JPH02501730A

JPH02501730A - 涙の出ない目を治療するためのリポソーム組成物

Info

Publication number: JPH02501730A
Application number: JP62506907A
Authority: JP
Inventors: グオ，ルーク　エス．エス
Original assignee: リポソーム　テクノロジー，インコーポレイテッド
Priority date: 1986-10-21
Filing date: 1987-10-20
Publication date: 1990-06-14
Also published as: WO1988003018A1; US4818537A; EP0327580A1; EP0327580A4; AU8173287A; AU599871B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は涙の出ない目（ｄｒｙ　ｅｙｅ　）を治療するための組成物および方法に関する。

２、参考文献Ｌａｗｒａｎｃｅ、Ｄ、Ｊ、ら、Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　１０６：６４６（１９６３）。

Ｌｅｍｐ、　Ｍ、Ａ、、　Ｉｎｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｃ１１ｎ　１３：１８５（１９７３）。

Ｍａｕｒｉｃｅ、　Ｄ、ら、　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔ、（１９８６）出版中。

Ｓｊδｇｒｅｎ、Ｈ，ら、５ｕｒｖ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１６：１４５（１９７１）。

５ｚｏｋａ、Ｆ、、Ｊｒ、ら、Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｂｉｏｅｎｇ　９：４６７（１８９０）。

３、背景涙の出ない目は、眼球表面における涙の膜が不連続になることにより特徴づけられる目の状態である。この状態には。

多くの異なる病因が存在する。この病因には、涙腺による水分の分泌が少ないこと（Ｓｊｏｇｒｅｎ）　、ゴブレット細胞による粘液の分泌が少ないこと（Ｌｅｍｐ）、ビタミンＡが欠乏していること（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）、および慢性のプレザレサティス（ｂｌｅｔｈａｒｉｔｓ）が原因で膜形成脂質が変化することなどが包含される。

涙の出ない目は１通常、この目に滴状でわずかに粘性のあるポリマー溶液を塗布して治療され、この溶液が蒸発するか。

あるいは瞬きをして拭い去られるまでに、この目は一時的に潤される。これらのポリマー溶液は、かなり早く目から排除される傾向があるので、頻繁に投与する必要がある。

涙の出ない目のための通常の処方物は、室温で貯蔵することを意図された液体である。従って、この製品は、数カ月間にわたって室温で貯蔵しても、安定であることが望ましい。

今述べたようなタイプのポリマー溶液にとって、貯蔵上の主要な問題は、細菌の増殖である。細菌の増殖は、静菌化合物の存在により制御され得る。広く用いられている静菌化合物の１つに塩化ベンザルコニウムがあり、約０．０１％の溶液濃度で用いられる。眼への使用は一般的には、安全であるが、この化合物が場合によっては眼に刺激を与えることが知られている。

発明者らはすでに、共有する特許出願「眼用リポソーム」（１９８６年６月１９日付で出願）において、涙の出ない目を治療するためにリポソーム組成物を使用することを提案した。この治療方法は、ポリマー溶液を用いる従来技術の治療より潜在的に有利な点をいくつか提供する。リポソームは、眼球表面に付着した場合には、水溶性流動物をカプセル化して結合保持するためのマトリックスを提供し、リポソームが眼球表面に保持されている限り、効果的な湿り気を与える。これらのリポソームはまた。安定な涙の膜を目に形成するための粘膜を模倣した特性を提供し得る。以前に述べた発明と、ここに開示された発明とによれば、リポソームは数時間までにわたって眼球表面に保持されるように処方され得、従って頻繁な投与の必要性がなくなる。さらに、リポソームは、治療を受けている患者に欠如している膜形成脂質および／またはビタミンＡを補給するように処方され得る。

リポソームには、涙の出ない目の治療を改良する可能性があるが、涙の出ない目を治療する効果的な処方物を設計するには、いくつかの問題がある。ある問題は、数カ月までの期間にわたって製品が安定でなければならないということである。リポソームは、数カ月間にわたって冷蔵庫温度で貯蔵した場合でさえ、様々な脂質の酸化／過酸化および加水分解反応を受けることは周知である。他方の聞届は、リポソームが視野を損なったり、視野を曇らせないように、処方物を光華的に透明にすることである。最後に、リポソーム懸濁液は。

許容される静菌剤と適合しなければならない。

４、発明の要旨本発明の一般的な目的は、涙の出ない目を治療するための改良されたリポソーム組成物および方法を提供することにある。

本発明のより特定の目的は、以下のような組成物を提供することにある；（ａ）室温で数カ月間貯蔵しても安定である；（ｂ）光学的に良好な透明度を有する；および（Ｃ）適当な静菌剤と適合し得る。本発明の他の局面によれば、この処方物は目に対する刺激が少ないという特性も有している。

本発明のさらに他の目的は、比較的簡単な処理方法により。

殺菌した形態に調製し得るようなリポソームの処方物を提供することにある。

目に対する刺激が少ない傾向を有する。涙の出ない目のための処方物を提供することは９本発明のさらに他の目的である。

本発明の組成物はリポソームの水性懸濁液を含有する。このリポソームの脂質組成物は、実質的に飽和した中性の小胞形成脂質と、少なくとも１２個の炭素原子からなる脂肪族炭化水素鎖を有する１０〜４０モル％の第４級ベンジルアミンとを含有する。水性媒体は、好ましくはｐ）Ｉが約６．２と６．８との間に調整され、静菌剤とカルシウムイオンキレート剤とを含有する。カルシウムイオンキレート剤は、リン脂質の加水分解を制限し、さらに静菌剤としても作用する。このリポソーム組成物は、さらにビタミンＡおよび／または膜形成脂質（例えハ、長鎮の脂肪族アルコールおよびコレステロールエステル）を含有する。

好ましい実施態様では、上記のリポソームは、約７０〜８５モル％の水素化ホスファチジルコリン（ＲＰＣ）と、約１５〜３０モル％のベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド（ＢＤＳＡ）とから構成されており、全組成物の約０．０２重量％および０．０４重量％の量で懸濁液中に存在する。好ましい静菌剤は塩化ベンザルコニウムであり、濃度は約０．０１重量％またはそれ以下である。この静菌剤は、リポソームの存在下では、目に対する刺激が少ない。

