와 리조포스 오라이제 리파아제를 1:3 내지 3:1로 혼합한 용액을 사용하는 것을 제외하고 상기 공정과 동일하게 수행하였다.

비교예 1. 다양한 버퍼용액을 이용한 리파아제의 고정화

인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer), 인산칼륨 버퍼(Photassium phosphate buffer), Tris-HCl과 NaOH 버퍼(Tris buffer; Sigma-Aldrich), 또는 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼를 단독으로 이용한 것을 제외하고 실시예 4와 동일한 공정을 수행하여 고정화 리파아제를 제조하였다.

또한, MOPs-HCl과 NaOH 버퍼와 Tris-HCl 버퍼의 혼합시스템을 이용한 것을 제외하고 실시예 4와 동일한 공정을 수행하여 고정화 리파아제를 제조하였다.

실험예 1. 다양한 버퍼용액을 이용하여 고정화된 리파아제의 활성 측정

비교예 1에서 고정화된 리파아제의 효소 활성을 측정하였다. 효소의 활성을 오랜 기간 유지시켜주는 특성을 나타내는 인산염 계열의 버퍼인 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer; ●) 및 인산칼륨 버퍼(potassium phosphate buffer; ○)와, 효소 및 단백질의 활성을 높여주는 특성을 나타내는 양쪽성이온 계열 버퍼인 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼(■) 및 Tris-HCl과 NaOH 버퍼(□)를 우선 선별하여 다양한 pH에 따른 고정화 리파아제들의 활성을 측정하였다.

리파아제 활성 측정 방법은 다음과 같다. 10%의 대두유를 포함하는 Isooctane 10 mL에 50 mM의 인산염 버퍼(pH 7) 10 mL를 혼합한후 200 mg의 고정화 리파아제를 넣어 37℃, 150 rpm에서 30분 동안 반응시킨다. 반응 후 upper layer의 2 mL를 샘플링하고 cupric acetate-pyridine 시약을 0.5 mL 첨가하여 1분간 반응시킨 후에 UV-spectrophotometer 715 nm에서 측정한다. 1 U의 효소 활성은 1 μmol의 지방산을 1분 동안 전환시킬 수 있는 효소의 양으로 정의된다.

도 1은 다양한 버퍼용액들의 pH에 따른 켄디다 루고사 (Candida rugosa) 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다. 켄디다 루고사 리파아제는 버퍼용액들의 pH가 증가함에 따라 리파아제의 활성이 조금씩 낮게 나타났으며 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼(□)의 pH 6.5에서 가장 높은 활성(760.4 U/g)을 나타내었다.

도 2는 다양한 버퍼용액들의 pH에 따른 리조포스 오라이제 (Rhizopus oryzae) 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다. 리조포스 오라이제 리파아제는 버퍼용액들의 pH가 증가함에 따라 리파아제들의 활성이 증가하였으나, MOPs-HCl과 NaOH 버퍼(□)의 pH 7.0에서 가장 높은 활성(763.5 U/g)을 나타내었다.

도 1과 2에서, 가장 높은 활성을 나타낸 pH 이상에서는 효소의 활성이 점차 감소하는 현상을 나타내었다. 특히 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼의 경우 가장 높은 활성을 나타내었으나 활성유지 기간이 짧은 특성을 나타내었다.

실험예 2. 버퍼혼합시스템을 이용하여 고정화된 리파아제의 활성 측정

버퍼혼합시스템을 사용한 것을 제외하고 실험예 1과 동일한 방법으로 고정화된 리파아제의 효소 활성을 측정하였다. 각각의 동일한 pH의 버퍼를 제조하여 동일비율로 혼합하였다. 버퍼혼합시스템은 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템(●), MOPs-HCl과 NaOH 버퍼와 Tris-HCl 버퍼의 혼합시스템(■), 및 Tris-HCl 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템(▲)을 각각 비교하였다.

효소의 활성을 오랜 기간 유지시켜주는 특성을 나타내는 인산염 계열의 버퍼와, 효소 및 단백질의 활성을 높여주는 특성을 나타내는 양쪽성이온 계열 버퍼의 버퍼혼합시스템의 다양한 pH, 이온강도 및 고정화시간에 따른 고정화 리파아제들의 활성을 측정하였다. 또한, 동시고정화의 경우 고정화시간 및 켄디다 루고사와 리조포스 오라이제 리파아제의 비율에 따른 동시고정화 리파아제의 활성을 측정하였다.

