CZ302369B6

CZ302369B6 - Prostredek vytvárející micely

Info

Publication number: CZ302369B6
Application number: CZ20024268A
Authority: CZ
Inventors: Leroux@Jean-Christophe; Souad Benahmed@Amina
Original assignee: Labopharm, Inc.
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2011-04-13
Also published as: DE60122335D1; IL153655A; DK1296647T3; WO2002000194A2; CN1447683A; ATE336229T1; HK1059395A1; PT1296647E; KR20030039332A; AU2001270405B2; NZ523645A; CA2414241C; BR0112054A; WO2002000194A3; CZ20024268A3; NO20026255L; NO20026255D0; HUP0300963A2; PL360262A1; AU7040501A

Abstract

Prostredek, vytvárející micely, vhodné pro prenos úcinných látek na místo jejich urcení a zahrnující - hydrofobní jádro, obklopené hydrofilním obalem a - lécebné cinidlo, fyzikálne zachycené v micele, je upraven tak, že hydrofobní jádro je zvoleno ze skupiny, zahrnující polyorthoester, polyanhydrid, pseudo-poly(aminokyselinu), odvozenou od tyrosinu, polyfosfazen nebo poly(.beta.-benzyl-L-aspartát) a jejich kombinace, nebo polyester, zvolený ze skupiny zahrnující poly(glykolovou kyselinu), poly(D,L/mlécnou kyselinu), laktidové/glykolidové kopolymery nebo polykaprolakton a deriváty techto sloucenin a hydrofilním obalem je poly(N-vinyl-2-pyrrolidon), pricemž prostredek se snadno redisperguje nebo znovu rozpustí po pridání vody k lyofilizovanému prostredku, vytvárejícímu micely.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká prostředků, zahrnujících polymemí micely, které jsou vhodné pro předávání léčebných činidel včetně, nikoliv však výlučně, protirakovinných léků.

Dosavadní stav techniky

Hlavním nedostatkem, spojeným s použitím chemoterapeutických činidel, je nedostatek selektivity vůči rakovinným buňkám. Tento nedostatek selektivnosti souvisí s toxickými vedlejšími účinky použití takových činidel, způsobenými jejich přístupem jak do normálních, tak i abnormálních buněk. Nedostatek selektivnosti léků vůči cílovým buňkám je problémem i při léčbě množství jiných chorob než jen rakoviny. Mnoho výzkumného úsilí bylo zaměřeno na vývoj nosičů léků, které mohou lék selektivně předávat do cílových buněk. Například pro zlepšení specifického dodávání léků s nízkým léčebným indexem byly studovány různé lékové nosiče jako liposomy, mikročástice, nano-asociáty a konjugáty léku a polymeru.

Ze studovaných přístupů, jak dosáhnout zacílení, si značnou pozornost získaly liposomy (fosfolipidové váčky). Jejich účinnost zacílení je ovšem omezena jejich rychlým odklízením retikuloendoteliálními buňkami (RE buňkami) jater a sleziny, nestálostí v plazmě, omezenou schopností vystrikování (extravazace) vzhledem kjejich velikosti, technickými problémy jejich výroby a snadnou oxidovatelností. Byla nalezena řešení jednotlivých problémů, ovšem řešení více než jednoho problému se jen zřídka spojila v případě jednoho prostředku. Například pokud bylo sníženo rozpoznávání RE buňkami a byla zlepšena stálost liposomů, bylo zároveň obtížné získat stálé liposomy, mající průměr menší než 50 nm.

Polymemí micely byly prvotně navrženy jako nosiče léků H. Baderem a spoluautory v roce 1984 (Angew. Makromol. Chem. 123/124, 457 až 485, 1984). Polymemí micely byly objektem rostoucí vědecké pozornosti a byly uvažovány jako možné nosiče léků, majících špatnou rozpustnost ve vodě, neboť mohou tyto léky ve svém vnitřním jádře rozpouštět a nabízejí také přitažlivé charakteristiky, jako je obecně malá velikost (menší než 100 nm) a sklon vyhýbat se odstranění prostřednictvím retikuloendoteliálního systému (RES).

Micely jsou často srovnávány s přirozeně se vyskytujícími nosiči, jako jsou viry nebo lipoproteiny. Všechny tři typy těchto nosičů vykazují podobnou strukturu jádro-obal, která umožňuje ochranu jejich obsahů během transportu k cílové buňce, ať už se jedná o DNA u virů, nebo vodou nerozpustné léky u lipoproteinů a micek

Lipoproteiny byly navrženy jako nosné prostředí pro zacílení protinádorových sloučenin na rakovinné buňky, neboť nádory vykazují zvýšenou potřebu lipoproteinů o nízké hustotě. Účinnost lipoproteinů jako nosičů byla zpochybňována; ovšem zejména proto, že by lipoproteiny, které začlenily léčivo, měly být rozeznatelné také zdravými buňkami a měly by soutěžit s přírodními lipoproteiny o receptorová místa v nádorech. Naproti tomu virové nosiče se používají zejména pro přenos genetického materiálu a mohou být nejlépe použity v takových aplikacích, které nevyžadují opakované podávání nosného prostředí, neboť pravděpodobně vyvolávají imunitní odpověď.

