CN104434876B - 用于癌症疗法及成像的缺氧-标靶聚合微胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于靶向缺氧肿瘤区域以检测或治疗癌症的组合物和方法，或癌症的治疗佐剂。具体来说，将缺氧标靶性部分结合到含有显影剂、治疗剂或治疗佐剂的聚合微胞。

Description

用于癌症疗法及成像的缺氧-标靶聚合微胞

本申请是2012年4月5日提交的共同未决的美国临时申请第61/620,620号“用于癌症疗法和成像的缺氧-标靶聚合微胞（Hypoxia-Targeted Polymeric Micelles forCancer Therapy and Imaging）”的完整申请，所述申请的全部披露内容通过引用结合在此。

技术领域

本发明涉及用于癌症疗法及成像的缺氧-标靶聚合微胞。

背景技术

癌症是由细胞复制增加和细胞死亡减少引起的一组异质性疾病。成功治疗癌症的关键是利用由正常细胞和癌症细胞所引起的差异来增加有选择的细胞杀伤。许多当前化学疗法和辐射疗法迅速地靶向正在生长的细胞。然而，因为存在频繁分裂的正常细胞，所以出现许多与治疗的非特异性相关的副作用，例如骨髓抑制、免疫抑制以及胃肠并发症。为了使副作用降到最少，目前正在研究的癌症治疗策略是靶向失调的蛋白质、基因疗法，或靶向微环境中的差异，例如血管生成、pH值、温度或缺氧。

由于血管结构不当，故在直径大于1mm的肿瘤或转移中出现缺氧。缺氧通过增加受体酪氨酸激酶活性、血管生成、侵袭力、转移、产生活性氧物质以及抑制免疫反应性而改变了肿瘤生物学。缺氧一般被视为一个要克服的障碍，因为它在许多化学疗法和辐射疗法中引起抗性。目前，新方法利用了肿瘤中的缺氧作为选择性治疗的手段，如由丹尼(2000)《柳叶刀·肿瘤学》,1:25-29；威尔逊和海利(2011)《自然评论：癌症》,11:393-410；陈和胡(2009)《医药研究评论》,29:29-64（Denny(2000)Lancet Oncol,1:25-29;Wilson&Hay(2011)Nat Rev Cancer,11:393-410;Chen&Hu(2009)Med Res Rev,29:29-64）所披露。

有多种化合物可在缺氧环境内选择性靶向和反应，包括硝基芳香族化合物、芳香族N-氧化物以及脂肪族N-氧化物。在美国专利第7,405,317B2号和第7,550,496B2号中，教示了适用作前药疗法中的触发剂的缺氧标靶性部分。

缺氧标靶性部分具有高氧化还原电势，在此情况下，其可以被任何细胞环境还原。然而，在氧存在下，所述反应逆转。当缺氧标靶性部分在缺氧环境中发生还原反应时，其与例如DNA、蛋白质或脂质等大分子形成共价加合物，从而在缺氧环境内累积。还原反应可以通过特定酶或酶的组合来催化，例如细胞色素P-450、细胞色素P-450还原酶、黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶以及DT-心肌黄酶，参见尤其沃克曼(1992)《国际放射肿瘤学杂志》22:631-637（Workman(1992)Int J Radiat Oncol22:631-637）。

如本领域的普通技术人员所知，纳米载体在癌症治疗中变得越来越通用。纳米载体是纳米级传递工具（10-1000nm直径），其中例如药物或显影剂等分子可以被囊封在所述传递工具内或共价连接到所述传递工具外部。实例包括脂质体、微胞、树状体以及纳米乳液。纳米载体可以通过限制与非特异性组织的相互作用来减少化学疗法的许多副作用。纳米载体还适用于使药物稳定、使药物增溶、延长药物的循环时间以及改善药物的生物分布。它们通过渗漏的血管结构被动地靶向肿瘤，称为增强的渗透性和滞留效应（enhancedpermeability retention effect，EPR）。它们还可以通过表面修饰主动地靶向肿瘤。EPR是基于肿瘤的病理生理学特征，包括血管过多、血管成熟不足、分泌血管渗透因子以及低效的淋巴引流，参见尤其彼特拉斯和德西蒙(2010)《自然评论·药物发现》,9:615-627（Petros&DeSimone(2010)Nat Rev Drug Discov,9:615-627）。

