JPH0383582A - 新規シクロデキストリン分解酵素，その製造法及び該酵素を生産する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規シクロデキストリン分解酵素。

その製造法及び該酵素を生産する微生物に関する。

〔従来の技術及び本発明が解決しようとする課題〕最近
、食品工業等においてシクロデキストリンは、各種シク
ロデキストリンの持つ包接作用を利用してスパイス類の
香気成分安定化、マスキングなどの目的で巾広く利用さ
れている。しかし、シクロデキストリンはこれらの機能
を有する反面、実際に食する場合には、香気成分が包接
されている為に、香りを弱く感じたり、嗜好を与えるの
に充分な香気を発生できないという問題点がある。

一方、医薬用としては薬剤の安定化の目的でシクロデキ
ストリンが使用されるが、シクロデキストリンは一般に
消化性、溶解性が悪く、本来の薬効が充分発揮されにく
いという問題点がある。これら問題点を解決するために
は、食品や医薬品を製造後、保存する間はシクロデキス
トリンの包接作用を利用して香気酸分や薬効成分の安定
化を図り、実際に食したり服用する時には、速やかに包
接を解除し、香りや薬効を発生させる技術が必要である
。しかし、一般にシクロデキストリンは分解することが
困難であり、これまでにシクロデキストリンの分解方法
としては、わずかにエキソ−αア２ラーゼによる酵素分
解法（Ｙ、５ｕｚｕｋｉ、　５ｔａｒｃｈ。

迎、　２１１．２４６　（１９８９））酸分解による方
法（特開昭６１−１９１６９０号公報）、固定化酵素に
より開裂する方法（特公昭５Ｂ−１９２７６号公報）が
知られているのみであった。しかしながら、酵素分解法
においては、例えばα−シクロデキストリンとβ−シク
ロデキストリンは分解されるが、いわゆる分岐鎖を持つ
シクロデキストリン等の他のシクロデキストリンへの分
解活性はなく、実用的な効果が期待し難い。

また、酸分解による方法では、分解工程からそのまま経
口的に使用することはできない。さらに、固定化酵素に
より開裂する方法も必ず固定化酵素による反応を経なけ
れば分解することができず、そのまま食したり服用する
ことはできない。前述のように、これら従来の方法は、
食品や医薬品を迅速に効率良く安全に処理するには不適
当であり、その効果も充分ではなかった。従って、本発
明は食品及び医薬品中のシクロデキストリンを迅速に、
かつ効率良く分解する方法を提供することを目的とする
ものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、シクロデキストリンを強力に分解する能
力を有する微生物の検索を広く自然界より行った結果、
土壌より分離したキサントモナス・キヤ“ンペストリス
に属するｌ菌株の生産する酵素が効率良くシクロデキス
トリンを分解することを認め、本発明を完成した。

すなわち、本発明は下記特性を有する新規シクロデキス
トリン分解酵素 Ａ１作用 本酵素はシクロデキストリンを分解する。

Ｂ、　５質特異性 ６−〇−α−Ｄ−グルコシルーシクロマルトヘキサオー
ス、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−シクロマルトヘプタ
オース、６−Ｑ−α−Ｄ−グルコシル−シクロマルトオ
クタオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキ
ストリン、Ｔ−シクロデキストリン５可ン容性澱粉、ア
ミロース、アミロペクチン及びマルトトリオースを分解
する。

Ｃ１至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 ｐＨ３，５〜６．５の範囲で作用し、至適ｐＨは４．５
付近にある。又、ｐＨ４，０〜６．０の範囲で安定であ
る。

Ｄ０作用温度範囲及び最適作用温度 温度３０″Ｃ〜５５℃の範囲で作用し、最適温度は５５
℃付近にある。

Ｅ１分子量 分子量は９３．０００である。

を提供すると共に、キサントモナス属に属し　該新規シ
クロデキストリン分解酵素を生産する能力を有する菌株
を培地に培養し、培養物から該新規シクロデキストリン
分解酵素を採取することを特徴とする該新規シクロデキ
ストリン分解酵素の製造法およびキサントモナス属に属
し、該新規シクロデキストリン分解酵素を生産する能力
を有するキサントモナス・キャンペストリス、さらには
該新規シクロデキストリン分解酵素をシクロデキストリ
ンに作用させることを特徴とするシクロデキストリンを
分解する方法をも提供するものであるＱ以下に、本発明
のシクロデキストリン分解酵素の諸性質について記載す
る。