Polymemí micely se zdají být jedním z nej výhodnějších nosičů k přenosu vodou nerozpustných léků. Polymemí micely jsou charakterizovány strukturou jádra a obalu. Farmaceutický výzkum polymemích micel byl soustředěn zejména na kopolymery, mající dvojblokovou strukturu A-B, přičemž A je hydrofilní částice obalu a B je hydrofobní polymemí jádro. Do micel mohou být organizovány také multiblokové kopolymery jako poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)- poly- 1 CZ 302369 B6 (ethylenoxid) (PEO-PPO-PEO) (A-B-A), které byly popsány jako možné nosiče léků; A. V. Kabanov se spoluautory, FEBS Lett. 258, 343 až 345, 1989. Hydrofobní jádro, které obecně sestává z biologicky odbouratelného polymeru jako je poly([3-benzyl-L-aspartát) (PBLA), poly(DL-míéčná kyselina) (PDLLA) nebo poly(e-kaprolakton) (PCL), slouží jako zásobník neroz5 pustného léku, který ho chrání před stykem s vodným prostředím. Jádro může sestávat také z vodou rozpustného polymeru, jako je poly(kyselina asparagová) (P(Asp)), který získá hydrofobnost chemickou konjugací s hydrofobním lékem, nebo je vytvořen asociací dvou opačně nabitých polyiontů (polyíontové komplexní micely).

io Několik studií popisuje užití biologicky slabě odbourávatelných nebo zcela neodbouráteIných polymerů, jako je polystyren (Pst) nebo poly(methylmethakrylát) (PMMA) jako složek inertního jádra. Viz například C. L. Shao se spoluautory, Langmuir 6, 514-516, 1990, L. Zhang se spoluautory, Science 268, 1728 - 1731, 1995 a T. Inoue se spoluautory, J. Controlled Release 51, 221 - 229, 1998. K tomu, aby byly považovány za klinicky odpovídající nosiče léčiv, musí být bio Ιοί 5 gicky neodbouratelné polymery netoxícké a mít molekulovou hmotnost dostatečně nízkou pro možnost vyloučení močovými cestami. Hydrofobní vnitřní jádro může také sestávat z vysoce hydrofobního malého řetězce, jako je alkylový řetězec nebo diacyllipid, jak je tomu u distearoylťosfatidylethanolaminu (DSPE). Hydrofobní řetězec může být buď připevněn na jeden konec polymeru, nebo může být v polymemí struktuře náhodně distribuován.

Obal zodpovídá za stabilizaci micely a za její interakce s plasmatickými bílkovinami a s buněčnými membránami. Obvykle sestává z řetězců hydrofilních biologicky neodbouratelných a biologicky slučitelných polymerů, jako je PEO. Biologická distribuce nosiče je určována hlavně povahou hydrofilního obalu. Jiné polymery, jako poly(N-isopropylakrylamid) (PNIPA) a poly25 (kyselina alky (akrylová), poskytují micelám citlivost vůči teplotě nebo pH a mohou být případně použity k poskytnutí vlastností biologické přilnavosti. Známé jsou také micely, vykazující na svém povrchu funkční skupiny pro spojení s cílovou částicí, viz například C. Scholz se spoluautory, Macromolecules 28, 7295 - 7297, 1995.

Dobře známým vodou rozpustným, biologicky slučitelným amfífílním polymerem je poly(Nvinyl—2-pyrrolidon) (PVP), mající vysoce polární laktamovou skupinu obklopenou nepolárními methylenovými skupinami v kostře a methylovou skupinou v kruhu. PVP se běžně používá jako sterický stabilizátor pro syntézy polystyrénových latexů. Viz například L. I. Gabaston se spoluautory, Macromolecules 31, 2883 - 2888, 1998; J. S. Rutt se spoluautory, J. Polym. Sci.: díl A:

Polym. Chem. 32, 2505- 2515, 1994. PVP lze použít také jako kry o—ochrannou látku a lyo— ochrannou látku. Viz například Η. B. Skaer se spoluautory J. Microsc. 110, 257- 270, 1977; M. W. Townsend se spoluautory J. Parenter. Sci. Technol. 42, 190 - 199, 1988.

Ve srovnání s PEG je PVP významný rozdílností interakcí, které vykazuje vzhledem k neionto4o vým i iontovým, společně rozpuštěným látkám. Viz P. Molyneux, Proč. Int. Symp. Povidone, 1 — 19. 1983. Vazba se uskutečňuje nejvýrazněji s molekulami, majícími dlouhé alkylové řetězce nebo aromatické částice. Podobně jako PEG může také PVP zvýšit in vivo dobu oběhu koloidních nosičů a peptidů/bílkovin. Viz například H. Kamada se spoluautory, Biochem. Biopkys Res. Commun. 257, 448 -453, 1999; V. P. Torchilin, J. Microencapsulation 15, 1 - 19, 1998. Dále bylo prokázáno, že nanočástice, obsahující d i blokové kopolymery po ly(D,L-m léčné kyseliny) a póly (ethy lengly kolu) (PEG), agregují po lyofilizaci. Viz F. De Jaeghere se spoluautory, Pharm. Res. 16, 859— 866, 1999. Tento problém se podařilo obejít použitím lyo-ochranné látky. Tuto obtíž by bylo možné řešit i použitím PVP, neboť samotný PVP je lyo-ochrannou látkou.

N-vinylpyrrolidon (VP) může být kopolymerizován velkým množstvím různých viny lových monomerů. S elektronegativními monomery vytváří střídavé (alternující) kopolymery, zatímco s akry laty vytváří náhodné kopolymery. Připraven byl například roubovaný kopolymer (graft copolymer), který tvoří poly(L-laktid) (PLLA) a polyvinylpyrrolidon (PVP). Viz například J. L. Eguiburu se spoluautory, J. San Roman, Polymer 37, 3615-3622, 1996. V této studii byl makro55 monomer PLLA kopolymerizován s VP, ovšem vytvoření polymemích micel nebylo hodnoceno.

Až do současnosti se většina studií, týkajících se přípravy biologicky od bouráte 1 ných polymerních micel, soustředila na využití PEG (polyethylenglykolu) k vytvořeni hydrofilního obalu. Viz například X. Zhang se spoluautory, lnter. J. Pharm. 132, 195-206, 1996; M. Yokoyama se spo5 luautory, J. Control. Release 55, 219-229, 1998 a C. Allen se spoluautory, J. Control. Release 63, 275-286, 2000.

