JPH0314814B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は脂質溶解性物質から製造された粒子
と、該粒子と該粒子に吸着させた生物学的活性物
質とからなる組成物と、それらの製造方法に関す
る。 本明細書において、脂質溶解性物質とか、具体
的に言えば、コレステリン、レシチンのような古
い呼称で類脂質と呼ばれる化合物群である。 今日の方法において、一般に試験管内試験はラ
テツクス担体に生物学的活性物質を担持させ行わ
れている（Am.J.Med.21，888−892（1956））。こ
のラテツクス担体は適切な大きさのポリスチレン
粒子からなる特殊な重合で作られたポリスチレン
懸濁液である。このラテツクス懸濁液の原料とな
るスチレンはよく知られている通り自己重合性の
大きな物質である。従つて市販のスチレンからポ
リスチレンを得るためには、該スチレン単量体を
蒸留分別した後に得られた単量体を重合させる。
このような用心をしても、なお貯蔵中該懸濁液は
経時変化（“ages”）を起こし、粒子が一定の大
きさに達すると反応体は浮澱反応を行うのに適し
なくなる（J.A.M.A.，186(2)，180−181（1958））。
この原因は、スチレンから得たラテツクス懸濁液
もやはり自己重合の欠点をなお保持しているため
と推定される。 ラテツクス担体を含有する反応体は少くとも２
段階からなる方法で製造される。第１段階ではま
ず担体を造り、第２段階で担体に生物学的活性物
質を吸着させる。この方法はなかなか煩雑であ
り、しかも得られた反応体は試験管内試験以外に
使用することができない。なぜならスチレンは生
体にとつて極めて有害だからである。 生体内試験用にはフロインド補助液
（Molecular Biology，13Biochemistry and
Biophysics，1973，New，York）が広く使用さ
れている。しかし、その使用は、実験的な条件下
でさえ副作用を生ずるので厳格に制限されてお
り、このためこれをヒトの治療に利用することは
出来ない。ヒトの治療には金属を含有する補助液
（Molecular Biology，13Biochcmistry and
Biophysics，1973，New，York）やサポニン型
の免疫刺激薬（immunostimulant）が血液像に
影響を及ぼすもの（Acta vet.scand.19，７−40
（1978））頻繁に使用されている。 最近、非経口的投与の前に生物学的活性物質の
担体としてリポソーマ（“liposoma”）を用いよ
うとする試みがある（Proc.Nat.Acat.Sei.72，88
−92（1975））。リポソーマはコレステロールと非
不均質界面活性剤とから形成された粒子である。
この粒子はクロロホルム中で上記２つの成分を混
合し、ホスフアチジル・コリンのような結合形成
性試薬を添加して造られる。次にクロロホルム相
を蒸留して無媒体状態にし、脂質層を容器壁上に
形成させる。その後生物学的活性物質の水溶液
を、形成されたフイルム上に添加する（英国特許
明細書28131／74）。この製造方法は逐次段階的で
あつて、一段階ではほんの微量の生成物しか得ら
れないことが知られている。また、この方法で得
られる粒子の粒径は均一でなくバラツキが非常に
大きい。 本発明によれば上に列挙した補助液の欠点を克
服した新規な担体系であつて生体内にも試験管内
にも使用することができる担体系が提供される。 本発明による担体は自己重合性を有さず、生体
に適合し、このため生体内利用にも試験管内利用
にも等しく適する。また、それは医学的治療およ
び獣医学的治療を含めて免疫学および生物学の各
部門に使用することができる。 当然、担体粒子は生物学的活性物質分子に対す
る被吸着能力を有することが必須となる。もう一