（１）作用 本酵素はシクロデキストリンを分解する。

（２）基質特異性 ６−〇−α−Ｄ−１’ルコシルーシク口マルトヘキサオ
ース（以下、分岐α−ＣＤという。）、６−０−α−Ｄ
−グルコシルーシクロマルトヘフタオース（以下、分岐
β−ＣＩ）という。）、６−０−α−Ｄ−グルコシル−
シクロマルトオクタオース（以下、分岐Ｔ−ＣＤという
。）、α−シクロデキストリン（以下、α−ＣＤという
、〉、β−シクロデキストリン（以下、β−ＣＤという
、）、Ｔシクロデキストリン（以下、γ−ＣＤという、
〉。

可溶性澱粉、アミ白−ス、アミロペクチン及びマルトト
リオースを分解する。

（３）至適ｐＨ及び安定ｐ）ｌ範囲 ｐＨ３，５〜６．５の範囲で作用し、至適ｐＨは４．５
付近にある。又、ｐＨ４，０〜６゜Ｏの範囲で安定であ
る。

なお、作用ｐＨの測定はα−ＣＤ１％を基質として４５
℃にて１５分間反応させて行い、安定ｐ）Ｉは各ｐｌ（
で４５℃にて３０分間処理した後１．α−ＣＤ１％を基
質としてｐｉ（４，５で４５℃にて１５分間反応させて
行った。

（４）安定温度範囲及び最適作用温度 温度３０″Ｃ〜５５℃の範囲で安定であり、最適作用温
度は５５℃付近にある。なお、安定温度範囲の測定は、
各温度でｐＨ１４，５にて３０分間処理した後、α−Ｃ
Ｄ１％を基質として４５℃にて１５分間反応させて行い
、最適作用温度は、α−ＣＤ１％を基質としてｐＨ４，
５にて１５分間反応させて行った。

（５）分子量 ヘトリックとス藁スの方法（Ｈｅｄｒｉｃ　ａｎｄ　ｓ
ｍｉｔｈｍｅｔｈｏｄ）により推定された本発明の新規
シクロデキストリン分解酵素の分子量は約９３．０００
である。

現在までに、以上のような性質を有する酵素は知られて
いないので、本発明のシクロデキストリン分解酵素は、
新規酵素であると判断した。

本発明のシクロデキストリン分解酵素は、キサントモナ
ス属に属し、上記シクロデキストリン分解酵素を生産す
る能力を有する微生物を培地に培養し、培養物からシク
ロデキストリン分解酵素を採取することによって得るこ
とができる。

本発明で用いるキサントモナス属に属し、シクロデキス
トリン分解酵素を生産する微生物は、以下のような菌学
的性質を有している。

Ａ、形態学的特徴 ■細胞の形及び大きさ：桿菌で、大きさは０．４〜０．
６μｍＸ１．５〜２．０７７ｍ■細胞の多形成　：　無
し ■運　動　性　：　有り、極鞭毛 ■胞子形成能　：　無し ■ダラム染色性　：　陰性 ■抗　酸　性　：　無し Ｂ、培養的性質 次の各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養：生育程度は普通。

黄色で光沢のあるコロニーを形威し、 拡散性の色素は産生しない。

■肉汁寒天斜面培養：生育程度は普通。

黄色で光沢が有り、粘ちょう性を有す る。

■肉汁液体培養：生育は弱く、わずかに混濁と沈渣を生
じ、不完全なリングを 形成する。

■肉汁ゼラチン穿刺培養二表面のみ生育し、ゼラチンの
液化は認められない。

■リドマス・ミルク：極めて遅く、アルカリ性で液化す
る。

Ｃ０生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　： ■脱窒反応 ■ＭＲテスト ■ｖｐテスト　　　　　　　士 ■インドールの生威： ■硫化水素の生成　：　　　± ■澱粉の加水分解　：　　　＋ ■クエン酸の利用　： ■無機窒素源の利用：アンモニア塩を弱く利用し、硝酸
塩は利用しない。

［相］色素の生成　：非水溶性の黄色色素を産生ずる。

■ウレアーゼ　　　・ ■オキシダーゼ　　：　　　± ■カタラーゼ　　　・　　　± ■生育の範囲　　　：　ｐｔｉｓ、　２〜ｐｌ（ｓ、　
６で生育し、１５℃〜４２℃で生育する。