Stále tedy přetrvává potřeba nových, biologicky slučitelných a biologicky odbouratelných polymemích micelárních systémů bez obsahu PEG, které by však vykazovaly dobré solubilizační io vlastnosti a poskytovaly několik vazných míst pro různé léky. Měly by být také snadno opět dispergovatelné nebo opět rozpustné po přidání vody ke své lyofílizované formě. Předkládaný vynález takový systém vytvořil z dvojbloku obsahujícího PVP-poly(D,L-laktid), tj. PDLLA.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří prostředek, vytvářející micely, vhodné pro přenos účinných látek na místo jejich určení a zahrnující - hydrofobní jádro, obklopené hydroftlním obalem a

- léčebné činidlo, fyzikálně zachycené v mi cele, prostředek je upraven tak, že hydrofobní jádro je zvoleno ze skupiny, zahrnující polyorthoester, polyanhydrid, pseudopoly(aminokyselinu), odvozenou od tyrosinu, polyfosfazen nebo poly(p-benzyl-L-aspartát) ajejich kombinace, nebo polyester, zvolený ze skupiny zahrnující poly(glykolovou kyselinu), poly(D,L-mléčnou kyselinu), laktidové/glykolidové kopolymery nebo polykaprolakton a deriváty těchto sloučenin a hydrofil25 ním obalem je poly(N-vinyl-2-pyrrolidon), přičemž prostředek se snadno redisperguje nebo znovu rozpustí po přidání vody k lyofílízovanému prostředku, vytvářejícímu micely.

Předkládaný vynález také poskytuje polymerní micelámí prostředek, obsahující léčebné činidlo, kde léčebné činidlo může být chráněno proti chemickým interakcím, jako je hydrolýza, tak, zeje obsaženo uvnitř hydrofobního jádra nebo hydrofilního obalu zmíněné micely.

Tyto a další rysy a výhody předkládaného vynálezu budou odborníkovi s běžnými znalostmi oboru srozumitelnější z následujícího podrobnějšího popisu vynálezu.

Předkládaný vynález poskytuje koloidní prostředek, sestávající zpolymemích micel, které mohou být použity k dodávání léčebných činidel, majících špatnou rozpustnost ve vodě a/nebo specifickou afinitu k hydrofilnímu obalu. Polymerní micely jsou charakterizovány strukturou jádra a obalu, přičemž hydrofobní jádro je obklopeno hydrofílním obalem. Hydrofilní obal obsahuje hydrofilní polymer nebo kopolymer.

Hydrofílním polymerem podle předkládaného vynálezu je polymer nebo kopolymer poly(Nvinyl-2-pyrrolidonu), PVP.

Hydrofobní částice vytváří jádro micely, Hydrofobní částice může být zvolena z polyesterů, jako poly(glykolové kyseliny), poly(mléčné kyseliny), poly(D-mléčné kyseliny), poly(D,L-mléčné kyseliny), z laktidových/glykolidových kopolymerů, polykaprolaktonu a jeho derivátů; z polyorthoesterů ajejich derivátů; zpolyanhydridů ajejich derivátů; zpseudo-poly(aminokyselin) odvozených od tyrosinu ajejich derivátů; z polyfosfazenů ajejich derivátů; z po ly(alkyl akry fátu) a jeho derivátů; z poly(J3-benzyl-L-aspartátu) a jeho derivátů a z kombinací takových látek.

Upřednostňovanou hydrofobní částicí je poly(L,D-laktid), PDLLA. Sloučenina PDLLA je přítomna v koncentraci přibližně od 10 % do 50 % (hmotnost/hmotnost).

-3 CZ 302369 B6

Vytváření micel

K vytváření micel dochází v důsledku dvou sil. Jednou je přitažlivá síla, která vede ke sdružování (asociaci) molekul, zatímco druhou silou je odpudivá síla, která v určité makroskopické fázi zamezuje neomezenému růstu micel. Amfifilní kopolymery se samy sdružují (typ self-associate), pokud jsou umístěny do rozpouštědla, které je selektivní, výběrové, buď pro hydrofilní, nebo pro hydrofobní polymer.

Proces micelizace amfifílních kopolymerů je podobný tomuto ději u povrchově aktivních látek o malých molekulových hmotnostech. Při velmi malých koncentracích existují polymery pouze jako jednotlivé řetězce. Jak se koncentrace zvyšuje k dosažení kritické hodnoty, nazývané „kritická koncentrace asociace“, CAC, začnou se řetězce polymerů sdružovat, spojovat, k vytvoření micel takovým způsobem, že hydrofobní část kopolymerů se bude vyhýbat styku s vodným médiem, v němž je polymer rozpuštěn. Při dosažení CAC se může podstatné množství rozpouš15 tědla nacházet uvnitř micelámího jádra a micely jsou popisovány jako volné, nespojité agregáty, vykazující větší velikost než micely, vytvořené při vyšších koncentracích. Při takových koncentracích bude rovnovážný stav upřednostňovat tvorbu micel, micely přijmou uspořádání nízkoenergetického stavu a zbývající rozpouštědlo bude z hydrofobního jádra rostoucím způsobem uvolňováno, výsledkem čehož bude zmenšení velikosti micel.

Amfifilní kopolymery obvykle vykazují CAC mnohem nižší, než je tomu u povrchově aktivních látek o malé molekulové hmotnosti. Například CAC pro PEO-PBLA a PNIPA-PSt jsou mezi 0,0005 až 0,002 %. Některé amfifilní kopolymery však vykazují mnohem vyšší CAC, dosahující až 0,01 až 10 % v případě poloxamerů. Amfifilní kopolymery s vysokou CAC nemusí být vhod25 né jako nástroj k zacílení léčiv, neboť jsou nestálé ve vodném prostředí a během zředění jsou snadno disociovány (děleny).

