JPH03216197A - 血小板活性化因子拮抗物質フォマクチンｂ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は血小板活性化因子（以下、ＰＡＦという）拮抗
作用を有する新規なジテルペン化合物およびその製法に
関する。

（従来の技術） ＰＡＦに拮抗作用を有する物質は、ＰＡＦ型と非ＰＡＦ
型に分類されており、このうち、ＰＡＦ型拮抗物質は主
として化学合成で得られ、非ＰＡＦ型拮抗物質は化学合
成品の他に高等植物あるいは微生物の二次代謝産物から
得られている。高等植物由来の非ＰＡＦ型拮抗物質とし
ては例えばギンコ・ビローバ（Ｇｉｎｋｇｏ　ｂｉｌｏ
ｂａ）より得られたギンコライド、パイパー・，フトー
カズラ（Ｐｉｐｅｒｆｕｔｏｋａｄｚｕｒａ）より得ら
れたカズレノン、マグノリア・アキュミナータ（Ｍａｇ
ｎｏｌｉａ　ａｃｕｍｉｎａｔａ）より得られたべラグ
エンシン、　ヒマンタンドラーベルグラベナ（Ｈｉｍａ
ｎｔａｎｄｒａ　ｖｅｌｇｒａｖｅｎａ）より得られた
ガルベンジンおよびガルブラビン、ネタタンドラ・リジ
ダ（Ｎｅｃｔａｎｄｒａ　ｒｉｇｉｄａ）より得られた
ネクタンドリンＡおよびＢ、ブルセラ・ミクロフィラ（
Ｂｕｒｓｅｒａ　ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌａ）より得られ
たブルセラン等が知られている（Ｐ　．Ｂｒａｑｕｅｔ
ａｎｄ　．Ｊ．Ｊ．Ｇｏｄｆｒｏｉｄ，　Ｔｒｅｎｄ　
ｉｎ　Ｐｈａｒｍ．　Ｓｃｉ．　，　７、３９７、（１
９８６））。

また、微生物の二次代謝物としてペニシリウム属（Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｌｉｋｏｗｓｋｉｉ）から
グリオトキシン誘導体（Ｍ．Ｏｋａｍｏｔｏ，　Ｃｈｅ
ｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．　３４（１）、３４０，　
（１９８６））およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ−）からジケトピペラジン誘導体
（Ｓ．Ｔａｋａｓｅ，　Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．　５２
，　３４８５、（１９８７））が得られている。

（発明が解決する課題） 本発明者らは、カニの甲殻から分離されたフオーマ属に
属するＳＡＮＫ　１１４８６株の培養物から、ＰＡＦ拮
抗作用を有する新規化合物フォマクチンＢ（Ｐｈｏｍａ
ｃｔｉｎ　Ｂ）が生産されることを見出して本発明を完
成した。

（課題を解決するための手段） 本発明のフォマクチンＢは下記の構造式および性状を有
する。

１）構造式 ２）物質の性状：無色針状結晶 ３）融点：　　１８０−１８２℃ ４）比旋光度：　〔α〕。＝　＋　１７５゜（ｃ　Ｏ．
７０、クロロホルム） ５）元素分析値＝　（％） 実測値　Ｃ、７１．７１　　Ｈ、９．０９計算値　Ｃ、
７１．８２　　Ｈ、９．０４６）分子式：　　Ｃ　２０
　Ｈ　３０　０　ｑ（高分解能質量分析法により測定） ７）分子量：３３４（質量分析法により測定）８）赤外
線吸収スペクトル：ｖｍａｘ　　ｃｍ−’ＫＢｒ法で測
定した赤外線吸収スペクトルは図１に示す通りである。

３４２０、３３８０、１６６９、１６３０．　１４６０
、１３９２、１２５０、１２００、１０８０、１０００
、９０３、８１２９）１Ｈ一核磁気共鳴スペクトル：δ
ｐｐｍ重メタノール中、内部基準にテトラメチルシラン
を使用して測定した核磁気共鳴スペクトル（５００　Ｍ
Ｈｚ）は図２に示す通りである。

