SE464448B - Fusogen fosfolipidvesikel innehaallande ett kvaternaert ammoniumhydroxidsalt i membranet samt ett foerfarande foer dess framstaellning - Google Patents

Description

464 448 Vidare har en mångfald användningar av liposomer som j överföringsmedel föreslagits i talrika patent. Sålunda 5 anger den nyssnämnda patentskriften 4 235 871 talrika aktiva föreningar och beredningar inkapslade i liposo- _ men för införlivning i celler. U.S. patent 4 394 448 är inriktad speciellt på införande av desoxiribonuklein- syra (DNA) eller fragment därav i en levande cell, var- vid DNA eller fragmentet därav inkapslas i en lipidve- sikel och denna bringas i kontakt med en cell, så att införandet sker. U.S. patent 4 199 565, 4 201 767, 4 261 975 och 4 235 877 anger införlivning av ett vi- ralt eller bakteriellt antigen i liposomer, som inne- håller ett positivt laddat aminohaltigt ytaktivt medel, vilket kan vara ett kvaternärt ammoniumhalidsalt. U.S. patent 4 483 929 anger ett immunoreaktant liposomrea- gens med förmåga att ingå i en immunospecifik reaktion med en känd antikropp. Ehuru det har påvisats, att fos- folipidliposomer är.i stånd att införa sitt innehåll i odlade celler såväl som i celler av specifika vävnader hos hela djur, har dessa liposomer veterligen visats vara endast relativt dåliga bärare i alla kända använd- ningar. Det förmodas att dessa kända liposomer inför de av dem burna substanserna, dvs läkemedlen, i cellerna med endocytoslika processer- Följaktligen kommer endast en liten andel av de molekyler som är infångade i lipo- somerna att nå mottagarcellernas cytoplasma. Vidare har det konstaterats, att när liposomer injiceras i djur, inklusive människor, fosfolipidliposomerna är inerta och icke immunogena upp till en viss koncentration. Först vid relativt höga koncentrationer blir liposomerna im- - munogena och toxiska. Dessa liposomer enligt teknikens ståndpunkt är visserligen i stånd att agglutinera cel- ~ ler, men de är inte fusogena och är ur stånd att smälta ihop med en cellmembran eller framkalla fusion av celler med varandra. 464 448 Det har också konstaterats, att höljen av vissa animaliska virus, såsom de från Sendai-virus er- hållna, är fusogena, och de har visats tjäna som en effektiv bärare för införande av molekyler i odlade celler, såsom anges i "A New Method for Reconstitution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes“, av Vain- stein et al., Biochimica et Biophysica Acta, 773 (1984), sid. 181-188. Den fusogena aktiviteten av dessa virus torde bero på närvaro av specifika viralglykoproteiner i virushöljena. Det förefaller emellertid som om närva- ro av ett protein i de fusogena viralhöljena gör dessa vesikler immunogena och därför opraktiska för använd- ning in vivo. Injektion av viralhöljen i djur framkal- lar bildning av specifika antivirala antikroppar, vil- ket begränsar deras användbarhet som biologisk bärare in vivo.

Den rapporterade litteraturen visar därför, attehurufosfolipidvesikler har insetts vara ett poten- tiellt betydelsefullt redskap för att införliva läke- medel.och andra cellmodifierande material i celler, den- na teknik på grund av de kända liposomernas begränsning- ar har fått endast begränsad framgång.

Det är följaktligen huvudsyftet med förelig- gande uppfinning att erbjuda_liposomer som är fusogena och som smälter ihop med en cellmembran och framkallar fusion av celler med varandra.

Det är ett annat syfte att erbjuda ett förfa- rande för att framställa liposomer, som smälter ihop med en cellmembran och framkallar fusion av celler.

