JPH03500603A - 安定な一液性α―アミラーゼ検定用試薬 - Google Patents
安定な一液性α―アミラーゼ検定用試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
安定的な一液性α−アミラーゼ試薬
発明の利用分野
本発明は、一般的には、血清中のα−アミラーゼ濃度の測定用試薬に関し、より
特定的には、安定的な一液性a−アミラーゼ検定用試薬に関する。
発明の背景
α−アミラーゼは、主として膵臓および唾液腺中に見出される。消化管に放出さ
れると、この酵素は澱粉を加水分解する。α−アミラーゼの測定は、膵臓および
耳下腺の疾病の診断に有用である。その血清濃度の上昇は、急性肝臓炎その他の
H臓疾恵はもとより、流行性耳下腺炎および細菌性耳下腺炎にも付随して生起す
る。その血清値の下降は、肝臓の疾病、例えば肝炎および閉塞性黄痕、および肺
腫瘍あるいは肝膿瘍に伴って認められることがある。
歴史的には、血清中のα−アミラーゼの測定方法としては、粘度測定、混濁度測
定、沃素滴定、還元度測定などの技術が用いられてきた。これらの方法によれば
、反応時間が長く、内在性グルコースの干渉を受ける傾向があり、発色は不安定
であって、再現性に乏しい。近年では、a−アミラーゼ測定のための検定系が開
発されている。
そのようなa−アミラーゼに対する検定系として典型的には、標識、例えば色原
体単位を結合させた基質である多糖類またはオリゴ糖類の1種が含まれる試薬が
ある。基質は、α−アミラーゼによって加水分解されて、1〜2種類のより低分
子のオリゴ糖を形成する。試薬は更に、この低分子オリゴ糖を加水分解して標識
単位を遊離する1種またはそれ以上の酵素を含んでいて、次いで分光測光法を用
いてこの標識単位を検出することができる。
このような検定用試薬によれば、歴史的方法に比して、a−アミラーゼの迅速か
つ正確な測定力回能となる。しかしながら、このような試薬は安定性に乏しい。
その結果、検定用試薬は凍結乾燥状態で保存されるのが一般的であり、使用に先
立ってこれを再構成しなければならない。再構成を行なった後は、棚もちは一般
にわずか1〜14日でしがない。また、このような試薬には、背景濃度が一定せ
ず、かつしばしば望ましくない程に高くなる傾向があり、このことがこの系の一
貫性および精度に不利な影響を及ぼすのである。
発明の要約
本発明によれば、生体体液中のa−アミラーゼを迅速に測定するための安定的な
一液性Q−アミラーゼ検定用試薬が提供される。検定用試薬は、a−アミラーゼ
によって直接または間接的に開裂されて反応混液に検出可能な変化を生じること
ができる基質を少なくとも1種類含有し、a−アミラーゼまたはα−アミラーゼ
活性を実質的に保有していない水溶液からなる。検出可能な変化は、検出可能な
成分の生成あるいは除去であっても良い。そのような成分は、光学的、電気化学
的、および熱化学的手段など、いがなる適当な手段を用いても検出することがで
きる。
本発明の好適実施例においては、試薬には、還元性末端に標識が結合した多糖類
の1種あるいは長鎖オリゴ糖である基質が含まれる。基質は、α−アミラーゼに
よって加水分解さhで、短鎖のオリゴ糖を形成し、少なくともそのうちの1種に
標識が含まれる。試薬には更に、少なくとも1種類の細胞外酵素が、好ましくは
β−アミラーゼとa−またはβ−グルコシダーゼとであることが好ましい1対の
細胞外酵素が含まれ、これがオリゴ糖を更に加水分解して標識を遊離し、次いで
、分光測光法を用いて遊離した標識を検出することができる。遊離標識の形成速
度が、生体体液中のQ−アミラーゼ濃度の直接的な指標となるのである。
a−アミラーゼ試薬は、無菌の水および精製された試薬を用い、かつ細胞外酵素
および基質を個別に、あるいは組み合わせて、孔径が約0.2pmを超えないフ
ィルターを通過させてa−アミラーゼ産生細菌を除去することによって、実質的
にa−アミラーゼを含まないようにされる。試薬からのα−アミラーゼの排除は
貯蔵の際の基質の消費を防ぎ、このようにして、試薬が安定化されるのである。
α−アミラーゼ検定用試薬は、細胞外酵素の分解を抑える多価アルコールをこれ
に含有させることによっても、更に安定化される。
発明の詳細な説明
本発明によれば、生体体液または血清中のa−アミラーゼの濃度を測定するため
の検定用試薬が提供される。検定用試薬は、単一の水溶液であって、約2〜約8
℃において少なくとも6ケ月間、好ましくは少なくとも1年間安定である。本明
細書に用いる場合、「安定」なる用語は、試薬が少なくとも95%の再現率を維
