MXPA03003786A - Sistema de suministro para entrampar macromoleculas cargadas y un metodo para prepararlo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un nuevo sistema de suministro y metodo para producir el mismo. El sistema de suministro es un sistema bifasico de suministro de macromoleculas cargadas y comprende una fase organica hidrofobica cargada negativamente y una fase inorganica cargada positivamente. La fase organica y la fase inorganica entrampan las macromoleculas agregadas. Las macromoleculas se entrampan por enlaces electrostaticos entre la fase organica, la fase inorganica y las macromoleculas. El metodo para producir el sistema de suministro comprende los pasos para contactar conjuntamente y mezclar una fase organica cargada negativamente, una macro-molecula cargada y la fase inorganica cargada positivamente.

Description

"SISTEMA DE SUMINISTRO PARA ENTRAMPAR MACROMOLÉCULAS Y UN MÉTODO PARA PREPARAR EL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un nuevo sistema de suministro para administrar drogas, vacunas u otros compuestos cargados. La presente invención se refiere también a un nuevo método para entrampar macromoléculas cargadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el campo de las vacunas, existe un creciente interés por el desarrollo de sistemas de suministro, similares a los liposomas y nanopartículas, pero capaces de entrampar una cantidad bastante grande de proteínas macromoleculares. Los sistemas de suministro coloidales deben cumplir también los requisitos farmacéuticos para la vida de anaquel del producto. Se han investigado diversos sistemas coloidales para desarrollar formas más seguras de drogas y vacunas. En general, el objetivo principal de estos sistemas fue permitir el suministro suficiente de los farmacéuticos a un sitio biológico. En este contexto, se han identificado los macrófagos como un objetivo para las proteínas macromoleculares suministradas por sistemas coloidales. Sin embargo, se sabe bien que el suministro eficiente de una proteína macromolecular a un sitio biológico que utiliza sistemas de suministro coloidales requiere un entrampamiento estable de la proteína macromolecular en el sistema de suministro utilizado. De acuerdo con estudios que evalúan el entrampamiento de la proteína macromolecular en sistemas de suministro, los principales inconvenientes que limitan el uso en diversas áreas de industrias farmacéuticas es una capacidad de entrampamiento relativamente baja de proteínas macromoleculares solubles en agua. Las proteínas macromoleculares solubles en agua se entrampan muy poco en sistemas coloidales debido a su gran tamaño. Generalmente, el entrampamiento de proteínas macromoleculares grandes solubles en agua en liposomas depende de la naturaleza de la fase acuosa, y raramente excede el 50%. Existen varios mecanismos sospechosos de ser responsables del entrampamiento proteínico solubles en agua en sistemas coloidales. Una suposición general es que las proteínas solubles en agua se entrampan libremente en la fase acuosa de los sistemas coloidales, similar a los liposomas. El entrampamiento de una protelna macromolecular soluble en agua más grande es difícil de llevar a cabo debido a su gran tamaño. La introducción de liposomas gigantes y emulsiones agua en aceite (a/o) ha remediado solo parcialmente la situación, debido a que la eficacia del entrampamiento proteínico obtenido que utiliza estos sistemas no refleja la capacidad actual de la fase acuosa de estos sistemas. Además, los métodos utilizados en la técnica anterior para preparar sistemas de suministro en general consumen bastante tiempo y frecuentemente no son compatibles con los requisitos farmacéuticos actuales.