つの要件としては、担体粒子の生成と生物学的活
性物質の結合は一段階で行なわれ、生成物が大量
かつ安価に得られることを要す。 本発明者は思いもよらず担体粒子の製造と生物
学的活性物質の結合が下記の方法による単一反応
段階で行えることを見い出した。すなわち、例え
ばコレステロールと非不均質界面活性剤、例えば
卵レシチンをアルコールに溶かし；これと別に、
生物学的活性物質、例えばバクテリア、ウイル
ス、バクテリアの細胞分屑もしくは代謝産物もし
くはその誘導体、それ自身では抗原性の低いヘプ
テン類、菌類の細胞分屑、原生動物の細胞分屑ま
たは抗生物質を電解質水溶液系に溶かし；アルコ
ール溶液相と水溶液相とを一緒にすると目的物を
一段階で製造することができる。 また、上記製造を２段階で行うこともできる。
この場合には、粒子生成用物質をアルコール性の
相に溶解し、これに電解質溶液相を加えて生物学
的活性物質が結合されていない、いわゆる“空”
粒子を得る。次にこれら粒子に生物学的活性物質
を結合させることができる。 上記２つの方法のいずれかの方法によつて得ら
れる懸濁液を遠心分離機にかけ、傾瀉し、析出物
を水もしくは電解質水溶液に懸濁させ、必要なら
ば超音波処理に付し、この生成物は凍結乾燥もし
くは冷却状態で保存される。また凍結乾燥生成物
を照射によつて殺菌する。 脂質溶解性物質から製造される粒子と、該粒子
とこれに吸収させた生物学的活性物質とからなる
組成物も本発明の範囲に含まれる。これら組成物
は本発明による新規な方法で製造される。本発明
の方法によれば、脂質溶解性物質と適切な界面活
性剤とからなるアルコールもしくはその他の有機
溶媒の溶液を下記の液体と混合することからな
る。すなわち、上記アルコールその他の溶液を、 (a) PH値が２−10の生物学的活性物質の水溶液も
しくは電解質水溶液と１：1000−９：１の容積
比で混合し、反応体混合物を少なくとも１分間
撹拌した後、最大７日間これを放置して既知の
方法で析出粒子を分離するか；または、 (b) 水もしくは電解質水溶液と１：1000−９：１
の容積比で混合し、析出粒子を分離した後、随
意にこれら粒子を２−10のPHの水もしくは電解
質水溶液に懸濁させるか、あるいは凍結乾燥さ
せるか；または、 (c) 水もしくは電解質水溶液と１：1000−９：１
の容積比で混合し、析出粒子を分離した後、生
物学的活性物質の水溶液もしくは電解質溶液を
該粒子に加え、少なくとも１分間溶液を撹拌
し、既知の方法で析出粒子を分離するか；また
は、 (d) 変法(b)によつて得られた粒子にPHが２−10の
生物学的活性物質の水溶液もしくは電解質溶液
を加えて懸濁液を生成させ；場合によつては、 随意に変法(a)もしくは(c)のいずれかの方法で得
た生成物を凍結乾燥し、所望ならば殺菌する。 本発明の効果の最も重要な点を要約すると下記
の通り。 １ 本発明の方法によると、粒子と生物学的活性
物質の結合とを所望により単一反応段階で得る
ことができる。 ２ 本発明の方法は連続法で行うことができ、ま
た粒子の大量生産が可能である。 ３ 粒子は生体と適合する物質で形成されてい
る。 ４ 本発明の方法は経済的である（上記第１項お
よび第２項を参照のこと）。 ５ 本発明の方法は簡便で即刻に行えるので、迅
速な免疫反応診断学的生体内内検査に利用でき
る新たな様々なシステムを造ることができる。
例えば、 (a) 変形関節炎の迅速定量に用いる診断用反応
体 (b) その他の迅速な免疫反応診断の診察用反応
体が挙げられる。 ６ 上記第５項で言及した免疫反応診断用の反応
体として、本発明の反応体が極めて優れている
という理由は反応を滴下試験で行うことがで
き、その結果が１〜２分で評価することができ
るという事実にある。 ７ 担体粒子には生体と不適合物質が含まれてい
ないので、これらの粒子は吸着された生物学的