Micelizace amfifílních kopolymerů může poskytnout dva odlišné typy micel v závislostí na tom, zdaje hydrofobní řetězec náhodně vázán na hydrofilní polymer, nebo zdaje naroubován najeden konec hydrofilního řetězce. Micely, vytvářené z náhodně modifikovaných, pozměněných polymerů, jsou obecně menší než koncově modifikované polymery. Micelámí velikost je určena zejména hydrofobními silami, které oddělují (sekvestrují) hydrofobní řetězce v jádře, a odpuzováním vyloučeného objemu mezi řetězci, které limituje jejich velikost. Rozdíl v rovnováze těchto dvou sil může u náhodných a u koncově modifikovaných kopolymerů vyvolávat jejich odlišnou velikost. Když se koncové hydrofobní skupiny sdružují k vytvoření micel, jsou vodné shluky, znehybněné kolem hydrofobních segmentů, vyloučeny z jádra a neexistuje přímá interakce mezi jádrem a hydrofilním obalem, který v micelámí struktuře zůstává ve formě pohyblivých rovných řetězců. Ovšem náhodně modifikované polymery se sdružují takovým způsobem, že se hydrofilní a hydrofobní části polymeru smotají dohromady, což umožňuje případný styk jádra svodným médiem. To je důležitým bodem, neboť vystavená hydrofobní jádra mohou vyvolávat druhotné sdružování poiymernich micel. Druhotné sdružování (agregace) bylo také navrženo jako hypotéza k vysvětlení přítomnosti větších částic (> 100 nm) v micelámích systémech PEO-P(Asp), nesoucího konjugovaný doxorubicin (DOX).

Stanovení kritické asociační koncentrace (CAC)

Ke stanovení molekulové hmotnosti a agregačního čísla micel se široce používá rozptyl světla. Nástup micelizace však může být detekován pouze tehdy, pokud velikost CAC spadá do rozmezí citlivosti metody měření rozptylu. V případě polymerů ve vodě k tomu dochází jen zřídka. Pou5o žita může být gelová permeační chromatografie (GPC) ve vodných podmínkách, neboť jednotlivé řetězce a micelámí podíly kopolymerů vykazují odlišné eluční objemy. Pomocí GPC je možné také souběžné stanovení molekulové hmotnosti micel ajejich agregačního čísla. Je důležité, aby integrita, neporušenost, poiymernich micel byla uchována během jejich eluce sloupcem, rozdělujícím látky podle jejich molekulové velikostí. Problém může vyvolat také adsorpce polymeru na

-4CZ 302369 B6 sloupec a to zvláště při koncentracích blížících se CAC, kdy micely sestávají z větších uvolněných agregátů.

Upřednostňovaná metoda ke stanovení CAC zahrnuje použití fluorescenčních sond, z nichž se nejvíce používá pyren. Pyren je kondenzovaný aromatický uhlovodík, který je vysoce hydrofobní a citlivý vůči polaritě okolního prostředí. Při koncentraci menší než CAC je pyren rozpuštěný ve vodě, médiu o velké polaritě. Když se vytvářejí micely, pyren se odděluje především směrem k hydrofobní oblasti vytvářené micelámím jádrem a je tak v nepolárním prostředí. Následkem toho jsou pozorovány početné změny, jako zvýšení intenzity fluorescence, změna jemné vibrační struktury emisního (vyzařovaného) spektra a rudý posuv pruhu (0,0) v excitačních spektrech. Zdánlivá hodnota CAC může být získána ze závislosti fluorescence pyrenu, poměru z emisních spekter nebo poměru I338/I333 z excitačních spekter vůči koncentraci. Hlavní změna sklonu ukazuje nástup micelizace. Poměr I1/I3 je poměr intenzity prvního a třetího nejvyššího energetického emisního maxima (píku) a měří se při konstantní vlnové délce excitace a proměnných emisních vlnových délkách, odpovídajících a I₃. Hodnota CAC, získaná fluorescenčními postupy, musí být opatrně interpretována, a to ze dvou důvodů. Jednak musí být koncentrace pyrenu udržována na extrémně nízké hodnotě (IO“⁷ mol.dm*³), neboť změna sklonu může být přesně zachycena jen při nástupu micelizace. Za druhé může být postupná změna fluorescenčního spektra někdy vyvolána přítomností hydrofobních nečistot nebo asociací, sdružováním, sondy s jednotlivými polymemími řetězci či predmicelámími agregáty. S nástupem micelizace bývaly rovněž spojovány změny an izotropie fluorescenčních sond.

Polymemí micely, jako jsou micely z prostředků podle tohoto vynálezu, jsou charakterizovány svou malou velikostí (10 až 100 nm). Kromě toho, že je potřebná pro vystřikování (extravazaci) nosičových materiálů, tato malá velikost umožňuje sterilizaci prostředků pouhou filtrací a minimalizuje riziko embolie kapilár (vlásečnic). To není situace, k níž dochází u nosičů objemnějších léčiv.

Micelámí velikost závisí na několika faktorech včetně molekulové hmotnosti kopolymeru, relativním poměru hydrofilních a hydrofobních řetězců a na agregačním čísle. Velikost micel, připravených dialýzou, může být narušena organickým rozpouštědlem, použitým k rozpuštění polymeru.

Micelární průměr a rozdělení velikostí (size polydispersity) mohou být získány přímo ve vodě nebo v isotonickém pufru dynamickým rozptylem světla (DLS, dynamic light scattering). DLS může také poskytovat informace o kulovitosti polymemích micel.

Micelámí velikost je možné určit také metodami, jako je mikroskopie na bázi atomových sil (atomic force microscopy, AFM), transmisní elektronová mikroskopie (transmission electron microscopy, TEM), a srovnávací elektronové mikroskopie (scanning electron microscopy, SEM). Tyto metody umožňují charakterizaci tvaru micel a rozdělení jejich velikostí. Někdy se pro stanovení polydisperzity polymemích micel provádějí studie rychlosti ultracentrifugace.

Inkorporace léčebných činidel do polymemích micel

Naplnění léčebného činidla do micel může být prováděno postupy, které jsou dobře známé odborníkovi v oboru. Plnění se může provádět například rozpuštěním sloučeniny v roztoku obsahujícím předem vytvořené micely, postupem „olej ve vodě“ nebo dialytickou metodou.

