JPH0347802A - Ｎ―アセチルキトオリゴ糖鎖を有するスチレン誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は主に生医学用材料、特に細胞培養用材料として
使用されるスチレン誘導体、ポリスチレン誘導体、およ
びそれらの製造方法に関する。

細胞培養技術の進歩により、細胞の増殖、分化、老化、
ガン化などの仕組みの研究が進むとともに、ワクチン、
ホルモン、インターフェロン等の生理活性物質の生産が
容易になってきている。

また、肝細胞、血管壁細胞、皮膚繊維芽細胞等の各種細
胞の培養研究から、人工肝臓、人工血管、人工皮膚とい
ったバイオ型人工臓器への応用も期待されている。細胞
のもつ多岐にわたる機能を生体外で長期的に発現させる
ために、細胞培養することの意義は大きい。

一例として肝細胞を例に挙げる。肝臓はを推動物におい
ては体内最大の原性器官であり、物質代謝とその調節の
大部分が行われる代謝中枢部である。肝細胞は本来、数
年に及ぶ長い寿命と、肝臓の一部を切除したときには活
発に増殖するように潜在的な増殖能とをもっている。し
かし、生体外で細胞培養を行うと寿命が短くなり、増殖
能をほとんど示さず、代謝活性も急速に失われる。細胞
を培養するためには細胞が接着するための固体表面が必
要である。肝細胞は、通常用いられる表面処理を施した
ガラスやポリスチレン製の培養皿には接着しにくいので
、機能を保持したまま接着、増殖できる生医学材料の開
発が望まれている。

［従来の技術］ 近年、細胞接着や細胞膜情報伝達機構等の分子レベルで
の理解が進むにつれて、糖タンパク質や糖脂質として細
胞膜表面に存在する糖鎖が細胞の認識機能に重要な役割
を演じていることが明らかになってきた。

本発明者らは既に、グルコース、マルトース、ラクトー
ス、マルトトリオース等の単糖やオリゴ糖を側鎖にもつ
ポリスチレンを合成し、これらを塗布した培養皿の上で
ラット肝細胞の接着実験を行った。その結果、これらの
重合体、中でも特にラクトースを側鎖にもつポリスチレ
ンは、血清の有無にかかわらず、肝細胞の接着能を飛躍
的に増大させることがわかり、ハイブリッド型生医学材
料として優れた特性をもつことが明らかになっている（
高分子論文集、Ｖｏｌ、４２．　Ｎｏ、１１．　ｐｐ７
１９−７２４（１９８５））　　。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、これらの単糖やオリゴ糖を側鎖にもつポ
リスチレンは優れた細胞認識機能をもつが故に、特定の
細胞、例えば肝細胞等のいくつかの細胞には良好な接着
、増殖能を発現するが、その他の細胞には接着、増殖能
を示さない。従って、生医学材料として幅広い用途展開
をはかるためには、さらに別の細胞に対する接着、増殖
能をもった種々の生医学材料の提供が望まれている。

本発明は、新規な生医学材料、特に細胞の認識機能や接
着機能を有することが期待される新規な生医学材料およ
びその製造方法を提供することを目的としている。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上記課題につき鋭意検討を重ねた結果、Ｎ
−アセチルキトオリゴ糖の誘導体とビニルベンジルアミ
ン又はその誘導体との反応により新規なスチレン誘導体
を得ることができ、更にそのスチレン誘導体の重合によ
り新規な重合体が得られることを見出し本発明に到達し
た。

すなわち本発明は、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖鎖を有す
るスチレン誘導体、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖鎖を側鎖
に有するポリスチレン誘導体、およびそれらの製造方法
に関する。

本発明におけるＮ−アセチルキトオリゴ糖鎖とは、下記
の一般式（７）で表わされる連鎖を言う。

（式中、ｎは１〜数十、好ましくは１〜１０の整数であ
る） Ｎ−アセチルキトオリゴ糖はキチンの加水分解生成物で
ある。構造式（８） （式中、ｎは１〜数士、好ましくは１〜１０の整数であ
る） で表されるキチンは、アミノ基のアセチル化されたＤ−
グルコサミンがβ（１→４）結合したアミノ糖の一種で
、甲殻類、昆虫類、貝類および菌類の細胞壁等、下等動
物の外皮骨格組織の成分であり、セルロースに匹敵する
生産量（１０Ｉ′トン／年）をもつと推定される生物資
源である。キチンは、このような資源としての豊富さに
加えて体内消化性や生体適合性に優れ、さらに傷口治癒
効果もあるため、医用材料として大きな可能性を秘めた
多糖でもある。