聚合微胞（Polymeric micelle，PMC）是超分子纳米粒子，它们是在体内使疏水性药物增溶并输送疏水性药物的有用试剂。PMC包含两性共聚物，所述共聚物由于临界微胞浓度低而在水性环境中非常稳定。PMC的一个主要优点是可以自发地囊封疏水性药物，不需要用可能有害的修饰来改变药物。可以关于生物相容性、稳定性、载药能力和药物释放动力学、大小（10-100nm）以及适当的清除机制来优化有效的PMC。这些特征的优化是通过选择内核（core）形成单元（疏水性）和外冠（corona）形成单元（亲水性）、布置单体形成聚合物以及聚合和微胞化方法进行。PMC还可以大量生产，具有可重复的结果并且大小和组成可调。作为药物传递系统，PMC可以通过限制与非特异性细胞的相互作用来降低药物毒性，延长药物循环时间，增加药物稳定性和溶解度，并且可以用标靶性部分修饰，如由托尔钦林(2001)《控释杂志》,73:137-172（Torchilin(2001)J Control Release,73:137-172）所报导。已经成功且高效地将若干化学治疗剂囊封在PMC中，其中有一些当前正在临床试验中。参见尤其里奥斯-多利亚等人.2012,《药物传递》,2012:1-8；松村2008,《日本临床肿瘤学杂志》,38:793-802（Rios-Doria et al.2012,Drug Deliv,2012:1-8;Matsumura2008,Jpn J ClinOncol,38:793-802）；美国专利第6,322,817B1号；美国专利申请公开案第2010/0158850A1号；以及临床试验ID NCT00912639；NCT00886717；NCT01426126。

经显示，光动力疗法（Photodynamic therapy，PDT）是某些癌症的一种非常有效的治疗法，具有有限的副作用（德尔曼（Dolmans）等人.(2003)《自然评论：癌症》,3:380-387）。PDT的原理是首先用光敏剂使细胞敏化，接着在氧存在下将光引入到标靶区域以产生活性氧物质（ROS），从而诱导细胞死亡。PDT的毒性比其他癌症疗法低，因为光敏剂在黑暗条件下是无毒的并且可以通过特定的光波长触发，而且可以将敏化剂和光优先导向标靶区域，剩下非特异性组织。PDT的光源通常处于较高波长范围中以增强组织穿透性，并且可以通过光导纤维投予以使得可以用光治疗的组织的量达到最大。然而，PDT仍然只对浅表肿瘤有效。通过建立可以照射嵌埋在深处的肿瘤并且穿透整个周围区域的光源，可以显著拓宽PDT的应用。可以通过使用化学发光产生系统（chemiluminescent producing system，CLS）产生遍及肿瘤的光，或通过化学反应来产生光。拉普帖夫等人.(2006)《英国癌症杂志》,95:189-196（Laptev et al.(2006)Br J Cancer,95:189-196）通过使用由鲁米诺反应（luminolreaction）引起的细胞内化学发光证实了PDT在白血病细胞中的功效。

在美国专利第7,416,898B2号（其披露内容通过引用结合在此）中，披露了可以修饰成通过不同机制，例如通过酶促反应、温度和pH值差异等触发的高敏感性化学发光底物。1,2-二氧杂环丁烷化学发光化学反应可以通过美国专利第7,300,766B2号（其披露内容通过引用结合在此）中的方法或通过使用例如二苯基蒽和荧光素等有机分子来增强。

增强化学发光反应有助于通过增加激活光敏剂的能力来使PDT更有效。举例来说，荧光素可以增强1,2-二氧杂环丁烷的化学发光并且随后将能量转移到光敏剂，例如孟加拉玫瑰红（Rose Bengal）。PDT作为疗法的另一个好处是由光敏剂的荧光发射来追踪有效治疗区域的位置的能力。

发明内容

如下详述的本发明通过提供用标靶性聚合微胞（PMC）治疗和检测癌症缺氧区域的组合物和方法改善了现有技术。

本发明提供了一种与PMC连接的缺氧标靶性部分，它能够囊封化学治疗剂、光产生系统、敏化系统、放射性系统等。

因此，本发明提供一种下式的化合物：

其中E是在PMC内的囊封剂，其中E是选自由以下各物组成的组：显影剂、治疗剂、治疗佐剂、光产生系统、放射性系统、敏化剂等。囊封剂可以或可以不结合到缺氧标靶性部分；R₁是缺氧标靶性部分，包括芳香族N-氧化物、脂肪族N-氧化物、硝基唑、硝基咪唑、硝基噻吩、硝基噻唑、硝基噁唑、硝基呋喃、硝基吡咯、过渡金属部分等；

R₂可以是显影剂、标靶性部分、治疗剂、敏化剂或其任何组合。R₂可以与囊封化合物相同或是一种不同的化合物，并且

R₃是用于改善PMC的溶解度、稳定性以及生物分布的极性生物相容性部分。

本发明还提供一种使用以上化合物治疗肿瘤和产生光的方法。为了较完整地理解本发明，参见以下详细描述和随附实施例。

附图说明

图1是显示本发明功效的曲线图。

具体实施方式

在以下说明中，为了清楚起见，将使用以下定义。

“肿瘤（Tumor）”或“癌症（cancer）”是指产生细胞实体肿块的一组异质性增生性疾病。其包括可以由已经从原发性肿块迁移以形成继发性或多发性肿块的细胞所引起的转移。