活性物質を生体内に導入するのに適する；しか
も (a) ウイルスによる自動免疫法の場合には、こ
れら粒子は生ウイルス、不活性ウイルス、お
よび崩壊ウイルスの抗原性を増大する能力が
ある。 (b) バクテリアによる自動免疫法の場合には、
これら粒子は不活性バクテリア、崩壊バクテ
リア、バクテリア分屑およびバクテリアの代
謝産物による免疫反応を刺激する能力があ
る。 (c) 菌分屑による自動免疫法の場合には、これ
ら粒子はかなりの刺激的活性を呈する。 ８ 本発明で得られる粒子によると、生体内で僅
かな免疫反応しか惹起さない生物学的活性物質
を吸着させることができるが、それは、この粒
子によつ免疫反応がかなり増大するからであ
る。このように本発明による粒子系はアジユバ
ント効果（例えばヘプテン、ホルモン、酵素、
ヒスタミン）を誘発させるのに適する。本発明
の粒子による注射が極めて優れている理由は注
射しても注射部もしくは生体の他のいかなる部
分にも何ら好ましからざる変化を誘発させるこ
とがないという事実にある。物質は完全に吸着
されていて、何ら副作用を起さない。 ９ また、本発明の方法によると、分子が小さい
ため比較的速に生体から排除される生物学的活
性物質（例えば、抗生物質、各種化学療法薬な
ど）を吸着させることができ、そうすることに
より、その生体からの排除をかなり遅延させる
ことができるので延長効果（“prolonged
effect”）が生ずる。 以下、実施例で本発明を更に詳説する。しか
し、これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定す
るものではない。以下に述べる本発明の方法の実
施例では、アルコールもしくは有機相と水溶液相
を１：1000−９：１の容積比で混合する。そうす
ることにより、最適粒径の粒子が最適量得られ、
生物学的活性物質に対する粒子の吸着能力は理想
的となる。 変法 (a) 第１図に示す装置の２つの容器１と２に原料溶
液を満たす。容器１にはレシチンとコレステロー
ルの無水アルコール溶液を注入し、容器２には生
物学的活性物質を含む電解質水溶液を注入する。
撹拌機３を起動させた後、容器１および２の内容
物を撹拌用容器４内に注入、滴下もしくは噴霧さ
せる。50r.p.m.で１分間撹拌した後、懸濁液を撹
拌用容器４から放流管５を経由して捕集器６に移
す。捕集器６内で撹拌を続けて所望量の粒子の懸
濁液を得る。生物学的活性物質を37℃で５−10分
間保温した後、懸濁液を6000r.p.m.で30分間遠心
処理し、次に傾瀉する。直接的使用を意図するな
らば、析出物を生理的塩類溶液に入れ、丹念に均
質な懸濁液にし、超音波処理に付す。生成物の保
存を意図するならば、析出物を蒸留水中に入れ、
丹念に均質な懸濁液にし、この液を分割した後凍
結乾燥する。凍結乾燥した生成物は照射により殺
菌処理に付される。 変法 (b) 第１図に示す装置２つの容器１と２に原料溶液
を満たす。容器１にはレシチンとコレステロール
の無水アルコール溶液を注入し、容器２には電解
質水溶液を注入する。撹拌機３を起動させた後、
容器１および２の内容物を撹拌用容器４内に注
入、滴下もしくは噴霧させる。撹拌後、懸濁液を
撹拌用容器４から放流管５を経由して捕集器６に
移す。捕集器６内で所望量の粒子の懸濁液が得ら
れるまで撹拌を続ける。 懸濁液を約6000r.p.m.（4000〜6000ｇ）で30分
間遠心処理し、次に傾瀉する。析出物を蒸留水中
に取り、丹念に均質化し、超音波処理に付す。次
にこれを分割した後、凍結乾燥し、照射処理によ
つて殺菌する。この方法で得られる凍結乾燥状態
の“空”の粒子の一単位は11.2mgの乾燥物質であ
り、これは粒子数1.5×10⁸−2.5×10⁸に相当する。 変法 (c) 第１図に示す装置２つの容器１と２に原料溶液
