DE69813287T2

DE69813287T2 - Lipidzusammensetzungen und deren verwendung

Info

Publication number: DE69813287T2
Application number: DE69813287T
Authority: DE
Inventors: Steven Warlingham LEIGH
Original assignee: Phares Pharmaceutical Research NV
Current assignee: Phares Pharmaceutical Research NV
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2018-12-09
Also published as: DE69813287D1; GB9725946D0; EP1035837A2; GB2331924A; WO1999029301A2; EP1035837B1; WO1999029301A3

Description

Einleitung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Lipid-Zusammensetzungen, zum Beispiel Zusammensetzungen, welche auf die Schleimhaut als Schmerzlinderungsmittel, Schutz- oder Gleitmittel oder für Träger von Medikamenten in Molekular-Dispersion angewandt werden können.
Probleme bei der Zuführung von Anti-Pilz-Mitteln und anderen hydrophoben Medikamenten
Hefen befinden sich normalerweise harmlos auf oder im menschlichen Wirt, jedoch können sie bei Gelegenheit einen Vorteil aus Schwächen und Erkrankungen des Wirtes ziehen, wodurch sie Infektionen bei einer bemerkenswert breiten Auswahl an feuchten membranartigen Geweben verursachen. Solche Infektionen werden üblicherweise unter dem gattungsspezifischen Namen Candidiasis beschrieben. Die häufigsten Candidiasis-Infektionen sind oberflächliche Schäden, insbesondere Infektionen der mukösen Oberflächen des Mundes oder der Vagina. Orale und vaginale Formen von Candidiasis sind allgemein als "Soor" bekannt. Derartige Leiden können normalerweise wirksam mit herkömmlichen topischen Anti-Pilz-Präparationen behandelt werden.
Mit der zunehmend weitverbreiteten Anwendung von Antibiotika, immununterdrückenden und cytotoxischen Arzneimitteln jedoch, können diese normalerweise relativ wenig bedeutenden Infektionen wesentlich ernster werden. Dies ist insbesondere bei der steigenden Zahl von Patienten mit Erkrankungen wie dem erworbenen Immunschwäche-Syndrom, wo der normale immunologische Schutz des Patienten schwer beeinträchtigt ist, der Fall. Die geringe biologische Verfügbarkeit der aktiven Bestandteile in herkömmlichen Formulierungen bedeutet, daß diese im allgemeinen suboptimal angewandt werden, und daß deshalb ein dringender Bedarf nach effektiven Zuführungssystemen besteht, welche für den Patienten angenehmer und zweckmäßiger einzusetzen sind.
Es gibt viele derzeitige Forschungen hinsichtlich effektiverer Schleimhaut-Arzneimittelabgabesysteme zur Behandlung von Pilzinfektionen. Das Hauptproblem liegt zum Ersten in der Natur der meisten Anti-Pilz-Mittel und zweitens im zu behandelnden Areal. Anti-Pilz-Wirkstoffe sind meistens lipophile Moleküle mit sehr geringer wäßriger Löslichkeit, was die Abgabe des Arzneimittels an das umgebende Milieu beschränkt. Dies führt zu beträchtlichen Problemen im Hinblick auf die Wahl eines geeigneten Trägers, in welchem der aktive Bestandteil in einer leicht verfügbaren Molekular-Dispersion formuliert werden kann und danach örtlich eine ausreichende Konzentration in Gegenwart natürlicher Sekretionen beibehalten kann.
Intensive Bemühungen sind auf die Lösung dieser zwei Probleme gerichtet worden unter Zuhilfenahme von (a) der Verwendung von Lösungsmitteln zur Solubilisierung der Verbindung oder (b) der Erhöhung der Schleimhaut- bzw. Mukoadhäsion zur Verlängerung des Kontaktes und der Freigabe des aktiven Bestandteils an die Schleimhautoberflächen. Eine verbesserte Muko-Adhäsion kann erhalten werden unter Verwendung von wasserlöslichen Hydrokolloiden (z. B. Carboxymethylcellulose), Polymeren (z. B. Carboxyvinyl-Copolymere) und natürlichen Gummis (z. B. Natriumalginaten) zur Bildung viskoser Gele, welche auf die Schleimhautoberflächen aufgebracht werden. Alternativ dazu werden die Hydrokolloide einfach in einer nicht-wäßrigen Basis dispergiert. Beim Aussetzen an Wasser quellen diese Materialien und vermitteln gewisse mukoadhäsive Eigenschaften an die Basis.
Diese Vorgehensweisen bieten, obgleich sie den Kontakt verlängern und das Potential für den Transfer des aktiven Bestandteils zu den Schleimhaut-Membranen erhöhen, dennoch einen begrenzten Nutzen wegen der lipophilen und geringen wäßrigen Löslichkeit der meisten Anti-Pilz-Verbindungen. In der Realität ist nur ein kleiner Gehalt des Arzneimittels in wäßriger molekularer Lösung für die Absorption verfügbar, und das Reservoir von ungelöstem Arzneistoff wird kaum mobilisiert. Ethanol und andere organische Lösungsmittel werden häufig in kleinen Mengen in den Formulierungen verwendet, um die Löslichkeit zu verbessern. Die Wirksamkeit solcher Präparationen für die topische Anwendung ist jedoch durch die Tendenz des Speichels und anderer Körpersekrete begrenzt, die gelösten Verbindungen zu präzipitieren. Für eine angemessene Solubilisierung werden deshalb größere Mengen an organischen Lösungsmitteln und/oder Tensiden erfordert. Dies kann seinerseits Probleme erzeugen, weil der Gehalt der aus solchen Formulierungen freigegebenen aktiven Verbindung aufgrund ungünstig hoher Partitions-Koeffizienten nicht ausreichend sein kann. Darüber hinaus sollte die Formulierung, um nützlich zu sein, Komponenten enthalten, welche nicht-toxisch, nichtsensitivierend und nicht-reizend sind, speziell bei entzündeten und empfindlichen Schleimhaut-Membranen. Vorzugsweise sollte sie Komponenten aufweisen, welche natürlicherweise mit Schleimhautoberflächen kompatibel sind. In der Praxis genügen die meisten Lösungsmittel und künstliche Tenside, welche wenig lösliche lipophile Verbindungen wirksam solubilisieren können, diesen Anforderungen nicht. Eine ideale Formulierung wäre ein natürlicher Träger, welcher in dem Milieu in der Nähe der Infektion verbleibt und das Arzneimittel in molekularer Lösung abgibt.
Amphotericin wird als eines der wirksamsten Anti-Pilz-Mittel angesehen. Es sind wenige Fälle von Resistenz gegen Amphotericin berichtet worden. Allerdings schränkt seine Nephrotoxizität seine Anwendung in der topischen Behandlung von mukosalen Pilzinfektionen im allgemeinen ein, falls es als Gurgelmittel oder Tablette verabreicht wird. Es wird nur bei ernsten systemischen Infektionen, welche nicht auf herkömmliche Anti-Pilz-Mittel ansprechen, intravenös verabreicht.
Die Verwendung von Liposomen zum Einschluß bzw. Einfangen von wasserunlöslichen/lipophilen Molekülen und somit zur Zulassung der Abgabe von höheren effektiveren Dosierungen, ist gründlich untersucht worden. Ein Grund für die Reduktion der Toxizität von Amphotericin in Lipid-Trägern kann auf einer Assoziation mit dem Lipid beruhen, wodurch die Menge des freien Arzneimittels, welches toxischer ist, verringert wird. Die Umsetzung dieser Vorteile in die Praxis, um die weitere und wirksamere Anwendung von Amphotericin zu ermöglichen, hat sich jedoch als schwieriger erwiesen.
Wie nachstehend ausführlich geschildert, ist eine Reihe von Vorgehensweisen zum Liposomen/Lipid-Einschließen von Amphotericin für die intravenöse Behandlung von systemischen Pilzinfektionen offenbart worden. Diese Vorgehensweisen haben sich jedoch wegen ihrer Anforderung nach kostspieligen Lipiden als zu kostspielig für den routinemäßigen und weitverbreiteten Einsatz erwiesen. Darüber hinaus sind die Herstellungskosten hoch, wobei große Volumina an Lösungsmitteln, Verdampfungs-, Lyophilisierungs- und spezialisierte Verarbeitungseinrichtungen erfordert werden. Deshalb wäre es von beträchtlichem Vorteil, die Komplexität und die Kosten zu verringern, wodurch zugelassen wird, daß Amphotericin (und andere lipophile Verbindungen) noch routinemäßiger bei der Behandlung von Erkrankungen verwendet wird.
Die EP-A-0317120 beansprucht eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Solubilisierung eines wenig löslichen amphiphilen Arzneimittels, z. B. Amphotericin, durch Bilden eines Komplexes mit einem geladenen Lipid, Phosphatidylglycerin (PG), in einem angesäuerten organischen Lösungsmittel bei einem pH zwischen 1 und 3. Der Komplex kann in Liposomen eingebracht werden, welche für die Langzeit-Aufbewahrung gefriergetrocknet werden können. Die gefriergetrocknete Zusammensetzung wird vor der Verabreichung mit wäßrigem Puffer re-hydriert. Es wird behauptet, daß dieses Verfahren eine hohe Lipid-Amphotericin-Assoziation ergibt, wodurch gestattet wird, daß höhere Dosierungen an Arzneimittel intravenös verabreicht werden können.
Die US-A-5180713 beansprucht ebenfalls eine gefriergetrocknete Amphotericin-Zusammensetzung, hergestellt aus dem Lyophilisieren einer Liposomen-Amphotericin-Suspension mit einer vorherbestimmten Größenverteilung zwischen 0,2 bis 0,5 μm in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels, z. B. eines Disaccharids, Trehalose. Es wird behauptet, daß der Einschluß von Trehalose die Größe der Liposomen bei der Rekonstituierung mit wäßrigem Medium erhält, wodurch die Langzeit-Aufbewahrung der gefriergetrockneten Präparation erlaubt wird.
Die EP-A-0282405 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen für nicht-liposomale Lipid-Komplexe, gebildet aus Assoziationen zwischen toxischen hydrophoben Arzneistoffen, wie Amphotericin B, und Kombinationen von Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) bei einem Molverhältnis von etwa 7 : 3.
Die EP-A-0 648 494 betrifft eine Rapamycin-Formulierung zur oralen Verabreichung. Ein typisches Verfahren für die Herstellung der Formulierung besteht aus den folgenden Verfahrensschritten:

– zuerst wird Rapamycin in einem nicht-wäßrigen Lösungsmittel (N,N-Dimethylacetamid) gelöst;
– in einem zweiten Schritt wird Polysorbat 80 zugesetzt;
– schließlich wird die Zusammensetzung mit Phosal 50 PG^©-Lecithin und Propylenglycol auf das Endvolumen eingestellt.

Obgleich das Verfahren von EP-A-0 648 494 eine Lösung oder Emulsion von Rapamycin mit einem amphiphilen, membranbildenden Lipid herstellen kann, befindet sich das Arzneimittel nicht in Molekular-Dispersion in den Doppelschichten von Membranlipiden. Das Verfahren, wie es in der EP-A-0 648 494 offenbart ist, erfordert ein zusätzliches Tensid (Polysorbat), um die biologisch aktive Komponente zu tragen. Es muß angemerkt werden, daß Polysorbate keine doppelschichtbildenden Membranlipide sind. Tatsächlich ist es bekannt, daß Polysorbate sogar häufig Doppelschichten zerstören.
Der Stand der Technik enthält eine große Zahl von Berichten über die klinischen Vorteile von Lipid-Amphotericin-Assoziationen. Die kleinere Anzahl von Veröffentllichungen betreffend Zusammensetzungen und Verfahren der Herstellung erfordern alle im wesentlichen geladene Lipide mit hohen Phasen-Übergangstemperaturen, z. B. Di-palmitoyl-phosphatidylglycerin (DPPG), kombiniert mit neutralen Lipiden, z. B. Di-myristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Di-palmitoylphosphatidylcholin (DPPC). Das negativ geladene Lipid bildet Komplex mit ionisiertem Amphotericin bei niedrigem pH.
Verwendung der vorliegenden Lipid-Zusammensetzungen zur Solubilisierung von wasserunlöslichen und lipophilen Verbindungen Die vorliegende Erfindung beschreibt einen neuen Ansatz in Hinsicht auf die Probleme bei der Verwendung von Membranlipiden für die Solubilisierung und Herstellung von Lipidbasierenden Zusammensetzungen, welche wasserunlösliche und lipophile Verbindungen im allgemeinen und Anti-Pilz-Mittel im besonderen enthalten. Das offenbarte Verfahren ist einfach, effektiv und kostengünstig in die Praxis umzusetzen. Darüber hinaus besitzt es den Vorteil der Verwendung von Membranlipiden oder von Monoacryl-Derivaten davon, welche kompatibel mit natürlichen Membranoberflächen und nicht schädlich sind. Vorteilhafterweise verleihen die in der Erfindung verwendeten Membranlipide der aktiven Verbindung verbesserte chemische und physikalische Stabilität und ermöglichen eine verlängerte Aufbewahrung unter angemessenen Bedingungen. Die resultierenden Zusammensetzungen zeigen überraschenderweise eine verstärkte biozide Aktivität im Vergleich mit herkömmlichen Formulierungen derselben Verbindung bei ähnlichen Konzentrationen.
Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, wie in Anspruch 1 definiert, vorgeschlagen, wobei das Verfahren die in diesem Anspruch dargestellten aufgeführten Schritte einschließt.
Das vorliegende Verfahren gestattet, die Einbindung einer lipophilen Verbindung, z. B. eines Fungizids, in Lösung oder Dispersion, in ein Lipid, wobei das Lipid in der Form von solvatisierten Doppelschichten in einem im allgemeinen wasserfreien organischen Medium vorliegt. Es versteht sich, daß der Begriff "wasserfrei", wie hierin verwendet, nicht die Gegenwart kleiner Mengen an Wasser und diejenigen Mengen an Wasser ausschließt, welche in Bestandteilen wie Ethanol und Glycerin getragen werden, und welche schwierig oder kostspielig voll-ständig zu entfernen sind.
Das vorliegende Verfahren ermöglicht, daß lipophile, biologisch aktive Materialien in Membran-Lipid in einer Form eingebunden werden, welche sich bei Zugabe oder Aussetzen an ein wäßriges Medium zu Liposomen, Micellen oder verwandten Strukturen mit einer hohen Einschließung umwandelt. Es sollte betont werden, daß die Bildung von Liposomen kein wesentliches Merkmal der gebildeten Zusammensetzung ist. In manchen Fällen, abhängig von der Natur der aktiven Verbindung und/oder der Wahl des verwendeten Lipids können die Zusammensetzungen zur Bildung einer oder mehrerer Lipid-Strukturen, wie Micellen oder gemischten Micellen führen. Der Typ von gebildeten Lipid-Strukturen könnte auch vom Ausmaß der Verdünnung, dem Verdünnungsmedium und der Gegenwart anderer Komponenten, welche in unterschiedlichen Anwendungen angetroffen werden, abhängen. Das bedeutende Merkmal besteht darin, daß die lipophile Verbindung im wesentlichen durch das Lipid solubilisiert bleibt, wenn die Zusammensetzungen mit wäßrigen Fluiden verdünnt werden.
Ein hauptsächliches Anliegen der Erfindung besteht darin, Zusammensetzungen vorzusehen, welche direkt auf Schleimhautmembranoberflächen angewandt werden können. Die Umwandlung von geballten doppelschichtigen Strukturen zu letztendlichen diskreten Lipidstrukturen findet in situ statt, wobei endogene Körperfluide oder -sekretionen verwendet werden. Alternativ dazu kann die Umwandlung beim einfachen Verdünnen mit externem wäßrigem Medium, vor der Anwendung, stattfinden. In beiden Fällen werden hohe Konzentrationen der biologisch aktiven Verbindung in den resultierenden Lipidstrukturen solubilisiert werden. Deshalb kann die Abgabe der aktiven Verbindung an die Schleimhautinfektion in großem Maße verstärkt werden.
Die Zusammensetzungen können für die nachstehend angegebenen Zwecke auf die nachstehendangegebenen Örtlichkeiten angewandt bzw. aufgebracht werden.