さらに、キチンを低分子化、あるいはオリゴ糖化するこ
とにより抗菌性、生分解性、生理活性等が増加する。

また、キチンの構成単糖であるＮ−アセチルグルコサミ
ンは糖タンパク、糖脂質、プロテオグリカン、リボ多糖
やペプチドグリカン等の成分として普遍的に存在する糖
であり、生体認識や生理活性に深くかかわっている。

したがって、キチン鎖、あるいはＮ−アセチルキトオリ
ゴ糖鎖をもつ化合物あるいはその重合体は新規な生医学
材料として有益である。

本発明にかかるＮ−アセチルキトオリゴ糖鎖を有するス
チレン誘導体の製造方法において、先駆物質であるＮ−
アセチルキトオリゴ糖は、キチンの部分加水分解によっ
て得られる。その重合度は１から数十まで任意に選ばれ
るが、反応性その他の見地から１０量体までのものが好
ましい。

このＮ−アセチルキトオリゴ糖の１位のヒドロキシル基
を適当な酸化剤によって酸化することにより、一般式（
５） （式中、ｎは１〜数士、好ましくは１〜１０の整数であ
る） で表されるＮ−アセチルキトオリゴ糖ラクトンが得られ
る。

Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の酸化反応の際、酸化剤には
公知のものが使用できるが、あまり強い酸化剤を用いる
と６位のヒドロキシメチル基が酸化されてしまうので好
ましくない。好ましくはヨウ素あるいは臭素が用いられ
る。また、溶媒には原料であるＮ−アセチルキトオリゴ
糖および酸化剤が溶けるものであれば何でも良いが、好
ましくは水、あるいは水／メタノール混合溶媒が用いら
れる。

上記のＮ−アセチルキトオリゴ糖ラクトンを、ビニルベ
ンジルアミン又はその誘導体と反応させることにより本
発明のＮ−アセチルキトオリゴ糖鎖を有するスチレン誘
導体を製造することができる。

Ｎ−アセチルキトオリゴ糖ラクトンとビニルベンジルア
ミン又はその誘導体との反応の際には、溶媒としてメタ
ノールが好ましく使用される。

上記のビニルベンジルアミン読導体として、ビニル基の
α位及び／又はβ位に低級アルキル基等の置換基を有す
るもの、ベンゼン環に低級アルキル基、低級アルコキシ
基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、脂環式基等の置換
基を有するもの等がある。

Ｎ−アセチルキトオリゴ糖ラクトンと反応させるビニル
ベンジルアミン又はその誘導体は好ましくは一般式（６
） （式中、Ｒ１は水素原子、低級アルキル基であり、Ｒ２
は水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハ
ロゲン原子である） で表されるものである。

従って、本発明の好ましいＮ−アセデルキトオリゴ糖鎖
を有するスチレン誘導体は一般式（１）（式中、Ｒ１は
水素原子、低級アルキル基であり、Ｒ２は水素原子、低
級アルキル基、低級アルコキシ基又はメチル基であり、
Ｒ２は１〜１０の整数である） で表される。

使用するビニルベンジルアミン又はその誘導体は、ｐ（
パラ）一体、ｍ（メタ）一体、０（オルソ）一体のいず
れでもよく、好ましくはｐ一体が用いられる。ｐ−ビニ
ルベンジルアミンは例えば文献（Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ、１５，６６７（１９８３））に示
されているように、Ｎ−ｐ−ビニルベンジルフタリミド
とヒドラジン水和物との反応により調製される。

本発明により得られるＮ−アセチルキトオリゴ糖鎖を有
するスチレン誘導体は新規であり、核磁気共鳴スペクト
ルや赤外吸収スペクトル等によりその構造は確認される
。スヂレン部分とＮ−アセチルキトオリゴ糖鎖とは、−
（：Ｒ２−ＮＨ−結合を介してつながっており、その結
合様式は、ｐ＋ｍＯ−のいずれでもよい。たとえば、ｐ
−ビニルベ２ ンジルアミンとｎが１〜１０の整数である一般式（５）
のＮ−アセチルキトオリゴ糖ラクトンとを反応させると
、一般式（２） （式中、ｎは１〜１ｏの整数である） で表されるスチレン誘導体が得られる。このスチレン誘
導体は特に好ましいものである。