持することを意味する。例えば、初めて混合された試薬が、ある特定の試T4に
ついて100単位のa−アミラーゼを分析できたとして、ある決められた期間、
例えば6ケ月後に同一試料について少なくとも95単位、すなノっち当初の分析
の5%の結果が得られる場合に、この試薬は[安定Jであると見なされる。
試薬へのα−アミラーゼ含有生体体液の添加によって、検出可能な産物の生成に
至る一連の反応が開始され、その検出可能産物の生成速度は、生体体液中のα−
アミラーゼ濃度に直接比例する。
検定用試薬は、a−アミラーゼ、および少なくとも1種類の、好ましくは1対の
細胞外酵素によって加水分解される基質を含有する。好適な基質および細胞外酵
素は、ゲンザイム・コーポレーション(Genzyme Corporatio
n)を発明者とする米国特許第4.649.108号明細書に記載されている(
参照により本発明に組み込まれる)。
基質は、a−アミラーゼによって加水分解される多糖類の1種であるのが好まし
く、オリゴ糖であれば更に好適である。基質にはグルコース単位が少なくとも3
個含まれるのが好ましい。基質の還元性の末端グルコース単位は、a−またはβ
−グルコシダーゼによる開裂カ呵能な結合を用いて、その結合の開裂に際して光
学的に測定可能な変化を示す標識に結合されている。基質の末端グルコース単位
は、遮断性原子団に結合されていて、これが、細胞外酵素による末端グルコース
と隣接グルコース単位との間の結合の開裂を阻害する。
標識は、発色団、螢光発色団、化学発光性置換基、あるいは生物発光性置換基の
1種であるのが好ましい。好適な標識としては、p−ニトロフェノール、0−ニ
トロフェノール、例えば4−メチルウンベリフェロンのようなりマリン誘導体、
およびルシフェリンがある。基質は、8個またはそれ以下のグルコース単位を有
するのが好ましく、6個または7個有するのが最も好ましい。好適な遮断性置換
基は、アセタールまたはケタール、例えばベンジリデンである。
好適実施例において用いられる基質は、p−ニトロフェニル;マルトヘプタオシ
ドであって、末端のグルコース原子団は、自発的な加水分解および細胞外酵素と
の反応が妨げられるように遮断されている。この基質は、Q−アミラーゼによっ
て加水分解されて、p−ニトロフェニル=マルトトリオシト、p−ニトロフエニ
ノν:マルトテトラオシド、すなわち遮断されたマルトトリオースおよびマルト
テトラオースなるオリゴ糖を生成する。基質は、その濃度が非律速的となるに足
る量で試薬中に存在するのが好ましい。好適実施例においては、約2mg/mQ
の濃度が用いられる。
検定用試薬は、協調的に作用して標識を遊離させる1対の細胞外酵素を含むのが
好ましい。好適な細胞外酵素としては、β−アミラーゼ、すなわちグルコアミラ
ーゼ、およびα−またはβ−グルコシダーゼのいずれか(標識と還元性末端グル
コースとの間の結合の性質による)がある。基質がa−アミラーゼによって開裂
されさえすれば、β−アミラーゼが、より低分子のオリゴ糖を切断するように作
用して、単一のグルコース単位が生じる。次いで、a−またはβ−グルコシダー
ゼが作用して、存在するグルコース単位から標識を遊離させるのである。
基質の末端グルコース単位には遮断性原子団が結合しているため、いずれの細胞
外酵素も、a−アミラーゼが作用するまでは作用を発揮することができない。し
たがって、細胞外酵素は、a−アミラーゼによる開裂の生成物と完全かつ急速に
反応するに足る量で存在する限り、律速要因となることはなし)。好適実施例に
おいては、β−アミラーゼについては19あたり約5キロ国際単位の濃度が、ま
たa−またはβ−グルコシダーゼについては]、Qあたり約12.5キロ国際単
位の濃度が用いられる。
基質および細胞外酵素に加え、検定用試薬は、カルシウム源、例えば塩化カルシ
ウム、および、追加的塩化物源、例えば塩化ナトリウムを含有する。カルシウム
イオンおよび塩化物イオンは、a−アミラーゼなる酵素の活性化に必要とされる
。塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムは、カルシウムイオンおよび塩化物イオ
ンのいずれもが速度制御的濃度とならないだけの量で存在する。好適実施例にお
いては、塩化カルシウムについては約5ミリモルの濃度が、また塩化ナトリウム
については約50ミリモルの濃度が用いられる。
本発明の実施に際しては、手法の併用によって検定用試薬が安定化される。
第1に、水溶性多価アルコールが試薬に加えられる。α−およびβ−グルコシダ