Léčebnými činidly, která lze použít, jsou jakékoli sloučeniny, včetně těch, které jsou uvedeny níže, které mohou být zachyceny, a to stálým způsobem, v polymemích micelách a podávány v léčebné účinné dávce. S výhodou jsou léčebná činidla, používaná i podle tohoto vynálezu, hydro fí lni, aby je bylo možné účinně plnit do micel. Avšak může být použito i vytváření stálých komplexů mezi iontovými micelami a opačně nabitými hydrofilní mi sloučeninami, jako jsou protisměrně čtené nukleotidy. Vhodné léky zahrnují protinádorově sloučeniny jako ftalokyaniny

- 5 CZ 302369 B6 (například ehloroftalokyaninatohlinitý komplex), antracykliny (například doxorubícin, DOX), špatně rozpustné antimetabolity (například methotrexát, mitomyein, 5-fluoruracil) a alkylační činidla (například karmustin). Micely mohou obsahovat také taxany, jako paclitaxel.

Přídavné léky, které mohou být obsaženy v micelách, jsou běžná hydrofobní antibiotika a fungicidy jako amfotericin B, vodou špatně rozpustné imunomodulátory jako cyklosporin, vodou špatně rozpustné steroidní (jako dexamethasin), nesteroidní (jako indomethacin) a proti zánět I i vé látky a genomové fragmenty.

io Léky mohou být do polymemích micelámích prostředků podle tohoto vynálezu začleněny pomocí chemické konjugace (spojení) nebo fyzikálním zachycením prostřednictvím dialýzy, emulgačních postupů, jednoduchým uvedením léku a micel ve vodném prostředí do rovnovážného stavu, nebo rozpuštěním (solubilizací) pevné disperze léku/polymeru ve vodě.

Do polymerních micelárních prostředků podle tohoto vynálezu mohou být začleněny také hydrofilní sloučeniny, jako jsou bílkoviny. Začlenění takových hydrofilních látek může ovšem vyžadovat chemickou hydrofobizaci molekuly nebo částečnou afinitu k hydrofilnímu obalu. Póly iontové sloučeniny mohou být začleněny vytvořením polyiontových komplexních micel.

Fyzikální zachycení léků se obecně provádí dialýzou nebo postupem k vytvoření emulze oleje ve vodě. Dialytícká metoda sestává z přenesení léku a kopolymeru z rozpouštědla, v němž jsou obě tyto látky rozpustné, jakým je ethanol nebo N,N-d imethyl formám id, do rozpouštědla, které je selektivní pouze pro hydrofilní část polymeru, jakým je voda. Jakmile je první rozpouštědlo nahraženo druhým, selektivním rozpouštědlem, hydrofobní část polymeru se sdružuje k vytvoření micelárního jádra, začleňujícího během tohoto procesu nerozpustný lék. Úplného nahrazení organického rozpouštědla může být dosaženo prodloužením dialýzy po dobu několika dnů.

Při metodě poskytující emulzi oleje ve vodě se roztok léku ve vodou nerozpustném těkavém rozpouštědle, jako je chloroform, přidá k vodnému roztoku kopolymeru k vytvoření emulze typu oleje ve vodě. S odpařováním rozpouštědla se vytváří konjugát micel a léku. Hlavní výhodou dialyzačního postupu oproti způsobu dříve popsanému je to, že se lze vyhnout používání případně toxických rozpouštědel, jako jsou chlorovaná rozpouštědla.

Postup, jakým je lék plněn, může ovlivnit rozdělování léku do micek Například Cao se spolu35 autory (Macromolecules 24, 6300- 6305, 1991) prokázal, že pyren, začleněný do micel v době jejich vytváření, nebyl chráněn před vodným prostředím tak dobře jako pyren, začleněný až po vytvoření micel, i když první způsob poskytoval trojnásobně vyšší naplnění lékem než druhý způsob.

4o Účinnost zachycování polymemími micelami podle vynálezu záleží na počátečním množství přidaného léku. Překročení nej vyšší kapacity plnění má za následek srážení léčebného činidla a následně i nižší výtěžek. Účinnost plnění léčebného činidla dále závisí na agregačním čísle kopolymeru. Micely vykazující vyšší agregační číslo umožňují rozpuštění většího množství léku ve svém vnitřním jádru.

Příklady polymerních micel, naplněných léčebným činidlem

V Tabulce 1 jsou uvedeny příklady sloučenin, plněných do polymerních micel a odpovídající plnící postupy. Póly měrní micelámí prostředky podle tohoto vynálezu se považují za vhodné pro použití jako dodávací systémy pro širokou škálu léčebných činidel, včetně, nikoli však výlučně, proti rakovin ných léků, plazmidové DNA, protisměrně čtených nukleotidů, nebo pro dodávání diagnostických činidel do konkrétního tělního orgánu.

-6CZ 302369 B6

Tabulka 1

Příklady léků a značených látek, plněných do polymerních micel

lék	polymer	typ začlenění	velikost micely j I s lékem (nm)
amfotericin B	PEO-PBLA	P	26
protisměrně čtený nukleotid	PEO-P(Lys)	EA	50
cisplatina	PEO-P(Asp)	C	16
cyklofosfamid	PEO-P(Lys)	C	n. a.
dequaíinium	ncn ntr Γ L_WT L_	P	Λ C I 1 u
doxirubicin (DOX)	PEO-P(Asp)	C	50
DOX	PEO-P(Asp)	C	14 - 131
DOX	PEO-P(Asp)	C	17 - 42
DOX	PEO-PBLA	P	30
DOX	PEO-PDLLA	P	n. a.
DOX	PEO-PBLA	P	37
DOX	PEO-P(Asp)	P+C	n. a.
DOX	PNIPA-PBMA	P	n. a. i
DOX	PAA-PMMA	P	n. a.
Gd-DTPA-PE ’”ln-DTPA-SA	PEO-PE	P	20
haloperídol	PEO-PPO-PEO	P	n. a.

