JPH0368599A - 新規なミクロプロテイン、製造方法および該新規なミクロプロテインの薬剤としての応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なミクロプロティン（微小蛋白）、製造方
法および該新規なミクロプロティンの薬剤としての応用
に関する。

一般にｒジャンピング・ガーキン」として知られている
エフバリウム・エラチリウム種が、プロティナーゼを阻
害する非常に重要なプロティン源であることは知られて
いる。斯くして、特に、下記構造のＥＥＴＩｎ（エフバ
リウム・エラチリウム・トリプシン阻害剤Ｕ）として知
られている上記橿から一つのミクロプロティンが単離さ
れてきた： ４５７　１０　　　１５　　　２０　　　２５［−Ｐｒ
ｏｔｅａｓｅ　　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　　ｆｒｏｍ　
Ｅｃｂａｌｌｉｕｓｅｌａｔｅｒｉｕｍ　　５ｅｅｄｓ
、Ａ、Ｆａｖｅｌ、Ｈ，Ｍａｔｔｒａｓ。

Ｍ、Ａ、　　Ｃｏ１ｅｔｔｉ−Ｐｒｅｖｉｅｒｏ、　　
Ｒ，Ｚｗｉｌｌｉｎｇ、　　Ｅ、＾。

Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　　＆　　Ｃａ５ｔｒｏ、Ｉｎｔｅｒ
ｎａｌ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＰｅｐｔｉｄｅ　＆
　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、；−１）＋　２
Ｄ　ＮＭＲａｎｄ　Ｄｉｓｔａｎｃｅ　Ｇｅｏｍｅｔｒ
ｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　　ｆａｉｄｉｎｇ　　ｏｆ　　Ｅｃ
ｂａｌｌｉｕｍ　　ｅｌａｔｅｒｉｕｍ、ａ　　ｍｅ＋
５ｂｅｒｏｆ　ｔｈｅ　５ｑｕａｓｈ　１ｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ　ｆａｍｉｌｙ、　　Ａ、　　Ｈｅ１ｔｚ。

Ｌ、　　Ｃｈｉｃｈｅ、　　Ｄ、　　Ｌｅ−Ｎｇｕｙｅ
ｎ　　＆　　Ｂ、　　（：ａｓｔｒｏ。

Ｂｉｏｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙ、　　（１９８９）　　２
ｇ、　　ｐ、　２３９２．　２３９８］　０用いられる
命名法はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（
１９８４）Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　
１ｇ３．９−３７のそれである。

特に、２８個のアミノ酸残基、三つのジスルフィド橋お
よび五つのグリシン残基を含むミクロプロティンはトリ
プシンを阻害する性質を示す。

このミクロプロティンの成るアミノ酸残基を他のアミノ
酸で代替させようとして、本発明者は、ウシ膵臓エラス
ターゼとヒト白血球エラスターゼとに対する抗エラスタ
ーゼ作用に益するようにＥＥＴＩＩｒの抗トリプシン作
用が消失している新規なミクロプロティンを合成によっ
て調製した。この生成物は加えて、全合成により大量生
産しうるという利益を提供する。

それゆえ、本発明の主題は、一般式： Ｃ式中 ４位のＸは、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロ
イシン、アラニン、シクロヘキシルアラニン、０−メチ
ルテオニン、フェニルグリシン又はα−アミノ酪酸、ア
ルギニンの残基を表わし、 ５位のＹはイソロイシン又はセリンの残基を表わし、 ７位のＺはメチオニン又はノルロイシンの残基を表わし
、而してＸがアルギニン残基を表わすときＺはノルロイ
シン残基を表わすものとする］に相当する２８個のアミ
ノ酸を含有する新規なミクロプロティンである。

上に定義されたミクロプロティンのうち、特に、５位の
Ｙがイソロイシン残基を表わし、４位のＸおよび７位の
２が既述の意味を有することを特徴とするミクロプロテ
ィンが好ましい。

取分け、７位のＺがノルロイシン残基を表わすもの並び
に、４位のＸがバリン、アラニン又はノルロイシン残基
を表わすものが好ましい。

本発明の好ましいミクロプロティンのうち、４位のＸが
バリン残基を表わし、５位のＹがインロイシン残基を表
わし、７位の２がメチオニン残基を表わすもの、 ４位のＸがアラニン残基を表わし、５位のＹがイソロイ
シン残基な表わし、７位のＺがノルロイシン残基を表わ
すもの、 ４位のＸがノルロイシン残基な表わし、５位のＹがセリ
ン残基を表わし、７位の２がメチオニン残基を表わすも
のが特に好ましい。