ーゼは分解速度が大である。多価アルコールはこの過程を抑止する。β−アミラ
ーゼは、a−あるいはβ−グルコシダーゼ程に不安定ではないが、時間が経てば
やはり分解する。この過程もまた、多価アルコールによって抑止される。好適な
多価アルコールは、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン
、ソルビトール、グリコール類、置換されたグリコール類、およびこれらの混合
物からなる1群の中から選択される。好適実施例において用いられる多価アルコ
ールはソルビトールである。
上記の理由から、多価アルコール、好ましくはソルビトールは、試薬の効用に有
害な干渉を行うことなく細胞外酵素の分解を抑止するに足る濃度で試薬中に保存
される。多価アルコールは、どのような量で存在しても酵素の分解を抑止する傾
向があるが、多価アルコールの濃度は、約10〜300 g / Q、好ましく
は約30〜70g/Qの範囲に、より好ましくは約50 g / Qに保たれる
のが好適である。約Log/Q未満の場合、試薬は依然として安定性が不足であ
る。約300g/9を上回る場合は、試薬の安定性はそれ以上増加することはな
く、試薬の粘度が望ましくないまでに上昇する傾向がある。
本発明において、酵素および基質は、試薬のpH値を約4〜約10に、好ましく
は約6.5〜7.5に保つことが可能な緩衝剤の添加によって更に安定化される
。好適な緩衝剤は、両性イオン緩衝液、例えば、3−N−モルホリンプロパン−
スルホン酸CMOPS> 、 N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N“−2
−エタン:スルホン酸(HEPES)、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミ
ノプロパン−スルホン酸(TAPS) 、あるいは3[N−)リス(ヒドロキシ
メチル)メチルアミノコ−2−ヒドロキシプロパン:スルホン酸である。好適実
施例においては、1110Psが用いられる。
両性イオン緩衝液は、約0.01〜約1.0モル/9、好ましくは約0.05〜
約O11モル/Qの範囲で存在するのが好ましい。約1.0モルを上回る両性イ
オン緩衝液の濃度は、そのような濃度によって、試薬のイオン強度が高くなり、
酵素の安定性が損なわれる傾向があるが故に好ましくない。約0.01モル未満
の濃度では、両性イオン緩衝液の有利な作用が減少するが故に好ましくない。
多価アルコールおよび両性イオン緩衝液は、酵素と会合し、それによって酵素に
対して有害に作用する他の成分の会合を妨げることによって、分解を抑止するも
のと考えられる。また、多価アルコールまたは両性イオン緩衝液は、有効な酵素
の3次元配置を保つことによって酵素の失活をも防止するものと考えられる。
β−アミラーゼ、およびα−またはβ−グルコシダーゼは、類ジフテリア菌、シ
ュードモナス・マルトフイリアなど、α−アミラーゼを産生する微生物によって
汚染されることが最も多い。したがって、本発明の実施に際しては、β−アミラ
ーゼ、およびa−またはβ−グルコシダーゼなどの酵素、および好ましくは基質
はすべて、α−アミラーゼ産生微生物を除去するに足る微細なフィルターを通し
て濾過される。酵素は、それぞれ別個に濾過しても良く、あるいは酵素と基質と
を混合してから濾過することもできる。孔径が約0.2μmを超えないフィルタ
ーがa−アミラーゼ産生細菌の除去に充分であることが知られている。
酵素および基質の濾過に加えて、他の汚染源、例えば試薬の製造に用いられる水
あるいは器具からのa−アミラーゼ産生細菌の混入がないことが重要であるとい
うことも周知のことである。したがって、用いられる器具は無菌であって、例え
ばオートクレーブで滅菌されていなければならず、試薬に用いられる水は、蒸留
水、あるいは煮沸された水でなければならない。
酵素の濾過によって、α−アミラーゼ産生細菌は実質的にはすべて除去されるも
のの、試薬中に1種またはそれ以上の抗菌剤、すなわち、混入微生物に対して有
毒な、あるいは少なくとも微生物の増殖を阻害または抑止する能力のある薬剤を
組み込むことも、やはり好ましい。そのような薬剤としては、臭化セチルトリメ
チルアンモニウム(CTh(A) 、コバルト錯体、例えば[Co(NH,)、
()1.0)C1] SO,および[Co [(OH)Co(NHs)4] −
3(SO4)3・4H20、カキグリコーゲン、マクロデキストリン(macr
odextrin) 、バクトリウム(bactrium) 、アジ化ナトリウ
ム、チメロサール(thirrerosal ) 、およびドデシル硫酸ナトリ