-7 CZ 302369 B6

haloperidoí	PEO-PPO-PEO	P	15
indomethacin	PEO-PBLA	P	25 - 29
indomethacin	PEO-PCL	P	145 - 165
indomethacin	PEO-PCL	P	14 - 156
jod. derivát kys. benzoové	PEO-P(Lys)	C	80
KRN - 5500	PEO-PBLA	P
	PEO-(C_ie, BLA)		71*
	PEO-P(Asp, BLA)
paclitaxel	PEO-PDLLA	P	n. a.
paxlitactel	LCC	P	<100
plasmidová DNA	PEO-P(Lys)	EA	140-150
sojový inhibitor trypsinu	PEO-PE	P	15
testosteron	PEO-PDLLA	P	n. a.
ellipticínový inhibitor topoizomerázy II	PEO-PE	P	n. a.

n.a. = nejsou k dispozici údaje; P = fyz. zachycení; C = chemická vazba; EA - elektrostatické sdružování (asociace) * po rozrušení ultrazvukem (sonikaci) agregátů PEO (C_l6, BLA)

Důkaz o začlenění léku je možné získat metodami GPC nebo DLS, neboť obě tyto metody detekují změny velikosti micek Umístění léku dovnitř micclámího jádra může být prokázáno zhášecími pokusy. Například jod (I), kterýje vodou rozpustný zhášeč DOX, neovlivňuje fluorescenci do micel začleněného léku, ale zháší fluorescenci volného léku. Takové pokusy prokázaly, že io DOX by byl zachycen v PEO-PBLA po lyofilizaci a opětném rozpuštění ve vodě. V případě

DOX má samospojování (self-association) léku v micelámím jádře za následek snížení intenzity fluorescence léku. Nedávno bylo nepřímo zjištěno zachycování a pomalé uvolňování amfotericinu B z polymemích micel měřením snížení jeho hemolytické aktivity po začlenění do micel typu PEO-PBLA.

Farmaceutické použití

Polymemí miceiámí prostředky podle tohoto vynálezu jsou vhodné pro použití v mnoha různých farmaceutických oblastech, jako je orální podávání, prodloužené uvolňování a místně specifické zacílení léku. S výhodou se micely podle předkládaného vynálezu používají k přenosu vodou nerozpustných léků.

-8CZ 302369 B6

Příklady provedení vynálezu

Následující příklad je ilustrativní a není zamýšlen jako omezení rozsahu předkládaného vynálezu.

Materiály

Komerční rozpouštědla byla získána od firmy Moquin Scientifíc (Terrebonne, Quebec) a reagencie od firmy Aldrich (Milwaukee, Wi). N-vinyl-2-pyrrolidon (VP), 2-isopropoxy ethanol, 35% (procenta hmotnostní) hydrid draselný (KH) v minerálním oleji a 18-crown-6 byly použity bez ío dalšího Čištění. D,L-laktid byl trojnásobně rekrystalizován z bezvodého ethylacetátu při teplotě °C a poté byl při teplotě místnosti sušen 24 hodin za sníženého tlaku a nad P₂O₅. Tetrahydrofuran (THF) byl refluxován (udržován za varu pod zpětným chladičem) a těsně před použitím byl destilován nad sodíkem a benzofenonem pod vysušenou argonovou atmosférou 1,1-azobis(cyklohexankarbonitril) (ACCN) byl čištěn vysrážením z ethanolového roztoku do vody a i 5 sušen po dobu 4 dnů pod vakuem. Sepharose 2B byla získána od firmy Sigma (Saint Louis, MO) a před použitím byla uvedena do rovnovážného stavu přidáním vody. Dialyzační vaky, použité při přípravě micel, byly typu Spectra/Por Membranes od firmy Raného Dominguez, CA, MWCO

6000-8000. Veškeré reakce byly prováděny v baňkách s kulatým dnem, které byly předem sterilizovány plamenem a opatřeny gumovou přepážkou pod atmosférou vysušeného argonu.

Molekulové hmotnosti byly určovány gelovou permeaění chromatografií (GPC, Waters Model

600, Milford, MA) za použití programu Millenium software. Použity byly tři sloupce Styragelu (Waters, HR1, HR2, HR4, 4,6 x 300 mm) a rozlišovací refraktometrický detektor (Waters 2410).

Mobilní fází byl CHC1₃ (30 °C a 1 ml/min). Kalibrace sloupce byla provedena polystyrénovými 25 standardy (Aldrich, Milewaukee, Wl). ‘Ha ^BC NMR spektra byla zaznamenána na spektrometrech Varían 300 a Brucker AMX 600 v deuterovaném chloroformu.

Kritická asociační konstanta (CAC) byla stanovena metodou fluorescence pyrenu v ustáleném (rovnovážném) stavu. Již dříve bylo prokázáno, že se vzrůstajícími koncentracemi amfifilních 30 polymerů ve vodném roztoku pyrenu dochází v excitačním spektru pyrenu k posunu pruhu (0,0) z

333 nm na 338,5 nm. Tato změna, měřená jako poměr intenzity WI333, doprovází přechod pyrenových molekul z vodného prostředí do hydrofobních micelámích jader a je možné ji použít k předběžnému výpočtu zřejmé CAC.

Připraveno bylo několik roztoků polymeru ve vodě, tišících se koncentrací polymeru, ale obsahujících vždy 10“⁷ mol.dm^-3 pyrenu, a tyto roztoky byly ponechány míchat přes noc ve tmě a při teplotě 4 °C. Fluorescenční spektra v ustáleném stavu byla měřena (k_em = 390 nm) po 5 minutách za míchání při 20 °C a za použití fluorimetru Serie 2 Aminco Bowman (Spectronics Instruments lne., Rochester, NY). Velikost micel byla stanovována ve vodě a v PBS (fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku) při 20 °C rozptylem dynamického laseru (DLS) za použití analýzy typu „Unimodal and differential size distribution processor intensity analysis“, SDP (N4Plus, Coulter Electronics, Hialeah, FL).