- - Como se vio con anterioridad, existe una gran necesidad de un sistema de suministro capaz de entrampar un amplio rango en tamaño y una gran cantidad de proteínas solubles en agua.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para entrampar proteínas solubles en agua utilizando interacciones electrostáticas variables. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema de suministro que entrampe proteínas solubles en agua utilizando interacciones electrostáticas variables. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema de suministro preparado por un método ya aceptado en la industria farmacéutica. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un sistema de suministro bifásico para moléculas cargadas que comprende una fase orgánica hidrofóbica cargada negativamente y una fase inorgánica cargada positivamente. La fase orgánica y la fase inorgánica se adaptan para entrampar moléculas cargadas por enlaces electrostáticos entre la fase orgánica, la fase inorgánica y al menos una molécula cargada. La fase orgánica es preferentemente una emulsión de aceite en agua, la cual comprende un aceite neutro y un compuesto orgánico cargado negativamente. Tal aceite neutral, por ejemplo, y sin limitarse al mismo, se selecciona a partir del grupo que consiste en escualano, - - aceite de soya, aceite de sésamo y aceite de cacahuate. El compuesto orgánico cargado negativamente es preferentemente dicetilfosfato. La fase inorgánica del sistema de suministro de la presente invención comprende preferentemente alumbre. El sistema de suministro tiene preferentemente un diámetro a lo sumo de cinco micrómetros cuando las moléculas cargadas se entrampan en él. Aún de acuerdo con la presente invención, se proporciona el sistema de suministro como se describió con anterioridad, lo cual comprende además moléculas cargadas. Las moléculas cargadas pueden ser por ejemplo, ADN, De acuerdo con la presente invención, se proporciona también un método para producir un sistema de suministro como se definió con anterioridad. El método comprende los pasos para contactar una fase orgánica hidrofóbica cargada negativamente, moléculas cargadas y una fase inorgánica cargada positivamente y mezclar las mismas para el entrampar las moléculas cargadas entre la fase orgánica y la fase inorgánica. Preferentemente, la fase orgánica hidrofóbica cargada negativamente y las moléculas cargadas se mezclan primero conjuntamente, seguido de la adición y mezclado de la fase inorgánica hidrofóbica cargada positivamente en la misma. El método de la presente invención es sencillo y es fácilmente escalabe, asi como también reproducible para aplicaciones industriales. Una granulometrla específica y bien definida del sistema de suministro pueden prepararse con el presente método. Por ende, el - - sistema es otro aspecto de la presente invención, lo cual significa que incluye un portador para la macromolécula, un adyuvante para vacunas, un sistema de suministro lento o un agente estabilizador.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra los resultados de las pruebas de diversos aceites electrostáticamente neutrales para la preparación de la fase orgánica objetivo del sistema de suministro de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención; La Figura 2 ilustra una granulometrla de gotas de una fase objetivo de emulsión de escualano del sistema de suministro de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, 420 días después de su almacenamiento a 4°C; Las Figuras 3A y 3B ilustran micrográficas electrónicas que muestran la forma y granulometría de la gota de la fase orgánica con un aumento de 10.5 K (Figura 3A) y 51K (Figura 3B); La Figura 4 ilustra una gráfica utilizada para evaluar la cantidad de alumbre utilizada en la fase de entrampamiento de una modalidad preferida del sistema de suministro de la presente invención; La Figura 5 ilustra las micrográficas electrónicas de un sistema de suministro de acuerdo con una modalidad de la presente invención con un aumento de 3.3K (Figura 5A) y 51K (Figura 5B); La Figura 6 ilustra la eficiencia de entrampamiento protelnico relativa a la fase orgánica (Figura 6A) o a la fase inorgánica (Figura 6B), de un sistema de suministro preferido, en función de la - - concentración de protefna; La Figura 7 ¡lustra el porcentaje de capacidad de entrampamiento de una modalidad preferida del sistema de suministro de la presente invención, con relación a la concentración de proteina agregada; Las Figuras 8A y 8B ilustran la capacidad de entrampamiento de una modalidad preferida del sistema de suministro de la presente invención para diversos tipos de proteínas (Figura 8A) y una comparación de la microfluidización y estrategias de entrampamiento de mezclado a mano (Figura 8B); Las Figuras 9A y 9B ilustran una comparación de la distribución de tejido del antlgeno libre y entrampamiento (Figura 9A) y sistema de suministro descubierto (Figura 9B) en ratones Balb/C 24 horas después de la inyección intramuscular; Las Figuras 10A y 10B ¡lustran un transcurso de tiempo de una liberación de un antígeno (Figura 10A) y de la fase objetivo de dispositivo (Figura 10B) a 37°C después de la incubación en el medio con contenido de suero bovino fetal al 50%; y La Figura 11 representa un gel de SDS-poliacrilamida que muestra la integridad de la BSA de entrampamiento después de 2 años de almacenamiento del sistema a 4°C.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El sistema de la presente invención tiene una propensión al tejido rico en macrófagos del sistema reticuloendotelial (RES) además de una propensión a la acumulación en el pulmón, intestino y riñón cuando se administra parenteralmente a animales, como se evidencia por los resultados de la distribución de tejidos ilustrada en las Figuras 9A y 9B. El sistema se encuentra diseñado para administrarse preferentemente por rutas intramusculares o subcutáneas. No han habido problemas de toxicidad encontrados en el sitio de inyección cuando se administró el sistema de suministro de la presente invención El sistema de suministro es electrostáticamente modulable y es capaz de entrampar una cantidad bastante grande de protetna entre sus fases orgánicas e inorgánicas sobre la base única de interacciones electrostáticas. Además, el sistema puede prepararse y esterilizarse utilizando procesos industriales bien conocidos en la industria farmacéutica. Por ejemplo, el sistema de suministro puede esterilizarse por filtración o irradiación UV, como se conoce bien en la materia, y también por procesos de autoclave (120°C durante 30 minutos), lo cual se considera que es una propiedad comercialmente importante que refuerza su aceptabilidad como producto farmacéutico. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el sistema de suministro tiene una mejor capacidad de entrampamiento proteinico en comparación con otros sistemas de suministro de la técnica anterior. Se encuentra compuesto de una emulsión hidrofóbica cargada negativamente o matriz orgánica como fase objetivo, y una matriz inorgánica cargada positivamente como fase de entrampamiento. Una matriz inorgánica cargada positivamente preferida es el alumbre - - mineral. La forma, tamaño promedio de partícula y granulometría de la matriz de emulsión fueron similares independientemente de los aceites utilizados para preparar la matriz de emulsión. Sin embargo, el escualano conocido por ser más resistente a la peroxidación lipldica que ocurre durante el almacenamiento, es el más preferido por su alto contenido en ácidos grasos saturados. El sistema de la presente invención se lleva a cabo fácilmente y tiene una tasa de entrampamiento estable de proteínas tales como BSA, peroxidasa, y entrampamiento de mezcla de proteína del virus de diarrea viral Bovina ¡nactivada (BVDV). Se agregó Ubiquinona™ 50 a la fase objetivo del sistema de la presente invención para incrementar la hidrofobicidad de la fase objetivo, mientras que se agregó dicetilfosfato (DCP) para conferirle a la fase objetivo una carga negativa dado el hecho de que la fase de entrampamiento se encuentra cargada positivamente (Makabi-Panzu, B. et al., Vaccine, Vol. 16, No. 16, págs. 1504-1510 (1998)). Como se encontró para liposomas y nanopartículas, el uso de una fase coloidal hidrofóbica cargada negativamente tiene la ventaja adicional de incrementar la capacidad de selección como objetivo de los macrófagos del sistema al permitir la unión de las opsoninas de suero circulatorio. La opsonización de suero es conocida por incrementar la fagocitosis por macrófagos de las vesículas hidrofóbicas cargadas negativamente. También se han probado otros tipos de proteínas de suero en el sistema de la presente invención. A diferencia de los sistemas de suministro coloidales tradicionales, el sistema de suministro de la presente invención comprende un sistema bifásico que contiene dos fases opuestamente cargadas: una fase orgánica cargada negativamente, la cual es la fase objetivo donde una proteína se une, y una fase inorgánica cargada positivamente (fase de entrampamiento), en la cual se encuentra entrampada la fase orgánica cargada negativamente y enjaulada a través de uniones electroestáticas variables. La proteína interactúa electrostáticamente también con la fase inorgánica cargada positivamente. El sistema de la presenta invención permite el suministro de proteínas al sistema retículo-endotelial después de la administración, preferiblemente administración intramuscular y/o administración subcutánea. El sistema de la presente invención permite el suministro de las proteínas unidas a la fase objetivo y/o a la fase de entrampamiento. Los resultados sobre la caracterización fisicoquímica del sistema de la presente invención demostraron que el sistema es un sistema muy estable que exhibe una gran capacidad de entrampamiento para las proteínas después de un año de almacenamiento a 4° Celsius además de tener la capacidad de incrementar la inmunogenicidad de vacunas tales como las vacunas de BVDV y la gripe. Consecuentemente, desde que el sistema de la presente invención tiene la capacidad de incrementar la inmunogenicidad de las vacunas, no existe por consiguiente la necesidad o una necesidad menor de aceleradores. Una vacuna que requería 2 aceleradores para ser eficiente, cuando se prepara de acuerdo con la presente invención, - - puede sólo requerir un acelerador, o ninguno, dependiendo de la proteína contra la cual será inmunizada, y la inmunogenicidad global de la proteina entrampada en el sistema de suministro de la presente invención.