(a) Mund-, Backenschleimhaut zur Linderung von Mundgeschwülsten;
(b) Vaginalschleimhaut zur Linderung, als Schutz oder als Gleitmittel;
(c) Rektalschleimhaut zur Linderung von Hämorrhoiden;
(d) ein Stoma bzw. eine Mundöffnung zum Schutz und/oder zur Schmierung;
(e) eine chirurgische Vorrichtung oder einen Handschuh als Gleitmittel;
(f) Magenschleimhaut.

Sie sind resistent gegenüber Mikrobenwachstum und können ohne zugesetztes Konservierungsmittel verwendet werden. Sie weisen vorzugsweise einen pH-Wert von 5–7,5 auf. Die Zusammensetzungen können als solches verwendet werden, oder sie können mit Wasser oder einer wäßrigen Flüssigkeit vor der Verwendung gemischt werden, z. B. um eine Spülung oder ein Gurgelwasser herzustellen.
Die gemäß dem vorliegenden Verfahren hergestellten Zusammensetzungen umfassen mindestens ein Membranlipid und/oder Micellen-bildendes Lipid, dispergiert in einem wasserfreien hydrophilen Medium, bestehend aus einer Mischung einer ersten Flüssigkeit (z. B. Ethanol) zur Bildung einer molekularen Dispersion des aktiven Bestandteils innerhalb der Lipid-Komponente und einer zweiten Flüssigkeit (z. B. Glycerin), mischbar mit der ersten organischen Flüssigkeit, zur Ausfällung des Membran-Lipides als Doppelschichten. Mindestens eine der ersten und zweiten wäßrigen Flüssigkeit kann wassermischbar sein, und vorzugsweise sind sie beide wassermischbar. Aktive Bestandteile (z. B. hydrophobe biozide Mittel, Steroide, cytotoxische Verbindungen, Immunmodulatoren oder Immununterdrückungsmittel) werden zwischen diesen Lipid-Doppelschichten und der hydrophilen Flüssigkeitsphase partitioniert bzw. geteilt. Die Zusammensetzungen werden normalerweise in der Form eines Gels vorliegen, dessen Viskosität von den relativen Anteilen der Bestandteile abhängig ist.
Durch das vorliegende Verfahren hergestellte Zusammensetzungen können vier Hauptkomponenten umfassen:

(a) mindestens ein Membran-Lipid, oder ein Gemisch eines Membran-Lipides und eines Micellen-bildenden Lipides;
(b) einen oder mehrere aktive Bestandteile;
(c) mindestens ein pharmazeutisch zugelassenes Lösungsmittel für das Lipid; und
(d) mindestens eine hydrophile organische Flüssigkeit, welche die Ausfällung von Lipid-Doppelschichten verursachen kann.

Jedwedes) Membran-Lipid oder Kombination von Membran-Lipiden, fähig zur Bildung von Lipid-Doppelschichten kann als die Komponente (a) verwendet werden. Bevorzugte Lipide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Eidotter-Lecithin, Sojabohnen-Lecithin, Phospholipide (z. B. Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidsäure (PA) und Sphingomyelin), Glycolipide, Cerebroside, Ganglioside und ihre Lyso-Derivate, z. B. Enzym-modifizierte Monoacyl-Derivate, ein. Wo es die Verwendung vorschreibt, können auch Mischungen von modifizierten Lipiden, wie hydroxyliertes und acetyliertes Phospholipid, verwendet werden. Für eine spezialisierte Anwendung, wie in Arzneimittel-Targeting-Anwendungen, können die Lipide auch in der Form von Derivaten (z. B. mit Polyoxyethylen-Ketten) vorliegen, um die Vesikel robuster zu machen. Monoacyl-Lipide können aus Glycolipiden, Sphingolipiden oder anderen Micellen-bildenden Lipiden abgeleitet sein und können aus natürlichen pflanzlichen, tierischen oder mikrobakteriologischen Quellen stammen, oder sie können synthetisiert oder zum Teil synthetisiert sein, z. B. von Polyethylenglycol (PEG) abgeleitete Monoacylphospholipide, z. B. pegalatiertes Monoacylphosphatidylethanolamin. Vorzugsweise umfaßt das Lipid zwei oder mehr Membran-Lipide. Mischungen von Lipid, welche allgemein als Lecithine bekannt sind, werden bevorzugt. Sie können natürlich oder synthetisch, hydriert, teilweise hydriert oder ungesättigt sein. Sie können von tierischem, Enzym-modifizierten oder pflanzlichen Ursprung sein. In der Praxis werden handelsübliche Mischungen aus Lecithinen und Enzym-modifizierten Lecithinen, welche mindestens 95% der Gesamtlipide enthalten, von denen die Hauptkomponente mindestens 40% Phosphatidylcholin ist, bevorzugt. Die Menge an verwendetem Lipid hängt von den aktiven Bestandteilen ab und sollte ausreichend sein, um sicherzustellen, daß es in mole kularer Dispersion vorliegt. Im allgemeinen ist etwa 50% die höchste Menge, welche erforderlich sein sollte, obwohl größere Mengen verwendet werden können, falls notwendig. Der übliche Bereich beträgt zwischen 10% bis 30% Phospholipid.
Die Erfindung gestattet, daß Vorteile erzielt werden, hinsichtlich der biologischen Verfügbarkeit und Wirksamkeit einer großen Anzahl von biologisch aktiven Materialien, einschließlich Medikamenten, Hormonen, Impfstoffen, Peptiden, Vitaminen und verwandten Materialien von medizinischem und biologischem Interesse, wie Antioxidationsmitteln, Marker-Verbindungen und Geschmacksmitteln. Die Erfindung ist besonders nützlich zur Solubilisierung von wasserunlöslichen und lipophilen bioaktiven Verbindungen für die örtliche Behandlung der Haut und von Oberflächeninfektionen der feuchten Haut-Areale des Körpers, einschließlich der Mundschleimhaut-Membranen, des oberen respiratorischen Trakts und der Vagina. Die Zusammensetzungen sind speziell geeignet für die örtliche Anwendung auf Schleimhaut-Membranen zur Behandlung von Befunden, welche auf die topische medikamentöse Behandlung mit Anti-Entzündungs-, bioziden und zytoxischen Mitteln oder immunmodulierenden Mitteln (Impfstoffen) ansprechen. In einer spezifischen Ausführungsform ist die Erfindung ein Träger für Anti-Pilz-Wirkstoffe.
Der aktive Bestandteil (b) kann irgendeiner eines breiten Bereichs von biologisch aktiven lipophilen Materialien sein, einschließlich Medikamenten, Hormonen, Impfstoffen, Peptiden, Vitaminen, Immununterdrückungsmitteln (z. B. Cyclosporin oder anderen cyclischen Peptiden) oder Immunmodulatoren (Impfstoffen). Alternativ dazu könnte er ein anderes lipophiles Material von medizinischem und biologischem Interesse sein, wie Antioxidationsmittel, Marker-Verbindungen und Geschmacksmaterialien. Die in der Zusammensetzung getragene Menge an lipophiler Verbindung kann bis zu 10% betragen, liegt jedoch typischerweise zwischen 0,1% bis 5% und vorzugsweise 0,1–2,5% w/w. Bei sehr wirksamen Verbindungen werden häufig Mengen von weniger als 0,1% verwendet.
Beispiele der Komponente (b) schließen ein:

(i) Anti-Pilz-Mittel für Candidiasis zur Anwendung auf die Mundschleimhaut oder Vagina;
(ii) antivirale Mittel zur Anwendung auf die Mundschleimhaut oder Vagina;
(iii) Antientzündungsmittel zur Anwendung auf die orale, rektale oder vaginale Schleimhaut.

Die biologisch aktive Verbindung kann z. B. ein Polyenmacrolid (z. B. Nystatin oder Amphotericin B) oder Imidazol-Derivat (z. B. Clotrimazol oder Miconazol) sein oder sie kann 5-Fluorcytosin, Acyclovir, Triamcinalon oder ein anderes steroides entzündungshemmendes Mittel sein).
Die biologisch wirksame Verbindung (b) kann zu der Lösung oder Dispersion des Lipides (a) als ein mikronisiertes Pulver, z. B. ein durch Mahlen der biologisch aktiven Verbindung in einer Kolloidmühle hergestelltes Pulver, zugesetzt werden.
Die Komponente (c) ist eine wasserfreie, vorzugsweise wassermischbare organische Flüssigkeit, welche ein Lösungsmittel für das Lipid und in den meisten Fällen für die lipophile aktive Verbindung ist. Im allgemeinen sollte die Menge der Verbindung (c) nicht diejenige überschreiten, welche erfordert ist, um die Verbindung und die lipophile Verbindung zu lösen und die Bildung einer molekularen Dispersion des aktiven Bestandteils zu gestatten. Ethanol ist die bevorzugte Komponente, aber Ethanol-freie Formulierungen können für einige Zwecke verlangt werden, und andere aliphatische Alkohole, z. B. Methanol, Propanol und Isopropylalkohol, oder andere geeignete Lösungsmittel (z. B. Propylenglycol, Diethylenglycolmonoethylether (Transcutol) und Propylenglycolcarbonat) oder Mischungen solcher Lösungsmittel können in denjenigen Anwendungen, wo ihre Verwendung zulässig ist, verwendet werden. Der breite Bereich der Komponente (c), welcher eingesetzt werden kann, liegt zwischen 2,5 bis 25 Gew.-%. Der bevorzugte Bereich beträgt 2,5 bis 10 Gew.-%, der am stärksten bevorzugte Bereich beträgt 5 bis 7,5 Gew.-%.
Die Komponente (d) ist eine zweite wasserfreie organische Flüssigkeit, vorzugsweise mischbar mit Wasser und der Komponente (b), welche von einer Natur und in einer Menge vorhanden ist, um zu veranlassen, daß das Membran-Lipid (oder -Lipide) in der Präparation Doppelschichten ausbilden. Geeignete Flüssigkeiten sind Glycerin, welches hinsichtlich seiner fehlenden Toxizität bevorzugt wird, oder Propylenglycol, aber wiederum können andere hydrophile Flüssigkeiten, z. B. die Polyethylenglycole, Glycofurole und Propylenglycol-Derivate, in denjenigen Anwendungen verwendet werden, wo ihre Verwendung zulässig ist. Es wird bemerkt werden, daß abhängig von den anderen verwendeten Materialien, Propylenglycol die Komponente (c) oder Komponente (d) sein kann. Der breite Bereich der Komponente (d) beträgt zwischen 30 und 90 Gew.-%, der bevorzugte Bereich 40 bis 90 Gew.-%, und der am stärksten bevorzugte Bereich 50 bis 80 Gew.-%.
Um unannehmbar hohe Konzentrationen in der Endzusammensetzung sowie das mögliche Erfordernis komplizierter Lösungsmittelentfernungsschritte zu vermeiden, sollte die Komponente (c) bei relativ geringer Konzentration verwendet werden. Die zum Solubilisieren des Lipides erforderliche Menge an Ethanol beträgt typischerweise etwa 25% w/w, bezogen auf das Gewicht des Lipides. Vorzugsweise sollte die Gewichtsmenge an Ethanol (oder irgendeines alternativen Lösungsmittels, welches als Komponente (c) verwendet wird) nicht die Ge wichtsmenge an Lipid übersteigen. Eine vollständige Auflösung der Lipid-Komponente in diesem ersten Herstellungsschritt ist, obwohl wünschenswert, nicht immer möglich oder tatsächlich notwendig, um die Bildung einer molekularen Dispersion des aktiven Bestandteils in der Endzusammensetzung zu erreichen.
Die zweite Stufe der Herstellung besteht aus der Zugabe von Komponente (d), um das Lipid als Doppelschichten auszufällen. Die Konzentration der Komponente (d) ist in den meisten Fällen nicht kritisch und wird hauptsächlich von den gewünschten rheologischen Eigenschaften der Präparation diktiert. Sie sollte jedoch in einer ausreichend hohen Konzentration vorhanden sein, um sicherzustellen, daß das gesamte oder der bei weitem größere Teil des Lipides in einer Doppelschicht-Konfiguration vorliegt.
In manchen Fällen, in denen der aktive Bestandteil eine signifikante Löslichkeit in Gemischen der Komponenten (c) und (d) aufweist, und vermieden werden muss, das Lipid und/oder den aktiven Bestandteils hohen Temperaturen während längerer Zeitdauern auszusetzen, ist eine vollständige Auflösung des aktiven Bestandteils unnötig, wenn die Zusammensetzung anfänglich gebildet wird, und die Präparationen sich beim Stehenlassen aufklären werden. Die Effektivität der Einbindung des aktiven Bestandteils unter diesen Bedingungen ist jedoch in starkem Maße von dem Grand der Unterteilung des aktiven Material abhängig. Der aktive Bestandteil kann eine Teilchengröße von 1 bis 10 μm zum Zeitpunkt der Einbindung aufweisen, oder er kann bei einer größeren Teilchengröße eingebunden werden, und die Zusammensetzung kann dann in einer Kolloidmühle behandelt werden, um eine molekulare Dispersion zu bewirken.
In ähnlicher Weise kann in Zusammensetzungen, enthaltend hohe Konzentrationen des aktiven Bestandteils, die Präzipitation einer gewissen Menge des aktiven Bestandteils in Form von kleinen Teilchen nach der Zugabe der Komponente (d) stattfinden. Dies ist jedoch häufig beim Stehenlassen reversibel.
Bei Ausführungsformen, wie Anti-Pilz-Gelen, ist es vorteilhaft, den Kontakt zwischen der Zusammensetzung und der darunterliegenden Verletzung zu verlängern. In solchen Fällen kann eine kleine Menge eines hydrophilen Kolloides, wie einem Hydrokolloid, Polymer oder einem natürlichen Gummi, in die Präparation beigemischt werden. Geeignete Materialien sind wasserlöslich aber unlöslich in der nicht-wäßrigen Zusammensetzung. Alginate, z. B. Natriumalginat, Carrageenan, Cellulose-Derivate, z. B. Hydroxypropylcellulose und ein Copolymer von N-Vinyl-2-pyrrolidon und Vinylacetat (Plasdone) sind erfolgreich eingesetzt worden. Bei der Anwendung hydratisieren die Gummis in dem wäßrigen Fluid und begrenzen die Zusam mensetzung auf die Stelle der Anwendung, wodurch eine verlängerte Umwandlung zu Liposomen oder anderen lipidhaltigen Teilchenstrukturen gestattet wird. Alternativerweise können zur Bereitstellung von Zusammensetzungen, welche Schutzeigenschaften aufweisen, größere Mengen des Hydrokolloids erforderlich sein, und die Gelbasis kann mit oder ohne ein Medikament eingesetzt werden. Im allgemeinen haben wir festgestellt, daß die eingebundenen Mengen an Polymer, Hydrokolloid oder natürlichem Gummi 0,5 bis 10 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise 1–10 Gew.-% und weiter bevorzugt 2 bis 5 Gew.-% betragen sollten. Unter 0,5 Gew.-% besteht nur eine geringfügige Verbesserung der Adhäsion, wohingegen über 10 Gew.-% das Material klebrig und schwierig zu behandeln wird.
Die im wesentlichen nicht-wäßrigen Zusammensetzungen weisen vorteilhafterweise einen pH-Wert von 5–7,5 auf.
Formulierungen dieser Erfindung können im großen Maßstab zuverlässig und wirtschaftlich hergestellt werden und können während längerer Zeitdauern stabil sein. Sie können unter aseptischen Bedingungen oder bei Erwärmung auf eine Temperatur von etwa 45°C hergestellt werden, oder können durch aseptische Filtration sterilisiert werden. Sie können in Tuben oder in Spendervorrichtungen vom Pumpen-Typ verpackt werden.
Die Erfindung und insbesondere ihre Anwendung auf die Formulierung von Anti-Pilz-Zusammensetzungen wird in den begleitenden Beispielen veranschaulicht.
Beispiel 1
Miconazol- und Clotrimazol-Formulierungen
Anti-Pilz-Gele wurden aus den folgenden Formulierungen hergestellt:
Ungefähr 10% des Gesamtlipids und der gesamte Ethanol wurden in ein bernsteinfarbiges Glasgefäß abgewogen und vermischt, bis das gesamte Lipid dispergiert worden ist. Das Anti-Pilz-Arzneimittel wurde in die Lipid/Ethanol-Mischung zugegeben, und es erfolgte weiteres Mischen, um die Arzneimittelteilchen zu zerbrechen. Der Rest des Lipides wurde zugesetzt und das Mischen wurde fortgesetzt, bis das gesamte Lipid dispergiert war. Das Glycerin wurde dann zugegeben und das Rühren wurde fortgesetzt, bis ein homogenes Gel erhalten wurde. Dieses war klar und transluzent mit einem süßen angenehmen Geschmack und konnte direkt auf die Schleimhaut aufgetragen werden. Etwa 1% bis 10% oder mehr, vorzugsweise jedoch etwa 2% bis 5% eines hydrophilen Polymeren oder natürlichen Gummis können in Pulverform dispergiert werden, um die Präparation mukoadhäsiv zu machen. Zusammensetzungen unter Verwendung von Lipid-Mischungen oder Lecithinen, welche 45% PC enthalten, bilden beim Umsetzen mit Wasser Liposomen. Das Arzneimittel ist bei sehr hohen Spiegel, d. h. mehr als 90%, mit den Liposomen assoziiert.
Miconazol (1-[2-Dichlor-(β-[2,4-dichlorbenzyl)oxyphenethyl]imidazolmononitrat ist ein weißes kristallines Pulver, das sehr geringfügig im Wasser löslich ist und sehr löslich in Ethanol ist. Es besitzt ein breites antifungales Spektrum und besitzt eine gewisse antibakterielle Aktivität. Es ist erhältlich von R. W. Unwin & Co., Ltd. Clotrimazol [1-(o-Chlor-a,adiphenylbenzyl)imidazol] ist ein weißes kristallines Pulver, welches in Wasser unlöslich und in Ethanol löslich ist. Es besitzt ein breites antifungales Spektrum und besitzt eine gewisse antibakterielle Aktivität. Es ist von Fabbrica Italiana Sintetici erhältlich.
Die Herstellung des Pro-Liposomen-Miconazol- und Clotrimazol-Gels erfolgte, wie obenstehend beschrieben. Frühe Formulierungsarbeiten wurden durchgeführt, um folgendes zu finden:

i) Eine Gel-Formulierung mit genug Ethanol, um das Miconazol und Clotrimazol zu lösen, was dem Gel ein transluzentes Aussehen gibt, jedoch mit ausreichend Ethanol, um ein optimales Viskositätsprofil zu erhalten (Tabelle 1).
ii) Eine Gel-Formulierung mit nicht zu viel Miconazol oder Clotrimazol, um die Kristallisation des Arzneistoff in dem Gel auszulösen (Tabelle 2).

Es wurde festgestellt, daß 5 % Ethanol in dem Gel sowohl für die Gel-Viskosität als auch die Arzneimittel-Kristallisation am besten geeignet sind. Bei diesem Ethanol-Spiegel wurde keine Miconazol-Arzneimittelkristallisierung in 1%igen und 2,5%igen Miconazol-Gelen beobachtet. Eine Arzneistoffkristallisation wurde in den 1%igen und 2,5%igen Clotrimazol-Gelen beobachtet, jedoch wird, da das 1%ige Clotrimazol eine viel geringere Arzneimittelkristallisation zeigte, erwartet, daß Gele mit gerade etwas weniger als 1 % Clotrimazol gar keine Arzneistoffkristallisation aufzeigen werden.
Die prozentuale Einkapselung der Anti-Pilz-Arzneimittel Miconazol und Clotrimazol wurde durch Filtration der Liposomen-Dispersion und durch HPLC-Analyse der unfiltrierten und filtrierten Lösungen hinsichtlich des Arzneistoffgehaltes bestimmt. Das Prinzip hinter der Fil trationstechnik besteht darin, daß die Liposomen (mit eingekapseltem Anti-Pilz-Mittel) durch 200 nm-Filter hindurchtreten können, während uneingekapselte Arzneistoffteilchen zu groß bleiben, um durch die Filter hindurchzutreten. Es wurden Proliposomen-Gele hergestellt, enthaltend 2,5% und 1% Miconazol und 1 und 0,5% Clotrimazol. Die prozentuale Arzneistoff-Einkapselung in die Liposomen ist in der Tabelle 3 gezeigt. Es wurde festgestellt, daß sowohl die Miconazol als auch Clotrimazol-Gele hohe Spiegel der Liposomen-Einkapselung aufzeigten. Die prozentuale Einkapselung des Arzneimittels sollte erwartungsgemäß sinken, wenn eine Kristallisation über die Zeit hinweg in den Gelen stattfindet.
Miconazol- und Clotrimazol-Gele wurden für Langzeit-Stabilitätsuntersuchungen bei Arzneistoffkonzentrationen gleich oder geringer als entsprechende Marken-Präparationen hergestellt. Die Proben wurden in verschlossenen Glasbehältern, geschützt vor Licht, bei 4°C, 25°C und 40°C aufbewahrt. Der Gehalt an Arzneistoff in den Gelen wurde durch HPLC-Analyse getestet, um das Ausmaß der Arzneistoffzersetzung zu bewerten. Die Stabilität von beiden, Miconazol und Clotrimazol, in den Pro-Liposomen-Formulierungen war von der Arzneistoffkonzentration abhängig. Je höher die Konzentration, desto geringer die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Zersetzung. Es ist bekannt, daß die Arzneistofflöslichkeit in der Basisformulierung das optimale Ausmaß der Arzneistoff-Konzentration beschränkt, weshalb die Formulierung ein Gleichgewicht zwischen Stabilität und Konzentration bleibt. Die Kristallisation des Arzneistoffs in dem Gel wurde durch Messen der liposomalen Einkapselung über die Zeit bestimmt.
Tabelle 1 Effekt der Veränderung der Ethanolkonzentration in (a) Miconazol- und (b) Clotrimazol-Pro-Liposomen-Gel-Formulierungen (a) Miconazol
(b) Clotrimazol
Tabelle 2 Effekt der Veränderung der Arzneistoffkonzentration in Pro-Liposomen-Gel-Formulierungen (a) Miconazol-Formulierungen
(b) Clotrimazol-Formulierungen
Tabelle 3 Prozentuale Einkapselung von Anti-Pilz-Arzneimitteln in Liposomen aus Pro-Liposomen-Gelen
Beispiel 2
Gele, welche Amphotericin B enthalten
Unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 1 wurden Pro-Liposomen-Gele mit verschiedenen Konzentrationen an Amphotericin B hergestellt. Die prozentuale Einkapselung des Amphotericin B in Liposomen (in 0,1%igen Suspensionen der Gel-Formulierungen) wurde nach 3 Tagen, 1 Monat, 3 Monaten und 6 Monaten nach der Pro-Liposomen-Herstellung gemessen. Die Gele wurden in verschlossenen Behältern, geschützt vor Licht bei 4°C aufbewahrt (Tabelle 4). Es wurde festgestellt, daß Amphotericin B hohe Spiegel an liposomaler Einkapselung bei Lipid-Arzneistoff-Verhältnissen im Bereich von 20 : 1–200 : 1 zeigte und das Niveau des Einkapselungsspiegels sich bei Langzeitaufbewahrung relativ wenig veränderte.
Tabelle 4 Prozentuale Einkapselung von Amphotericin B in Liposomen aus einem Pro-Liposom bei Langzeitaufbewahrung bei 4°C
Beispiel 3
Gel, enthaltend Amphotericin B und Puffer
Ein Pro-Liposomen-Gel, enthaltend Amphotericin B, wurde wie folgend formuliert:
Das Gel wurde hergestellt durch Dispergieren des Lipides, von welchem 90% Phosphatidylcholin sind, und Ethanol in einem Gefäß, welches verschlossen und 24 Stunden lang bei 25°C gelassen wurde, bis sich das Lipid dispergiert hatte. Dann wurde das Amphotericin B zu dem Lipid/Ethanol-Gemisch zugesetzt und homogenisiert. Tris-Base zum Puffern des Gels auf einen pH-Wert von ungefähr 6,5 wurde in dem Glycerin gelöst durch Erwärmen dieser zusammen bei 60°C während etwa 30 Minuten, wonach die Lösung auf Raumtemperatur gekühlt wurde. Die Glycerin-Lösung der Tris-Base wurde in die Lipid-Mischung eingerührt, bis sich ein homogenes zweischichtiges Gel bildete. Eine ähnliche Präparation kann unter Verwendung einer Lipid-Mischung, welche 45% PC enthält, erfolgen.
Amphotericin B mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 1 bis 5 μm wurde festgestelltermaßen gut in das Gel eingebunden. Es zeigte eine fast 100%ige Einkapselung in Lipo somen, welche aus den Pro-Liposomen bei Zugabe von Wasser gebildet werden, wohingegen die Einbindung von gröberen Teilchen festgestelltermaßen viel weniger effizient war. Der gewählte Gehalt von Tris-Base sieht eine gute Stabilität für das Lipid vor, während die Stabilität des Amphotericin B im Vergleich zu einem Gel das keinen Puffer enthält, erhöht wird.
Beispiel 4
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde befolgt, um das zweischichtige Gel herzustellen. 2%iges Natriumalginat-Pulver wurde gleichmäßig in die Zusammensetzung dispergiert, wodurch dieser verbesserte mukoadhäsive Eigenschaften und ein geringfügig trüberes Aussehen gegeben wurden.
Beispiel 5
Mikrobiologie
Mikrobiologische Arbeiten wurden durchgeführt, um zwei fundamentell unterschiedliche Eigenschaften der Pro-Liposomen-Gel-Formulierung aufzuklären;

– Um die intrinsische antimikrobielle Aktivität der Gelbasis ohne Anti-Pilz-Arzneimittel und ohne Verdünnung zu einer liposomalen Dispersion) als Maß dafür zu untersuchen, ob die Gelbasis allein das mikrobielle Wachstum bei Langzeitaufbewahrung inhibieren oder fördern würde, oder ob sie zusätzliche antimikrobielle Konservierungsstoffe enthalten muß.
– Um die Anti-Pilz-Aktivität der Pro-Liposomen-Gelformulierung (mit Anti-Pilz- Arzneimittel, verdünnt zu einer wäßrigen liposomalen Dispersion) im Vergleich zu einer äquivalenten wäßrigen Suspension des Anti-Pilz-Arzneimittels zu untersuchen.