［相］酸素に対する態度：絶対好気性 ＠）Ｏ−Ｆテスト　　：酸化的 ■下記の糖類からの酸及びガスの生成：酸　　　　ガス Ｌ−アラビノース　　＋ Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース　　　＋ Ｄ−マンノース　　　士 Ｄ−フラクトース　　± Ｄ−ガラクトース　　＋ 麦芽糖　　　　　　　十 シ！ｌ　Ｉ！ 乳糖 トレハロース　　　　士 Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット イノシフト グリセリン デンプン　　　　　　＋ Ｄ、その他の生理学的性質 ■ジオキシアセトンの生成： ■エスクリンの分解　　　・　　　　　十■アルギニン
の分解　　　・ ■リジンの脱炭酸反応 ■オルニチンの脱炭酸反応： ■塩化ナトリウムの耐性　：ＮａＣｊ！５％で生育し、
７％で生育しない。

■レシチナーゼ　　　　　・　　　　±■栄養要求性　
　　　　　　　　　有り■シモンズクエン酸ナトリウム
培 地での生育　： ［相］マツコンキー寒天培地での生育：　十■ＴＣＣ寒
天培地での生育： ＠カゼインの分解　　　　　　　　　十〇チロシンの分
解　　　　　　　　　十ＱＴｗｅｅｎ　８０の分解　　
　・　　　　十Ｅ、化学分類学的性質 ■ＤＮＡのＧＣ含量：６７．７％ｍｏｌ■ユビキノン系
　　：ユビキノンー８ ■菌体脂肪酸組成　：イソ分枝脂肪酸含有以上の菌学的
性質をもとに、本発明のシクロデキストリン分解酵素生
産菌の分類学的地位をパージエイズ・マニュアル・オプ
・システマティック・バタテリオロジー第１　＠　（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌｕｍｅ　１（
１９８４））の記載及びその他の研究（Ｉｎｔ、　Ｊ。

５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３０＋　４３７＋
　（１９８０）；　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２７＋　５７＋　
（１９８１）；　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−１ｏｇｙｃａｌ　
Ｒｅｖｉｅ＠４５＋　３１６＋　（１９８１））の記載
と比較して求めたところ、キサントモナス・キャンペス
トリスに属する新菌株であると同定し、型苗をキサント
モナス・キャンペストリス１１１５株と命名した。なお
、型苗は工業技術院微生物工業技術研究所に第１０９４
９号として寄託されている。

上記シクロデキストリン分解酵素生産菌株の培養は、炭
素源、窒素源、無機イオンなどを含有する培地で行えば
よく、炭素源としては、各種シクロデキストリンあるい
はその他の糖類を単独、または２種以上を組み合わせて
用いることができる。窒素源としては、有機窒素化合物
として各種アミノ酸酵母エキス等を、又無無機窒素化合
物としては、塩化アンモニウムを硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、尿素等を単独、または２種以上を組み
合わせて用いることができる。その他、ビタミン、ミネ
ラル等を適宜添加することもできる。

培養温度は１５℃〜４２℃が適しており、さらに望まし
くは２５℃〜３５℃である。培養時のｐＨは５．２〜８
．６が通しており、さらに望ましくはｐ１１６．０〜８
．０である。培養時間は１８〜７２時間、さらに望まし
くは２０〜３６時間である。

培養方法は、液体培養、固体培養の何れでも良いが、好
気的条件下で液体培養するのが望ましい。

培養終了後、通常の方法によりシクロデキストリン分解
酵素を得ることができるが、次にその１例を示す。

まず、培養液を遠心分離して菌体を集める。

得られた菌体を超音波処理することにより破砕し、１０
００００ｘ　ｇで１時間遠心分離して上清液を得る。こ
の上清液を粗酵素として用いることも可能である。さら
に、この上清液に硫酸アンモニウムを加え、４５〜７０
％飽和で沈澱する塩析沈澱物を得る。この沈澱物を透析
して得られる粗酵素をＣＭ−トヨパール６５０Ｍを用い
、塩化ナトリウムＯ’−０，３Ｍのグラジェントイオン
交換クロマトグラフを行い、塩化ナトリウム０．１５Ｍ
付近に溶出される活性画分を集めて脱塩する。次に、Ｐ
ｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０３を用い硫酸アンモニウ
ム１−０Ｍのグラジェント疎水クロマトグラフにより硫
酸アンモニウム０．８〜０．６Ｍで溶出される活性画分
を集め、脱塩し、精製されたシクロデキストリン分解酵
素を得る。

上記の如して得られるシクロデキストリン分解酵素を各
種シクロデキストリンに作用させることにより分解する
ことができる。この酵素を作用させるにあたっては、シ
クロデキストリンの種類や濃度により異なるが、シクロ
デキストリン分解酵素０．０１〜１０単位を加えてｐＨ
３．５〜６．５、温度３０〜５５℃にて３０分以内反応
させればよい。