RADIO ETIQUETACIÓN DE BVDV Y MEZCLAS DE GLICOPROTEÍNAS CELULAR El virus de diarrea viral Bovina (BVDV) y las glicoproteínas de superficie celular se utilizan en la presente como un ejemplo de grandes proteínas solubles en agua a ser entrampadas en el sistema de la presente invención. Las glicoproteínas de superficie de BVDV se han etiquetado de acuerdo con un procedimiento de una galactosa oxidasa-[3H]borohidruro (Lukkonen, A. et al.,Virology, 76:55 (1977)) utilizando un comprimido de sobrenadantes de cultivo celular con contenido de virus preclarificado por centrifugación (25000 g, 3 h a 4°C). En resumen, la preparación del comprimido de virus, tratado con solución de Tritón™ X-100 al 0.5% durante una hora antes de suspenderse en PBS, se incubó primeramente con oxidasa de galactosa durante 60 minutos a 37°C y por lo tanto con 500 [iC\ de boro[3H]hidruro de sodio durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los virus etiquetados se separaron utilizando columnas de Sephadex 50™ después de una centrifugación baja (200 g, 15 minutos a 4°C). Finalmente, se depositaron las glicoproteínas etiquetadas y se almacenaron a -70°C.

PREPARACIÓN DEL SISTEMA DE SUMINISTRO. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el sistema de suministro se preparó al contactar 140 mg de un comprimido de alumbre comercialmente disponible con 2 mi (32.4 mg) de emulsión de aceite en agua elaborada con aceite neutral como se explica a continuación. Se prepararon cien (100) mi de emulsión por microfluidización (12,000 psi, 3 ciclos o 20,000 psi, un ciclo, a temperatura ambiente) en PBS Ubiquinona™ 50, 4 mi de un aceite neutral (escualano, aceite de soya, aceite de sésamo, o aceite de cacahuate), 100 mg de dicetilf osfato y 2 mi de mezcla Tween™ 80:span 85 (1:1, v/v). Opcionalmente, pueden agregarse vitaminas a esta solución. Un volumen de la emulsión recién preparada se agrega después a un volumen igual de solución protelnica en PBS antes de hacerse reaccionarse con alumbre. La cantidad de alumbre utilizada para preparar el sistema se determinó por ser la cantidad necesaria para unir 100% de la cantidad de preparación de emulsión agregada. Para determinar la cantidad de alumbre, se hacen reaccionar 2 mi (32.4 mg) de la emulsión de aceite tritiado con diferentes cantidades de alumbre. Se monitoreó la radioactividad residual en el sobrenadante después de una centrifugación baja (200 g, 15 minutos) a 4°C. La cantidad preferida de alumbre es una para la cual la radioactividad en el sobrenadante es mínima. En una modalidad preferida de la presente invención, la cantidad de dicetilfosfato utilizada puede variar para modular las interacciones electrostáticas entre una macromolécula y el sistema de - - suministro para variar la tasa de liberación de la macromolécula por el sistema. Crear interacciones electrostáticas fuertes al agregar más dicetilfosfato puede disminuir eventualmente la tasa de suministro del sistema hasta un sistema de suministro de liberación lenta. En ello, la tasa de liberación del sistema de la presente invención es variable consecuentemente. El sistema de suministro puede prepararse con o sin el antlgeno, en cuyo caso se agrega el antígeno en un momento posterior.

ANÁLISIS DE GRANULOMETRÍA DE PARTICULA Y FORMA Las mediciones de tamaño y forma de la partícula se llevaron a cabo por espectroscopia de correlación de fotones y microscopía electrónica de transmisión después del teñido negativo de muestras con una solución acuosa de acetato de uranilo al 1% como se resumió por Aurora et al. (Biochim. Biophys. Acta, Vol. 820, págs. 250-258 (1985); Wei, L. y Thomas, H. LH., Biochemistry Vol. 25, págs. 7477-7483 (1986)). Los resultados de medición de tamaño se citan como tamaño promedio y granulometría de partícula. Las imágenes de microscopía electrónica con un aumento apropiado permitieron la visualización de la forma del sistema (Figuras 3A, 3B, 5A y 5B), ENTRAMP AMIENTO MAC ROM O LE CU LAR El entrampamiento de glicoproteína de superficie de BVDV en el sistema de suministro se determinó sea después de microfluidizar una vez, a 12000 psi y temperatura ambiente, volúmenes iguales de una - - emulsión de tamaño bien definido y solución de macromoióculas antes de preparar el sistema de la presente invención, o, después de microfluidizar conjuntamente, bajo condiciones similares, volúmenes iguales de una suspensión de sistema ya instalada y la solución proteínica (50 mi de solución proteínica más 50 mi del sistema instalado). En ambos casos, la cantidad de proteína entrampada en el dispositivo se determinó al monitorear, utilizando una prueba de proteína de ácido bucinconínico comercialmente disponible (BCA), vendida por Pierce. La presencia de la proteína en el sobrenadante, en comparación con la cantidad total de proteína agregada, se determinó también después de la extracción con metanolxloroformo (1:2).