本発明にがかるＮ−アセチルキトオリゴ糖鎖を側鎖に有
するポリスチレン誘導体は、本発明により提供されるＮ
−アセチルキトオリゴ糖鎖を有するスチレン誘導体の重
合によって得られる。

本発明にがかるＮ−アセチルキトオリゴ糖鎖な側鎖に有
するポリスチレン誘導体の製造方法においては本発明に
より提供されるＮ−アセチルキトオリゴ糖鎖を有するス
チレン誘導体に加えて、他のビニル化合物、例えばスチ
レン類を併用して共重合を行うこともできる。スチレン
類としては例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ
−ヒドロキシスチレン等が挙げられる。共重合を行なう
場合には、その共重合体が細胞に対する接着、増殖能を
示すことが必須であり、そのためには上記スチレン誘導
体５モル％以上、その他のビニル化合物９５モル％以下
を用いる。

重合溶媒としては、モノマーであるＮ−アセチルキトオ
リゴ糖鎖を有するスチレン誘導体やスチレン類を溶解し
つるものであれば良いが、好ましくは、水、ジメチルス
ルホキシドが用いられる。

重合触媒には、スチレンの重合触媒として公知のものを
使用できるが、好ましくはラジカル開始剤、例えば過硫
酸カリウム、アゾビスイソブチロニトリル、２．２°−
アゾビス（アミジノプロパン）塩酸塩等が使用される。

重合温度は、使用する触媒の種類、量等により適宜決定
されるが、０〜９０℃付近が好ましい。

本発明の好ましいＮ−アセチルキトオリゴ糖鎖を側鎖に
有するポリスチレン誘導体は一般式（３）（式中、Ｒ’
は水素原子、低級アルキル基であり、Ｒ２は水素原子、
低級アルキル基、低級アルコキシ基又はメチル基であり
、Ｒ２ば１〜１ｏの整数である） で表される単量体単位を２〜５００個含むポリスチレン
誘導体である。

重合体を構成する単量体単位の数が５００個を越えると
、水、その他の溶媒に対する該重合体の溶解性が低下す
る傾向にある。

本発明の特に好ましいＮ−アセチルキトオリゴ糖を側鎖
に有するポリスチレン誘導体は一般式（４） （式中、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは２〜５００の
整数である） で表されるポリスチレン誘導体である。

［実施例］ 次に本発明の実施例を示してさらに具体的に説明する。

なお、実施例中の物性値その他は以下のように測定した
。

ハタ　　ｙスペクトル（ＩＲ 臭化カリウム錠剤法にて測定した。

磁　共　スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲ 試料を、メタノールを約１％含む重水に溶解（濃度的１
０％）して測定した。

痰光渡 試料を水に溶解しく濃度、Ｉｇ／１００ｍ１）　、光源
にはナトリウムＤ線を用い、旋光度肝で２５℃にて　６ 測定した。

参考例Ｉ Ｎ−アセチルキトオリゴ糖ラクトン（［０−β２−アセ
タミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）］、、−］２−アセタミドー２＝デオキシーＤグル
コノラクトン、前記の一般式（５）、以後Ａ　Ｇ　Ｌと
略記）の合成。

Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（３，４および５量体の混合
物、平均重合度３．３〜４．０）　２．１ｇを水１００
ｍ１に溶解し、そこへ０．ＩＮヨウ素水溶液７５ｍ１お
よび０．ＩＮ水酸化カリウム水溶液７５ｍ１をゆっくり
滴下した。遊離のヨウ素の色が消えるまでさらに０．Ｉ
Ｎ水酸化カリウム水溶液を滴下した。反応液を数ｍｌに
なるまで濃縮した後、１５０ｍ１のメタノール中に注ぎ
、撹拌した。生じた白色沈澱を遠心分離により捕集し、
真空乾燥した後、１０ｍ１の水に溶解した。炭酸銀０．
１ｇ加えて撹拌し、生じた黒灰色の沈澱を除去した後、
アンバーライトＩＲ−１２０をつめたカラムに通した。