1. Mikrobielle Herausforderung der Gelbasis
Die antimikrobielle Wirksamkeit einer pharmazeutischen Präparation wird durch einen einfachen Herausforderungstest untersucht (basierend auf Appendix XVI C BP 1988 S. A200-S. 02). Die folgenden A2Organismen wurden in dem Test verwendet: Aspergillus niger NCPF 2275, Escherichia coli NCTC 1487, Candida albicans NCPF 3179, Pseudomonas aeruginosa B15 und Staphylococcus aureus NCTC 4135.
Für die Pro-Liposomen-Gelbasis wurden 10 g Placebo-Proben, hergestellt gemäß Beispiel 1 ohne den Einschluß der Anti-Pilz-Mittel, mit Mikroorganismen inokuliert, wodurch ein Inokulum von 1 × 10⁶ Bakterien oder Hefen pro g der Probe oder 1,4 × 10⁴ Schimmelpilzen pro g Probe (Inokulum-Volumen 1% der Probe) erhalten wurden. Kontrollproben wurden auf die gleiche Weise unter Verwendung von 0,1% Pepton-Wasser (für Bakterien und Hefen) oder 0,1% Pepton-Wasser + 0,5% Tween 80 (für Schimmelpilze) hergestellt. Die inokulierten Proben wurden einen Monat lang bei 20°C aufbewahrt. Zu regelmäßigen Intervallen wurden 1 g große Unterproben entnommen und passend verdünnt, um die Anzahl verbleibender Mikroorganismen in der Probe zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der 1 gezeigt, welche das Ergebnis der Herausforderung der Gel-Basis mit (a) Bakterien, (b) Hefe und (c) Schimmelpilz zeigt.
Für Bakterien und Hefen wird die Anzahl von aus dem Gel zurückgewinnbaren Organismen umgehend um einen Faktor von mindestens 10 verringert. Für den Schimmelpilz wird die Anzahl von aus dem Gel gewinnbaren Organismen umgehend um einen Faktor von mindestens 102 verringert. Es wird angenommen, daß diese überraschend effektive antimikrobielle Aktivität die Folge sowohl des mikroziden Effektes des Ethanols als auch des osmotischen Potentials des Glycerins ist. Dies war ein unerwarteter Bonus, und als Ergebnis wird erwartet, daß die Pro-Liposomen-Gelbasis allein annehmbare konservierende Eigenschaften für viele Anwendungen als eine topische oder orale pharmazeutische Präparation hat, ohne die Notwendigkeit für zusätzliche Konservierungsstoffe in der Gelbasis (d. h. die Pro-Liposomen-Gelbasis-Formulierung kann den BP-mikroben Herausforderungs-Test bestehen). Die meisten zur Verhinderung des mikrobiellen Verderbens verwendeten Konservierungsstoffe sind sensitivierende Mittel. Deshalb werden Präparationen, welche natürliche Konservierungseigenschaften ohne die Notwendigkeit von zugesetzten antimikrobiellen Mitteln aufweisen, bevorzugt.
2. In vitro-Anti-Pilz-Aktivität
Die Anti-Pilz-Eigenschaften des Pro-Liposomen-Gels (mit Anti-Pilz-Mittel) wurden unter Verwendung zweier Verfahren untersucht. Das erste, der Titer-Platten-Diffusions-Test, untersucht die Anti-Pilz-Aktivität durch Diffusion durch ein festes Medium. Das zweite untersucht Anti-Pilz-Aktivität in einem flüssigen Medium. Die Tests wurden beide ausgeführt, um die Wirksamkeit der liposomalen antifungalen Präparationen gemäß der Erfindung mit derjenigen von äquivalenten wäßrigen Suspensionen des Anti-Pilz-Mittels zu vergleichen.
a) Titer-Platten-Diffusionstest
Die Pro-Liposomen-Gele, enthaltend 1% Miconazol, 2,5% Clotrimazol und 1,0% Amphotericin, hergestellt durch die Beispiele 1, 2 bzw. 3, wurden vermischt und in passender Weise verdünnt in wäßrigem Phosphat-Puffer, wodurch liposomale Dispersionen gebildet werden, welche die gleiche Konzentration an Arzneistoff enthalten wie die wäßrigen Suspension (1, 10 und 100 μg/ml). Es wurde ein Titer-Platten-Diffusionstest unter Verwendung von Candida albicans durchgeführt. Trypton-Soja-Agarplatten wurden verwendet, welche mit Candida albicans NCPF 3179 zu einer Endkonzentration von 10⁶ lebensfähigen Zellen pro ml inokuliert worden waren. Lösungen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 5-mm-Vertiefungen inkubiert, gefolgt von 18 Stunden bei 37°C. Die Wachstumsinhibitions-Zonen von Candida albicans wurden dann im Vergleich zu äquivalenten wäßrigen Suspensionen von Anti-Pilz-Mitteln von (a) Amphotericin B, (b) Miconazol und (c) Clotrimazol gemessen ( 2).
Die liposomalen Formulierungen der Anti-Pilz-Arzneimittel zeigten größere Inhibitionszonen als die wäßrigen Anti-Pilz-Suspensionen. Im Vergleich zeigte die Kontroll-Gelbasis (ohne Anti-Pilz-Mittel) keine Inhibitionszone. Die größeren Inhibitionszonen mit den Liposomen-Präparationen reflektieren die höhere biologische Verfiigbarkeit der Anti-Pilz-Arzneimittel aus dieser Formulierung.
b) Wachstumsinhibition in einem flüssigen Medium
Die Pro-Liposom-Gele wurden im wäßrigen Medium gemischt und entsprechend verdünnt, um liposomale Dispersionen zu bilden, welche die gleiche Konzentration an Arzneimittel enthielten, wie wäßrige Suspensionen. 1-ml-Proben wurden dann mit 9 ml Trypton-Soja-Nährlösung gemischt und mit Candida albicans NCPF 3179 zu einer Endkonzentration von 10⁶ lebensfähigen Zellen pro ml inokuliert. Die optische Dichte (bei 600 nm) wurde dann bei Intervallen als Maß des Wachstums (und der Wachstumsinhibition) von Candida albicans abgelesen. Die 3 zeigt die Wachstumsinhibition von Candida albicans in einem flüssigen Medium als eine Funktion der Zeit (Amphotericin B-Konzentration 1 μg/ml). Die 4 zeigt die Inhibition von Candida albicans in einem flüssigen Medium als Funktion der Anti-Pilz-Mittel-Konzentration (Inkubationszeit 24 Stunden). Die 5 zeigt die Wachstumsin hibition von Candida albicans in einem flüssigen Medium durch verschiedene Konzentrationen der liposomalen Amphotericin B-Formulierungen (Inkubationszeit 24 Stunden).