１０）１３Ｃ一核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ重メタ
ノール中、内部基準にテトラメチルシランを使用して測
定した核磁気共鳴スペクトル（１２６　ＭＨｚ）は図３
に示す通りであり、以下にケミカルシフトおよび多重度
を示す。

１４．５（ｑ），　１６．４（ｑ），　１９，７（２Ｘ
ｑ），　２２．７（ｔ），２３．２（ｑ），　３３．６
（ｔ），　３５．７（ｔ），　３７．４（ｔ），４１．
５（ｓ），　４６．３（ｄ），　６２．８（ｓ），　６
５．９（ｄ），７１．４（ｄ），　７３．３（ｓ），　
１２０．３（ｄ），　１３５．６（ｄ），１３５．８（
ｓ），　１４７．２（ｓ），　２００．１（ｓ）１１）
紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ　ｎｍエタノール中で
測定した紫外線吸収スペクトルは次に示す通りである。

２４０　（２，５００） １２）溶解性： メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロ
ロホルム、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、エーテル
に可溶、水に不溶である。

１３）呈色反応： 硫酸、ヨードに陽性。

１４）薄層クロマトグラフィ一二 Ｒ，値；　０．５１ 吸着剤；シリカゲルプレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅ１６０
Ｆ２Ｓ４、メルク社製） 展開溶媒；ｎ−ヘキサンー酢酸エチル （１：２） 本発明のフォマクチンＢは種々の立体および幾何異性体
を有する。前記式においては，これらの異性体およびこ
れらの異性体の混合物がすべて単一の式で示されている
。従って、本発明においてはこれらの異性体およびこれ
らの異性体の混合物をもすべて含むものである。

フォマクチンＢの生産菌であるＳＡＮＫ　１１４８６株
の菌学的性状は次の通りである。

本菌は福井県沖で採取されたカニで甲殻が黒変し「スス
ガニ」と呼ばれているズワイガニ（Ｃｈｉｎｏｅｃｅｔ
ｅｓ　ｏｐｉｌｉｏ）の甲殻から分離された菌株で、そ
の菌学的諸性状は次の通りである。オートミール寒天培
地上、２５℃での生育は７日間で２０ｍｍ、１４日間で
３８　ｍｍに達する。両培地上ともコロニーは湿気のあ
るビロード状でその色は灰汁色（Ｇｒｅｅｎｉｓｈ　ｇ
ｒａいである。

オートミール寒天培地上では菌糸のみで胞子、分生子の
形成は見られないが、人工海水（商品名、Ｊａｍａｒｉ
ｎ　Ｓ）で作ったオートミール寒天培地上では分生子殻
を形成し、その中に分生子を形成する。

分生子殻は暗褐色、亜球形ないし洋梨型で孔口を有し、
サイズは８０〜１２０　Ｘ　８０〜１５０μｍである。

孔口の径は５〜１５μｍでその周辺に褐色で２０〜５０
Ｘ２〜４μｍの剛毛を有する。

分生子柄はとくに分化せず殻壁最内層がフイアライドと
なる。分生子柄は無色，一細胞、楕円形ないし長楕円形
で２．５〜４．Ｏｘ２．Ｏ〜２．５　ｐｍである。

なお、本菌は３７℃では生育しない。

以上の諸性状をもとにＢ．Ｃ．Ｓｕｔｔｏｎ著　″Ｔｈ
ｅ　Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ”　　　Ｃｏｍｍｏｎｗ
ｅａｌｔｈ　　Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ，　１９８０年発行およびＪ．Ｋｏｈｌｍｅｙ
ｅｒおよびＥ．Ｋｏｈ　ｌｍｅｙｅｒ著″Ｍａｒｉｎｅ
　Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｆｕｎ
ｇｉ”Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　１９７９年発
行を用いて検索した結果、本菌を公知の属であるフオー
マ属に属するフオーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ　ｓｐ．
）と同定し、保存番号としてＳＡＮＫ　１１４８６株（
微工研条寄第２５９８号、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５９８）
を付与した。

なお、色の表示は、Ａ　，ＫｏｒｎｅｒｕｐおよびＪ．
ＨＪａｎｓｃｈｅｒ著［Ｍｅｔｈｕｅｎ　Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋ　ｏｆ　ｃｏｌｏｕｒ，第３版１９７８年、Ｅｙｒ
ｅ　Ｍｅｔｈｕｅｎ，　Ｌｏｎｄｏｎ発行〕に従って行
った。