本発明には、以下の工程を包含する。涙の出ない目の治療方法も含まれる：（ａ）眼球表面における保持力を高めるために処方されたリポソームの水性懸濁液を提供すること；および（ｂ）眼球表面を被覆する水性リポソームマ）ＩＪフックス形成するのに充分な量で、該懸濁液を眼球表面に塗布すること。この懸濁液は、上記のリポソーム組成物の特性を有している。

本発明のこれらの目的や特徴および他の目的や特徴は、以下の本発明の詳細な説明を添付の図面と共に読むことにより。

さらに明確になる。

図面の簡単な説明第１図は眼の組織における５ｔｌＶの保持力を示す。白丸は水素化ホスファチジルコリン（ＩＩＰｃ）だけを用いて調製したＳＵＶの場合、黒丸はベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド（ＢＤＳＡ）と水素化ＰＣ（ＲＰＣ）とをＨＰＣ：ＢＤＳＡ＝４：１の割合で用いて調製したＳＵｖの場合を示す；第２図は、眼の組織における１ｔＰｃ／ＢＤＳＡ　Ｓ［ＪＶの保持力を示す。

白丸はポリマーを添加して処方したＳＵｖの場合、黒丸はポリマーを添加せずに処方したＳＵＶの場合を示す；第３図は眼の組織におけるＨＰＣ／ＢＤＳＡ　ＳＵＶの保持力を示す。

該ＨＰＣ／ＢＤＳＡ　ＳＵＶは以下の量のりゾホスファチドおよび遊離脂肪酸を用いて処方された：黒丸は０モル％；黒三角は１０モル％；および白丸は３０モル％。

第４図は、遊離のＲＰＣ，遊離のＢＤＳＡ、およびＨＰＣ／ＢＤＳＡ　５ＩＩｖニ関する示差走査熱量測定のサーモグラムを示す。

第５図は、ポリマーを含有するＩ（ＰＣ／ＢＤＳＡ　ＳＵＶの懸濁液中におけるリン脂質の加水分解率を示す：該懸濁液は、７０℃にてｐＨ６，０（白三角）　、　ｐＨ６，８（黒三角）、Ｐ＋１７．４（白丸）、およびｐＨ８，０（黒丸）で、それぞれインキュベートした。

第６図は、　ｐＨ６，ｇでのリポソーム処方物中におけるリン脂質の加水分解反応のアルニウスプロットである；第７図は螢光色素の角膜への浸透度をプロットしたものであり、　ＢＤＳＡの濃度を上昇させた場合［ＢＤＳＡがリポソーム形態でないとき（白丸）あるいはリポソーム形態であるとき（黒丸）〕と、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）の濃度を上昇させた場合ＣＢＡＣがリポソーム形態でないとき（白三角）あるいはリポソーム形態であるとき（黒三角）〕とのププロトである：そして第８図はリポソームを数回滴下した後のウサギの目における脂質の飽和を示す。

（以下余白）溌」トλ謀週」Ｉ【肌本組成物のリポソームは種々の小胞形成脂質から形成される。この小胞形成脂質は、２個の脂肪族鎖を有する脂質（例えばリン脂質、ジグリセリドおよび２個の脂肪族鎖を有する糖脂質）、およびコレステロールおよびその誘導体を包含す　、る。この脂質成分は、リポソーム中で、全脂肪成分の約６０〜９０の間の量で存在する。残りは後述の項で述べる表面成分である。

本明細書中で定義されるように、「リン脂質」は、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルグリセロール（ｐｃ）　。

ホスファチジルコリン（ｐｃ）　、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）　、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ｐｓ）　、プラスマロゲン、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）を包含する。「コレステロール」という用語は。

例えば次のコレステロール誘導体を包含する：３−（ヒドロキシ−５，６−コレスタン）、およびその類似体（例えば３−アミノ−５，６−コレスタンおよび５，６−コレスタン）；コレスタン、コレスタノールおよびその類似体（例えば、３−ヒドロキシーコレスクン）；および帯電したコレステロール誘導体（例えばコレステリルβ−アラニンおよびコレステリルヘミサクシネート）１本明細書中で用いられる「糖脂質」という用語は、２個の脂肪酸類（その１つがスフィンゴシンの炭化水素鎖である）、および１個あるいはそれ以上の糖残基を存する脂質を包含する。本発明を実施するのに適した糖脂質の例には、セレブロシド、ガラクトセレブロシド、グルコセレブロシド、スルファチド、および先頭の極性基としてジサッカライドおよびトリサツカライドを有するスフィンゴ脂質（例えば、ジヘキソシドおよびトリへキソシド）が包含される。

リン脂質のような２個の脂肪族鎖を有する脂質（好ましくは小胞形成脂質の大部分を構成する）において、脂肪族鎖は。

好ましくは、少なくとも約１２原子の長さであり、最適には約１５原子と２０原子の間の長さである。この鎖もまた。実質的に飽和している。つまり、各類はせいぜい１個の不飽和結合を含むことを意味する。この飽和脂肪鎖が存在すると、より容易にリポソーム中に脂質が被包される。このことは、粘膜表面に結合するリポソームが増えることにより見い出された。

さらに重要なことには、そして９本発明を支持するために行った実験では、飽和類が存在すると数ケ月間にわたって室温で貯蔵しても脂質の酸化／過酸化による変質が生じない。酸化による変質が起こらないということは、α−トコフェロールのように親油性のフリーラジカルクエンチャ−が存在しないときでさえ観察される。しかし、このような脂質保護剤が必要により添加され得る。同様に、ステロイド型の脂質がリポソーム中に含有される場合には、これらはコレスタノールおよびその類似体のような飽和種であることが好ましい。

本発明のリポソーム組成物を形成するために用いられる脂質は帯電していても、中性であってもよい。すべてのリポソーム表面が正に帯電していることが本組成物の保持力を、高めるために望ましいので、中性あるいは正に帯電した脂質が好ましい。しかし、負に帯電した脂質でも次のような場合には、ある程度リポソーム内に取りこまれる。つまり、脂質のって付与された全正電荷と比べて比較的低い場合には、ある程度リポソーム内に取り込まれる。