を満たす。容器１にはレシチンとコレステロール
の無水アルコール溶液を注入し、容器２には電解
質水溶液を注入する。撹拌機３を作動させた後、
容器１および２の内容物を撹拌用容器４内に注
入、滴下もしくは噴霧させる。撹拌後、懸濁液を
撹拌用容器４から放流管５を経由して捕集器６に
移す。捕集器６内で所望量の粒子の懸濁液を得ら
れるまで撹拌を続ける。 懸濁液を約6000r.p.m.で30分間遠心処理し、次
に傾瀉する。直接的使用を意図するならば、所望
の生物学的活性物質を生理的塩類溶液に入れ、得
られた粒子をこの溶液中に懸濁させ、均質化し、
超音波処理に付す。析出物の保存を意図するなら
ば、あらかじめPHや２−10の水もしくは電解質水
溶液に入れた生物学的活性物質を得られた粒子に
加え、該混合物を丹念に均質化し、これを超音波
処理に付した後、37℃で５−10分間保温し、分割
し、凍結乾燥する。 変法 (d) 変法(b)によつて得た粒子は随意の生物学的活性
物質と結合させて補助液として使用することがで
きる。 実施例 １ 肝炎抗体の産生 変法(b)によつて造つた１単位の凍結乾燥粒子に
ウイルス粒子10⁹個を加えて、粒子に生肝炎ウイ
ルスおよび不活化肝炎ウイルスを吸着させる。得
られた免疫物質によると、抗体レベルは既知の抗
体レベルよりも高くなる。 実施例 ２ 不活化粘液腫症ウイルス・ワクチンによる保護
作用 今まで、生ウイルスによつて造られたワクチン
だけがこのウイルスに対して保護作用をすること
が知られていた。そこでウサギに10⁸ウイルス粒
子／mlの不活化粘液腫症ウイルス・ワクチンを注
射した、具体的には変法(b)によつて得た１単位粒
子に吸着させた１mlのワクチンをウサギに皮下注
射した。注射後30日してから、その結果を判定し
たところ、このようにして造られたワクチンを使
用すると対照実験の際感染量100に相当する生ウ
イルスに対しても完全な保護作用を呈することが
解つた。粒子を変法(a)によつて得るならば、その
抗体レベルは感染量10に対して完全な保護作用を
呈する。 実施例 ３ トレポネーマ症に対する免疫 トレポネーマ・パリズム、ブタペスト株に崩壊
細胞（10⁷／ml）から超音波処理によつて抗原を
調製する。得られた抗原１mlを変法(b)によつて造
られた凍結乾燥粒子２単位に結合させる。動物に
１週間に１度、総合して６回、抗原１mlの筋肉内
注射、静脈内注射および皮下注射を行う。このよ
うに処理した動物内には、高い特異抗体のレベル
および細胞免疫を検出することができる。 実施例 ４ 破傷風に対する免疫 (a) 変法(b)によつて造つた単位量の粒子に単位量
の破傷風トキソイドを添加する。次にこの物質
を凍結乾燥する。使用前に、この物質をその最
初の量に相当する生理的塩類溶液に懸濁させ
る。免疫活性はモルモツトに関する英国薬局
方、米国薬局方およびハンガリー薬局方に記
載の方法で試験すると、この物質の破傷風に対
する抗原性は本質的にその処方で要求される免
疫効果よりも明らかに優れていることが確認で
きる。 これぞれ変法(a)および変法(b)によつて造つたワ
クチンについても試験を行つた。その結果は上
記と同じであつた。 (b) 変法(b)によつて造つた単位量の種々の量の破
傷風トキソイドを添加する。この物質を凍結乾
燥してから、凍結乾燥前の容積に相当する生理
的塩類溶液にそれを懸濁させる。免疫活性は上
記同様モルモツトについて試験する。その特異
抗原性は処方よりも優れており、投与量一効果
則に適合する。 (c) 変法(b)によつて造つた種々の量の粒子に、同
一量の破傷風トキソイドを添加する。凍結乾燥
後、凍結乾燥前の容積に相当する生理的塩類溶
液にこの物質を入れる。上記同様にモルモツト
に関して行つた試験によると、いずれの場合も