Föreliggande uppfinnings syften ernås genom införlivning av ett kvaternärt ammoniumhydroxidsalt i en liposoms membran antingen under liposomens framställ- ning eller efter framställningen. Det har befunnits, att närvaro av det kvaternära ammoniumhydroxidsaltet i fosfolipidvesikelns membran tillåter vesikeln att smäl- ta ihop med en cellmembran och framkalla fusion av cel- 464 448 ler. Om vesikeln är laddad med ett läkemedel eller nâ- gon annan cellmodifierande substans, kommer vesikelns , innehåll att mikroinjiceras i djur- eller växtcellen.

Det kvaternära ammoniumhydroxidsaltets förmåga att om- 1 vandla fosfolipidvesiklerna från icke fusogena till fu- ' sogena vesikler är synnerligen förvånande med tanke på att andra kvaternära ammoniumsalter än hydroxidsalterna ger vesikler som inte är fusogena. Sålunda har det visat sig,att fosfolipidvesikler innehållande kvaternära ammo- niumhalider,kvaternära ammoniumacetatochliknande,inte smälter ihop med en cell och således inte heller mikroinjice- rar vesiklernas innehålli.encell.Dessa vesikler reagerar likadant som de kända icke fusogena vesiklerna och synes införliva sitt innehåll i cellernafgenom en endocytoslik- nande process. De fusogena egenskaperna hos liposomerna enligt föreliggande uppfinning erbjuder å andra sidan ett bekvämt medel att införliva vilken som helst cell- modifierande substans, som kan infângas i en fosfolipid- vesikel, direkt i en växt- eller djurcell i väsentligen kvantitativa mängder.

Detkvaternäraammoniumhydroxidsaltet för in- förlivning i fosfolipidvesikelns vägg eller membran har formeln R1 - N - R3 OH vari R1 är en stor alkylgrupp eller en kombination av . en alkyl- och arylradikal som bibringar saltet ytaktiva egenskaper, och R2, R3 och R» är grenkedjiga alkylradi- kaler med 1 till 20 kolatomer eller en arylradikal eller R2 och R3 tillsammans kan vara en 5-ledad eller 6-ledad 464 448 heterocyklisk radikal, såsom pyrrol eller pyridin. Sär- skilt föredragna föreningar är de ytaktiva medlen ce- tylbensyldimetylammoniumhydroxid, hexadecyltrimetylam- moniumhydroxid, cetyltrimetylammoniumhydroxid, diisobu- tylkresoxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid, diiso- butylfenoxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid, me- tyldodecylbensyltrimetylammoniumhydroxid, metyldodecyl- xylenbis(trimetylammoniumhydroxid), N-alkyl-(C12,C1u,- C16)-dimetylbensylammoniumhydroxid och oktylkresoxiet- oxietyldimetylbensylammoniumhydroxid. Det är väsentligt, att det kvaternära ammoniumhydroxidsaltet har ytaktiva egenskaper och innehåller hydroxiradikalen, så att den bibringar fosfolipidvesikeln fusogena egenskaper. Mäng- den kvaternärt ammoniumhydroxidsalt i vesiklerna varie- rar normalt från ca 5 till 750 ug per 1 mg fosfolipid och företrädesvis från ca 50 till 250 pg kvaternärt am- moniumhydroxidsalt per 1 mg fosfolipid.