好ましい処方では、全脂質の３０〜９０モル％がリン脂質であり、さらに好ましくは、全脂質の６０〜９０モル％が飽和された中性のリン脂質（例えば水素化ホスファチジルコリン（ＲＰＣ）　）である。全脂質の４０モル％までが飽和コレステロール誘導体で代表される。このリポソーム組成物は後述の実施例■および ■、そしてその後のいくつかの実施例で例示され、小胞形成脂質は８０モル％のＲＰＣを含有する。

この小胞形成脂質は、さらにビタミンＡを含み、このビタミンＡはリポソーム形成時にリポソームの二重層に優先的に捕捉される。ビタミンＡの濃度は好ましくは約０．５モル％と約５．０モル％の間である。この組成物はビタミンＡ欠乏性に関連する涙の出ない目を治療するのに有用である。

涙を形成する脂質の欠如に関連する涙の出ない目の状態をアルコール、脂肪酸および／またはコレステロールエステルを含有するように処方される。但し、この少量の脂質成分は次のような条件を備えていなければならない：（ａ）粘膜組織へのリポソームの結合親和力が有意に弱められないこと、（ｂ）実質的に不飽和であること、（Ｃ）目に対して毒性あるいは刺激性がないこと。まず、リポソーム中に含有される負電荷の脂質の量を制限し、そして、脂質を包み込むリポソーム二重層を破壊するような該脂質量についても制限しなければならない。

２．１里旦太表皿威圀リポソームはまた。ベンジル／脂肪族鎖アミンを１０〜４０モル％の割合で含有する。この（ａ）ベンジル／脂肪族鎖アミンは。

その脂肪族鎖およびベンジル基の効果によりリポソーム二重層に固定され、　ｐＨが約６．２と６．８の間では正に帯電している。

このアミンは、好ましくはベンジルアミン、ジアルキルアミン、脂肪族鎖を有する四級アミンであり、これらのアミンの正電荷は、ｐＨに依存しない。

アミンの脂肪族鎖は、少なくとも１２個の炭素原子の長さであり、そして、好ましくは約１５個〜２０個の炭素原子の長さである。四級アミン化合物では、残りの窒素結合基は約５個未満の炭素原子を有するアルキル置換基で飽和されている。このベンジル基は９アルキル基あるいは他の疎水基で置換され得る。好ましいベンジルアルキルは、塩化ベンジルメチルステアリルアンモニウム（ＢＤＳＡ）　、、および脂肪族鎖が約１５〜２０個の原子を有するベンジルジメチル脂肪族鎖アミンである。

このアミンの長鎖の脂肪族基およびベンジル基の両者とも。

脂質二重層の内側の疎水域に分子を固定するような疎水性の基である。ただひとつの疎水性の部分によって二重層に固定される従来の技術におけるアミンに比べて１本発明の組成物は、このアミンに存在する２つの疎水性でかつ固定できる官能基の効果によって、安定性を増強している。

ある好ましいリポソーム（ＨＰＣおよびＢＤＳＡを４＝１のモル比で含有する）の安定性は、実施例■および第４図において認められる。ここでは、遊離のＲＰＣ（上の曲線）、遊離のＢＤＳＡ（下の曲線）およびＨＰＣ／ＢＤＳＡリポソーム（真中の曲線）は。

示差走査熱量測定のサーモグラムである。リポソーム組成物は、検知し得る遊離のＢＤＳＡを含有していない。

添加されたアミンが眼の組織にリポソーム保持力を有意に高めることは実施例■ に報告された研究で示される。ここでは、ＰＣおよび２０モル％ＢＤＳＡで形成されたリポソームが使用されている。第１図で見られるように、　ＢＤＳＡの添加（第１図の黒丸）により投与１時間後で、眼におけるリポソームの保持力が３〜４倍高められる。

本発明の重要な特色として、帯電したアミン含有リポソームは、目の刺激試験（実施例■およびＸに示す）においてほとんどあるいは全く、目の刺激を示さなかった。特に、　ＢＤＳＡは遊離の形で目に投与した時より、リポソームに結合させた時のほうが有意に刺激が少なかった。

３、土乞二上Ｍ二の組成物は、リポソーム中の脂質の分解を減じ、そして。

静菌作用に寄与する両機能を有するカルシウムイオンキレート剤を包含し得る。

脂質の加水分解の阻害は、ホスホリパーゼＡ２の阻害に起因する。このホスホリパーゼＡ２は懸濁液中に夾雑物として存在し、コファクターとしてカルシウムを必要とする。このキレート剤の静菌作用は金属を利用できない形態にして除くことに関与する。

これらイオンのそれぞれの錯体を形成する上で存用であるキレート剤の例には、エチレンジアミン四酢ａ　（ＥＤＴＡ）　、エチレンジアミン酢酸（ＥＤ３Ａ）およびジエチレントリアミン五酢酸がある。キレート剤は、懸濁液中のカルシウムイオンより多量に１代表的には約２５から５０μｍの間の量で加えられる。

４、　庁に　、するポリマー眼の表面でのリポソーム組成物の保持力をさらに改良するために、多くの高分子量の重合体が水性分散液に含有され得る。適当なポリマーには、セルロースポリマー（例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース。

メチルセルロース）、ビニルポリマー（例えばポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコール）、およびそれらの混合物があるが、これらに制限されない。

これらのポリマーは、眼の表面におけるリポソームの保持力を高めるように作用し、おそらくそれは、水性懸濁媒体の粘度を上げることおよび／または眼の表面で、結合したリポソーム凝集物を形成するという理由による。リポソームの保持力を高めることは、実施例■および第２図に示されており。

ここでは、０．８％ヒドロキシメチルセルロースおよび０．２％のポリビニルアルコールのポリマー混合物が添加される。簡単に述べれば、この図でわかるように、このポリマーの混合物は１時間後に眼における保持力を６０〜７０％の割合で増大した。