その抗原性は処方よりも明らかに優れている。 実施例 ５ 複合細菌性抗原による免疫法 変法(b)によつて造つた単位量の粒子に破傷風、
ジフテリアおよび細菌性抗原を組み合せて結合さ
せる。凍結乾燥後この物質をその最初の容積中に
再懸濁し、抗原成分の活性を実施例４に記載した
局方の方法により、モルモツトおよび白ハツカネ
ズミについてそれぞれ試験すると、その抗原性は
処方と同等かそれ以上である。 実施例 ６ 抗絨毛性ゴナドロピン（HCG）免疫血清の製
造 アンチホルモンの製造について、モデル試験を
ヒト絨毛性ゴナドロピン（HCG）で行う。この
伝統的に使われているが弱い抗原物質は慣習的に
油性のフロインド補助液の助けを受けている。
HCG3000E／mgを変法(b)によつて得た１単位の粒
子に結合させる。この方法で得られたワクチンに
よつて、重量2.5ｇのNZWラビツトの各々１週間
置きに皮下注射する。７回目の注射の後の抗
HCG抗体レベルは対照グループのNZWラビツト
について測定した抗体レベルよりも高い。次に、
対照グループのNZWラビツトにフロインド補助
液で刺激した同量のHCGを注射する。本発明の
粒子で処理した動物には何も副作用も現われない
のと対照的に、好ましくない副作用が観察され
る。この長い免疫期間の後、ラビツトの血液を排
液し、剖検に付す。肝臓、腎臓および肺の顕微鏡
観察および組織学的検査によつて、何な病理学的
変化がないことがわかる。 実施例 ７ 抗ヒスタミン血清の製造 変法(b)によつて得た２単位粒子の凍結乾燥担体
に無毒化ヒスタミン（ｐ−アミノ−ベンゼンアゾ
ヒスタミン）2.7mgを吸着させる。ここで得られ
た物質によつてウサギを１日置きごとに免疫性を
与えると、20回目の注射の後、高いレベルの抗ヒ
スタミン抗体が記録される。 実施例 ８ 脂質溶解性物質の粒子に結合したガンマグロブ
リン反応体の製造（変法(a)） ガンマグロブリンのPH６緩衝液の0.25％溶液２
を造る。同時にこれと別に、0.01−0.6％卵レ
シチルと0.1−２％コレステロールを含む脂質溶
解性物質の無水アルコール溶液を調製する。次に
上記２つの溶液を変法(a)で述べた通りに混合す
る。 得られた析出物を、血清の希釈に慣用される生
理的電解質溶液（５）に入れ、これを混合し、
超音波処理に付すと、即使用可能な反応体が得ら
れる。 実施例 ９ 脂質溶解性物質粒子に結合したガンマグロブリ
ン反応体のリウマトイド因子定量への使用 リウマチ様関節炎は正常なヒトの免疫グロブリ
ンと反応する免疫性コンプレツクスの存在を伴
う。リウマチ様関節炎の鑑別診断は実際、この反
応に基づいている。この反応は例えばラテツクス
粒子を使用することにより目視でき、非常に鋭敏
なワーラー・ローズ反応を提供する。 ラテツクス補助液系の性質については本明細書
の最初の部分に既に記述した。 ワーラー・ローズ反応は受動血球激集反応法で
あつて、なかなか厄介であり、反応の完結には時
間がかかる。 検診患者から採血した血清を56℃で30分間加熱
し、使用するまで＋４℃で保存する。可能なら新
鮮な血清を使用するが、１週間以内の血清ならま
た用いることができる。 試験用血清を生理的塩類溶液で希釈する。１滴
（0.05ml）をガラス板上に滴下し、種々の希釈液
に対応する液滴に、ガンマグロブリン（実施例
８）を含む反応体の分液0.01mlを加える。 血清に反応体を添加した後、反応の進行を見守
る。当然、反応体を出来るかぎり間を置かずに希
釈された血清液滴に加えなければならない。液滴
は丹念にガラス棒で撹拌する。絶え間なく撹拌す
ると２つの物質の混合がより均質化する。反応の
進行は目視によつて評価する。一定時間、例えば
５分内に何ら凝集反応が起らないならば結果は
“０”である。凝集反応の度合は＋印で示す。試
験時間に強固な凝集体が形成され、かつ沈着物間
の液体が澄んでいる場合、反応の度合を“＋＋＋