De enligt föreliggande uppfinning användbara liposomerna kan vara vilka som helst av de kända lipo- somerna. Exemplifierande liposomer innefattar de natur- liga och syntetiska fosfokolinhaltiga lipiderna med en fettsyrakedja av 12 till 20 kolatomer och en fettsyra- kedja med minst 8 kolatomer, exemplifierade av dimyri- stoylfosfatidylkolin, dioleoylfosfatidylkolin, dipal- mitoylfosfatidylkolin,,distearovlfosfatidylkolin, fos- fatidylkolinc3fl1sfingomyelin; samt kolesterol och lik- nande. Liposomerna kan framställas med nâgra av de väl- kända publicerade metoderna, såsom sonikation av fosfo- -«li idsus ensioner, reverserad indunstnin 'ellerneh dra- P 9 Y tíëñ av torkade lager av fosfolipidmolekyler. Lämpliga metoder beskrivs i "Procedure for Preparation of Lipo- somes with Large Internal Aqueous Space and High Cap- ture by Reverse-Phase Evaporation", av Szoka et al, an- förd ovan; "Dehydration-Rehydration Vesicles: A Simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes", av Kirby och Gregoriadis, anförd ovan, såväl som andra kända 464 448 metoder, såsom användning av tensider (se Szoka och Pa- pahadjopoulos, Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 2 (1980), sid. 467-480). Dessutom kan den cellmodifierande sub- stansen, som kan inneslutas i liposomen och mikroinji- ceras i djur- eller växtceller genom fusion med liposo- merna enligt föreliggande uppfinning, vara någon av de tidigare föreslagna substanserna. Det har befunnits, att substanser, som kan inkapslas i liposomen och mikro- injiceras i en cell enligt uppfinningen, inkluderar DNA och DNA-fragment, farmaceutiskt aktiva föreningar och beredningar därav såsom kolhydrater, nukleotider, poly- nukleotider, både naturliga och syntetiska, influensa- vacciner och antigener samt andra substanser, som kan påverka djur- och växtcellers fysiologi.

Följande exempel belyser föredragna sätt att framställa de fusogena liposomerna enligt uppfinningen.

Exempel 1 Införlivning av kvaternärt ammoniumhydroxid- salt i liposommembraner under liposomframställning 2 mg oladdad fosfolipid, fosfatidylkolin (PC), och 1 mg kolesterol intorkas ur kloroformlösningar. Det av PC och kolesterol erhållna torra skiktet solubilise- ras med 1 ml dietyleter, och den erhållna lösningen sätts till en suspension innehållande 2 mg oktylkres- oxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid (Q-salt) i acetatbuffert vid pH 7,0. Den erhållna suspensionen om- rörs sedan kraftigt och ljudbehandlas kortvarigt i en -badsonikator. Reversindunstade stora enlamelliga lipo- samer framställs sedan med den metod som beskrivs i' "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", av Szoka et al, ovan. överskott av icke införlivat Q-salt avlägsnas genom tillsats av SM-2 Bio-beads enligt den metod som beskrivs i "A New Method for Reconstitution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes" av Vainstein et al, 464 448 ovan. Sålunda inkuberas omkring 50 - 80 mg SM-2 Bio- beads med ovan beskrivna fosfolipider och Q-salt un- der 40 - 60 minuter vid rumstemperatur under mild om- skakning i en slutlig volym av 1 ml acetatbuffert. En kvantitativ uppskattning visar, att omkring 30 - 40 % av det tillsatta Q-saltet införlivas i fosfolipiddubbel- skiktet (300 - 400 pg Q-salt per mg PC). För framställ- ning av liposomer laddade med en komponent av intresse sätts de önskade komponenterna, såsom droger, enzymer, RNA eller DNA, till bufferten, vari fosfolipiderna är suspenderade, såsom beskrivs i "Procedure for Prepara- tion of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation", av Szoka et al, ovan.