“治疗性（Therapeutic）”或“治疗剂（therapeutic agent）”或“药物（drug）”是指癌症治疗中所用的任何药剂。

“敏化剂（Sensitizer/sensitizing agent）”是指使细胞对治疗更敏感的任何试剂。在这类试剂内包括光敏剂，细胞借此在光存在下经历程序性细胞死亡。

“缺氧（Hypoxia）”或“肿瘤缺氧（tumor hypoxia）”是指由于肿瘤微环境内的血液供应不足而导致的细胞和组织中的氧含量降低。

“聚合微胞（Polymeric micelle）”或“PMC”是指包含两性共聚物的超分子结构，它在暴露于水性环境时产生疏水性内核和稳定化亲水性外冠。

“显影剂（Imaging agent）”是可以用于辅助肿瘤检测和诊断的任何化合物，并且其可以用于各种应用中，包括（但不限于）MRI扫描、PET扫描、CAT/CT扫描、荧光断层成像（fluorescence tomography）、荧光反射、放射学、NMR光谱法、显微术、组织学等。

“囊封（Encapsulated）”是指分子的位置在内核内或在PMC的内核-外冠界面内，并且其保护分子不受周围环境影响。囊封剂可以通过疏水性相互作用、氢键、离子键或共价键固定在PMC内。

如上文所指出，本发明提供一种下式的化合物：

其中R₁是缺氧标靶性部分；

R₂是显影剂、标靶性部分、治疗剂、敏化剂或混合物。R₂可以与囊封化合物相同或不同；

R₃是改善PMC的溶解度、稳定性以及生物分布的极性生物相容性部分，并且

E是在PMC内的囊封剂，其中E是选自由以下各物组成的组：显影剂、治疗剂、治疗佐剂、光产生系统、放射性系统、敏化剂等。囊封剂可以结合或不结合到缺氧标靶性部分。

聚合微胞

本发明PMC一般具有从约10nm到约100nm的直径并且包含形成内核的疏水性生物相容性聚合物和形成外冠的亲水性或极性生物相容性聚合物。

可用于形成PMC的内核的生物相容性聚合物包括例如聚苯乙烯、聚(二乙烯苯)、聚(丙烯酸酯)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(乙烯基甲苯)、聚(丁二烯)、聚(天冬氨酸)、聚(天冬氨酸苯甲酯)、聚己内酯和其衍生物、聚(丙交酯)和其衍生物、聚(谷氨酸苯甲酯)、聚(L-赖氨酸)、聚(氧化丙烯)、寡聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(异戊二烯)、聚(异丙基丙烯酰胺)、杯芳烃、聚酸酐、假-聚(氨基酸)、聚磷腈和其衍生物等，以及其混合物。

可用于形成PMC的外冠的亲水性或极性生物相容性聚合物包括例如聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氧化乙烯)、聚(氧化丙烯)、聚(乙烯基甲基醚)、羟丙基纤维素、壳聚糖、多糖、叔铵和鏻盐等，以及其混合物。

有用的内核聚合物是衍生自内核聚(乙烯基苯甲基)聚合物内核并且对应于下式的那些聚合物：

其中n是从1到20的整数；R₁表示缺氧标靶性部分；R₂是显影剂或对比剂、标靶性部分、治疗剂、敏化剂或如上文所定义的类似药剂；并且R₃是极性生物相容性部分。

缺氧标靶性部分可以是芳香族N-氧化物、脂肪族N-氧化物、硝基唑、硝基咪唑、硝基噻吩、硝基噻唑、硝基噁唑、硝基呋喃、硝基吡咯、过渡金属部分等。

有用的显影剂或对比剂可以选自由以下各物组成的组：荧光团、染料、量子点、过渡金属、过渡金属络合物、放射性核素等，以及其混合物。

除了缺氧标靶性部分以外，本文中还可以使用第二标靶性部分。这类第二标靶性部分可以选自由以下各物组成的组：抗体或修饰的抗体（例如针对分子标记的抗原结合片段（Fab）或单链可变片段（scFv））、针对细胞表面受体的配体、肽、蛋白质、糖蛋白、核酸序列、碳水化合物、类固醇等，以及其混合物。

有用的治疗剂可以选自由以下各物组成的组：化学治疗剂、放射性同位素、治疗性蛋白质或肽、基因疗法等。

有用的化学治疗剂是选自由以下各物组成的组：抗代谢物、烷化剂、生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞毒性抗生素、铂类药物等。

敏化剂可以选自含有以下各物的组：光敏剂，例如萘、蒽、联苯、醌、卟啉以及酞菁；荧光素；孟加拉玫瑰红；伊红蓝；及赤藓红B；氧载体，例如内过氧化物和氮氧化物；以及其混合物。

极性生物相容性部分可以选自含有以下各物的组：例如聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氧化乙烯)、聚(氧化丙烯)、聚(乙烯基甲基醚)、羟丙基纤维素、壳聚糖、多糖、叔铵和鏻盐等，以及其混合物。