本発明の別の主題は、上に定義されたミクロプロティン
の製造方法にして、架橋オキシメチルポリスチレン樹脂
上に、カップリング剤を用い、適宜保護されたアミノ酸
を導入して固相合成を行ない、斯くして形成せるペプチ
ド鎖を樹脂から解放し、アミノ酸を脱保護し、次いで三
つのジスルフィド橋を環化して所望のミクロプロティン
を得ることを特徴とする方法である。

好ましい作業条件において、上記方法は、架橋オキシメ
チルポリスチレン樹脂がｒ　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＣＭ　Ｊ
　　（Ｂｏｃがターチオブチルオキシカルボニル基であ
り、Ｇｌｙがグリシン基であり、ＣＭが架橋オキシメチ
ルポリスチレン樹脂である）タイプの樹脂であり、 カップリング剤がＢＯＰ又は（ペンゾトリアゾール−１
−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム
ヘキサフルオロホスフェートであり、 樹脂からのペプチド鎖解放およびアミノ酸の脱保護が低
温でふつ化水素酸により実施されることを特徴とする。

本発明の主題であるミクロプロティンは非常に有用な薬
理学的性質を有し、特にウシ膵臓エラスターゼとヒト白
血球エラスターゼとに対する顕著な抗エラスターゼ作用
が観察される。他方、この生成物の抗トリプシン作用は
消失している。

これらの性質は後記実施例で例示される。

而して、該性質は、上記式（Ｉ）に相当する新規なミク
ロプロティンの薬剤としての使用を正当化する。

斯くして、本発明の他の主題は、上記一般式（Ｉ）で定
義される新規なミクロプロティンの薬剤としての使用で
ある。

本発明の主題である薬剤のうち、特に、上記一般式（１
）中５位のＹがイソロイシン残基を表わし、４位のＸお
よび７位のＺが既述の意味を有する新規なミクロプロテ
ィンで構成されていることを特徴とする薬剤が好ましい
。

取分け、７位の２がノルロイシン残基を表わすミクロプ
ロティン並びに、４位のＸがバリン、アラニン又はノル
ロイシン残基を表わすミクロプロティンを含む薬剤が好
ましい。

本発明の好ましい薬剤のうち、 ４位のＸがバリン残基を表わし、５位のＹがイソロイシ
ン残基を表わし、７位のＺがメチオニン残基を表わすミ
クロプロティンで構成されているもの、 ４位のＸがアラニン残基を表わし、５位のＹがイソロイ
シン残基を表わし、７位の２がメチオニン残基を表わす
ミクロプロティンで構成されているもの、 ４位のＸがノルロイシン残基を表わし、５位のＹがセリ
ン残基を表わし、７位の２がメチオニン残基を表わすミ
クロプロティンで構成されているものが特に好ましい。

これらの薬剤は、例えば、気腫、肺炎、気管支炎、ニコ
チン中毒ないし大気汚染によって引起こされる肺動脈障
害を治療するための呼吸器学、アテローム性動脈硬化症
を治療するための心臓学、関節炎を治療するためのリュ
ーマチ病学、乾廁、火傷、水庖症を治療し或は皮膚をエ
ージングするための皮膚科学、急性膵臓炎を治療するた
めの胃腸病学並びに、エラスターゼの機能不全を包含す
る障害すべてを治療するための一般的方法で用いられる
。

通常の用量は、使用生成物、治療を受ける患者および懸
案の障害によって変化しつるが、例えば、静脈内ルート
で大人−日当り１〜３００ｍｇでありうる。

本発明の更に他の主題は、有効成分として既述の誘導体
中なくとも１種を含む製薬組成物である。

有効成分として、一般式（Ｉ）に相当するミクロプロテ
ィンは、消化器系、非経口ないし局所ルート向けに意図
される製薬組成物に混入することができる。

これらの製薬組成物は例えば固体ないし液体であり得、
ヒトの薬に一般に用いられる製薬形状例えばブレーン若
しくは糖衣錠剤、ゼラチン質カプセル、カプセル、顆粒
状物、生薬、注射液。

軟膏、エーロゾル形状で供され得、而して通常の方法で
調製される。これらの製薬組成物に通常用いられるタル
ク、アラビアゴム、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マ
グネシウム、カカオ脂、水性ないし非水性ベヒクル、動
物ないし植物源脂肪物質、パラフィン誘導体、グリコー
ル、種々の湿潤剤、分散剤若しくは乳化剤および防腐剤
の如き賦形剤と一緒に１種ないし複数種の有効成分を混
入させることができる。