たとえポリマーが貯蔵時にリポソームの凝集を引き起こしても、この凝集物は、ゆるやかに振るとすぐに分散し、わずかに不透明な懸濁液を形成する。安定性を促進させる実験におけるこのリポソーム／ポリマーの懸濁液の安定性は、実施例 ■に示される。

（以下余白）５、懸濁液のｐＨおよび緩衝液本発明を支持するために行ない、実施例Ｖで示される実験では、リン脂質の脂質加水分解は、懸濁液のｐＨに非常に関係があることが示される。ｐＨ６、０からｐ）１８．０の間の４つのｐＨ値における７０℃で５日間にわたる加水分解率を第５図に示す。

ｐＨ６、０では試験期間を通じて加水分解はほとんど観察されなかったが、　ｐＨの上昇にともなって加水分解率上昇が生じた。

実施例■で報告した研究では、３８℃、　ｐＨ６，８６で４．５ケ月後に観察される加水分解量は約１２％にすぎず、　ｐＨ６，７ではほとんど分解されなかった。室温では、　ｐＨ６，８６での４．５ケ月後の分解率は約６．７％にすぎなかった。

これらの結果に基づいて、至適ｐＨとして約６．８より低いｐＨ。

好ましくはｐＨ１６，３と６．７との間のｐ＋＋が選択された。１３ｍＭのリン酸緩衝液は長期間の貯蔵において、良好な緩衝能力を有する。

このリポソーム組成物は、好ましくは、懸濁液中に含まれるカルシウムイオンキレート剤に加えて静菌剤を含有する。本発明を支持するために行った実験によれば、リポソーム中に含有されるＢＤＳＡがテスト濃度＜０．０５％ＢＤＳＡ）では、有効な静菌剤とならないことを示した。他の静菌剤とともに行った試験では、０．０１％塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）は、０．０１％の濃度で、良好な静菌効果を示した。この化合物はＢＤＳＡに関するものであるが、主として１２〜１４個の炭素原子の脂肪族鎖を含む。そのため、この化合物はリポソームに対する親和性が低いと予想される。しかし、この化合物とリポソームの間には、いくつかの相互関係が生じるようであり、そのことはこの化合物をリポソームと共に処方したとき（実施例■）に観察される目への刺激が減じることで明白である。ＢＤＳＡおよびＢＡＣにより目への刺激を回避するときのリポソームの影響は。

第７図に示される。第７図によれば、遊離の形で存在する両孔合物において認められる。濃度に依存して上昇する刺激を。

リポソームが防ぐということがわかる。本発明の１つの新規な点は、上記のように、　ＢＡＣが見かけ上の静菌活性を喪失せずに目への刺激を減じさせることである。

Ｂ、リポソーム組成物の調製本発明のリポソーム懸濁液は、リポソームを調製し大きさを整えるという一般的な方法により、調製され得る。この調製法には、リポソーム膜の水和、溶媒の注入、逆相蒸発（らが詳述している）が包含される。実施例Ｉには、米国特許第４．２３５．８７１号に開示されている逆相蒸発相法（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ　ｐｈａｓｅ　ｍｅｔｈｏｄ）による逆相蒸発小胞（ＲＥＶ　）の調製法が述べられている。実施例Ｈには、脂質膜の溶媒和による多層ラメラ小胞（ＭＬＶ　）の調製法が記載されている。後者の方法が一般に好適であり、この方法では、適当な溶媒に溶解させたリポソーム形成脂質の混合物を容器内でエバボレートシ、薄い膜を形成させ、この薄膜を水性緩衝液で覆う。

この脂質膜は９代表的には約０．１〜１．０μｍの大きさの１．４Ｌνを作るように水和する。

ＲＥＶあるいはＭＬＶの調製物は、さらに処理して、より小さく、比較的大きさがそろったリポソーム（０，１〜１．０μｍの大きさの範囲）を含む懸濁液を調製することもできる。小さくて大きさがそろったリポソームの利点は２次のとおりである＝（１）はとんど凝集しない傾向にあること；（２）粘膜組織表面で高密度のリポソームを存在させることが可能であること。

および（３）目に適用したときに視覚的に非常に透明であること。

大きさを整えるひとつの効果的な方法は９選択された均一のポアサイズ（代表的には０．２．０．４．０．６．０．８あるいは１μｍ）を有するポリカーボネート膜にリポソームの水性懸濁液を通すこと（Ｓｚｏｋａら）を包含する。この膜のポアサイズは、該層を通じて押出された調製されたリポソームの最も大きいサイズにほぼ対応する。ここでは、同じ膜を２回以上通し押し出すことによって調製が行われる。より最近の方法には、左右非対称のセラミックフィルターを通して押し出す方法がある。この方法は、　１９８６年２月１３日出願の同時係属米国特許出願第８２９．７１０号「リポソーム押出法」に開示されている。

あるいは、　ＲＥＶあるいはＭＬＶの調製には、その大きさが０．０４〜０．０８μｍの範囲にあることが特徴である小さい単ラメラの小胞を製造する方法がある。粒子サイズが小さいため、　ＳＵＶ懸濁液は視覚的に全く透明であり、従って眼への適用に有利である。５ＬＩＶのもう一つの有利な点は、上記で示唆されたように、粘膜表面上でのリポソームの密度が増すことであり。

これはより小さなリポソーム粒子により達成され得る。

ＳＵｖを製造するためのひとつの好ましい方法は、ミルクを均質にするための商業用の高圧ホモジナイザーを用いて、　ＭＬＶ調製物を均質にすることである。

ここで、　ＭＬＶ調製物はホモジナイザー中を循環するため、これを定期的にサンプリングして粒子サイズを測定し、　ＭＬＶが実質的にＳＵＶに転換する時点を決定する。この方法を実施例■で述べる。実施例■では。

常圧および高圧における均質化によるＭＬＶからＳＵｖへの転換が記載されている。

■、使用方法涙の出ない目の治療においては、上述の処方物は、流動性をよくするために眼の表面に付与され、必要に応じて、ビタミンＡおよび／または膜形成脂質が眼の組織に供給される。