ウムがある。
好適実施例において用いられる抗菌剤としては、約0.001%の濃度の臭化セ
チルトリメチルアンモニウム(CTMA) 、約0.075mg/muの量のバ
クトリウム、および約1g/9の量のアジ化ナトリウムがある。
試薬の製造に際しては、回分混合工程としてすべての成分を一度に混合すること
ができる。しかしながら、酵素および基質は高価であるから、緩衝液、酵素濃縮
液、および基質の原液を最初に調製するのが好適である。
大及模生産を目的として、緩衝液原液、酵素濃縮液、および基質濃縮液を別個に
調製すれば、成分溶液を少量ン昆合し、汚染を検査してから酵素および基質濃縮
液の原液全体を緩衝液と混合することが可能となる。
実施例
最初に緩衝液、酵素濃縮液、および基質濃縮液を調製することによって、安定的
な、−液性a−アミラーゼ試薬を製造する。
無菌の、例えば蒸留した水1.0Qを無菌の、例えばオートクレーブで滅菌した
ステンレス鋼の化合物容器に加えて緩衝液を調製する。次いで、K幻PSI0.
460 gをこの水に加える。p!(を測定し、必要とあらば4.0モルの水酸
化ナトリウムを用いてpH7,0±0.03に調整する。これを混合しつつ、下
記の成分を加える。すなわち、EDTAの二ナトリウム塩0.740 g、塩化
カルシウム1.030g、塩化ナトリウム2.920 g、 (精製)ソルビト
ール50.0g、アジ化ナトリウム1.0g、 (D!、ISOに溶かした)バ
クトリウム溶液2.50r++9、および1%臭化CTl1(A1.Omlであ
る。混合液を10分間撹拌し、次いで、pHを測定する。必要とあらば、4モル
の水酸化ナトリウムあるいは6モルの塩酸を用いてpHを7.0±0,03に調
整する。次いで、オートクレーブで滅菌した孔径0.2gmのフィルターを通し
て、エチレンオキシドで滅菌したlQQmQ入り試薬瓶に緩衝液を濾取する。
酵素濃縮液は、無菌の水0.9660 Qを無菌ステンレス鋼製容器に入れてこ
れを調製する。次いで、(、(OPSIo、 460 gをこの水に加える。p
Hを測定し、4モルの水酸化ナトリウムを用いてpH7,0±0.03に調整す
る。これを混合しつつ、下記の成分を加える。すなノフち、EDTAの二ナトリ
ウム塩0.742 g、塩化カルシウム1.030g、塩化ナトリウム2.92
0 g、 (精製)ソルビトール50.0 g、アジ化ナトリウム1.0g、
(DMSOに溶かした)バクトリウム溶液2.50mQ、および1%臭化CT1
.tへ1.Omlである。この溶液に、マルターゼ(a−グルコシダーゼ) 2
.500.0キロ国際単位、およびグルコアミラーゼ(β−アミラーゼ) i、
ooo、oキロ国際単位を撹拌せずに加える。酵素が溶解したならば、混合液を
10分間静かに撹拌し、次いで、オートクレーブで滅菌した孔径0.2μmのフ
ィルターを通して、オートクレーブで滅菌した吸引容器に濾取する。濾取した溶
液は、2〜8℃で24時間貯蔵してから使用に供する。
基質濃縮液は、酵素濃縮液の場合と同様にしてこれを調製するが、酵素の代わり
にp−ニトロフェニル−マルトへブタオシド200.0 gを加え、緩やかに撹
拌して溶解させ、次いで15分間撹拌する点が異なる。次いで、オートクレーブ
で滅菌した孔径02μmのフィルターを通して、オートクレーブで滅菌した吸引
容器に濾取する。
次いで、無菌的条件下で、酵素濃縮液1.0mQ、および基質濃縮液1.Oml
を緩衝液の入った100m+入り試薬瓶に計り取ることによって、a−アミラー
ゼ試薬を製造する。
以上の記載は、本発明の好適実施例に関してなされたものである。本発明に関わ
る技術および技法に習熟した者は、本発明の基本的な精神および対象範囲から著
しく逸脱することなく、記載の組成物および方法に修正および変更を加え得るこ
とを理解するものと思われる。
したがって、前記の内容は、記載の組成物および方法そのものにのみ妥当すると
して解釈されてはならず、それらの最も充分に正当な対象範囲となるべき下記の
請求範囲との整合性を有し、かつそれを補完するものとして理解されなければな
らない。
国際調査報告
Claims (37)
- 1.α−アミラーゼ活性を実質的に保有しない水溶液からなる安定的な一液性α −アミラーゼ試薬であって、α−アミラーゼを含有する試料と混合した場合に、 直接または間接的にα−アミラーゼと反応して該試料中のα−アミラーゼの量を 示す検出可能な変化を反応混液中に生じる少なくとも1種類の基質が含まれるα −アミラーゼ試薬。
- 2.α−アミラーゼによる直接的または間接的な開裂が可能な光学的に検出可能 な標識が基質に含まれる請求項1記載のα−アミラーゼ検定用試薬。