本発明の使用例を非制限的態様で以下に示す： 轟−ユ：Ｖａｌ−４、Ｎ１ｅ−７誘導体り凰Δ：ペブチ
゛　の　１て 固相合成法を架橋オキシメチルポリスチレン樹脂（以下
ＣＭ樹脂と呼称）に用い、そしてｒ　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−
ＣＭ−樹脂Ｊ　　（Ｂｏｃはターチオブチルオキシカル
ボニル基であり、Ｇｌｙはグリシン基を表わし、ＣＭ−
樹脂は架橋オキシメチルポリスチレン樹脂を意味する）
タイプの樹脂を用いる。

ｇ当り０．４ミリモルのＧｌｙを含有する樹脂を、ＧＩ
ＳＩＮ、　ＢＦ（１９７３）　Ｈｅ１ｖ、　（：ｈｉｍ
、　Ａｃｔａ　５６゜１４７６−１４８２に記載の技法
に従ったセシウム塩性により調製した。

アミノ酸の保護基は下記のものであった；システィン用
のｐ−メトキシベンジル。

アスパラギン用のシクロヘキシルエステル、アスパラギ
ンおよびグリシン用のキサンチル、 アルギニン用のトシル、 セリン用のベンジル、 リシン用の０−クロロベンジルオキシカルボニル、 メチオニンは保護処理しない。

カップリング反応を、ＢＯＰ　（ペンゾトリアゾール−
１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム
ヘキサフルオロホスフェート）を用いて実施した。

カップリングサイクルは下記の如く要約しうる： 肢保１： １−ジクロロメタン中３０％のトリフルオロ酢酸による
洗浄、１分。

２−ジクロロメタン中３０％のトリフルオロ酢酸による
脱保護、３０分。

３−イソプロパノール中３％のエタンジチオールによる
洗浄、１回。

４−ジクロロメタンによる２回の洗浄。

Ｌエヱ１之ｌ： １−Ｂｏａ−アミノ酸とＢＯＰの錯体を添加。

２−撹拌下ジイソプロピルエチルアミン（４当量）次い
で溶剤（ジクロロメタンないしジメチルホルムアミド）
を添加。

３−ニンヒドリンへの陰性反応後ジクロロメタンによる
２回の洗浄。

アセチル化のため、樹脂を無水酢酸／ジクロロメタン（
５０１５０Ｖ／Ｖ）２１合物で１５分間処理する。

メチオニンは保護処理しないので、最後のＢｏａ基はｔ
−ブチル化を遵けるためにふり化水素酸による処理前ト
リフルオロ酢酸で排除される。

斯くして、ｒ　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＣＭ−樹脂Ｊ３ｇから
、手による操作で、保護されたペプチド鎖錯体９．５ｇ
を得た。その樹脂を下記工程に直接用いる：工程１：　
　ベブチ　　−　　　　の 保護ペプチド鎖−樹脂錯体３ｇをアニソール（３ｍ０お
よびジメチルスルフィド（１ｍりの存在下ふっ化水素酸
３０ｍ１と０℃で６０分間反応させる。樹脂をエーテル
で洗浄し、粗製ペプチドを２０％の酢酸水溶液で抽出す
る。凍結乾燥後、粗生成物（未環化）１．１ｇを得、こ
れを下記工程に直接用いる： Ｌ里亙：夏止旦主１１１ 上で得た粗製ペプチド４００ｍｇを水３５０ｍ１に溶解
し、激しく撹拌し、ｐＨ８が得られるまでジイソプロピ
ルエチルアミンを加える【毎時１滴の混合物を回収し、
酸化反応に従わせるためにに、ＨＰＯ，のモル緩衝液（
ｐＨ８）中ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を含有す
る溶液ｌ漬に加える］、全反応にわたり、ジイソプロピ
ルエチルアミンを加えることによってｐＨを８に保持す
る。

５０時間後、ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）による
テストで黄色化のないことが観察される。

得られた生成物をワットマンＭ２Ｏ０Ｄｓカラム上での
高性能リキッドクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
精製し、０．１％トリフルオロ酢酸を含有するＣＨ，Ｃ
Ｎ／Ｈ，Ｏ溶液で溶離する。