この組成物は、眼の表面でのなめらかさおよび湿気の保持を増すのに充分な量および回数で付与される。

最適なリポソームの用量この処方物中のリポソーム濃度は、生成物の効能に直接影響を与え得る。提案されたリポソーム濃度０．４％（リン脂質０、３６２％、　ＢＤＳＡ　Ｏ，０５％）は、この濃度は目の表面に有効なリポソームの数の理論計算値およびウサギの目での保持力実験、そして、目への刺激の測定に基づいている。

眼の表面における単層リポソームに基づく計算ヒトの目の全表面積を推定すると、結膜および角膜を含めて約２０ｃｎｆであり、小さな単層リポソームは５０ｎｍであるので。

眼の表面をリポソーム単層で覆うには１．０Ｘ１０１２個の小胞が必要であると推測され得る。０．４％リポソーム処方物１回の点眼量２５μｌは、約３．７Ｘ１０′２個の小胞を有する。そのため。

１回の点眼により目の表面に単層のリポソームを飽和するためには、およそ４倍量過剰の小胞を供給すべきである。

上記の事柄から９本発明は、いかに種々の目的と特色とを達成するかがわかる。

本発明は、涙の出ない目に適用するための液状の組成物を提供し、この組成物は、脂質組成、キレート剤および静菌成分、そしてＰＪ濁液のｐＨの効能により、室温で数ケ月間貯蔵しても安定である。この生成物は、視覚的に透明に処方され得る。それはリポソームのサイズが小さく。

リポソームと高粘性ポリマーとがよく適合していることに関係する。

上記のような利点が、帯電リポソーム組成物において達成される。帯電リポソーム組成物は、目の組織への結合能が高められている。特に、リポソーム上の表面の帯電したアミン基および高粘性ポリマーの組みあわせにより、ポリマーを有さず電荷を持たないリポソームよりも目におけるリポソーム保持の力が３〜４倍高められる。

本発明の別の利点によれば、この組成物には、静菌剤が存在するため、目への刺激が減じられていることが示される。

この影響は、おそらく、リポソームが刺激がなく、かつ適当な静菌作用を提供し得る静菌剤のある割合を減らし得ることによる。

本発明の他の利点は、涙の出ない目に欠乏していることが知られているビタミンＡまたは膜形成性脂質のような親油剤を供給し得ることにある。

以下の実施例では９本発明のリポソーム組成物の調製法および使用法を例示する。しかし、これは本発明の範囲を制限するものではない。

れぞれアメリカンレシチンカンパ＝　−（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＬｅｃｉｔｈｉｎＣｏｍｐａｎｙ　；　Ａｔ１ａｎｔａ、　ＧＡ　）およびアサヒケミカルインダストリー（Ａｓａｈｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｃｌｕｓｔｒｙ、日本）から得た。塩化ベンジルジメチルステアリルアンモニウムは、アルトリ・ソチケミカルＣｏ、＜Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）から。

そして塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）は、ハーネスーヒンドＩｎｃ、　（Ｂａｒｎｅｓ−Ｈｉｎｄ、　Ｉｎｃ、、　５ｕｎｎｙｖａｌｅ、　ＣＡ）から得た。

本実施例は、サイズ調整した逆相蒸発小胞（ＲＥＶ　）の調製について記述しており、このＲＥＶは８０モル％の水素化大豆ホスファチジルコリン（ｔｌＰｃ　 ’）および２０モル％の塩化ベンジルジメチルステアリルアンモニウムを含有する。ＲＰＣの脂肪酸組成は２次のとおりである：　１６：　Ｏ（７，７％）　；　１８：　Ｏ（８５，３）；　１１２　（０，９％）　、　１８：　２　（０，７％）；および２０：　Ｏ／２０：　１（０，８％）。このように不飽和脂肪酸アシル残基の全割合は２．５％未満である。

上の脂質組成物の全部で８０ｍｇを、ジエチルエーテル１０ｒｎ　ｊ７に溶解させた。１３１リン酸、　１４０ｍＭ　ＮａＣ１を含有するｐＨ６，７の緩衝液を、有機溶媒に最終容量が１３ｍｆとなるように加えた。

そして、この混合物を室温またはそれを下まわる溶液の温度を維持しながら１時間音波処理することにより乳化した。エーテル溶媒を、室温にて減圧下で除去し、そして生成したゲルを上記緩衝液１〇−中にとり、激しく振盪した。得られたＲＥＶ懸濁液は、顕微鏡試験によって決定すると、約０．１〜０．２μｍの間の粒子サイズを有しており、主として１層のあるいは。

たった数層の二層ラメラを有する比較的大きな（１μｍより大きい）小・胞で形成される。

ＲＥＶは、０．２μｍのポリカーボネートフィルター（バイオラド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）から得た）を数回通すことによりサイズを調整した。押し出し圧力は約５０ｐｓ　ｉであった。押し出された小胞は、約０．２μｍおよびそれより小さい大きさのものが優先し９次に滅菌のために０．４５μｍの濾過膜で容易に濾過さ本実験では、多層ラメラ小胞をホモジナイズすることにより、小さな単ラメラ小胞を調製する方法を述べる。

水素化大豆ＰＣ（８０モル％）およびＢＤＳＡ　（２０モル％）の総量７．２ｇを５００艷の第３ブタノールに溶解させた。溶解した脂質／アミン組成物を凍結乾燥し１次に、　１３ｍＭＪン酸、　１４０　ｍＭＮａＣｌ、　０．０２％ＥＤＴＡを含有するｐＨ７，４の生理食塩緩衝液が脂質薄膜に加えられた。６０℃で２時間緩やかに振盪して形成したＭＬＶは、約０．０５〜２０μｍの間であって、異なる大きさを有し。

そして多層構造が優先する。

上記により得られる約１１のＭＬＶ　ｕ濁液を、ガラリンホモジナイザーモデル１５Ｍ　（Ｅｖｅｒｅｔｔ、　ＭＡ）にかけ、至適作動圧力である約９０００ｐｓｉで循環させた。ダイナミックレーザーによって粒子サイズの分析を行なうために多数回循環させた後。