Wie in dem Titer-Platten-Diffusionstest-Experiment wurde beobachtet, daß die liposomale Präparation viel wirksamer zur Inhibierung des Wachstums von Candida im Vergleich zu der wäßrigen Dispersion war. Dies unterstreicht die hohe biologische Verfügbarkeit von liposomalem Amphotericin B und die Fähigkeit der liposomalen Präparation, als ein Reservoir für das antimikrobielle Mittel zu wirken.
Die in vitro-Tests zeigen, daß die Pro-Liposomen-Anti-Pilz-Gele eine überlegene Anti-Pilz-Aktivität im Vergleich zu den freien Anti-Pilz-Arzneimitteln allein aufzeigen. Wenn diese Eigenschaft auf eine in vivo-Situation extrapoliert wird, dann ist es wahrscheinlich, daß die natürliche Affinität von Phospholipid für Schleimhautoberflächen die Zurückbehaltung und Verfügbarkeit des Anti-Pilz-Arzneimittels weiter verbessern würde.
Die Pro-Liposom-Formulierung ist ideal als ein Träger zur topischen Verabreichung von Anti-Pilz-Arzneistoffen auf Schleimhautoberflächen. Alle Formulierungskomponenten sind pharmazeutisch annehmbar. Das Gel hat einen angenehmen süßen Geschmack und ist ausreichend viskos, um zu gestatten, daß es auf das Zahnfleisch oder eine Schleimhaut angewandt wird, falls gewünscht. Darüber hinaus bleibt, bei Umwandlung zu Liposomen oder anderen Lipidstrukturen (abhängig vom Typ des verwendeten Lipids) die aktive Verbindung in molekularer Lösung, bei einem sehr hohen Grad der Einschließung, was die Freisetzung des Arzneistoffes an die Stelle der Infektion verlängert. Die Gelbasis allein unterstützt nicht das Mikrobenwachstum, und unter Verwendung sorgfältiger Herstellungsbedingungen sollte das Gel eine sehr niedrige anfängliche mikrobiologische Belastung haben.
Die in dieser Erfindung offenbarten, Amphotericin B-enthaltenden Formulierungen sind bei 25°C wahrscheinlich mehrere Monate lang stabil, und bei 4°C mindestens ein Jahr lang, was die Entwicklung eines verbesserten, wirtschaftlich sinnvollen pharmazeutischen Produktes mit einer guten Haltbarkeitsdauer ermöglicht. Eine stabile Pro-Liposomen-Formulierung, welche relativ hohe Dosierungen an die beabsichtigte Behandlungsstelle abgibt, sollte Patienten mit Candida-Infektionen von Nutzen sein. Das Pro-Liposomen-Gel ist einfach und wirtschaftlich herzustellen und zeigt ein großes Potential zur Verbesserung der biologischen Verfügbarkeit mehrerer unterschiedlicher Anti-Pilz-Arzneistoffe. Darüber hinaus sollte die Präsentation eines angenehmen und schmackhaften Gels das Einverständnis des Patienten fördern.
Beispiel 6
Zusätzliche Polymer- und Hydrokolloid-Materialien
Das Verfahren von Beispiel 4 wurde mit 1 Gew.-% und 5 Gew.-% Natriumalginat (Keltone HVCR) und mit jeweils 1 Gew.-%, 2 Gew.-% und 5 Gew.-% von Carrageenan (Gelcarin GP37ANF), Hydroxypropylcellulose (Kucel HF) und einem Copolymer von N-Vinyl-2-pyrrolidon und Vinylacetat (Copolyvidon; Plasdone 5630) wiederholt. In jedem Fall bestand eine verbesserte Adhäsion im Vergleich zu einer entsprechenden Formulierung ohne zugesetztes Polymer, und die Verbesserung der Adhäsivität erfolgte in der Reihenfolge Natriumalginat > Carrageenan ≫ Copolyvidon ≫ Hydroxypropylcellulose vor. Das 5 Gew.-% Natriumalginat enthaltende Gel, getestet durch Adsorption an Dialyseschläuche [RS Manly (Hrsg.) Adhesion in Biological Systems, Academic Press, N. Y. 1970, Kapitel 10, J. L. Chen und G. N. Cyr, "Compositions Producing Adhesion through Hydration"], rief eine mittlere Adhäsionszeit von etwa 230 Minuten hervor, und 5 Gew.-% Carrageenan rief eine mittlere Adhäsionszeit von etwa 190 Minuten hervor. Mikrobiologische Untersuchungen zeigten, daß keines der Polymere, bei den verwendeten Spiegeln, materiell die Anti-Pilz-Aktivität des Amphotericin-haltigen Pro-Liposomen-Gels verringerte, welche derjenigen einer, als Kontrolle verwendeten, im Handel erhältlichen Amphotericin-Suspension in großem Mäße überlegen blieb.
Beispiel 7
Verwendung von alternativen Lösungsmitteln
Das Lipid von Beispiel 1 dispergierte festgestellterweise in Transcutol (Gattefosse), Laurylactat und Isopropylmyristat bei einem Lösungsmittel : Lipid-Verhältnis von mindestens 1 : 1. Die obenstehenden Lösungsmittel können bei bestimmten Konzentrationen zum Ethanol beigemischt werden, den in anderen Beispielen verwendeten Ethanol ersetzen, sie sind jedoch nicht wassermischbar. Es wurden dann Proben hergestellt, in welchen Amphotericin und Lipid in diesen Lösungsmitteln dispergiert wurden, und in jedem Fall wurden hellgelbe, trübe Suspensionen des Arzneimittels erhalten. Glycerin wurde zu Portionen der gut-dispergierten Proben zugesetzt, um Gele zu bilden, deren Viskosität durch die Menge an zugesetztem Glycerin reguliert werden kann. Geeignete Formulierungen sind wie folgend, wobei die Proportionen als Lipid : Lösungsmittel : Amphotericin : Glycerin angegeben sind.