減圧濃縮したあと、メタノールに溶解し、エタノールを
加えて乾固する操作を３回繰り返した。真空乾燥して黄
白色粉末状物質を得た。赤外吸収スペクトル（ＩＲ）測
定および核磁気共鳴（”Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル測定に
より生成物がＡＧＬであることを確認した。

Ｎ−アセチルキトオリゴ糖からＡＧＬへの転化はほぼ定
量的であった。

実施例１〜５ Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［０−β−２−アセタミド−
２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシル＝（１→４）ｌ、
ｌ−、−２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコナ
ミド（前記の一般式（２）、以後■ＧＮＡと略記）の合
成。

第１表に示すように、所定量のＡＧＬを、メタノール、
ジメチルスルホキシドにて溶解した後。

ｐ−ビニルベンジルアミンのメタノール溶液を添加し、
所定温度で所定時間反応させた。反応液を濃縮した後、
水に溶解してクロロホルムで数回洗浄した。水層の濃縮
液をアセトン中に投入し、生じた白色沈澱を分離回収し
た。乾燥して得られた白色粉末をメタノールおよびアセ
トンで洗浄した後、水に溶解してから凍結乾燥して黄白
色粉末状のＶＧＮＡを得た。

ＩＲ測測定　３４００ｃｍ−’　（０−Ｈ伸縮）　、　
２９２０ｃｍ−’（Ｃ−Ｈ伸縮）　、１６４０ｃｍ”’
　（アミドＣ＝Ｏ伸縮）、１５４０ｃｍ−’　（アミド
Ｎ−Ｈ変角）。

”Ｃ−Ｎ　Ｍ　Ｒ：　１７４．６ｐｐｍ　（アセトアミ
ド基のカルボニル炭素）　、　１７２．ｌｐｐｍ　（ビ
ニルベンジルアミド基のカルボニル炭素）、１１４．５
〜１３７．５ｐｐｍ　（ベンゼン環およびビニル基の炭
素）　、１０１．５ｐｐｍ　（キトオリゴ糖のβアノマ
ー炭素）、５５〜８０ｐｐｍ（オリゴ糖残基炭素）　、
　２２．３ｐｐｍ（アセトアミド基のメチル炭素）。

旋光度［α］：＋０．２゜ 護゛・′１９ ０ 実施例６〜９ ｐ−ビニルベンジルアミンの代わりに。−ビニルベンジ
ルアミン、ｍ−ビニルベンジルアミン、ｐ−α−メチル
ビニルベンジルアミン又はｐ−ビニル−ｍ−メチルベン
ジルアミンを用いた以外は実施例１と同様にしてスチレ
ン誘導体を得た。収率はそれぞれ１３％、２１％、３２
％及び２８％であった。

実施例１０〜１４ 第２表に示すように、所定量のＶＧＮＡおよび２．２゛
−アゾビス（２−アミジノプロパン）塩酸塩（触媒）を
重合用試験管にとり、水に溶解させた。脱気コックを取
り付けて凍結脱気を３回行った後、試験管を溶封した。

６０℃で所定時間重合させた後、管を開き、溶液をメタ
ノール中に注ぎ込んだ。析出した白色粉末を水に溶解し
てメタノールに再沈澱させる操作を３回行った後、再び
水に溶解し、セルロースチューブに入れて３日間透析し
た。水溶液を濃縮して凍結乾燥し、重合体を得た。

ＩＲ測測定　３４００ｃｍ−’　（０−Ｈ伸縮）　、　
２９３０ｃｍ（Ｃ−Ｈ伸縮）　、　１６４０ｃｍ−’　
（アミドＣ＝Ｏ伸縮）、１５４０ｃｍ−’　（アミドＮ
−Ｈ変角）。

”Ｃ−Ｎ　Ｍ　Ｒ：　１７４．４ｐｐｍ　（アセトアミ
ド基のカルボニル炭素）　、１７２．０ｐｐｍ　（ビニ
ルベンジルアミド基のカルボニル炭素）、１４５．ｌ、
　１３５．５．１２８．３ｐｐｍ（ベンゼン環の炭素）
　、　１０１．ｌｐｐｍ　（キトオリゴ糖のβアノマー
炭素）、５５〜８０ｐｐｍ　（オリゴ糖残基炭素）　、
４１．６ｐｐｍ（ポリスチレン鎖およびベンジル基のメ
チレン炭素）　、２２．３ｐｐｍ（アセトアミド基のメ
チル炭素）。