その一部を回収した。粒子サイズの分布は、また、２％アガロースゲル（バイオゲルＡ４０Ｍ）カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィーによって調べられた。カラムから溶出されるリン脂質のプロフィールは、ボイドボリュームに含まれる大きい多層ラメラ小胞が、カラムに入り、ブロードなピークとして溶出される小さな単層ラメラ小胞にまでの変化することを反映している。

脂質懸濁液は、ホモジナイザーにより循環するため、小胞の平均粒子サイズは、徐々に小さくなる。カラムの溶出プロフィールに基づくと、　ＭＬＶの約６０％、７５％、８７％、および９０％がそれぞれ１０回、２０回、３０回および５０回の循環後には、　５ＵＶ（約０．０６μｍより小さい）に転換された。最終的な調製物は。

視覚的には、非常に透明であった。

同様のＭＬＶ懸濁液を、非常に高圧のホモジナイザー（フレンチプレッシャーセルホモジナイザー、モデルＪ４−３３３８．　ＳＬＭ−アミン：ｌ、　Ｕｒｂａｎａ、　ＩＬ）中で約２０．０ＯＯｐｓｉの圧力で作動させてホモジナイズすると、より小さなリポソームが得られ、そして、より視覚的な透明さが達成された。脂質小胞のわずかに約５％がＭＬＶからＳＵｖに完全に転換されなかったことがカラムの溶出により示された。

（以下余白）実施例■ 卵ＰＣ８０モル％、および２０モル％のＢＤＳＡを含有するＳＵＶ。

および卵ＰＣのみを含有する対照のＳＵｖを、実施例Ｈのようにして調製した。

両調製物は１００ｎモルの脂質あたり約１０５カウント／分（ＣＰＭ）の”ｌ− ＰＥを含有していた。両調製物におけるＳＵｖの最終濃度は、約１０μモル脂質／ｒｄであった。

インビボでの眼における保持力の研究は、ウサギ目でシンチレーションプローブ法を用いて行なった。各実験では、約１００ｎモルの脂質および＋２５１標識したＰＥ　１１０５ｃｐを含有するリポソーム１０μｌを、ウサギの目に付与した。保持力は、ウサギの目の上に配置されたガンマプローブで評価した。このプローブをプレキシグラススリーブホールダーに固定することにより、目とプローブとの間を２ｃｍの一定間隔とした。１７８インチ厚の鉛隔壁を、兎の涙を分泌する器官の涙液鼻腔領域に置いた。この隔壁は、鼻涙領域に排出される放射性物質を。

効果的に遮断する。保持時間は、他に指示されていない限り。

１時間にわたって追跡された。チャートの記録から、ピークの高さが読みとられた。全放射活性の値は、放射活性リポソームの標準希釈液のインビトロ測定による標準曲線から、算出された。保持率（％）は、最初の１０μｌ試料の１分間あたりのカウント数（ＣＰＭ　）に基づいて、計算された。

保持率は、２．　５．１０．１５．３０．３０．４５．および６０分後に測定された。２つのＳＵｖ調製物の保持時間を第１図に示す。

第１図において、　ＢＤＳＡ　ＳＵＶを黒丸で、そして対照のＳＵｖを白丸で表わす。全ての値は４匹のウサギの目の測定値の平均である。この図かられかるように中性の５ＬＩＶ　（黒四角）は、１時間後にはわずか７％保持されたにすぎなかった。これに比較して、　ＢＤＳＡリポソームは１時間後に約２０％保持された。

８０モル％の卵ＰＣおよび２０モル％のりシニルホスファチジルエタノールアミン（リシニルＰＥ）を含有するＳＵｖを、実施例■に従って調製した。リシニルＰＥは、アミド結合によってリジンのカルボキシル基に遊離のＰＨのアミンをカップリングすることによって形成されるアミン誘導体ＰＥであり、詳しくは。

上記に引用された特許出願「眼用リポソーム」に開示されている。ＳＵｖ調製物の一部を０．８％ヒドロキシメチルセルロースおよび０．２％ポリビニルアルコールを含有するポリマー溶液の等容量と混合し、残り（対照）を等容量の緩衝液と混合した。

両懸濁液は、実施例■に記述のように、眼における保持力をテストした。得られた結果を第２図に示す。時間毎の点は。

４匹の動物について得られた結果の平均値を表している。第２図では、ポリマー含有ＳＵｖを白丸で、そして非ポリマ−リポソームを黒丸で表した。ここでわかるように、帯電したリポソーム懸濁液中にポリマーが存在することによって、１時間のテスト期間にわたって、保持力が有意に増大した。

実施例■ 脂肪酸におけるカルボキシル基のｐＫ、は、約５である。中性ｐＨでは、脂質の加水分解（後述の実施例■）によって生成する遊離の脂肪酸はイオン化され、負に帯電する。正に帯電したリポソームの眼における保持力は、中和されるために減衰する。

部分的に加水分解されたリポソームの目における保持力に対する影響を決定するために、実施例Ｈに記述したように調製したＢＤＳＡ　ＳＵＶを、０モル％、１０モル％あるいは３０モル％の遊離脂肪酸およびリゾリン脂質（Ｉｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）を含有するように処方された。このＳｔ＋ν懸濁液は、実施例■および■で述べたウサギの目のモデルで評価された。この実験の結果を第３図に示す。第３図では遊離脂肪酸をそれぞれ０モル％（黒丸）、１０モル％（黒三角）および３０モル％（白丸）含有するＳＵＶの保持力をプロットした。このデータは、１時間にわたってリポソームの保持力が脂肪酸およびリゾリン脂質の含量には影響されないことを示している。

実施例■で記述のように調製したＳＵｖの構造安定性は、示差走査熱量測定法によって評価された。第４図で示すように。

ＰＣおよびＢＤＳＡはそれぞれ単独で、約５２℃および３４℃で特徴的な吸熱転移を行う。混合したリポソーム処方物においては。

ＰＣおよびＢＤＳＡのペアレント転移ピーク（ｐａｒｅｎｔ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｐｅａｋ）はなくなり、４５℃で新たな吸熱転移を示した。凍結（−３４℃ ）および加熱（７０℃）を繰り返すことによって、相転移のプロフィールは変化しなかった。相分離は高温でも低温でも観察されなかったので、この結果により、ＰＣおよびＢＤＳＡが約４＝１のモル比で調製されたリポソームは、構造的に安定であることが示される。