优选的极性生物相容性部分是以下所表示的叔盐（tertiary salt）：

其中X是N或P；R₄、R₅以及R₆各自表示具有1到20个碳原子的直链或分支链烷基链，所述烷基链未被取代或被一个或一个以上羟基、烷氧基、芳氧基、氨基或被取代的氨基、氟烷、对氟芳基、氘化烷基等以及其混合物取代。

另一种有用的共聚物与连接基区域交联，其对应于下式：

其中n是从1到20的整数；R₁、R₂以及R₃如上文所定义；L是与三取代的胺或三取代的膦连接的具有饱和或不饱和碳的连接基区域，如美国专利第7,300,766B2号中所披露。

连接基区域优选地选自由以下各物组成的组：N,N,N'N'-四甲基-2-丁烯-1,4-二胺；N,N,N'N'-四甲基丁-1,4-二胺；1,4-二甲基哌嗪；1,4-苯二胺，以及其混合物。

缺氧标靶性部分

如上所指出，本发明使用与PMC连接的缺氧标靶性部分用于进行肿瘤的标靶传递。缺氧标靶性部分是相对于具有充足氧供应的区域优先在缺氧环境内累积的结构。

缺氧标靶性部分是通过下式表示：

R-N→O

其中R是环状或直链脂肪族部分或芳香族部分。

如上文所指出，有用的缺氧标靶性部分包括芳香族N-氧化物、脂肪族N-氧化物、硝基唑、硝基咪唑、硝基噻吩、硝基噻唑、硝基噁唑、硝基呋喃、硝基吡咯、过渡金属部分等。

优选的缺氧标靶性部分可以用以下结构表示：

其中X是N、S或O并且Y是C或N。

在另一个优选具体实例中，当X和Y都为N时，所述部分是被取代或未被取代的2-硝基咪唑，并且其对应于下式：

其中R₇、R₈以及R₉独立地表示直接或通过连接基区域与PMC的连接；氘化或非氘化烷基、羧酸酯、羧酸烷酯、氨基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基等，以及其混合物。

囊封和功能部分

如上所指出，PMC可以具有共价连接的官能团或被囊封在PMC内的疏水性试剂，包括治疗剂、单态氧产生系统、光产生系统、放射性系统、敏化剂、显影剂等，以及其混合物。

可以被囊封在PMC内的有用的疏水性治疗剂可以包括例如化学治疗药物、血管生成抑制剂、放射性毒素等。化学治疗药物包括例如阿霉素（doxorubicin）、道诺霉素（daunorubicin）、表柔比星（epirubicin）、顺铂（cisplatinum）、卡铂（carboplatin）、太平洋紫杉醇（paclitaxel）、喜树碱（camptothecin）等。囊封剂优选地具有高度疏水性并且换句话说，不可溶于水性介质中。

根据本文的优选PMC是缺氧标靶治疗性纳米载体，其具有作为缺氧标靶性部分的2-硝基咪唑、作为极性生物相容性组分的三取代的盐，以及一种或一种以上囊封治疗剂，可以表示如下：

在另一个优选具体实例中，PMC纳米载体是用显影剂修饰以在体内成像，并且对应于以下结构：

其中IA表示显影剂，包括荧光部分、氘化部分、电磁部分、放射性同位素等。

合适的荧光部分包括例如有机染料、量子点、荧光探针，以及荧光生物分子，例如蛋白质和肽。显影剂共价连接到PMC并且可以定位在PMC外部（亲水性）或PMC内（疏水性），或非共价连接并且囊封在PMC内（疏水性）。

除了缺氧标靶性部分以外，本文中还可以使用第二标靶性部分。这类第二标靶性部分可以选自由以下各物组成的组：抗体或修饰的抗体（例如针对分子标记的抗原结合片段（Fab）或单链可变片段（scFv））、针对细胞表面受体的配体、肽、蛋白质、糖蛋白、核酸序列、碳水化合物、类固醇等，以及其混合物。

光动力疗法

PDT的成功取决于光敏剂在标靶区域中的充分积累以及所述光敏剂被适当的光源激活。

如上所指出，本发明可以用于PDT以传递敏化剂、作为光源的化学发光底物或两者。本发明还提供一种使用化学发光来治疗肿瘤和产生光的方法。

光敏剂可以是有机染料和其衍生物、萘、蒽、联苯、醌、卟啉以及酞菁，以及其混合物。有机染料包括荧光素、孟加拉玫瑰红、伊红蓝、赤藓红B等。

本发明还提供一种用于在光敏剂存在下在肿瘤微环境内选择性产生光的方法。前述缺氧标靶性PMC可以用来囊封化学发光底物并且使其在肿瘤微环境内充分积累，其中可以触发所述底物，从而激活已经存在于肿瘤中的光敏剂。

可以囊封的合适的化学发光底物包括稳定化的1,2-二氧杂环丁烷，如在美国专利第7,416,898B2号中所描述，其披露内容通过引用结合在此。另一种合适的化学发光底物是鲁米诺。