＋”で印す。凝集反応の評価には拡大鏡が役に立
つ。対照試験としては、希釈用に使用した生理的
塩類溶液１滴と0.01mlの反応体を使用する。対照
試験では試験時間（５分）内に何の凝集反応も起
らない。 微量凝集体の生成は顕微鏡観察によつて監視す
ることができる。この場合、反応は顕微鏡用スラ
イド上でなされ、判断には40倍の対物鏡と７倍の
接眼鏡とが使用される。 次に、未希釈の濃厚血清についても試験を行
う。１分以内に凝集反応が観察されるならば、試
験は陽性であり、１分以内に何の凝集反応も起ら
ないならば試験は陰性である。この試験結果は下
記の第１表に掲げてある。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は脂質溶解性物質の粒子ならびに、脂質
溶解性物質の粒子および該粒子に吸着させた生物
学的活性物質とからなる組成物を製造するための
装置の概略図を示す。 １および２……原料溶液を入れる容器、３……
撹拌機、４……撹拌用容器、５……放流管、６…
…捕集器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 脂質溶解性物質の粒子と、その表面に結合
   （吸着）した生ウイルス、不活性ウイルスもしく
   は崩壊ウイルスの粒子、不活性バクテリアもしく
   は崩壊バクテリア、バクテリア分屑、バクテリア
   代謝産物もしくはその誘導体、菌類の細胞分屑、
   原生動物細胞分屑、免疫グロブリン、ホルモン、
   ヒスタミンもしくはその誘導体、抗生物質および
   化学療法薬からなる群から選ばれる生物学的活性
   物質からなる抗原組成物。 ２ 特許請求の範囲第１項に記載の抗原組成物で
   あつて、免疫付与に使用されるもの。 ３ 特許請求の範囲第１項に記載の抗原組成物で
   あつて、免疫反応診断に使用されるもの。 ４ 脂質溶解性物質の粒子と、その表面に結合
   （吸着）した生ウイルス、不活性ウイルスもしく
   は崩壊ウイルスの粒子、不活性バクテリアもしく
   は崩壊バクテリア、バクテリア分屑、バクテリア
   代謝産物もしくはその誘導体、菌類の細胞分屑、
   原生動物細胞分屑、免疫グロブリン、ホルモン、
   ヒスタミンもしくはその誘導体、抗生物質および
   化学療法薬からなる群から選ばれる生物学的活性
   物質からなる抗原組成物の製造方法であつて、脂
   質溶解性物質と界面活性物質を含む有機溶媒溶液
   を、 (a) 該生物学的活性物質を含むPHが２ないし10の
   水もしくは電解質水溶液と１：1000〜９：１の
   容積比で混合し、該反応混合物を少なくとも１
   分間撹拌し、これを長くても７日間放置した
   後、溶液から析出した粒子を分離するか； (b) PHが２ないし10の水もしくは電解質水溶液と
   １：1000〜９：１の容積比で混合し、析出する
   粒子を単離し、必要ならば、水または電解質水
   溶液に懸濁し、得られる生成物を凍結乾燥し、
   このものを生物学的活性物質と接触させるか； (c) 水もしくは電解質水溶液と１：1000〜９：１
   の容積比で混合し、析出する粒子を単離し、そ
   れを該生物学的活性物質を含むPHが２ないし10
   の水もしくは電解質水溶液に加え、該液を少な
   くとも２分間撹拌し、これを長くても７日間放
   置した後、生成する粒子を単離するか； 前記(a)または(c)によつて得られる生成物を凍結
   乾燥するか、照射によつて滅菌することからなる
   方法。 ５ 特許請求の範囲第２項に記載の方法であつ
   て、脂質溶解性物質として卵レシチンおよび／ま
   たはコレステリンを使用する方法。 ６ 特許請求の範囲第２項または第３項に記載の
   方法であつて、粒子が遠心分離によつて単離され
   る方法。