（以下余白）実施例■ 実施例■と同様にＰＣ：ＢＤＳＡを４：１のモル比で含有するＳＵｖをｐ）１６．０．６．８．７．４および８．０に調整したリン酸緩衝液中で調整した。４つの調製物をすべて実施例■のポリマー溶液と混合した。この４つの調製物はｐＨおよび脂質加水分解を決定するためにそれぞれの時間でサンプルを取り出しながら５日間７０℃でインキュベートした。

溶媒のｐＨは、この５日間を通して、３つの最低Ｐ）Ｉの懸濁液においてほんのわずかに影響があっただけである。ｐＨ８の懸濁液は５日間のテスト期間にわたり最終ｐＨが約７．５まで落ちた。ｐＨ変化はおそらく遊離脂肪酸の生成、および溶媒中のポリビニル酢酸の存在による遊離酢酸の生成に起因したものである。

リゾリン脂質および遊離脂肪酸の生成を引きおこす脂質加水分解の程度は後述の実施例■に記述のように決定された。

その結果を第５図に示す。第５図では白玉角はｐＨ６，０での加水分解を表しており、黒三角はｐＨ６、８，白丸はｐＨ７，４，黒丸はｐＨ８，０での加水分解をそれぞれ表している。このように。

加水分解の程度はテストされたｐＨ範囲内でｐＨに対し非常に影響を受けやすい。

ｐＨ６，７の１３ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液および２６ｍＭのリン酸緩衝液中で調製された２種のＳＵＶ懸濁液については、逆滴定法を用いてその緩衝能をテストした。両緩衝液は、脂質の７０％より多くが加水分解されたときの有意なｐＨの降下（ｐＨ単位で０．２を越える）を充分に防いだ。

実施例■において、調製された２種のＳｏｌν懸濁液は、　ｐＨ６，８６あるいは、さらに至適なｐＨであるｐ）１６．７０に調製して処方された。両処方物は、防腐剤を添加せずに）ＩＰＣ／ＢＤＳＡ　リポソームおよび実施例■のポリマーで構成された。サンプルは、４℃、３０℃および３８℃で殺菌状態下、キャップしたポリエチレンチューブ中に保管した。脂質の加水分解が主に安定性に関係するようなので、リン脂質の加水分解は２つの異なる分析法、即ちＴＬＣ濃度計走査法および直接リン酸法（最近ＬＴＩで開発された）によって厳密に評価された。両リポソーム調製物では。

ポリマーとリポソームを混合後、凝集物が速やかに現れた。

数日放置すると沈澱が生じた。主にリポソームを含有する沈澱物は、緩やかに混合すると、容易に再懸濁する。分散溶液は半透明な白色をしており、数時間にわたって静まらなかった。光学顕微鏡観察によるとリポソームは、直径が数ミクロンの小さな凝集物として現れた。凝集物を作る傾向は９種々の温度で４．５ケ月貯蔵したのちも変わらなかった。貯蔵期間中９色の変化は見られず、サンプルはすべて無臭のままであった。わずかなｐＨ降下がほとんどのサンプルで認められ、この変化は温度依存性であった。

ｐＨの変化は、脂質分解の結果として生じる遊離脂肪酸の生成（上記参照）というよりむしろ、ポリマー中に不純物として存在するポリ酢酸ビニルの分解によると考えられる。

ＴＬＣスキャニング法で得られた値は、一般には直接リン酸法で得られる数字より低い値を示した。ｐＨ６，８６のＳＵｖは、４℃、３０℃および３８℃で４．５ケ月貯蔵すると、それぞれおよそ１．９％、６．７％、および１２．７％の脂質加水分解を示した。ｐＨ６，７のＳ［ＪＶでは１分解速度がより遅いことが観察された。

Ｂ、室温での１８ケ月後の加水分解の予想値加水分解の予想値を評価するためにアレニウス方程式を適用した。直接リン酸法から得られた加水分解のデータを用いて１種々の温度（Ｔ）における分解速度（Ｋ）が次式に従って計算された：第６図はＩ／Ｔに対するＫの対数（Ｉｎ　Ｋ）のアレニウスプロットを表している。３０℃およびｐ）１６．８６でのリン脂質の加水分解の一定速度（ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｒａｔｅ）は、１．２％／月であると評価される。貯蔵期間を通しての加水分解の速度が同じであると仮定すると、１８ケ月の終わりまでに２１．６％の加水分解が生じる。加水分解は直線関数というよりむしろ指数関数的である（第５図）ので、実際の加水分解はこの予想を下回るべきでＳＵｖの中のＢＤＳＡおよびＢＡＣによって生じる目への刺激眼への処方におけるＢＤＳＡの許容値を決定するために、　ＢＤＳＡを０．０１％および０．０５％含有するＳＵＶ懸濁液がドライズラビットの目の刺激テストおよびインビトロの細胞毒性実験によってテストされた。急性角膜毒性に対するマウスのモデル（Ｍａｕｒ　１ｃｅ）もまた、　ＢＤＳＡおよびＢＡＣに起因する目への刺激を評価するために用いられた。

ＢＤＳＡを含有する両リポソーム処方物は、単一の局所適用で番まこのウサギの目に何の刺激も与えなかった。

ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙ）は、０．０１％ＢＤＳＡを含有する上記の１ノポソーム処方を用いて行われた。０．０１％塩化ベンザルコニウムを含有するハーネスーヒンド　カンフオート　テイアーズ（Ｂａｒｎｅｓ−Ｈｉｎｄ　ｃｏｍｆｏｒｔ　Ｔｅａｒｓ”　）が対照として用いられた。鈍鋸歯状化、空胞化、細胞単層の不均一化、および細胞溶解のような細胞変性の変化に基づくと、塩化ベンザルコニウムを含有する二種のサンプルはリポソーム処方物よりも細胞毒性があることがわかった。