도 3과 4는 다양한 버퍼혼합시스템의 pH에 따른 켄디다 루고사 (Candida rugosa) 및 리조포스 오라이제 (Rhizopus oryzae) 리파아제의 활성을 각각 나타낸 그래프이다. 버퍼혼합시스템을 이용한 고정화의 경우에서, pH가 증가함에 따라 리파아제들의 활성이 증가하였으나 MOPs-HCl과 NaOH와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템(●)의 pH 6.5에서 켄디다 루고사(850.4 U/g)와 리조포스 오라이제 리파아제(832.7 U/g) 모두 가장 높은 활성을 나타내었으며 그 이상의 pH에서는 효소의 활성이 점차 감소하는 현상을 나타내었다. 특히, 리조포스 오라이제 리파아제의 경우 단일 버퍼를 사용했을 때의 최적 pH는 7.0이었으나 버퍼혼합시스템에서는 pH 6.5에서 가장 높은 활성을 나타내어, 버퍼혼합시스템에서 각각의 버퍼의 상호작용에 의해 효소가 영향을 받는다는 것을 간접적으로 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 활성 유지기간의 경우에서도 단일 버퍼에서 나타난 활성유지기간이 짧은 단점이 보완되어 실제로 10배 이상의 활성유지기간을 나타내었다.

도 5와 6은 다양한 버퍼혼합시스템의 이온강도에 따른 켄디다 루고사 (Candida rugosa) 리파아제 및 리조포스 오라이제 (Rhizopus oryzae) 리파아제의 활성을 각각 나타낸 그래프이다. 이온강도는 용액 안에서 염 분자의 수화효과 때문에 효소의 활성에 큰 영향을 미치는 인자로서, 특히 고정화 공정에서는 효소활성에 아주 큰 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다 (Essa, H et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzyme 49, pp61-68). 도 5와 6에서, 이온강도에 따른 리파아제들의 활성을 조사하였으며 0.25 M의 이온강도에서 가장 높은 켄디다 루고사(910.2 U/g)와 리조포스 오라이제(880.3 U/g) 리파아제의 활성이 나타났으며 그 이상의 이온강도에서는 리파아제의 활성이 점차 감소하는 현상을 나타내었다.

실험예 3. 버퍼혼합시스템을 이용하여 동시고정화된 리파아제의 활성 측정

이상의 결과로부터, 켄디다 루고사와 리조포스 오라이제 리파아제의 최적 고정화 조건이 동일함을 발견하고 추가적으로 효소 활성의 증가를 위해 동시고정화 공정을 적용하였다. 몇몇의 연구에서는 동시고정화의 경우 중간체를 생성하는 반응에서 두 효소의 거리가 짧아 반응의 유발효과를 유도할 수 있어 각각의 고정화 효소의 활성보다 훨씬 더 높은 활성을 나타낼 수 있다고 보고하였다 (Romero C et. al., Enzyme and Micribial Technology 11, pp837-843; Suman and Pundir CS, Current Applied Physics 3, pp129-133; Torabi SF et, al., Journal of Biotechnology 131 pp 111-120). 따라서 최적화된 고정화조건에 켄디다 루고사와 리조포스 오라이제 리파아제의 동시고정화를 적용하여 활성을 조사하였다.

도 7은 켄디다 루고사와 리조포스 오라이제 리파아제의 비율에 따른 동시고정화 리파아제의 활성을 나타낸 그래프이다. 도 7에서, 동일 비율의 켄디다 루고사와 리조포스 오라이제 리파아제에서 가장 높은 동시고정화 리파아제의 활성(4126.4 U/g)을 나타내었다.

도 8은 MOPs-HCl 버퍼에서 12시간 고정화공정을 수행한 후의 고정화 및 동시고정화 리파아제의 활성 및 고정화율을 각각 나타낸 그래프이다. 도 8에서 보면, 12시간의 고정화 시간동안 고정화 및 동시고정화 리파아제의 고정화율은 약 70% 정도였으며, 리파아제 활성은 동시고정화 경우에서 각각의 리파아제 활성보다 현저히 높은 4126.40 U/g을 나타내었다.