本発明のシクロデキストリン分解酵素の力価は、１％の
ｃｘ−ＣＤを基質として４５℃，ｐｌ＋４．５（５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液）にて反応を行い、生成する還元糖をソモ
ギイーネルソン（ＳｏｍｏｇｙｔＮｅｌｓｏｎ）法で定
量し、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元
力を生成する酵素量を１単位（１’Ｕ　”）とした。

〔実施例］ 次に、本発明を実施例により説明する。

実施例１　粗酵素の！Ｐｉ製１ Ｏ１１％α−ＣＤ、０．１％硝酸アンモニウム。

０．１４％リン酸二水素カリウム、０．０２％硫酸マグ
ネシウム７水塩、０．２％酵母エキス、２．０％ポリペ
プトン及び微量成分として下記の各成分を培地１，００
０＋＋１に対して下記した割合で添加した培地（ｐＨ６
，３）を作製した。

−徽旦底光一 塩化ナトリウム　　１０■ 塩化マンガン　　　１０１ｍｇ 塩化カルシウム　　ｌＯ■ 塩化第２鉄　　　　ｌＯ■ 塩化亜鉛　　　　　　０．０２６５■ ホウ酸　　　　　０．０１■ 硫酸カルシウム　　０．００５ｍｇ この培地を５００ａｆｆｌ容坂ロフラスコに１００−入
れ、常法に従い１２０　’Ｃで１５分間滅菌した後、キ
サントモナス・キャンペストリス、１１１５１　（ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−１０９４９）を接種し、３０”Ｃで２４時
時間上う培養を行った。

培養終了後、７．ＯＯＯＸｇで遠心分離を行い、培養液
１００　ｒｎｌ当つＩｇの湿菌体を得た。この菌体に１
０ａｔｅの水を加えて懸濁したのち、超音波菌体破砕装
置（ＳＯＮＯＦＩＥＲＣＥＬＬ　ＤＩＳＲＵＰＹＯＲ３
５０、Ｂｒｏｎｓｏｎ　５ｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ社製）
で１０分間処理した０次いで、超遠心分離装置（日立製
７０Ｐ−７２）”ｉ？７０．ｏｏＯＸｇに７１時間遠心
分離し、粗酵素を含む上滑液１０ｍｌ１を得た。

この粗酵素液は培養液１−当り９．７単位の酵素力価を
有していた。

実施例２　粗酵素の調製２ 実施例１で調製した培地を５１容のジャーファメンター
に３１入れ、実施例１において２４時間培養を行った培
養物の１００ｄを接種し、２０−　Ｏｒｐｍ、０．８　
ｖｖｍの条件下で３０℃にて２４時間通気撹拌培養を行
った。培養終了後、実施例１と同様に処理し、粗酵素液
１００ｄを得た。

この粗酵素液は３単位／−の酵素活性を有していた。

実施例３　分解ｌ 実施例２で得られた粗酵素液１　ｍｌを１％分枝α−Ｃ
Ｄ溶液（ｐＨ６，３）　５５！ｌ！に加え、４５℃にて
１０分間分解反応を行った。分解の確認は薄層クロマト
グラフを用い、次のように行った。

反応液をシリカゲル薄層板（メルク社製キーゼルゲル６
０）に適量スポットし、ｎ−プロバノール：ニトロメク
ン：水＝ｉｏ：２＋３の溶媒系を用いて展開し、風乾後
、硫酸発色を行った。

分岐α−ＣＤの標品と比べた結果、分解反応液ではこれ
に相当するスポットは完全に消失しており、分岐α−Ｃ
Ｄはほぼ１００％分解したことが確認された。

実施例４　酵素の精製 実施例２で得られた粗酵素液１００Ｉｄに硫酸アンモニ
ウムを加え、４５〜７０％飽和で沈澱する塩析沈澱物を
得た。この沈澱物の総蛋白量は１．９３５■、総活性は
２，３４８単位であった。

これを透析し、ＣＭ−トヨパール６５０Ｍを用い、塩化
ナトリウム（又は食塩）０〜０．３Ｍのグラジェントイ
オン交換クロマトグラフを行い、塩化ナトリウム（又は
食塩）０．１５Ｍ付近に溶出される活性画分を集め、脱
塩した。活性画分の総蛋白量は７００■、総活性は２．
１８４単位であった。次に、フェニル−トヨパール６５
０Ｓを用い硫酸アンモニウム１〜ＯＭのグラジェント疎
水クロマトグラフにより、０．８〜０．６Ｍで溶出され
る活性画分を集め、脱塩し、精製されたシクロデキスト
リン分解酵素３．６５ｍｇ　（４２９単位／ｍｇ）を得
た。