緩衝液中で、あるいはリポソーム中で処方された４つの値のＢＤＳＡはマウスの刺激モデルでテストされた。このテストでは、テスト化合物投与後の螢光染色剤、つまりスルフオルホダミンの角膜透過性が測定される。眼の螢光がＢＤＳＡ濃度の関数として観察される。このテストの結果を、第７図に示す。

第７図では遊離のＢＤＳＡは白丸で、そしてリポソームのＢＤＳＡは黒丸で表される。この図かられかるように、遊離のＢＤＳＡが０．００１％から０．１％まで増加すると染色剤の浸透性が増すが、リポソームの形態でのＢ［ｌＳＡでは染色剤の浸透性に何の変化もない。

同様の結果が０．００１％および０．０１％の塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）を用いても認められ、この結果もまた第７図にプロットした。第７図で白玉角は遊離のＢＡＣを、そして黒三角はリポソーム形態のＢＡＣを表している。

目に対する刺激におけるリポソーム接触時間の影響を評価するために、目への刺激に対する上記染色剤浸透性テストで。

染色剤を付与する４５〜６０分前に、リポソームを一滴、−匹のマウスに点眼した。第２の目に生理食塩水を一滴点眼し、対照として用いた。６匹のマウスにおいて螢光の測定をすると。

染色剤の浸透性には、何ら違いを示さず（４５±１０ｍＶ対５１±１７ｍＶ）　、これはＢＤＳＡ　ＳＯνを目に接触させても全く刺激がないことを示す実施例 ■の実験を支持した。

インビボでのリポソームの眼における飽和値を決定するために、実施例■と同様に１０μｍ２　ＢＤＳＡ　５ＩＩＶを１２５１−脂質で標識して複数の用量で調合し、１時間毎にウサギに点眼した。点眼後１時間において目に残留して放射能を、シンチレーションプローブ法で測定した。第８図に示すように、保持されるリポソームは点眼を繰り返すに従って徐々に増し、５回点眼を行うと飽和した。

眼に付与される一滴の平均量は、約２５μｌであるので、２Ｘ２５μｌの量の点眼を行うことによって飽和が達成され得るといえる。

本発明は、より好ましい特定の実施態様および使用を組み合わせて記述してきたが９本発明から外れることなく種々の改変および修飾がなされ得ることが明らかである。

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Claims

【特許請求の範囲】１．涙の出ない目を治療するためのリポソーム組成物であって，（ａ）ｐＨが約６．２と６．７との間に調整された水性媒体；（ｂ）該水性媒体中に分散したリポソームであって，その小胞形成脂質が実質的に飽和したリボソーム；および（ｃ）該リポソームの脂質二重層内に含有され，少なくとも１２個の炭素原子からなる脂肪族炭化水素鎖を有する，１０〜４０モル％の第四級ベンジルアミン，を含有するリポソーム組成物。２．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，前記リポソームは，主として約０．０２〜０．０８ミクロンのサイズ範囲内にある。３．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，前記リポソームおよびアミンは，該組成物の約０．０２〜０．０８重量を構成する。４．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，前記小胞形成脂質は約６０〜９０％の飽和した中性リン脂質を含有する。５．６０％〜９０％の水素化ホスファチジルコリンを含有する，請求の範囲第４項に記載の組成物。６．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，前記アミンは，１５〜２０個の炭素原子からなる飽和脂肪族鎖を有するベンジルジアルキルアンモニウム塩である。７．請求の範囲第６項に記載の組成物であって，該組成物は，１５％〜３０％のべンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリドと，約７０〜８５モル％の水素化ホスファチジルコリンとを含有する。８．前記組成物の粘度を実質的に増大させる濃度で，さらに高分子量ポリマーを含有する，請求の範囲第１項に記載の組成物。９．請求の範囲第８項に記載の組成物であって，前記ポリマーは，ヒドロキシエチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，メチルセルロース，ポリビニルピロリドン（ｐｏＩｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｊｄｏｎｅ），およびポリビニルアルコール，ならびにこれらの混合物からなる群から選択される。１０．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，前記水溶液中のリポソーム濃度は約０．０２重量％と０．０４重量％との間である。１１．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，前記リポソームは約１〜１０モル％のビタミンＡを含有する。１１．さらに静菌剤を含有する，請求の範囲第１項に記載の組成物。１２．請求の範囲第１１項に記載の組成物であって，前記静菌剤は約０．００４％と約０．０１％との間の濃度の塩化ベンザルコニウムである。１３．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，前記静菌剤はカルシウムイオンキレート剤を包含する。１４．涙の出ない目を治療するためのリポソーム組成物であって，ｐＨが約６．２〜６．７に調整された水性媒体；該水性媒体中に分散した，直径が約０．２μｍより小さいリポソームであって，その小胞形成脂質が，約１０モル％と３０モル％との間のベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド，および約７０モル％と９０モル％との間の飽和したホスファチジルコリンを有するリポソーム；ヒドロキシエチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，メチルセルロース，ポリビニルピロリドン（ｐｏＩｙｖｉｎｙｌ−ｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ），およびポリビニルアルコール，ならびにこれらの混合物からなる群から選択される，約０．０２〜０．０６重量％の間のポリマー；および水溶性のカルシウムイオンキレート剤，を含有するリポソーム組成物。１５．涙の出ない目を治療する方法であって，眼球表面における保持力を高めるために処方されたリポソームの水性懸濁液を提供すること；および眼球表面を被覆する水性リポソームマトリックスを形成するのに充分な量で，該懸濁液を眼球表面に塗布すること，を包含する治療方法。１６．請求の範囲第１５項に記載の方法であって，前記懸濁液は次の（ａ），（ｂ），（ｃ）．および（ｄ）を含有するように処方される：（ａ）ｐＨが約６．２と６．７との間に調整された水性媒体；（ｂ）該水性媒体中に分散したリポソームであって，その小胞形成脂質が実質的に飽和した，リポソーム；（ｃ）該リポソームの脂質二重層内に含有され，少なくとも１２個の炭素原子からなる脂肪族炭化水素鎖を有する，１０〜４０モル％の第四級ベンジルアミン；および（ｄ）カルシウムイオンキレート剤。