以上、フォマクチンＢの生産菌について説明したが、カ
ビの諸性質は一定したものではなく、自然的、人工的に
容易に変化することは周知の通りであり、本発明で使用
しうる菌株はフォーマ属に属するフォマクチンＢを生産
するすべての菌株を包含するものである。

本発明の新規化合物フォマクチンＢを得るため、これら
の微生物の培養は他の醗酵生産物を生産するために用い
られるような培地中で行う。培地には人工海水を用いて
もよいし、水道水を用いてもよい。このような培地中に
は、微生物が資化できる炭素源、窒素源および無機塩を
含有する。

一般に、炭素源としてグルコース、フラクトース、マル
トース、シュークロース、マンニトール、グリセロール
、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデン
プン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、
糖蜜、クエン酸、酒石酸などを単一に、あるいは併用し
て用いることができる。一般には、培地量の１−１０重
量％で変量する。

窒素源としては、一般に蛋白質を含有する物質を醗酵工
程に用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、フスマ、
落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水分解物、ファ
ーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉
エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝
酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、
等である。

窒素源は、単一または併用して培地量の０．２−６重量
％の範囲で用いる。

培地中に取り入れる栄養無機塩は、ナトリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、フオスフエート、サルフエート、
夕ロライド、カーボネート等のイオンを得ることのでき
る通常の塩類である。また、カリウム、カルシウム、コ
バルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属も
含む。液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界面
活性剤等が消泡剤として使用される。

フオーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ　ｓｐ．）　ＳＡ’Ｎ
Ｋ　１１４８６株を培養し、フオマクチンＢを生産する
培地のｐＨは、５．０−９．０、好適には６．５−８．
５、に変化できる。

菌の生育温度は１５℃から３０℃までであるが更にフオ
マクチンＢの生産には、２０℃から２８℃、特に２２℃
から２６℃、が好適である。

フオマクチンＢは、好気的に培養して得られるが通常用
いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振どう培養
法、通気攪拌培養法等が用いられる。小規模な培養にお
いては、２２℃〜２６℃で数日間〜２週間、振どう培養
を行うのが良好である。培養は、バッフル（水流調節壁
）のついた三角フラスコ中で、１−２段階の種の発育工
程により開始する。種発育段階の培地は、炭素源および
窒素源を併用できる。種フラスコは定温インキュベータ
ー中で２２℃〜２６℃、７日間振とうするか、または充
分に成長するまで振とうする。成長した種は第二の種培
地、または生産培地に接種するのに用いる。中間の発育
工程を用いる場合には、本質的に同様の方法で成長させ
、生産培地に接種するためにそれを部分的に用いる。接
種したフラスコを一定温度で数日間振とうし、インキュ
ベーションが終わったらフラスコの含有物を遠心分離ま
たはろ過する。大量培養の場合には、攪拌機、通気装置
を付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方
法によれば、栄養培地をタンクの中で作成できる。栄養
培地を１２５℃まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地
にあらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は２
２℃〜２６℃で通気攪拌して行う。この方法は、多量の
化合物を得るのに適している。

培養終了後、培養液中の液体部分に存在するフオマクチ
ンＢは、菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤と
する、ろ過操作または遠心分離によって分別し、そのろ
液または上清中に存在するフオマクチンＢを、その物理
化学的性状を利用し抽出精製することにより得られる。

例えば、ろ液または、上清中に存在するフォマクチンＢ
は、中性ｐＨ条件下で水と混和しない有機溶剤、例えば
エーテル、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、
塩化エチレン、塩化メチレンなどの単独または、それら
の組み合わせにより抽出精製することができる。あるい
は吸着剤として、例えば活性炭または吸着用樹脂である
アンバーライトＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４（ローム・アン
ド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０，ＨＰ
−２０，ＣＨＰ−２０Ｐ，ＨＰ−５０　（三菱化成（株
）製）等が使用される。フオマクチンＢを含む液を上記
のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取
り除くか、またはフォマクチンＢを吸着させた後、メタ
ノール水、アセトン水、ｎ−ブタノール水などを用いて
溶出させることにより得られる。