当用于PDT中时，本发明的优选具体实例可以显示为：

其中所述PMC与2-硝基咪唑结合，PS是选自由萘、蒽、联苯、醌、卟啉、酞菁、荧光素、荧光素衍生物、孟加拉玫瑰红、伊红蓝以及赤藓红B组成的组的光敏剂，X⁺是N或P的叔盐，并且CL是囊封的化学发光底物。有用的CL底物中有一些是1,2-二氧杂环丁烷化合物和鲁米诺。PMC经由2-硝基咪唑被导向肿瘤并且保留在肿瘤内，在其中触发CL。化学发光产生的光激发光敏剂以诱导附近细胞的细胞凋亡或坏死。

用于PDT和肿瘤成像中的本发明优选具体实例可以显示为：

其中IA、PS以及X⁺如上所述。

为了较完整地理解本发明，提到以下非限制性实施例。在实施例中，除非作相反指示，否则所有的份数都是按重量计的。

实施例I

本实施例说明了标靶缺氧的PMC的制备。

步骤1：合成1-(3-邻苯二甲酰亚氨基丙基)-2-硝基咪唑

在氩气气氛下，在维持在155℃-160℃之间的预热油浴中将5.36份2-硝基咪唑、13.39份N-(3-溴丙基)-邻苯二甲酰亚胺以及11.85份N,N-二异丙基乙胺的混合物在回流下加热3小时45分钟。使混合物冷却到室温并且凝固。打碎固体并在去离子水（DI water）存在下搅拌。将固体在室温下空气干燥4小时，接着在40℃下空气干燥18小时。通过NMR光谱法确定结构。

步骤2：合成1-(3-氨丙基)-2-硝基咪唑

将0.15份无水肼于无水乙醇（1mL）中的溶液添加到0.14份在步骤1中获得的1-(3-邻苯二甲酰亚氨基丙基)-2-硝基咪唑于无水乙醇（5mL）中的回流溶液中并且回流2小时。在约30℃下，在减压下浓缩混合物至干燥。用二氯甲烷（20mL）将残余物制成浆液，保持30分钟，并且过滤固体，并用二氯甲烷（5mL）洗涤两次。合并滤液并且在约30℃下浓缩至干燥，并在真空下干燥1小时。

在氩气气氛下，将10份1-(3-氨丙基)-2-硝基咪唑于无水DMF（2mL）中的溶液添加到聚(乙烯基苯甲基氯)于DMF（100mL）中的溶液中并且搅拌18小时。将溶液加热到50℃-55℃，保持3小时。冷却混合物到室温，保持3小时。向溶液中添加三丁基磷杂环戊二烯（tributylphosphene）（23mL）并且搅拌18小时。将溶液加热到55℃-57℃，保持3小时，并且冷却到室温，保持3小时。向溶液中添加三辛基磷杂环戊二烯（5.5mL）并且搅拌66小时。

将溶液加热到50℃-55℃，保持4小时，并且冷却到室温，保持18小时。在将溶液加热到30℃-35℃的同时，在真空下浓缩溶液到50mL并且将其冷却到室温。添加无水DMF（30mL）并且将溶液缓慢倒入无水乙醚（1.5L）中并且剧烈搅拌30分钟。用无水乙醚（3×500mL）洗涤固体并且剧烈搅拌10分钟，并且每次倾析。重力过滤固体并且在真空下在25℃下干燥24小时。

实施例II

本实施例说明了通过显影剂和光敏剂共价连接来修饰的标靶缺氧的PMC的制备。

用孟加拉玫瑰红和荧光素合成1-(3-氨丙基)-2-硝基咪唑

将0.15份无水肼于无水乙醇（1mL）中的溶液添加到0.14份在实施例I的步骤1中获得的1-(3-邻苯二甲酰亚氨基丙基)-2-硝基咪唑于无水乙醇（5mL）中的回流溶液中并且回流2小时。在约30℃下，在减压下浓缩混合物至干燥。用二氯甲烷（20mL）将残余物制成浆液，保持30分钟，并且过滤固体，并用二氯甲烷（5mL）洗涤两次。合并滤液并且在约30℃下浓缩至干燥，并在真空下干燥1小时。

在氩气气氛下，将10份1-(3-氨丙基)-2-硝基咪唑于无水DMF（2mL）中的溶液添加到聚(乙烯基苯甲基氯)于DMF（100mL）中的溶液中并且搅拌18小时。将溶液加热到50℃-55℃，保持3小时。冷却混合物至室温，保持3小时，并且添加0.13份孟加拉玫瑰红。搅拌混合物18小时。将溶液加热到50℃-55℃，保持3小时，并且冷却到室温，保持3小时。向此溶液中添加0.07份荧光素并且搅拌18小时。将溶液加热到50℃-55℃，保持3小时，并且冷却到室温，保持3小时。向溶液中添加三丁基磷杂环戊二烯（23mL）并且搅拌18小时。将溶液加热到55℃-57℃，保持3小时，并且冷却到室温，保持3小时。向溶液中添加三辛基磷杂环戊二烯（5.5mL）并且搅拌66小时。