実施例５　分解２ 実施例４で得られた精製酵素を各種基質に作用させた。

結果を第１表に示す。なお、反応は各種基質１％に実施
例４で得られた酵素を０、０２５単位を加え、ｐＨ４，
５で４５℃にて１５分間行った。

第１表 実施例６ 実施例２で得られた粗酵素液を凍結乾燥した粗酵素粉末
を用いて、わさびの香気および辛みの発現試験を下記の
方法に従い行った。なお、試験結果の評価は訓練された
パネル１０名による官能評価で行い、有意差の有無で判
定した。

粉わさび１００ｇに分岐α−ＣＤ粉末と分岐β−ＣＤ粉
末各々３．５ｇを混合し、そこに水２００ｍを加え攪拌
してシクロデキストリンによる包接を行った。包接の終
了した混合物を凍結乾燥し、約１００ｇのシクロデキス
トリン包接わさびを得た。一方、包接処理を施さない粉
わさびは、常温で１週間保存した後、水で溶く（わさび
１ｇに対して水２戚の割合）と明らかに香気及び辛みが
低下することが官能的に確認（１％の危険率で有意差有
り）できたが、包接処理を行ったわさびは、常温で１週
間保存した後も製造直後と比べて水で溶いても香気及び
辛みの低下は少なく（有意差なし）、シクロデキストリ
ンの包接による香気及び辛みの安定化効果が確認できた
。しかし、製造直後と比べると、同じ分量のわさびから
官能的に感しられる香気及び辛みは包接処理を施さない
粉わさびの方が強く、包接されたわさびのちは弱かった
（５％の危険率で有意差有り）。

さらに、上記シクロデキストリンで包接されたわさびの
製造直後に、実施例２で得られた粗酵素粉末を０．１　
ｗ　ｔ％混合し、常温で１週間保存した後、わさび１ｇ
に対して水２成の割合で加えたものについて官能評価を
行った。その結果、粗酵素粉末を加えたものは、加えな
いものに比べて有意に（１％の危険率）香気及び辛みが
強く、また包接処理を施さない製造直後の粉わさびを水
に溶いたものと比べても強弱の差は無かった。

このように、本発明の新規シクロデキストリン分解酵素
を用いることにより、香気および辛みを効果的に発現さ
せることができた。

〔発明の効果〕

本発明のシクロデキストリン分解酵素は、シクロデキス
トリンを迅速に、かつ効率よく分解することができる。

従って、食品中に含まれる各種物質を包接したシクロデ
キストリンや医薬品中に含まれるシクロデキストリンを
分解し、その効果を発現させるのに有用である。また、
本発明によれば、微生物を用いてシクロデキストリン分
解酵素を効率よく生産することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の新規シクロデキストリン分解酵素の作
用ｐｉ（範囲を示すものであり、第２図はｐＨ安定性を
示す。第３図は当該酵素の温度と活性の関係を示し、第
４図は当該酵素の温度安定性を示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記特性を有する新規シクロデキストリン分解酵
   素。 Ａ、作用 本酵素はシクロデキストリンを分解する。 Ｂ、基質特異性 ６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−シクロマル トヘキサオース、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−シクロ
   マルトヘプタオース、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−シ
   クロマルトオクタオース、α−シクロデキストリン、β
   −シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、可溶
   性澱粉、アミロース、アミロペクチン及びマルトトリオ
   ースを分解する。 Ｃ、至適ｐＨ及び安定ＰＨ範囲 ｐＨ３．５〜６．５の範囲で作用し、至適ｐＨは４．５
   付近にある。又、ｐＨ４．０〜６．０の範囲で安定であ
   る。 Ｄ、安定温度範囲及び最適作用温度 温度３０℃〜５５℃の範囲で作用し、最適 温度は５５℃付近にある。 Ｅ、分子量 分子量は９３，０００である。
2. （２）キサントモナス属に属し、請求項記載の新規シク
   ロデキストリン分解酵素を生産する能力を有する微生物
   を培地に培養し、培養物から請求項１記載の新規シクロ
   デキストリン分解酵素を採取することを特徴とする請求
   項１記載の新規シクロデキストリン分解酵素の製造法。
3. （３）キサントモナス属に属し、請求項１記載の新規シ
   クロデキストリン分解酵素を生産する能力を有するキサ
   ントモナス・キャンペストリス。
4. （４）請求項１記載の新規シクロデキストリン分解酵素
   をシクロデキストリンに作用させることを特徴とするシ
   クロデキストリンを分解する方法。