Příprava PVP-OH

Hydroxyskupinou zakončený polyvinylpyrrolidon (PVP-OH) byl připraven radikálovou polymerizací za použití 2-isopropoxy ethanolu jako přenašeče řetězce. Sloučeniny V P (5 ml, 47 mmol) a ACCN (0,1 1 g, 0,45 mmol) byly rozpuštěny v 60 až 300 ml 2-isopropoxyethanolu. Tyto roztoky byly odplyněny argonem. Polymerizace probíhala při 80 °C za míchání a pod atmosférou suché50 ho argonu po dobu 24 hodin. Po odpaření 2-isopropoxyethanolu byl polymer vysrážen v přebytku diethyletheru. Takto získaný bílý prášek byl trojnásobně čištěn rozpuštěním v minimálním množství CH₂C1₂ a vysrážením z diethyletheru. Nakonec byl vysušen pod vakuem.

-9CZ 302369 B6

Charakterizace PVP-OH ¹H NMR 8 (ppm): 1, 15 (m, CH,). 3,5-4 (široký signál, CH PVP) ”C NMR 8 (ppm): 175 (C=0 PVP), 63,05 (CHjOH)

Tabulka 1: průměrné molekulové hmotnosti PVP

PVP-OH č. šarže	rozpouštědlo/VP (objemový poměr)
1	12	8 516	4 731	1,8
2	30	5 726	4 090	1,4
3	30	7 163	3 964	1,8
4	40	5 900	3 278	1,8
5	60	4 585	2 413	1,9

to

Průměrné molekulové hmotnosti PVP-OH jsou uvedeny v Tabulce 1. Je zřejmé, že molekulová hmotnost klesá s tím, jak se zvyšuje objemový poměr rozpouštědla vůči VP.

Příprava blokového kopolymeru PVP-PDLLA

Blokový kopolymer byl získán an iontovou polymerizací za otevření kruhu.

Sloučenina KH (0,567 g, 14 mmol) byla umístěna do baňky s kulatým dnem pod proudem argonu. Dvouhrotou pipetou (jehlou) byl přidán bezvodý tetrahydrofuran, výsledná disperze byla rychle míchána a poté byl THF opět odstraněn. Do baňky bylo přidáno 30 ml THF a disperze byla ochlazena na 0 °C. PVP-OH, předem 24 hodin sušený pod vakuem při 60 °C a nad P₂O₅, byl rozpuštěn v 30 ml THF při 60 °C. Tento roztok byl přidán k míchané disperzi za použití dvouhroté pipety a výsledný roztok byl udržován 1 hodinu při teplotě 0 °C. Po ohřátí na teplotu místnosti pokračovalo míchání po dobu dalších 4 hodin. Následně byla disperze převedena do jiné baňky a při teplotě místnosti byl přidán 18-crown-6 (0,085 g, 0,32 mmol) a míchán 30 minut. Polymerizace D,L-laktídu byla iniciována rychlým přídavkem D,L-laktidu (1,5 g, 10 mmol), rozpuštěného v 20 ml THF. Po 16 hodinách byla polymerizace ukončena přídavkem 1 ml kyseliny octové a 5 ml vody. Roztok polymeru byl k vytvoření micel dialyzován proti vodě po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C. Po dialýze byl roztok odstřeďován 30 minut při 40 790 x g k odstranění jakéhokoliv homopolymeru poly(D,L-laktíd)u (PDLLA). Supematant byl zmražen a lyofilizován v lyofilizačním přístroji firmy Labconco, modelu 77 535 (Kansas City, Missouri). Lyofilizovaný prášek byl opět rozpuštěn ve vodě a volný PVP-OH byl odstraněn průchodem přes sloupec Sepharose 2B (Pharmacia, 1 x 40 cm). Micelámí roztok byt zmražen, v průběhu dvou dnů lyofilizován a skladován při teplotě -20 °C až do svého použití.

Charakterizace PVP-PDLLA 'H NMR δ (ppm): 5,2 (m, CH PDLLA), 3,5-4 (široký signál, CH PVP) ^l3C NMR δ (ppm): 175 (C=O PVP), 169 (C-0 PDLLA), 69,8 (CH-CH, PDLLA), 17,2 (CH40 CH, PDLLA)

- 10CZ 302369 B6

Tabulka 2: Charakterizace PVP-PDLLA a poiymernich micel

PVP-OH šarže č.	PVP-PLA šarže č.	PVP:PLA (% hmotn.)³			ΜΛ	velikost miceP ve vodě (nm)	velikost micel” vj PBS (nm)	CAC i (mg/1)
1	1a	59:41	15151	7955	1,9	56±24	44±21	10,2
2	2a	74:26	8500	5500	1,5	54±24	59±25	3,4
3	3a	60:40	8985	6576	1,3	106±45	95±37	2
3	3b	33:67	14 500	12 084	1,2	168+71	160±64	2,6
3	3c	88:12	6700	4500	1,4	74+31	92±41	22,4
4	4a	60:40	7134	5488	1,3	51+22	48+19	1,9
4	4b	64:36	7920	5100	1,5	50+22	66±31	r~
5	5a	65:35	5737	3685	1,5	48±21	58±23	4,3

a) stanoveno pomocí GPC 5 b) z unimodátní analýzy

Syntetizováno bylo několik blokových kopolymerů PVP-PDLLA o různých složeních. Jak je znázorněno v Tabulce 2, průměrná velikost micel se pohybovala od 44 do 168 nm a CAC byla nízká. Vzorek 3 a, s nej kratším segmentem PLA, měl nej vyšší hodnotu CAC. Ovšem rozdělení io velikostí nebylo unimodální, jak vyplývá z analýzy SDP (viz Tabulka 3).