このようにして得られたフオマクチンＢは、更にシリカ
ゲノレ、マグネシウムーシリカゲル系のフロリジルのよ
うな担体を用いた吸着力ラムクロマトグラフィー、セフ
ァデックスＬＨ−２０　（ファルマシア社製）などを用
いた分配力ラムグロマトグラフィー、および順相、逆相
方ラムを用いた高速液体クロマトグラフィ一等で精製す
ることができる。

本発明のフォマクチンＢは、文献未載の新規化合物であ
り、動物（例、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ等）に対して
ＰＡＦ拮抗作用を示し、例えば抗血栓剤としての使用は
もとより、喘息、消化性潰瘍、腎臓障害、高血圧等の予
防、治療剤として有用である。

本発明のフオマクチンＢを医薬として用いる場合、常法
に従ってそれ自体または適宜の薬学的に許容される担体
、賦形剤、希釈剤と混合し、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カ
プセル剤、注射剤などの形態で経口的または非経口的に
安全に投与することができる。投与量は対象疾患、投与
経路および投与回数などにより異なるが、例えば成人に
対しては１日１　ｍｇから１０００　ｍｇを、症状に応
じて１回または数回に分けて投与するのが好ましい。

（実施例） 次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する。

実施例１．フォマクチンＢの採取 Ａ）培養 フォーマ・エスピーＳＡＮＫ　１１４８６株をそのスラ
ントから、滅菌した後述の組成の培地１００　ｍｌを含
むバンフルの付いた５００　ｍｌの三角フラスコ（種フ
ラスコ）に一白金耳接種した。

培地組成 シュークロース　　　　　　　　　　２０ｇジャガイモ
　　　　　　　　　　　１００ｇペプトン　　　　　　
　　　　　　Ｌｏｇリン酸一カリウＡ　　　　　　　　
　　　５　ｇ人工海水（商品名、Ｊａｍａｒｉｎ　Ｓ　
　１０　０　０　ｍｌジャマリンラボラ１へり一社製） ｐＨ　　８．５ 次いでこれを２６℃で７日間、２００　ｒｐｍ　　（７
ｃｍの回転半径）のロータリー振どう機で培養した。

種培地と同じ組成の培地を、各々１００　ｍｌづつバッ
フルの付いた５００　ｍｌの三角フラスコ４８０本に入
れ、滅菌後、種フラスコから３　ｍｌづつ成長菌を取っ
て接種した。この４８０本の三角フラスコを種培養と同
じ条件で７日間振どう培養した。

Ｂ）単離 培養液全体を吸引ろ過し、そのろ液４８　Ｌを同量の酢
酸エチルで２回抽出した。得られた酢酸エチル層を水２
０　Ｌで洗浄し、更に無水流酸ナトリウムで乾燥した後
、ロータリーエバポレーターで減圧下濃縮、乾固した。

得られた油状物を３０倍のシリカゲルを用いた吸着力ラ
ムクロマトグラフィ（Ａｒｔ．９３８５、２３０〜４０
０メッシュ、メルク社製）に付し、ｎ−ヘキサンー酢酸
エチル（１：１）の混合溶剤で溶出する分画を集めた。

この分画より溶剤を減圧下で留去し、逆相液体力ラムク
ロマトグラフィー（ローパーＲＰ−８、サイズＢ、メル
ク社製）に付し、次いで高速液体クロマトグラフイー（
センシューパック　ＯＤＳ−２２５１−Ｓ　，センシュ
ー科学（株）製）に付して精製すると無色油状のフオマ
クチンＡ　９．４　ｍｇが得られた。更にｎ−ヘキサン
ー酢酸エチル（２　：　３）の混合溶剤で溶出する分画
を集めた。この分画より溶剤を減圧下で留去すると油状
物７８．２　ｍｇが得られた．得られた油状物をシリカ
ゲルを用いた順相液体力ラムクロマトグラフイ一（ロー
ハーＳｊ６０、サイズＡ，メルク社製）に付してｎ−ヘ
キサンー酢酸エチル（１：１）で溶出される分画を集め
た．ついで得られた分画を逆相液体力ラムクロマトグラ
フィー（ローパーＲＰ−８、サイズＢ、メルク社製）に
付し、６０％含水メタノールで溶出する部分を集めた．
この分画より溶剤を減圧下で留去すると無色針状結晶の
目的化合物フォマクチンＢ〔化学名：　（７Ｅ）−１３
、１５−ジヒドロキシー３、４−エポキシ−２−オキソ
ー４、８、１１，　１２、１５−ペンタメチルビシクロ
［９、３、■］ペンタデ力−７、Ｉ４−ジエン〕１５．
９　ｍｇが得られた。