３ 実施例１５ 実施例８で得た、即ちｐ−α−メチルビニルベンジルア
ミンを用いて得たスチレン誘導体を出発モノマーとして
用いた以外は実施例１０と同様にして２時間重合を行な
った。得られたポリマーの収率は１２％であった。

実施例１６ 実施例１４で得たＶＧＮＡ重合体（ＰＶＧＮＡ）を蒸留
水に溶解しく１％）、４日間室温で磁気撹拌した。Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒフィルターで濾過した後、その１ｍｌを培
養皿（ポリスチレン製、φ１００ｍｍ　）に注入し、室
温で１０分間静置して重合体を培養皿に吸着させた。上
澄み液を除き、１ｍｌのリン酸緩衝液で３回すすいで、
重合体の塗布された培養皿を得た。

この培養皿に、５％のＦｅ２を含むＤＭＥ培地１０ｍ１
を加え、次に培養皿１個当たり５００個の細胞になるよ
うにマウスＣ１２７細胞を播種した。５％炭酸ガス培養
装置内で静置し、３７℃にて２週間培養を行った後培養
皿上で生育した細胞　４ （コロニー）をクリスタルバイオレットで染色し、細胞
の生育状況およびコロニー数を確認した。その結果を第
３表に示す。

Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を側鎖にもつポリスチレンを
塗布した培養皿は、良好なマウスＣ１２７細胞の接着・
増殖能を有している。

比較例１〜４ 比較として、ラクトース、メリビオース、マルトースを
それぞれ側鎖にもつポリスチレン（それぞれ、ＰＶＬＡ
、ＰＶＭｅＡ、ＰＶＭＡと略記）を培養皿に塗布したも
の（それぞれ比較例１．２．３）および何も塗布しない
市販のポリスチレン製培養皿（Ｆａｌｃｏｎ　１００１
、一般細菌用）（比較例４）を用いて、実施例１６と同
様に細胞付着実験を行った。その結果を第３表に示す。

第３表 ［発明の効果］ 本発明により、新規な生医学材料であるＮ−アセチルキ
トオリゴ糖鎖を有するスチレン誘導体、Ｎ−アセチルキ
トオリゴ糖を側鎖にもつポリスチレン誘導体、およびこ
れらの製造方法が提供される。本発明のポリスチレン誘
導体はマウスＣ１２７細胞の接着、増殖能を有しており
生医学用材料として有益である。

　７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖鎖を有するスチレン誘導
   体。 ２、一般式（１） ％式（１） （式中、Ｒ＾１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ＾２
   は水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハ
   ロゲン原子であり、ｎは１〜１０の整数である） で表される請求項１記載のスチレン誘導体。 ３、一般式（２） ▲数式、化学式、表等があります▼（２） （式中、ｎは１〜１０の整数である） で表される請求項２記載のスチレン誘導体。 ４、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖鎖を側鎖に有するポリス
   チレン誘導体。 ５、一般式（３） ▲数式、化学式、表等があります▼（３） （式中、Ｒ＾１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ＾２
   は水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハ
   ロゲン原子であり、ｎは１〜１０の整数である） で表わされる単量体単位を２〜５００個含む請求項４記
   載のポリスチレン誘導体。 ６、一般式（４） ▲数式、化学式、表等があります▼（４） （式中、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは２〜５００の
   整数である） で表される請求項５記載のポリスチレン誘導体。 ７、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖ラクトンとビニルベンジ
   ルアミン又はその誘導体とを反応させることを特徴とす
   る請求項１〜３項のいずれかに記載のスチレン誘導体の
   製造方法。８、一般式（５） ▲数式、化学式、表等があります▼（５） （式中、ｎは１〜１０の整数である） で表されるＮ−アセチルキトオリゴ糖ラクトンと一般式
   （６） ▲数式、化学式、表等があります▼（６） （式中、Ｒ＾１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ＾２
   は水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハ
   ロゲン原子である） で表されるビニルベンジルアミン又はその誘導体とを反
   応させることを特徴とする請求項７記載のスチレン誘導
   体の製造方法。 ９、請求項１〜３項のいずれかに記載のスチレン誘導体
   ５〜１００モル％及びその他のビニル化合物０〜９５モ
   ル％を重合させることを特徴とする請求項４〜６項のい
   ずれかに記載のポリスチレン誘導体の製造方法。