DETERMINACIÓN DE PROTElNA Las concentraciones proteínicas en el presente sistema se han determinado utilizando una prueba de BCA comercialmente disponible con BSA como estándar.

ESTUDIOS DE DISTRIBUCIÓN DE TEJIDOS Los experimentos in vivo se realizaron con ratones Balb/C hembras que pesaban 17 a 20 g, como se reportó en Makabi-Panzu, B. er al., Vaccine, Vol. 16, No. 16, págs. 1504-1510 (1998). El sistema de suministro de la presente invención se administró intramuscularmente a los ratones distribuidos en grupos de 6, a una dosis de 1,000,000 DPM por ratón. En muchos casos, la actividad específica del sistema inyectado fue de 1 pCi por mg de aceite neutral utilizando un - - hexadecilo-éter-colesterol tritiado no intercambiable y no metabolizable como marcador de la fase de selección como objetivo de dispositivo. La distribución de tejido se determinó 24 horas después de la administración de todo el dispositivo etiquetado a los ratones, Se tomaron los siguientes tejidos: pulmón, bazo, hígado, intestinos, riñón y plasma. Las muestras se pesaron y se interrumpieron con un combinador de tejidos (modelo 985-370, Xymotech Biosystems) en un volumen mínimo de solución de Tritón X-100™ al 0.25% (20 mg de tejido por mi). Los alícuotas de 200 µ? o 300 µ? de los homogenizados se digirieron durante 3 horas a 60°C con solubilizador 450 de tejidos Beckman (Beckman Canadá Inc., ississauga, Notario). Se agregó después un volumen apropiado de peróxido de hidrógeno al 30% para decolorar la muestra antes del conteo de escintilación con objeto de evitar la extinción (50 µ? por mi de homogenizado de tejido o agregar otros 50 µ? si no se encuentra decolorado). Después de 18 horas a temperatura ambiente en frascos fuertemente cerrados, se agregaron 70 µ? de ácido acético glacial a las muestras para evitar la quimioluminiscencia. Se agregó una cantidad apropiada de cóctel de escintilación tal como Ecolite™ (de Amersham Canadá) a las muestras que se contaron después en un contador de escintilación líquida (contador de escintilación líquida, LKB Wallac, 1217 Rackbeta, Turku, Finlandia). La distribución del sistema en los ratones se evaluó a partir de la radioactividad (cuentas DPM) por el peso del tejido total y se convirtió a mg del sistema inyectado por g de tejido.

- - RESULTADQS PREPARACIÓN DEL SISTEMA DE SUMINISTRO El sistema de suministro se construyó al contactar conjuntamente una fase orgánica basada en emulsión cargada negativamente con una fase inorgánica basada en alumbre cargada positivamente. Se han probado cuatro aceites neutrales preferidas, a saber aceite de soya, aceite de sésamo, aceite de cacahuate, y escualano, para formar la fase orgánica del sistema de suministro en forma de emulsiones de submicrónica de aceite en agua. En general, no se encontró ninguna diferencia en términos de forma, tamaño promedio de partículas, ni granulometría de partículas (Figuras 1 y 3). Todas las emulsiones preparadas consistieron básicamente de gotitas globulares de menos de 400 nm de diámetro, similarmente distribuidas. El escualano se seleccionó para estudios adicionales debido a su alto contenido en ácidos grasos saturados. Las emulsiones de escualano exhibieron una estabilidad coloidal muy buena a largo plazo después de 420 días de almacenamiento a 4°C (ver la Figura 2). En cambio, el alumbre utilizado para preparar la fase inorgánica del sistema de suministro de la presente invención es una preparación comercial fácil de utilizar. (Vendida por Accurate Chemical, Westbury, Nueva York, EUA). En la Figura 4, se encontraron adecuados 140 mg de este alumbre para instalar todo el sistema de suministro. Esta cantidad de alumbre es la cantidad que une totalmente la cantidad de fase orgánica utilizada (32.4 mg). La Figura 4 ilustra la cantidad de alumbre necesaria - - para unir la fase orgánica del sistema de suministro de la presente invención. Como puede observarse en la Figura 4, se alcanza una meseta cuando se utilizan más de 140 mg de alumbre. La cantidad de alumbre utilizada fue aquella para enjaular una cantidad máxima de la fase llpida. Esta cantidad máxima se ha determinado interactuando diferentes cantidades de alumbre con 2 mi de la fase llpida tritiada a temperatura ambiente.

EFICIENCIA DEL ENTRAMPAMIENTO PROTEÍNICO DEL SISTEMA DE SUMINISTRO El sistema de suministro de la invención exhibió una capacidad muy buena para entrampar proteínas como se muestra en las Figuras 5 y 6. La capacidad de entrampamiento protelnico del sistema de la presente invención, se evaluó utilizando cantidades variables de albúmina de suero bovino (BSA) como modelo, excedió 25 mg cuando no se utilizó la Ubiquinona 50 en la formulación. El porcentaje de entrampamiento de BSA bajo las mismas condiciones fue de aproximadamente 90 a 100%, independientemente de la estrategia de preparación utilizada, y/o la cantidad de lípido en la fase de emulsión. Se observa una alta correlación entre el contenido de lípido de la fase de emulsión y la eficiencia de proteínas de entrampamiento del sistema (Tabla 1, Figura 7). El sistema de suministro exhibió un comportamiento de entrampamiento similar utilizando otras proteínas y/o un método de entrampamiento de mezclado a mano (ver la Figura 8).