- 3.少なくとも1種類の酵素が更に含まれ、基質がα−アミラーゼと反応して生 成物を生じると、該生成物が酵素と反応して検出可能な変化を反応混液中に生じ る請求項1記載のα−アミラーゼ検定用試薬。
- 4.α−アミラーゼ活性を実質的に持たない水溶液からなる安定的な一液性α− アミラーゼ試薬であって、α−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダーゼによる 開裂が可能な結合によって基質の還元性末端グルコースと該基質の末端グルコー スに結合した遮断性原子団とに結合した光学的に検出可能な標識を有する多糖類 またはオリゴ糖なるα−アミラーゼの基質と、β−アミラーゼと、α−グルコシ ダーゼおよびβ−グルコシダーゼからなる1群から選択され、該基質の還元性末 端グルコースと該標識との間の結合を開製することが可能な細胞外酵素と、該試 薬中の酵素の少なくとも1種類の分解を抑止するに足る量の多価アルコールとか らなるα−アミラーゼ試薬。
- 5.多価アルコールがエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビト ール、グリコール類、置換されたグリコール類、およびそれらの混合物からなる 1群から選択される請求項4記載のα−アミラーゼ検定用試薬。
- 6.多価アルコールが試薬1lあたり約10〜約300gの量で存在する請求項 4記載のα−アミラーゼ検定用試薬。
- 7.多価アルコールが試薬1lあたり約30〜約70gの量で存在する請求項6 記載のα−アミラーゼ検定用試薬。
- 8.試薬のpH値を約4〜約10に保つことが可能な少なくとも1種類の緩衝液 が更に含まれる請求項4記載のα−アミラーゼ検定用試薬。
- 9.緩衝液が試薬のpH値を約6.5〜約75に保つ請求項8記載のα−アミラ ーゼ検定用試薬。
- 10.緩衝液が試薬の酵素の少なくとも1種類を安定化させることが可能な両性 イオン緩衝液である請求項8記載のα−アミラーゼ検定用試薬。
- 11.両性イオン緩衝液が約0.01〜約1.0モル/lの濃度で存在する請求 項10記載のα−アミラーゼ検定用試薬。
- 12.両性イオン緩衝液がMOPS、HEPES、TAPS、TAPSO、およ びそれらの混合物からなる1群から選択される請求項10記載のα−アミラーゼ 検定用試薬。
- 13.両性イオン緩衝液がMOPSである請求項12記載のα−アミラーゼ検定 用試薬。
- 14.酵素の少なくとも1種類をして実質的にすべてのα−アミラーゼ産生微生 物を保留するに足る小孔径のフィルターを通過させた請求項4記載のα−アミラ ーゼ検定用試薬。
- 15.フィルターの孔径が0.2μmを超えない請求項14記載のα−アミラー ゼ検定用試薬。
- 16.酵素および基質をして実質的にすべてのα−アミラーゼ産生微生物を保留 するに足る小孔径のフィルターを通過させた請求項4記載のα−アミラーゼ検定 用試薬。
- 17.フィルターの孔径が0.2μmを超えない請求項16記載のα−アミラー ゼ検定用試薬。
- 18.少なくとも1種類の抗菌剤が更に含まれる請求項4記載のα−アミラーゼ 検定用試薬。
- 19.抗菌剤が臭化CTMA、バクトリウム(bactrium)、アジ化ナト リウム、およびそれらの混合物からなる1群から選択される請求項18記載のα −アミラーゼ検定用試薬。
- 20.安定的な一液性α−アミラーゼ検定用試薬の製造方法であって、少なくと も1種類の緩衝剤を無菌の水に混入させてpH値が約6.5〜約7.5の緩衝液 を調製する段階と、α−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダーゼによる開裂が 可能な結合によって結合された光学的に検出可能な標識と、基質の各末端グルコ ースに結合された遮断性原子団とを有する、α−アミラーゼの基質となる多糖類 の1種またはオリゴ糖、β−アミラーゼ、該標識と該基質との間の結合を開製す ることが可能であって、α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼからなる 1群から選択された細胞外酵素、および、試薬中の酵素の少なくとも1種類の分 解を抑止するに足る量の少なくとも1種類の多価アルコールを該緩衝液に混入さ せる段階と、該基質および酵素が含まれる溶液をして実質的にすべてのα−アミ ラーゼ産生微生物を除去するに足る小孔径のフィルターを通過させる段階とから なるα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 21.