Det i exempel 1 angivna förfarandet för fram- ställning av fusogena liposomer.rekommenderas inte när laddade molekyler infångas i liposomerna. Under vissa betingelser och vid ett visst pH blir varje negativt laddad komponent komplexbunden vid den kvaternära am- moniumhydroxiden och utfälld därmed. Eftersom det kva- ternära ammoniumhydroxidsaltet är positivt laddat, sam- verkar det elektrostatiskt med varje negativt laddad molekyl, såsom nukleinsyrorna, exemplifierade av DNA eller RNA, vilka är starkt negativt laddade vid neut- ralt pH. Bildning av sådana komplex mellan det posi- tivt laddade kvaternära ammoniumhydroxidsaltet och de negativt laddade molekylerna minskar infångningseffek- tiviteten (antalet inom varje liposom infângade moleky- ler) och liposomernas fusogena aktivitet. Följaktligen anges i exempel 2 en andra metod för framställning av fusogena liposomer, vari direkt kontakt mellan det kva- ternära ammoniumhydroxidsaltet och de infångade mole- kylerna undviks. 464 449 Exempel 2 Insats av Q-salt i redan framställda laddade liposomer Laddade liposomer framställs såsom beskrivs i exempel 1 eller i enlighet med ovan beskrivna tidi- gare publicerade metoder. Till skillnad från den i exempel 1 beskrivna metoden tillsätts inte Q-saltet under framställningen av liposomerna, utan efter till- sats av de laddade liposomerna till en suspension inne- hållande laddade omförseglade liposomer. Inkubation av Q-saltet med en suspension av omförseglade liposomer resulterar i införlivning av Q-saltmolekylens hydro- foba del i liposomens fosfolipiddubbelskikt.

Förfarandet utförs som följer: En suspension innehållande fosfolipidvesikler (liposomer) framställda av 2 mg PC och 1 mg kolesterol, suspenderade i 400 ul acetatbuffert, sätts till ett rör innehållande 3 mg Q-salt i 20 ul acetatbuffert. Den erhållna blandningen omrörs kraftigt, varefter den inkuberas 10 - 15 minu- ter vid 37°C med sakta omskakning. överskott av fritt icke införlivat Q-salt bortskaffas genom adsorption på SM-2 Bio-beads, såsom beskrivs ovan. En kvantitativ uppskattning visade igen, att omkring 30 % av det till- satta Q-saltet införlivades i fosfolipiddubbelskiktet. fFörfarandet enligt exempel 2 kan vara fördel- aktigt för vissa framställningar framför förfarandet enligt exempel 1, i det att molekyler som innesluts i liposomen uppfångas inom liposomen före tillsats av Q-saltet; därför kan ingen samverkan ske mellan det inneslutna materialet och det tillsatta ytaktiva med- let. Dessutom är de med förfarandet enligt exempel 2 framställda Q-saltbärande liposomernas fusogena egen- skaper överlägsna de med förfarandet enligt exempel 1 framställda liposomernas.

De i exempel 2 beskrivna av fosfatidylkolin och kolesterol sammansatta liposomernas (PC/kolesterol- V\ 464 448 liposomernas) förmåga att framkalla cellfusion studera- des genom inkubation med mänskliga erytrocyter och med hepatomvävnadskulturceller (HTC) i jämförelse med kont- roller. Q-salt, som är oktylkresoxietoxietyl-dimetyl- bensylammoniumhydroxid, C-salt som är oktylkresoxietoxi- etyldimetyl-bensylammoniumklorid, och B-salt, som är bensyl-dimetyl-hexadecylammoniumbromid, införlivades i redan bildade liposomer, såsom beskrivs i exempel 2. I dessa försök inkuberades antingen fritt Q-salt (5 - 10 ug) eller fritt C-salt (5 - 10 ng) eller fritt B-salt (5 - 10 pg) eller liposomer bärande dessa kvaternära ammoniummolekyler (20 pg PC) med en cellsuspension (106 celler) under 15 minuter vid 3700. Agglutinering av cel- ler och cellfusion följdes genom observation i ett fas- mikroskop. Resultaten är tabulerade i tabell I.