- - Tabla 1 Efecto de la estrategia de microfluidización en el entrampamiento proteínico en el sistema de suministro e influencia de la cantidad de las fases lipídica coloidal (fase objetivo) y de alumbre (fase objetivo). * representa el valor medio (desviación estándar) DISPOSICIÓN IN VIVO DEL SISTEMA DE SUMINISTRO EN EL CUERPO Como se reportó en la Figura 9, la fase objetivo del sistema de suministro de la presente invención, cuando se administra intramuscularmente a ratones BALB/c, acumulada preferentemente en el tejido rico en macrófagos del RES a 24 horas postinyección. También se observó una acumulación significativa del sistema en tejidos tales como intestinos, riñón y en la circulación. Se ha demostrado que el sistema de suministro de la presente invención puede utilizarse como vehículo o portador para - - suministrar proteínas cargadas preferentemente intramuscularmente o subcutáneamente. Las macromoléculas se entrampan con base en su carga e interacción electrostática con el sistema de suministro. Las cargas electrostáticas del sistema pueden variar para modular la interacción entre el sistema de suministro y la macromolécula a entramparse, y consecuentemente modular la respuesta de liberación de macromolécula del sistema. Contrario a los sistemas de la técnica anterior, el sistema de suministro no solo selecciona como objetivo macrófagos, sino también tejidos objetivo tales como pulmón, bazo, hígado, intestinos, riñón y plasma. La presente invención se comprenderá más fácilmente refiriéndose al siguiente ejemplo, el cual se brinda para ilustrar la invención en lugar de limitar su alcance.

EJEMPLO I Etiquetación de glicoproteínas de MDBK infectadas con BVDV por el procedimiento de borohidruro tritiado de oxidasa de galactasa El sobrenadante de cultivo celular con contenido de virus se preclarifica por centrifugación a 25,000 g durante 3 horas a 4°C. Las glicoproteínas con contenido de comprimido se vuelve a suspender en PBS y se trata con un volumen igual de una solución de Tritón X-100™ al 0.5% durante una hora a 4°C. Después se agregan veinticinco unidades (25) de oxidasa de galactosa y se incuban durante una hora. Después se agrega borohidruro de sodio tritiado (500 ¿L/Ci) y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se elimina la etiqueta libre - - (radioisótopo) utilizando una columna de Sephadex™ G50 después de una centrifugación de baja velocidad a 200 g durante 15 minutos a 4°C. Las glicoproteínas así etiquetadas se depositan y almacenan a -70°C hasta su uso.

EJEMPLO II Preparación y caracterización del sistema de suministro de la presente invención. El sistema se ha preparado al microfluidizar en un volumen de 100 mi a 12 000 psi 4 mi de escualano, 1 mi de Span 85, 1 mi de Tween 80, 100 mg de Ubiquinona 50 (U50), 100 mg de dicetilfosfato (DCP), 20 mg de vitamina A y 100 mg de vitamina E como se explica a continuación: en resumen, después se agregaron volúmenes apropiados de U50, DCP, vitaminas A y E disueltas en metanohcloroformo (2:1) en una botella de 100 mi, y se evaporó el orgánico solvente utilizando un flujo de gas nitrógeno antes de agregar cantidades apropiadas de escualano, Span 85 y Tween 80. La mezcla se microfluidizó después tres veces en 100 mi de PBS. La emulsión obtenida se esterilizó finalmente al someter a autoclave a 120 grados durante 15 minutos. Al final del proceso de autoclave, la fase separada de U50 se volvió a adherir por simple agitación de la botella una vez que su temperatura se enfrió lo suficiente para ser manejada por las manos. Generalmente, 14 mi de fase de emulsión tuvieron contacto con 980 mg de alumbre para formar una mezcla de tipo gel a temperatura ambiente. La macromolécula se entrampó al mezclar simplemente con un volumen - - igual de suspensión de sistema de adyuvante preparado (también referido en la presente como sistema de suministro). Este procedimiento se llama procedimiento preformado utilizando la fase de emulsión de sistema de adyuvante preformado o la suspensión del sistema de suministro preinstalado. Un procedimiento alterno que consiste en el entrampamiento de la macromolécula durante el paso de microfluidización se llama procedimiento paso a paso.

Tamaño de partícula El tamaño de la partícula de la fase de emulsión del sistema de suministro se analizó utilizando un nanocalibrador (Coulter) el cual es adecuado para medir partículas menores a 1 µ<? donde es mayor la resolución aunque las partículas grandes pueden cuantificarse también con menos precisión.

Entrampamiento macromolecular Con objeto de caracterizar la partición de macromoléculas libres y unidas en el sistema adyuvante, se evaluó la eficiencia de entrampamiento macromolecular del sistema, Se separaron las macromoléculas libres de las macromoléculas unidas por centrifugación baja (13 000 rpm, 15 min, a temperatura ambiente), y se evaluó la cantidad de macromoléculas entrampadas en comparación con la cantidad agregada inicialmente de macromoléculas utilizando una prueba de protelna BCA en el caso de la proteína o simplemente evaluando una longitud de onda UV (260 nm) en el caso de la medición - - de ADN.

Liberación de macromoléculas unidas del sistema adyuvante. La medición de la liberación de macromoléculas del sistema de adyuvante da una buena ¡dea acerca de la capacidad del sistema para modular diferencialmente las respuestas inmunológicas a través de las macromoléculas unidas al seleccionar como objetivo básicamente APCs tales como los macrófagos. Se incubó 1 mi de alícuotas del sistema de adyuvante con contenido de macromoléculas unidas a 4, 25, 37 y 60°C en PBS. La liberación de la macromolécula se monitoreó en el sobrenadante en diferentes periodos de tiempo. La cantidad de macromoléculas liberadas se evaluó en el sobrenadante después de la extracción con un volumen igual de metanol/cloroformo (1/2) utilizando una prueba de proteína de BCA en el caso de las proteínas o simplemente al medir a 260 nm en el caso del ADN.