将溶液加热到50℃-55℃，保持4小时，并且冷却到室温，保持18小时。在将溶液加热到30℃-35℃的同时，在真空下浓缩溶液到50mL并且将其冷却到室温。添加无水DMF（30mL）并且将溶液缓慢倒入无水乙醚（1.5L）中。剧烈搅拌溶液30分钟。倾析溶剂并且在剧烈搅拌下用无水乙醚（3×500mL）洗涤固体10分钟。重力过滤固体并且在真空下在25℃下干燥24小时（回收到22.5份产物）。

实施例III

本实施例说明了将疏水性药物囊封在PMC内。

使用实施例I的PMC来囊封以下药物：

药物A：(3Z)-3-{[3,5-二甲基[丙基-1-基氨甲酰基]-1H-吡咯-2亚甲基}-5-氟-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮

将聚合物以0.010g/mL的浓度溶解于去离子水或水性缓冲液中。将药物A以5μg/μl的浓度溶解于DMSO中。在室温下，在恒定搅拌下，将药物A逐滴添加至聚合物溶液中。经60分钟的时程添加药物，使得相对于聚合物摩尔过量2-5倍。将溶液离心以去除任何沉淀并且将其转移到10,000MWCO的透析管中。相对于水性缓冲液（50×体积）透析溶液30分钟。

通过紫外/可见光分光光度计记录聚合物-药物溶液和透析缓冲液的吸光度并且与各自在透析前的样品相比较（聚合物吸光度=280nm；药物A吸光度=450nm）。由药物在此初始透析之后的吸光度变化来计算囊封效率。用新鲜的缓冲液（50×体积）进一步透析聚合物-药物溶液，在72小时的时程内进行多次读数，其中缓冲液变化4次。由聚合物-药物溶液和透析缓冲液中药物的吸光度随时间的变化来计算药物从聚合微胞释放的速率。

计算得到在tris缓冲液（pH7.4）中药物A的囊封效率大于80%，其中在24小时的时程内释放了50%的药物。

实施例IV

本实施例说明了将疏水性药物囊封在PMC内。

使用实施例I的PMC来囊封以下药物：

药物B：N-(4-氯-3-三氟甲基)苯基-N'-{4-甲基氨甲酰基]-4-吡啶氧基苯基}脲：

药物B的囊封是通过与实施例III中关于药物A所述相同的透析程序进行。将药物B溶解于DMSO中，得到2.5mg/ml的储备溶液。在310nm下追踪药物B的吸光度并且在280nm下追踪聚合物的吸光度。计算得到药物B的囊封效率大于85%，其中在24小时之后释放了20%的药物。

实施例V

本实施例说明了在产生单态氧的PMC中囊封的化学发光底物的制备。

使用实施例I所述的聚合物来囊封磷酸酶的1,2-二氧杂环丁烷化学发光底物。

将1,2-二氧杂环丁烷添加到含有实施例1的聚合物的水溶液中并且在室温下，在10,000MWCO薄膜中相对于AP稳定化tris缓冲液（50×体积）透析24小时。通过透析之后碱性磷酸酶活性的变化来测定囊封效率。

实施例VI

本实施例说明了在产生单态氧的PMC中囊封的化学发光底物的制备。

使用实施例II所述的聚合物来囊封磷酸酶的1,2-二氧杂环丁烷化学发光底物。

将1,2-二氧杂环丁烷添加到含有实施例II的聚合物的水溶液中并且在室温下，在10,000MWCO薄膜中相对于AP稳定化tris缓冲液（50×体积）透析24小时。通过监测碱性磷酸酶活性和吸光度读数随时间的变化来测定复合物的囊封效率和稳定性（聚合物=290nm，荧光素=495nm，孟加拉玫瑰红=570nm）。

实施例VII

本实施例说明了将疏水性荧光团囊封在PMC内。

使用实施例I的聚合物来囊封荧光素和孟加拉玫瑰红。将聚合物以0.010g/mL的浓度溶解于接近生理条件的水性缓冲液中。在DMSO中制备荧光素和孟加拉玫瑰红的储备溶液。在恒定搅拌下，在室温下，将每一荧光团逐滴添加到聚合物溶液中，直到荧光素的最终浓度是0.167μM并且孟加拉玫瑰红的最终浓度是13.7μM。使溶液在室温下混合2小时。图1显示了相比于水溶液中的荧光团，当荧光团被囊封在聚合物中时荧光强度和红移光谱的变化。当囊封在聚合物中时，从荧光素到孟加拉玫瑰红的能量转移增强超过1000倍。在10,000MWCO的透析管中，在100×体积水性缓冲液中透析囊封的荧光团24小时。如通过荧光强度和吸光度所测定，超过90%的荧光团被截留在透析管内的聚合物中。