Transcutol 20 : 20 : 1 : 59

Lauryllactat 20 : 30 : 1 : 49

Isopropylmyristat 20 : 30 : 1 : 49
Beispiel 8
Ethanol-freies Amphotericin-Proliposomengel
Ein Lipid (2g), welches etwa 45% Phospholipid enthält, wovon 33% Phosphatidylcholin sind und etwa 10,5% Monoacyl-Phosphatidylcholin sind, und Ethanol (0,5 g) wurden in ein Glasröhrchen gebracht und bei 40°C gelassen, bis das Lipid im Ethanol gelöst worden war. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und Amphotericin (0,1 g) wurde zugegeben. Die resultierende flüssige Mischung wurde 30 Minuten lang an Ultraschall ausgesetzt. Getrennt davon wurden TRIZMA-Base (Tris, 0,02 g), was ein Puffer ist, und Glycerin (14,78 g) etwa 30 Minuten lang bei etwa 200°C erwärmt, wonach sich die Base vollständig aufgelöst hatte. Die Glycerin-Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und ein Anteil (7,4 g) wurde mit der Lipid-Mischung vermischt, um ein trübes senffarbiges Gel herzustellen. Die obenstehende Formulierung ist ethanolfrei, wie Beispiel 7, und die Gegenwart des Monoacyl-Phosphatidylcholins fördert die Aufnahme des Zusatzstoffes.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung umfassend mindestens eine lipophile biologisch wirksame Verbindung in molekularer Dispersion in Doppelschichten einer im wesentlichen nicht-wässrigen Zusammensetzung umfassend mindestens ein Membranlipid, welches in einem hydrophilen Medium suspendiert ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Lösen oder Dispergieren mindestens eines Teils des Membranlipids in einer ersten organischen Flüssigkeit, welche das Lipid lösen oder dispergieren kann; Zusetzen der lipophilen biologisch wirksamen Verbindung zu der Lösung oder Dispersion; und Zusetzen einer zweiten organischen Flüssigkeit, welche mit der ersten organischen Flüssigkeit mischbar ist und von solcher Natur ist und in einer solchen Menge vorliegt, dass das(die) Membranlipid oder -lipide mindestens teilweise in der Form von Doppelschichten vorliegt/vorliegen, wobei mindestens eine der ersten und zweiten Flüssigkeit mit Wasser vermischbar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologisch wirksame Verbindung als ein mikronisiertes Pulver zu der Lösung oder Dispersion zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zugegebene biologisch wirksame Verbindung ein Polyen-Makrolid ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zugegebene biologisch wirksame Verbindung Nystatin oder Amphotericin B ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zugegebene biologisch wirksame Verbindung ein Imidazolderivat ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die zugegebene biologisch wirksame Verbindung Clotrimazol oder Miconazol ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die zugegebene biologisch wirksame Verbindung 5-Fluorcystosin ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei 0,1–2,5% w/w der biologisch wirksamen Verbindung zugegeben werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei etwa 1% w/w der biologisch wirksamen Verbindung zugegeben werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in der ersten organischen Flüssigkeit eine Mischung aus einem Membranlipid und einem micellenbildenden Lipid dispergiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das in der ersten organischen Flüssigkeit dispergierte micellenbildende Lipid ein Monoacyl-Lipid ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das in der ersten organischen Flüssigkeit dispergierte Membranlipid Eidotter-Lecithin oder Sojabohnen-Lecithin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Eidotter-Lecithin oder Sojabohnen-Lecithin von einer Güte ist, welche mindestens 40 Gew.-% Phosphatidylcholin umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, welches das Einbringen von 2,5– 25% w/w der ersten wassermischbaren organischen Flüssigkeit in die Zusammensetzung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die erste wassermischbare organische Flüssigkeit in einer Menge von 2,5–10% w/w der Zusammensetzung eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die erste wassermischbare organische Flüssigkeit in einer Menge von 5–7,5 Gew.-% der Zusammensetzung eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die erste organische Flüssigkeit Ethanol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei Ethanol in der ersten organischen Flüssigkeit vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, welches das Einbringen von 30 bis 90 % w/w der zweiten organischen Flüssigkeit in die Zusammensetzung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, wobei die zweite organische Flüssigkeit in einer Menge von 40 bis 90% w/w der Zusammensetzung eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die zweite organische Flüssigkeit in einer Menge von 50 bis 80% w/w der Zusammensetzung eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei die zweite organische Flüssigkeit Glycerin umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend das Einbringen eines Hydrokolloids, Polymers oder Naturkautschuks in die Zusammensetzung in einer Menge, welche wirksam ist, um die Muko- bzw. Schleimhautadhäsion der Zusammensetzung zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei 1 bis 10% w/w des Hydrokolloides, Polymers oder Naturkautschuks eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei 2 bis 5% w/w des Hydrokolloides, Polymers oder Naturkautschuks eingebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei das Hydrokolloid oder der Naturkautschuk ein Cellulosederivat, Carrageenin oder ein Alginat ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung, die hergestellt wird, steril ist.