Evaluaciones de estabilidad La estabilidad del sistema de adyuvante se evaluó también al monitorear a simple vista el proceso de descremación, separación de fases, y agregación de la preparación después de un almacenamiento de 2 años a 4°C.

Resultados y Discusión La Tabla 2 muestra la formulación de la fase de emulsión del sistema de suministro de la presente invención. Como puede verse - - a partir de esta tabla, la emulsión se encuentra elaborada de escualano cargado negativamente debido a la presencia de dicetilfosfato. El escualano sirve como matriz a los demás ingredientes tales como Ubiquinona 50, vitaminas A y E. Se utilizaron diez (10) mi de solución de Ubiquinona 50 al 10%, dicetilfosfato, vitaminas E y 10 mi de solución de vitamina A al 2% para preparar la fase de emulsión.

Tabla 2 Formulación Composición Contenido % Escualano 4.00 (v/v) Tween 80 1.00 (v/v) Span 85 1.00 (v/v) Ubiquinona 50 0.10 (v/v) Dicetilfosfato 0.10 (v/v) Vitamina E 0.10 (v/v) Vitamina A 0.02 (v/v) La matriz de escualano se elabora a partir de 200 nm de gotitas estables suspendidas en una solución de PBS acuosa. Las gotitas fueron resistentes al proceso de autoclave debido a que su tamaño no se vio demasiado afectado por la temperatura elevada durante el proceso de autoclave (121°C, 15 min) (ver la Tabla 3). En la - - Tabla 3, el tamaño de las gotitas de emulsión almacenadas a 4 grados se determinó utilizando un nanocalibrador Coulter 2 años y 5 años después de la preparación.

Tabla 3 Tamaño de la partícula de la fase de emulsión del sistema adyuvante Edad de emulsión Autoclave Tratamiento Antes Después 2 años de edad ND 540 nm ± 59 5 días de edad 189 nm* 146 nm ± 74 'representa la media ± SD, n = 3.

En la Tabla 4, la estabilidad de la fase de emulsión se monitoreó en presencia de BSA interactuando con las gotitas dependiendo de la estrategia de preparación utilizada. La estrategia paso a paso consistió en el entrampamiento de la proteína durante la preparación de emulsión mientras que la estrategia de preformado consistió en el entrampamiento de la proteína utilizando gotitas preformadas.

- - Tabla 4 Estabilidad del sistema de adyuvante de emulsión después de 2 años de almacenamiento a 4 grados - Influencia de la presencia de proteínas Estrategia de Presión preparación Agregación 12 000 psi Paso a paso + (>10 mg/ml) 12000 psi Preformado + (>20 mg/ml) 20000 psi Paso a paso + (>10 mg/ml) 20000 psi Preformado + (>20 mg/ml) Aunque el proceso de autoclave provocó la separación de Ubiquinona 50 la cual se volvió a adherir en gotitas aceitosas simplemente al agitar la botella a una temperatura de aproximadamente 40-50 grados, la reacción con la fase de alumbre produjo un sistema bastante estable con una gran capacidad de entrampamiento proteinico incluso después de 2 años de almacenamiento a 4°C (Tablas 5 y 6). La capacidad de entrampamiento del sistema de 2 años de edad fue comparable con el del sistema recién preparado (Tabla 5).

- - Tabla 5 Capacidad de unión de proteína del sistema de adyuvante después de 2 años de almacenamiento - Comparación con la capacidad protelnica del alumbre BSA (mg) Sistema adyuvante Alumbre % % 00.00 000 + 0.00* 000 + 0.00 03.12 100 + 0.18 093 + 1.50 06.25 100 + 0.17 088 + 2.71 12.50 090 + 0.15 079 + 1.97 19.00 065 + 0.45 nd 25.00 049 + 1.95 065 + 4.40 * representa el valor medio ± SD, n=3. nd significa no determinado.

El porcentaje descrito en la Tabla 5 se calcula a partir de la cantidad de protelna restante entrampada con respecto a la cantidad utilizada originalmente. La capacidad de unión proteínica se define como la cantidad de proteína agregada inicialmente captada totalmente por el sistema. Se mezclaron diferentes cantidades de proteínas con los alícuotas del sistema y se evaluó la protelna entrampada comparando la cantidad de proteína en el sobrenadante con la cantidad agregada inicialmente utilizando una prueba de proteína de BCA después de la extracción con un volumen igual de metanol/cloroformo.

- - El sistema de 2 años de edad exhibió una capacidad entrampamiento mayor que la del alumbre (Tabla 6).

Tabla 6 Comparación de capacidades de unión de proteina de sistemas adyuvantes recién preparados y con 2 años de edad BSA (mg) Preparación nueva Preparación vieja % % 00.00 000 + 0.00* 000 + 0.00 03.12 100 + 0,43 100 + 2.60 06.25 100 + 0.07 100 + 0.17 12.50 095 + 0.67 094 + 0.69 25.00 047 + 2.04 039 + 4.10 * representa el valor medio ± SD, n=3.

El porcentaje utilizado en la Tabla 6 se calcula a partir de la cantidad de proteína entrampada con respecto a la cantidad de proteína utilizada generalmente. Además de entrampar una proteína cargada negativamente, el sistema mantuvo también una cantidad significativamente de una proteina cargada positivamente (Tabla 7).

- - Tabla 7 Capacidades de entrampamiento del sistema de adyuvante para las macromoléculas cargadas positivamente y negativamente Protelna (mg) BSA (negativo) Espermidina (positiva) % % 00.00 000 + 0.00 000 + 0.00* 03.12 100 + 0.43 100 + 0.00 06.25 100 + 0.07 056 + 8.14 12.50 095 + 0.67 042 + 4.43 25.00 047 + 2.04 017 + 4.44 * representa el valor medio ± SD, n=3.