实施例VIII

本实施例说明了囊封在缺氧标靶性PMC内的缺氧标靶性疏水性药物的囊封。

使用实施例I的PMC来囊封以下缺氧标靶性药物：

药物C：(3Z)-3-{[3,5-二甲基[3-(2-硝基咪唑)-丙基-1-基氨甲酰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-5-氟-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮

将药物以10×预定最终囊封浓度的储备液浓度溶解于DMSO中。将药物逐滴添加至实施例I的聚合物的水溶液中，并且使其混合2小时。通过透析去除过量药物，并且由吸光度变化来计算囊封效率。

实施例IX

本实施例说明了囊封在缺氧标靶性PMC内的缺氧标靶性疏水性药物的囊封。

根据实施例VIII的程序，使用实施例I的聚合物来囊封以下药物：

药物D：N-(4-氯-3-三氟甲基)苯基-N'-{4-[3-(2-硝基咪唑)氨甲酰基]-4-吡啶氧基苯基}脲

本发明通过提供用于治疗剂的标靶传递系统改善了不同癌症治疗的治疗功效。通过增加药物的溶解度和稳定性，改善生物可用性并且降低毒性改善了功效。本发明还可以用于使疾病成像和定位以帮助做出治疗决策。

因此，本案所要求保护的发明描述于权利要求书中。

Claims (22)

1.一种聚合微胞，其包含形成内核的疏水性生物相容性聚合物和形成外冠的亲水性或极性生物相容性聚合物且包含E、R₁、R₂和R₃，

其中R₁、R₂和R₃连接至聚合微胞的外部；且

其中E是在聚合微胞内的囊封剂，其中E是选自由以下各物组成的组：显影剂或对比剂、治疗剂、治疗佐剂、光产生系统、放射性系统、敏化剂以及其混合物；

R₁是缺氧标靶性部分，包括芳香族N-氧化物、脂肪族N-氧化物、硝基唑、硝基咪唑、硝基噻吩、硝基噻唑、硝基噁唑、硝基呋喃、硝基吡咯以及过渡金属部分；

R₂是选自由以下各物组成的组：显影剂或对比剂、标靶性部分、治疗剂、敏化剂以及其混合物；

R₃是用于改善所述微胞的溶解度、稳定性以及生物分布的极性生物相容性部分，并且

其中所述敏化剂可以结合到所述缺氧标靶性部分，

其中所述微胞包含连接基区域，其对应于下式：

其中n是从1到20的整数；R₁、R₂以及R₃如上述所定义；L是与三取代的胺或三取代的膦连接的具有饱和或不饱和碳的连接基。

2.根据权利要求1所述的微胞，其中：

所述聚合微胞具有大小范围为约10nm到约100nm的直径并且包含疏水性生物相容性内核和亲水性或极性生物相容性外冠。

3.根据权利要求1所述的微胞，其中：

所述形成外冠的生物相容性聚合物是选自由以下各物组成的组：聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氧化乙烯)、聚(氧化丙烯)、聚(乙烯基甲基醚)、羟丙基纤维素、壳聚糖、多糖、叔铵和鏻盐，以及其混合物。

4.根据权利要求1所述的微胞，其中：

所述缺氧标靶性部分是选自由以下各物组成的组：芳香族N-氧化物、脂肪族N-氧化物、硝基唑、硝基咪唑、硝基噻吩、硝基噻唑、硝基噁唑、硝基呋喃、硝基吡咯、过渡金属部分以及其混合物。

5.根据权利要求1所述的微胞，其中：

所述显影剂或对比剂是选自由以下各物组成的组：荧光团、染料、量子点、过渡金属、过渡金属络合物、放射性核素以及其混合物。

6.根据权利要求1所述的微胞，其中：

所述治疗剂是选自由以下各物组成的组：化学治疗剂、放射性同位素、治疗性蛋白质或肽、置换的正常基因，以及其混合物。

7.根据权利要求6所述的微胞，其中：

化学治疗剂是选自由以下各物组成的组：抗代谢物、烷化剂、生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞毒性抗生素、铂类药物以及其混合物。

8.根据权利要求1所述的微胞，其中：

所述敏化剂是选自由以下各物组成的组：(a)光敏剂，包括萘、蒽、联苯、醌、卟啉以及酞菁(phthalocyanins)；(b)荧光素；(c)孟加拉玫瑰红(Rose Bengal)；(d)伊红蓝；(e)赤藓红B；(f)氧载体，包括内过氧化物和氮氧化物；以及(g)其混合物。

9.根据权利要求1所述的微胞，其中：

所述极性生物相容性部分是选自由以下各物组成的组：聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氧化乙烯)、聚(氧化丙烯)、聚(乙烯基甲基醚)、羟丙基纤维素、壳聚糖、多糖、叔铵和鏻盐，以及其混合物。

10.根据权利要求9所述的微胞，其中所述极性生物相容性部分是对应于下式的叔盐：

其中X是N或P；R₄、R₅以及R₆各自独立地是具有1到20个碳原子的直链或分支链烷基链，所述烷基链未被取代或被一个或一个以上羟基、烷氧基、芳氧基、氨基或被取代的氨基、氟烷、对氟芳基、氘化烷基以及其混合物取代。