도 9a와 9b는 버퍼혼합시스템에서 고정화시간에 따른 켄디다 루고사 및 리조포스 오라이제와 동시고정화 리파아제의 활성 및 고정화율을 각각 나타낸 그래프이다. 도 9a와 9b에서, 고정화 및 동시고정화 리파아제의 활성을 높이기 위한 고정화시간에 대한 리파아제의 활성 변화를 조사하였다. 고정화시간이 증가함에 따라 고정화 및 동시고정화 리파아제의 활성은 증가하였으며 고정화시간이 24시간 일 때, 켄디다 루고사(3756.1 U/g), 리조포스 오라이제(2721.35 U/g), 동시고정화 리파아제(16505.6 U/g)가 가장 높은 활성을 나타내었다.

도 10은 켄디다 루고사, 리조포스 오라이제와 동시고정화 리파아제의 재사용 가능성을 나타낸 그래프이다. 도 10에서, 버퍼혼합시스템을 이용한 고정화 및 동시고정화 리파아제를 생산할 경우의 재사용 가능성을 도시화하였다. 고정화 켄디다 루고사와 리조포스 오라이제 리파아제의 경우 10회 반복 사용 후에도 최초 활성의 90% 이상을 유지하였으며, 동시고정화 리파아제의 13회 반복 사용 후에도 최초 활성의 90% 이상을 유지하였다. 따라서 본 발명의 버퍼혼합시스템을 이용한 고정화공정의 경우 고정화 및 동시고정화 리파아제의 재사용 가능성이 매우 높음을 알 수 있었다.

도 11은 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템 및 Tris-HCl과 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템을 이용한 동시고정화 리파아제의 재사용시 활성유지 성능을 나타낸 그래프이다. 도 11에서, 2가지 버퍼혼합시스템(MOPs + sodium phosphate 및 Tris + sodium phosphate)에서 동시고정화 리파아제의 재사용 및 활성유지 성능을 실험한 결과, MOPs-HCl과 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템의 경우는 20회 재사용시에도 70% 이상의 높은 활성유지 성능을 보였으며, Tris-HCl과 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템의 경우는 40회 재사용시에도 70% 이상의 높은 활성유지 성능을 보였다. 이는 Tris-HCl과 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템이 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템 보다 2배 이상 증가된 활성유지 성능을 보이는 것으로 판단할 수 있다.

이러한 결과는, 2가지 버퍼혼합시스템 모두 단독 버퍼를 사용하는 경우보다 월등히 높은 리파아제의 활성 증가 및 활성 유지 성능을 보이지만, 2가지 향상된 장점 중 높은 활성을 우선으로 하는 경우에는 MOPs-HCl과 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템이 더 적합하고, 반대로 높은 활성 유지 성능을 우선으로 하는 경우에는 NaOH 버퍼와 인산나트륨 버퍼의 혼합시스템이 더 적합하므로 목적에 맞게 더 적절한 버퍼혼합시스템을 선택할 수 있음을 보여준다.

Claims (7)

1. 리파아제를 담체에 고정화시키는 방법에 있어서, 오일과 반응시키는 전처리 과정을 거친 리파아제와 알데히드기가 부착된 담체를 양쪽성 이온계열의 버퍼와 인산염 계열의 버퍼를 혼합한 버퍼혼합시스템에서 공유결합시킴으로써 리파아제를 담체에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 리파아제의 고정화 방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 리파아제는 켄디다 루고사(Candida rugosa) 리파아제 또는 리조포스 오라이제(Rhizopus oryzae) 리파아제인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 켄디다 루고사 리파아제와 리조포스 오라이제 리파아제를 동시에 고정화하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 양쪽성 이온계열의 버퍼는 MOPs(3-morpholinopropanesulfonic acid)-HCl과 NaOH 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 인산염 계열의 버퍼는 인산나트륨 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 버퍼혼합시스템은 양쪽성 이온계열의 버퍼와 인산염 계열의 버퍼를 동일한 비율로 혼합한 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화는 pH 6.0-7.0 및 이온강도 0.2-0.3 M의 버퍼혼합시스템에서 20-30시간 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
   

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