実施例２．フォマクチンＢの採取 実施例１．Ａ）培養の項において、人工海水の代わりに
水道水を用いて５５本の三角フラスコを２３℃で１１日
間培養した． 得られた培養ろ液５．４Ｌを等量の酢酸エチルで２回抽
出した。得られた酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸ナト
リウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターで減圧
下濃縮、乾固して油状物６３６　ｍｇが得られた６得ら
れた油状物を１０　ｇのシリカケルを用いた吸着力ラム
グロマトグラフイー（Ａｒｔ．９３８５，　２３０〜４
００メッシュ、メルク社製）に付し、ｎ−ヘキサンー酢
酸エチル（２：８）の混合溶剤で溶出する分画を集めた
．得られた分画より溶剤を減圧下で留去すると油状物２
７４　ｍｇが得られた．得られた油状物を高速液体クロ
マトグラフイー（センシューパック　ＯＤＳ−２２５１
−Ｓ，センシュー科学（株）製）に付し、８０％メタノ
ールで毎分６ｍｌで溶出すると保持時間２２分３０秒で
フオマクチンＡ　１４．０　ｍｇが得られた．更に、前
留部分については、溶剤を留去し得られた残留物を再度
、同一カラムに付し７０％メタノールで毎分６　ｍｌで
溶出すると保持時間１８分でフオマクチンＢ　１４．４
　ｍｇかえられた。

（実施例の効果） 得られたフオマクチンＢは下記の生物学的性状を示す。

試験例１．ＰＡＦによる血小板凝集の抑制作用家兎より
心臓採血し、この血液を直ちに１：９容の３．８％のク
エン酸ソーダと混合した。室温下で、　１５０Ｘ［にて
１５分間遠心し、上層より多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌ
ｅｔ　ｐｏｏｒ　ｐｌａｓｍａ：　ｐｐｐ）を得た。

ＰＲＰとＰＰＰとを適量混合し、ＰＲＰの血小板数を６
０万個／μ１になるように調製した．血小板凝集は、Ｂ
ｏｒｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ，　ｖｏｌ．Ｉ９４，ｐｐ
．９２７−９２９　（１９６２））により、アグリコメ
ーターを用いて、透過光の増加により測定した。

即ち、ＰＲＰ　（２５０μ１）に被検薬のＤＭＳＯ溶液
（３μ１）を加え、１分後にＣ　１ｓ−　Ｐ　Ａ　Ｆの
生理食塩水溶液（２５μ１，ＰＡＦの終濃度　１〜３×
１０−８Ｍ）を添加した。

被検薬の溶液の代わりに生理食塩水を加え、１分後にｃ
，６−ＰＡＦ添加による凝集を対照値とした。その結果
、フォマクチンＢの■Ｃ５。＝１７μ阿であった。

（発明の効果） 本発明のフォマクチンＢはＰＡＦ拮抗作用を有し、医薬
として有用である。

【図面の簡単な説明】

図１はフォマクチンＢの赤外線吸収スペクトルを示し、
図２は同物質の１Ｈ一核磁気共鳴スペクトルを示し、図
３は同物質の１３Ｃ一核磁気共鳴スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するフォマクチンＢ（ＰｈｏｍａｃｔｉｎＢ）。 ２、フォーマ属に属するフォマクチンＢ生産菌を培養し
   、その培養物よりフォマクチンＢを採取することを特徴
   とするフォマクチンＢの製造法。 ３、フォーマ属に属するフォマクチンＢ生産菌がフォー
   マ・エスピーＳＡＮＫ１１４８６株（微工研条寄第２５
   ９８号、ＦＥＲＭＢＰ−２５９８）である請求項２、記
   載の製造法。