混入される多価アルコールの量が緩衝液1lあたり約10〜約300gで ある請求項20記載のα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 22.混入される多価アルコールの量が緩衝液1lあたり約30〜約70gであ る請求項21記載のα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 23.緩衝液が試薬の酵素の少なくとも1種類を安定化させることか可能な両性 イオン緩衝液である請求項20記載のα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 24.混入される両性イオン緩衝液の濃度が約0.01〜約1.0モル/lであ る請求項23記載のα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 25.両性イオン緩衝液がMOPS、HEPES、TAPS、TAPSO、およ びそれらの混合物からなる1群から選択される請求項23記載のα−アミラーゼ 検定用試薬の製造方法。
- 26.両性イオン緩衝液がMOPSである請求項25記載のα−アミラーゼ検定 用試薬の製造方法。
- 27.緩衝液に少なくとも1種類の抗菌剤を混入させる段階が更に含まれる請求 項20記載のα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 28.抗菌剤が臭化CTMA、バクトリウム、アジ化ナトリウム、およびそれら の混合物からなる1群から選択される請求項27記載のα−アミラーゼ検定用試 薬の製造方法。
- 29.安定的な一液性α−アミラーゼ検定用試薬の製造方法であって、少なくと も1種類の緩衝剤およびソルビトールが含まれるpH値が約6.5〜約7.5の 緩衝液を調製する段階と、α−グルコシダーゼまたはβ−グルコシダーゼによる 開裂が可能な結合によって基質の還元性末端グルコースに結合された光学的に検 出可能な標識と、該基質の末端グルコースに結合された遮断性原子団とを有し、 α−アミラーゼの基質となる多糖類の1種またはオリゴ糖を該緩衝液の第1の部 分に混入する段階と、β−アミラーゼ、および、該標識と該基質との間の結合を 開製することが可能であって、α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼか らなる1群から選択される細胞外酵素を該緩衝液の第2の部分に混入させる段階 と、該緩衝液の第1および第2部分のそれぞれを0.2μmを超えない孔径のフ ィルターを通して濾過する段階と、該緩衝液の第1および第2部分を混合する段 階とからなるα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 30.存在するソルビトールの量が緩衝液1lあたり約10〜約300gである 請求項29記載のα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 31.存在するソルビトールの量が緩衝液1lあたり約30〜約70gである請 求項29記載のα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 32.緩衝剤が試薬の酵素の少なくとも1種類を安定化させることが可能な両性 イオン緩衝剤である請求項29記載のα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 33.存在する両性イオン緩衝剤の濃度が約0.01〜約1.0モル/lである 請求項32記載のα−アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 34.両性イオン緩衝液がMOPS、HEPES、TAPS、TAPSO、およ びそれらの混合物からなる1群から選択される請求項32記載のα−アミラーゼ 検定用試薬の製造方法。
- 35.両性イオン緩衝剤がMOPSである請求項34記載のα−アミラーゼ検定 用試薬の製造方法。
- 36.緩衝液に少なくとも1種類の抗菌剤が更に含まれる請求項29記載のα− アミラーゼ検定用試薬の製造方法。
- 37.抗菌剤が臭化CTMA、バクトリウム、アジ化ナトリウム、およびそれら の混合物からなる1群から選択される請求項35記載のα−アミラーゼ検定用試 薬の製造方法。
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