El porcentaje representado en la Tabla 7 se calcula a partir de la cantidad de proteína entrampada en el sistema con respecto a la cantidad de protelna utilizada originalmente. El sistema de suministro de la presente invención fue capaz de entrampar una cantidad bastante grande de vacuna contra la gripe a una concentración elevada (Tabla 8).

- - Tabla 8 Partición de la vacuna contra la gripe en el sistema adyuvante Muestra Antlgeno libre Antígeno unido Total % % % Prep. de 2 014 + 0.27* 086 + 0.27 100 + 0.00 años de edad Prep. de 5 016 + 2.56 084 + 2.56 100 + 0.00 días de edad Solución de 100 + 2.20 000 + 0.00 100 + 0.00 Antigeno Sistema 000 + 0.00 000 + 0.00 0.00 + 0.00 descubierto * representa el valor medio ± SD, n=3.

Una solución de la vacuna contra la gripe con contenido de 1.25 mg de protefna total como se evalúa con el uso de una prueba de proteína BCA se probó aquí. La proteína entrampada se determinó como se describe en la Tabla 5. Los resultados de la liberación proteínica del sistema después de la incubación en PBS a diferentes temperaturas (4, 25, 37 y 60°C) durante tres semanas confirmaron la estabilidad del sistema en términos de entrampamiento de una proteína tal como BSA (Tabla 9).

Tabla 9 Estabilidad de entrampamiento proteínico (%) del sistema después de tres días de incubación a diferentes temperaturas Temperatura Muestra 4°C 25°C 37°C 60°C Prep. de 2 100±0.00 100±0.00* 100±0.00 100±0.00 años de edad Prep, de 5 días 100±0.00 100±0.00 100±0.00 100±0.00 de edad * representa el valor medio ± SD, n=3 En la Tabla 9, los alícuotas del sistema de adyuvante que entrampan 12.5 mg de proteína se incubaron a las temperaturas indicadas durante tres días y la proteína liberada en el sobrenadante se evaluó como se describió con anterioridad utilizando una prueba de proteína de BCA. La estabilidad se expresa como un porcentaje de la proteína unida restante con respecto a la proteína unida inicial. Un entrampamiento estable de proteína se encontró después de tres días y una, dos, tres semanas para todas las temperaturas de incubación utilizadas (Tablas 9 a 12). La capacidad de entrampamiento del sistema de adyuvante parecía incrementar irreversiblemente con la temperatura de incubación en presencia de una cantidad en exceso de proteína (Tablas 10 a 12) debido a que no se observó ninguna liberación de proteína a partir de las muestras después de un período largo de - - almacenamiento (tres semanas) a 4°C. El sistema de adyuvante exhibió también una capacidad de entrampamiento superior para el ADN además de entrampar una gran cantidad de proteína, Tabla 10 Estabilidad de entrampamiento proteínico del sistema después de semana de incubación a diferentes temperaturas Temperatura Protelna (mg) 4"C 25°C 37°C 60°C 00.00 OO.OOiO.OO 00.00±0.00 00.00i0.00 00.00±0.00 03.12 10000±0.03 99.00±0.74 99.00±0.20 100.00±0.05 06.25 100.00±0.06 100.00±0.11 99.00±0.44 100.00±0.06* 12.50 100.00±0.05 100.00±0.02 10O.00±0.03 99.00±0,06 25.00 59.00±1.14 63.00±1.50 75.00±0.O5 88.00±0.09 * representa el valor medio ± SD, n=3 La prueba representada en la Tabla 10 se llevó a cabo de manera similar a la representada en la Tabla 9, excepto que se han utilizado los alícuotas de sistema de adyuvante mezclados con una cantidad diferente de BSA.