-IICZ 302369 B6

Tabulka 3: rozdělení velikostí micel PVP-PDLLA a SDP analýza intenzity

PVP-PDLLA č, šarže	voda	! PBS \| j I
SDP maximum množství	SDP maximum průměr (nm)	SDP maximum množství	SDP maximum průměr (nm)	\|sDP maximum množství
1 a	85 %	62 ± 29	63 %	41 + 13
15 %	419 ± 133	34 %	290 ± 60
2a	50 %	29 + 6	56 %	124 ± 51
50 %	199 + 54	44 %	36 ± 12
3a	60 %	106 ± 22	82 %	154 + 69
30 %	328 ± 111	18 %	38 ± 12
3b	63 %	319 ± 46	96 %	243 ±138
37 %	100 ± 15	4 %	40 ± 13
3c	69 %	129 ± 44	59 %	326 ± 59
31 %	34 ± 7	41 %	78 ± 28
4a	72 %	48 + 26	52 %	37 ± 11
28 %	158 ± 51	48 %	89 ± 21
4b	64 %	39 ± 23	86 %	119 ± 37
36 %	248 ± 88	14 %	26 ± 8
5a	55 %	36 ± 10	62 %	106 ± 36
45 %	109 + 46	38 %	36 + 11

Jak je z Tabulky 3 zřejmé, všechny vzorky poskytly micely s bimodální distribucí, přičemž velikost malých částic se pohybovala od 26 do 124 nm a velikost větších agregátů se pohybovala od 106 do 419 nm.

io Ke stanovení účinnosti zachycení léku byl indomethacin zachycen do micel PV-PDLLA a PEGPDLLA, jak je znázorněno v Tabulce 4.

- 12 CZ 302369 B6

Tabulka 4: Začlenění indomethacinu do polymeračních micel

počáteční naplnění lékem (%)	PEG-PDLA (63:37 % hmotn.)	PEG-PDLLA
(60:40 % ř	ímotn.)
konečné naplnění lékem (%)	účinnost zachycení (%)	konečné naplnění lékem (%)	účinnost zachycení (%)
10	3 + 1,0	30 ± 10	2 ± 0,5	20 ± 5 i
20	5 ± 1,2	25 + 6	7 ± 3,1	35 ± 16
30	10 + 0,9	33 ± 3	12 ± 1,8	40 + 6
40	12 + 1,2	30 ± 3	18 ± 1,2	45 + 3
50	12 ± 1,0	24 ± 2	22 ± 2,0	44 + 4

PEG-PDLLA (63:37 % hmotn.) Mn = 7 900, střední průměr (unimodální analýza) = 110 ± 42 nm PEG-PDLLA (60:40 % hmotn.) Mn = 6 600, střední průměr (unimodální analýza) = 106 ± 45 nm Uvedené údaje jsou průměrem 3 měření ± směrodatná odchylka.

Lék a kopolymer byly rozpuštěny v Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF) a dialyzovány 24 hodin, ve tmě, proti vodě. Roztoky byly filtrovány přes filtr o velikosti pórů 0,22 μπι a lyofilizovány. Naplnění indomethacinem bylo stanoveno měřením absorbance UV záření micelámího roztoku v DMF při 320 nm za použití spektrofotometru Hewlett Packard 8452A s detekcí „diodě array“ (Boise, ID).

Účinnost zachycení indomethacinu v micelách PVD-PDLLA a PEG-PDLLA bylo při nízké hladině léku podobné. S rostoucím naplněním lékem byla účinnost zachycení micelami PVPPDLLA lepší než účinnost zachycení micelami PEG-PDLLA (uvažované kopolymery měly stejnou molekulovou hmotnost). Aniž by bylo žádoucí vázat se teorií, předpokládá se, že při nízkých poměrech léku se lék nejprve začleňuje do jádra a poté, až při vyšších poměrech, se začíná začleňovat do hydrofilního obalu, tvořeného PVP.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostředek, vytvářející micely, vhodné pro přenos účinných látek na místo jejich určení a zahrnující

- hydrofobní jádro, obklopené hydrofilním obalem a

- léčebné činidlo, fyzikálně zachycené v micele, vyznačující se tím, že hydrofobní jádro je zvoleno ze skupiny, zahrnující polyorthoester, polyanhydrid, pseudo-poly(aminokyselinu) odvozenou od tyrosinu, polyfosfazen nebo poly(p-benzyl-L-aspartát) ajejich kombinace, nebo polyester, zvolený ze skupiny zahrnu- 13 CZ 302369 B6 jící poly(glykolovou kyselinu), poly(D,L-mléčnou kyselinu), laktidové/glykolidové kopolymery nebo polykaprolakton a deriváty těchto sloučenin a hydrofilním obalem je póly(N-vtny 1-2pyrrolidon), přičemž prostředek se snadno redisperguje nebo znovu rozpustí po přidání vody k lyofílizované5 mu prostředku, vytvářejícímu micely.
2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčebným činidlem je protinádorově působící sloučenina.

io
3. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že protinádorově působící sloučenina je zvolena z alespoň jedné ftalokyaninové sloučeniny, anracyklinové sloučeniny, antimetabolitu, alkylačního činidla a taxanu.
4. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že ftalokyaninovou sloučeninou

15 je chloroftalokyaninatohlinitý komplex.
5. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že antracyklinovou sloučeninou je doxorubicin.

20
6. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že antimetabolit se volí ze skupiny methotrexát, mitomycin a 5-fluoruracil.
7. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že alkylačním činidlem je karmustin.
8. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že taxanem je paclitaxel.
9. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčebné Činidlo se volí z hydrofobního antibiotika, hydrofobní antifungální látky, imunomodulátoru, protivirové látky

30 nebo stero i dní nebo nesteroidní protizánětlivé látky.
10. Použití prostředku podle nároku 1, vytvářejícího micely, pro výrobu farmaceutického prostředku pro podávání léčebného činidla, obsaženého v micelách.

35 11. Použití podle nároku 10, při němž se lyofilizovaná forma prostředku podle některého z nároků 1 až 9 snadno redisperguje nebo znovu rozpustí po přidání vody.