11.根据权利要求1所述的微胞，其中R₁对应于下式：

其中X是N、S或O并且Y是C或N。

12.根据权利要求11所述的微胞，其中所述缺氧标靶性部分是被取代或未被取代的2-硝基咪唑并且当X和Y都为N时对应于下式：

其中R₇、R₈以及R₉独立地表示直接或通过连接基区域与聚合微胞的连接；氘化或非氘化烷基、羧酸酯、羧酸烷酯、氨基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基，以及其混合物。

13.根据权利要求1所述的微胞，其中所述连接基选自由以下各物组成的组：N,N,N'N'-四甲基-2-丁烯-1,4-二胺、N,N,N'N'-四甲基丁-1,4-二胺、1,4-二甲基哌嗪、1,4-苯二胺以及其混合物。

14.一种聚合微胞，其包含形成内核的疏水性生物相容性聚合物和形成外冠的亲水性或极性生物相容性聚合物且包含E、2-硝基咪唑和

其中E在聚合微胞内且2-硝基咪唑和连接至聚合微胞的外部，

其中2-硝基咪唑是标靶性部分，所述极性生物相容性组分是叔盐，E是治疗剂，X是N或P，R₄、R₅以及R₆独立地是具有1到20个碳原子的直链或分支链烷基链，所述烷基链未被取代或被一个或一个以上羟基、烷氧基、芳氧基、氨基或被取代的氨基、氟烷、对氟芳基、氘化烷基以及其混合物取代，

其中所述微胞包含连接基区域，其对应于下式：

其中n是从1到20的整数；R₁、R₂以及R₃如上述所定义；L是与三取代的胺或三取代的膦连接的具有饱和或不饱和碳的连接基。

15.根据权利要求14所述的微胞，其另外包含IA，其中IA连接至聚合微胞的外部，

其中IA表示显影剂，包括荧光部分、氘化部分、电磁部分、放射性同位素以及其混合物。

16.根据权利要求15所述的微胞，其中所述显影剂是选自由以下各物组成的组的荧光部分：

有机染料、量子点、荧光探针以及荧光生物分子，所述显影剂是在所述聚合微胞外部、在所述聚合微胞内共价连接到所述聚合微胞，或非共价连接到所述聚合微胞或被囊封在所述聚合微胞内，其中所述聚合微胞外部是亲水性的且所述聚合微胞内部是疏水性的。

17.根据权利要求14所述的微胞，其中所述连接基选自由以下各物组成的组：N,N,N'N'-四甲基-2-丁烯-1,4-二胺、N,N,N'N'-四甲基丁-1,4-二胺、1,4-二甲基哌嗪、1,4-苯二胺以及其混合物。

18.一种光动力疗法聚合微胞，其包含形成内核的疏水性生物相容性聚合物和形成外冠的亲水性或极性生物相容性聚合物且包含CL、2-硝基咪唑、PS和

其中CL在聚合微胞内且2-硝基咪唑、PS和连接至聚合微胞的外部，

其中所述聚合微胞与2-硝基咪唑结合，PS是选自由萘、蒽、联苯、醌、卟啉、酞菁、荧光素、荧光素衍生物、孟加拉玫瑰红、伊红蓝以及赤藓红B组成的组的光敏剂，X是N或P，并且CL是囊封的化学发光底物，所述底物是选自由底物1,2-二氧杂环丁烷化合物和鲁米诺(luminol)、2-硝基咪唑组成的组，其中所述CL被触发，R₄、R₅以及R₆独立地是具有1到20个碳原子的直链或分支链烷基链，所述烷基链未被取代或被一个或一个以上羟基、烷氧基、芳氧基、氨基或被取代的氨基、氟烷、对氟芳基、氘化烷基以及其混合物取代，

其中所述微胞包含连接基区域，其对应于下式：

其中n是从1到20的整数；R₁、R₂以及R₃如上述所定义；L是与三取代的胺或三取代的膦连接的具有饱和或不饱和碳的连接基。

19.根据权利要求18所述的微胞，其进一步包括显影剂IA，其中IA连接至聚合微胞的外部，

其中IA是选自由以下各物组成的组：荧光团、染料、量子点、过渡金属、过渡金属络合物、放射性核素以及其混合物。

20.根据权利要求18所述的微胞，其中所述连接基选自由以下各物组成的组：N,N,N'N'-四甲基-2-丁烯-1,4-二胺、N,N,N'N'-四甲基丁-1,4-二胺、1,4-二甲基哌嗪、1,4-苯二胺以及其混合物。

21.一种根据权利要求18所述的微胞的用途，其用于制造用于治疗缺氧肿瘤的医药品。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述微胞进一步包含显影剂部分IA，其中IA连接至所述微胞的外部，

其中IA是选自由以下各物组成的组：荧光团、染料、量子点、过渡金属、过渡金属络合物、放射性核素以及其混合物。