得られた留分を凍結乾燥し、最後に所期生成物４０ｍｇ
を回収する。

アミノ酸の組成を下記表１に示す。

例」ニニ旦二 他のアミノ酸を用いるほかは例１と同じ態様で操作し、
下記表１に示す他の誘導体６種を調製した。

アミノ酸の組成を同表１に示す： 例」−旦： 下記処方に相当する注射溶質を調製した二側１の生成物
　　　　　　　　　　　１１ｇ無菌水性賦形剤　　　　
　　　　　　２　　ｍ１園土ユニ 下記処方に相当する錠剤を調製した二 側１の生成物　　　　　　　　　　　２１ｇ（賦形剤の
組成：　ラクトース、澱粉、タルク、ステアリン酸マグ
ネシウム） 鮭土ユニ 下記処方に相当する軟膏を調製した： 例１の生成物　　　　　　　　　　　１０ｍｇる）。

５　Ｘ　　１　０−’Ｍ ６ＸＩＯ−’Ｍ ２．５Ｘ１０−”Ｍ ３Ｘ１０−’Ｍ ８×　１０″？Ｍ ２Ｘ１０−”Ｍ ９Ｘ１０−’Ｍ ６Ｘ１０−”Ｍ ２　Ｘ　　１　０−’Ｍ ２Ｘ１（Ｍ’Ｍ ２．５Ｘ１０−’Ｍ 抗エラスターゼ作用は、ウシエラスターゼおよびヒト白
血球エラスターゼに関し分光光度用量によって測定した
（Ｄｅｌｍａｒ　ａｎｄ　Ｔｏｌｉａ　Ｂｉｏｃｈｅａ
＋。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中 −４位のＸは、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノル
   ロイシン、アラニン、シクロヘキシルアラニン、ｏ−メ
   チルテオニン、フェニルグリシン又はα−アミノ酪酸、
   アルギニンの残基を表わし、 −５位のＹはイソロイシン又はセリンの残基を表わし、 −７位のＺはメチオニン又はノルロイシンの残基を表わ
   し、而してＸがアルギニン残基を表わすときＺはノルロ
   イシン残基を表わすものとする］に相当する２８個のア
   ミノ酸を含有する新規なミクロプロテイン。 ２、５位のＹがイソロイシン残基を表わし、４位のＸお
   よび７位のＺが既述の意味を有することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載のミクロプロテイン。 ３、７位のＺがノルロイシン残基を表わすことを特徴と
   する特許請求の範囲第１項又は２項記載のミクロプロテ
   イン。 ４、４位のＸがバリン、アラニン又はノルロイシン残基
   を表わすことを特徴とする特許請求の範囲第１項、２項
   又は３項記載のミクロプロテイン。 ５、４位のＸがバリン残基を表わし、５位のＹがイソロ
   イシン残基を表わし、７位のＺがノルロイシン残基を表
   わすことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のミク
   ロプロテイン。 ６、４位のＸがアラニン残基を表わし、５位のＹがイソ
   ロイシン残基を表わし、７位のＺがメチオニン残基を表
   わすことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のミク
   ロプロテイン。 ７、４位のＸがノルロイシン残基を表わし、５位のＹが
   セリン残基を表わし、７位のＺがメチオニン残基を表わ
   すことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のミクロ
   プロテイン。 ８、特許請求の範囲第１項記載の新規なミクロプロテイ
   ンを製造するに当り、架橋オキシメチルポリスチレン樹
   脂上に、カップリング剤を用い、適宜保護されたアミノ
   酸を導入して固相合成を行ない、斯くして形成せるペプ
   チド鎖を樹脂から解放し、アミノ酸を脱保護し、次いで
   三つのジスルフィド橋を環化して所望のミクロプロテイ
   ンを得ることを特徴とする方法。 ９、−架橋オキシメチルポリスチレン樹脂が「Ｂｏｃ−
   Ｇｌｙ−ＣＭ」（Ｂｏｃがターチオブチルオキシカルボ
   ニル基であり、Ｇｌｙがグリシン基であり、ＣＭが架橋
   オキシメチルポリスチレン樹脂を示す）タイプの樹脂で
   あり、 −カップリング剤がＢＯＰ又は（ペンゾトリアゾール−
   １−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウ
   ムヘキサフルオロホスフェートであり、 −樹脂からのペプチド鎖解放およびアミノ酸の脱保護が
   低温でふっ化水素酸により実施されることを特徴とする
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、特許請求の範囲第１項記載の一般式（ I ）によ
   り定義される新規なミクロプロテインによって構成され
   ることを特徴とする薬剤。 １１、特許請求の範囲第２項、３項、４項、５項、６項
   および７項のいずれか一項で定義される新規なミクロプ
   ロテインによって構成されることを特徴とする薬剤。 １２、有効成分として特許請求の範囲第１０項又は１１
   項で定義される薬剤の少なくとも１種を含むことを特徴
   とする製薬組成物。