- - Tabla 11 Estabilidad de entrampamiento protelnico del sistema después de dos semanas de incubación a diferentes temperaturas Temperatura Proteina (mg) 4°C 25°C 37°C eo°c 00.00 00.00±0.00 00.00±0.00 00.00±0.00 00.00±0.00 03.12 100.00±0.06 100.00±0.02 100.00±0.17 100.00±0.03 06.25 100.00±0.03 100.00±0.08 T9.00±0.30 99.00±0.70* 12.50 100.00±0.05 100.00±0.02 99.00±1.17 99.00±0.08 25.00 65.00±0.52 63.00±3.09 80.00±1.03 99.00±2.56 * representa el valor medio ± SD, n=3 Tabla 12 Estabilidad de entrampamiento protelnico del sistema después de tres semanas de incubación a diferentes temperaturas Temperatura Proteina (mg) 4°C 25°C 37°C 60°C 00.00 00.00±0.00 00.00±0.00 00.00±0.00 00.00±0.00 03.12 100,00±0.12 100.00±0.10 100.00±0.02 100.00±0.06 06.25 100.00±0.05 100.00±0.08 100.00±0.70 100.00±0.03* 12,50 100.00±0.03 100,00±0.05 100.00±0.71 100.00±0.47 25.00 66.00±0.30 70.00±1.46 76.00±0.88 98.00±0.47 * representa el valor medio ± SD, n = 3 La prueba representada en la Tabla 12 se llevó a cabo de manera similar a la representada en la Tabla 9, excepto que se han - - utilizado alícuotas del sistema de adyuvante mezclado con una cantidad diferente de BSA. La protefna entrampada en el sistema de la presente invención estuvo aún intacto incluso después de dos años de almacenamiento como se muestra en la Figura 11. La Figura 11 ¡lustra la integridad de la BSA entrampada después de 2 años de almacenamiento del sistema a 4°C. Aquí, se mezclaron 10 µ? de suspensiones del sistema mezcladas inícialmente con diferentes concentraciones de BSA; se diluyeron 25.00, 12.5, 6,25, y 3.12 mg de la pista convencional (normas de peso molecular alto Blorad) ½ en regulador de muestra de SDS antes de analizarse a través de un gel de SDS-PAGE al 12% después de un teñido de azul Coomasie (pistas 6 a 9). Se han utilizado las mismas cantidades correspondientes de BSA libre (pistas 2 a 5) como controles. A bajas concentraciones, la proteína se entrampó fuertemente en el sistema mientras que a concentraciones altas, se entrampó holgadamente una porción de la cantidad de proteína en el sistema. La proteína fuertemente entrampada no ingresó al gel. Solamente la porción de proteína entrampada holgadamente ingresó al gel. Los resultados sobre las propiedades físico-químicas del sistema de la presente invención después de 2 años de almacenamiento a 4 grados en comparación con su contraparte recién preparada demuestra claramente que el sistema es un sistema de suministro muy estable con gran capacidad de entrampamiento de proteínas incluso - - después de dos años de almacenamiento a 4°C que utiliza BSA como modelo protefnico. El sistema no exhibió separación de fases, descremación ni agregación. La emulsión orgánica cargada negativamente se estabilizó a través de sus interacciones con la fase inorgánica cargada positivamente. El sistema entrampó fácilmente cualquier macromolécula cargada mediante un sencillo agitación con un volumen de solución macromolecular como demostró la BSA, la vacuna contra la gripe y resultados de ADN. Los hechos de que el sistema es estable durante más de dos años y se preparó a partir de materiales clínicamente aprobados utilizando un procedimiento farmacéutico bien aceptado representan una gran ventaja en términos de aprobación por la FDA y el cumplimiento de los requisitos farmacéuticos. En virtud de estos resultados, puede concluirse que el sistema de la presente invención es un sistema muy estable con una gran capacidad de entrampamiento sobre la única base de cargos electrostáticos. Aunque se ha descrito la invención en conexión con modalidades especificas de la misma, se comprenderá que es capaz de modificaciones adicionales y esta solicitud pretende cubrir cualesquier variaciones, usos, o adaptaciones de la invención y en general, los principios de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo desviaciones de la presente descripción como una práctica conocida o habitual en la materia a la cual pertenece la invención y como puede aplicarse a las características esenciales - - expuestas con anterioridad, y como se explica a continuación alcance de las reivindicaciones anexas.

- - REIVINDICACIONES 1. Un sistema de suministro bifásico para moléculas cargadas caracterizado porque comprende una fase orgánica hidrofóbica cargada negativamente y una fase orgánica hidrofóbica cargada positivamente, siendo capaces dicha fase orgánica y dicha fase inorgánica de entrampar moléculas cargadas con la unión electrostática de las moléculas cargadas con la fase orgánica y la fase inorgánica. 2. El sistema de suministro según la reivindicación 1, caracterizado porque las moléculas cargadas son macromoléculas. 3. El sistema de suministro según la reivindicación 1, caracterizado porque la fase orgánica es una emulsión de aceite en agua que comprende un aceite electrostáticamente neutral y un compuesto orgánico cargado negativamente. 4. El sistema de suministro según la reivindicación 3, caracterizado porque el aceite neutral se selecciona a partir del grupo que consiste en escualano, aceite de soya, aceite de sésamo y aceite de cacahuate. 5. El sistema de suministro según la reivindicación 3, caracterizado porque el compuesto orgánico cargado negativamente es dicetilfosfato. 6. El sistema de suministro según la reivindicación 1, caracterizado porque la fase inorgánica comprende alumbre. 7. El sistema de suministro según la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de suministro tiene un diámetro a lo

Claims (1)

1. sumo de cinco micrómetros cuando dichas moléculas cargadas se entrampan ahí. 8. El sistema de suministro según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además moléculas cargadas. 9. El sistema de suministro según la reivindicación 8, caracterizado porque las moléculas cargadas son ADN. 10. Un método para producir un sistema de suministro según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende los pasos para contactar una fase orgánica hidrofóbica cargada negativamente con moléculas cargadas y una fase inorgánica cargada positivamente y mezclar las mismas para entrampar dichas moléculas cargadas entre la fase orgánica y la fase inorgánica. 11. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque la fase orgánica hidrofóbica cargada negativamente y las moléculas cargadas primeramente se mezclan conjuntamente, seguido de adición y mezclado de la fase inorgánica cargada positivamente. 12. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque la fase orgánica es una emulsión de aceite en agua que comprende un aceite neutral y un compuesto orgánico cargado negativamente. 13. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque el aceite neutral se selecciona a partir del grupo que consiste en escualano, aceite de soya, aceite de sésamo y aceite de cacahuate. 14. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto orgánico cargado negativamente es dicetilfosfato. 15. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque la fase inorgánica comprende alumbre. 16. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque el sistema de suministro tiene un diámetro a lo sumo de cinco micrómetros cuando dichas moléculas cargadas se entrampan ahí. 17. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque dichas moléculas cargadas son ADN. RESUMEN La presente invención se refiere a un nuevo sistema de suministro y método para producir el mismo. El sistema de suministro es un sistema bifásico de suministro de macromoléculas cargadas y comprende una fase orgánica hidrofóbica cargada negativamente y una fase inorgánica cargada positivamente. La fase orgánica y la fase inorgánica entrampan las macromoléculas agregadas. Las macromoléculas se entrampan por enlaces electrostáticos entre la fase orgánica, la fase inorgánica y las macromoléculas. El método para producir el sistema de suministro comprende los pasos para contactar conjuntamente y mezclar una fase orgánica cargada negativamente, una macro-molécula cargada y la fase inorgánica cargada positivamente. 100% población 75% población 50% población 25% población 100 200 300 400 500 tamaño (nm) Fig. 1