Tabell I Karakterisering av liposomer bärande fusogena och icke fusogena kvaternära ammoniumsalter Humanerytrocyter inkuberade Agglutination Cellfusion med: PC/kolesterol-liposomer.... - - Fritt Q-salt (OH_-salt).... + + PC/kolesterol-liposomer bä- rande Q-salt (OH_-salt).... + +++ Fritt c-salt (c1"-sa1t).... + - PC/kolesterol-C-salt (Cl-- salt) . . . . . . ... . . . . . . . . . . . .. + - Fritt B-salt..... = . ; . . . . . .. + - PC/kolesterol-liposomer bä- rande B-salt............... + - 464 448 Tabell I (forts.) HTC-inkuberade med: Agglutination Cellfusion PC/kolesterol-liposomer.... - - Fritt Q-salt (oH'-sa1t).... + + PC/kolesterol-liposomer bä- rande Q-salt (0H_-salt).... + +++ Fritt C-salt (Cl--salt).... + - PC/kolesterol-C-salt (Cl_- salt) . . . . . . . . ... . . . . . . . . . .. + - B-salt...... . . . . . . ......... + - PC/kolesterol-liposomer bä- rande B-salt . . . . . . . . . . . . ... + - De i tabell I sammanfattade resultaten visar följande: (1) Liposomer sammansatta av PC/kolesterol men utan kvaternära ammoniummolekyler hade ingen inver- kan på agglutinering eller cellfusion av humanerytrocy- ter eller HTC-celler. (2) Alla de använda kvaternära ammoniummole- kylerna (Q-salt, C-salt och B-salt), vare sig i fri form eller införlivade i liposomer, var i stånd att framkalla cellagglutinering. Detta torde bero på bindningen av de positivt laddade kvaternära ammoniumsaltmolekylerna vid de negativt laddade cellmembranerna. (3) Endast Q-saltet, dvs hydroxidsaltet, vare sig i fri form eller införlivat i liposomer, kunde fram- .kalla cellfusion. Framkallandet av cellfusion med lipo- somer oärande Q-salt var mycket högre än med fritt Q- salt. De kvaternära ammoniumklorid- och -bromidsalterna framkallade inte cellfusion trots att de kan bindas vid cellmembraner, såsom kan härledas ur deras förmåga att framkalla cellagglutination.

Fusion av liposomer bärande ett kvaternärt am- moniumhydroxidsalt med celler visas också av deras för- måga att mikroinjicera sitt innehåll i djur- och växt- n 464 448 11 cellers cytoplasma. Tre system har använts för att kons- tatera fusion av Q-salt bärande liposomer med levande celler och mikroinjektion av innehållet i dessa, på föl- jande sätt: (1) Toxinet ricin-A-kedja inneslöts i liposo- merna, och dessa laddade liposomer inkuberades med cel- ler i kultur, såsom HTC. Ricin A inhiberar cellprotein- syntesen och dödar därför celler endast när det före- kommer inne i cellerna. Till skillnad från hela ricin- molekylen (ricin innehållande både A- och B-enheten) kan ricin-A-kedjan inte för sig själv tränga in i cel- lerna. När den förekommer utanför cellen har den såle- des inte någon letal effekt. (2) SVQÛ-DNA, dvs DNA extraherad ur viruset SVQO, inneslöts i liposomerna. Liposomer laddade med SVQO-DNA inkuberades med odlade HTC. Mikroinjektion av Svro-DNA i HTC-cellerna observerade genom uppträdandet av ett specifikt protein, SVQO-T-antigen. Syntes av SV40-T-antigen induceras endast när SV40-DNA införs i cellens cytoplasma varifrån den överförs till cellkärnan.

Det är också att märka, att (a) uppträdande av SVQO-T-antigen förekom endast i levande celler, enär den kräver aktiv proteinsyntes; och (b) fria SV40-DNA-mole- kyler är vid inkubering med levande celler ur stånd att tränga in i cellerna, och dessa fria molekyler framkal- lar således inte syntes av T-antigenet. (3) Fluorescensmärkta proteinmolekyler, näm- ligen fluorescensmärkt bovinserumalbumin, BSA, inne- slöts i liposomerna, Laddade liposomer inkuberades se- dan med antingen växtprotoplaster eller en suspension av växtceller. Fusionsförmedlad mikroinjektion observe- rades genom att uppträdandet av intracellulär fluorescens följdes. 464 448 12 (a) Fusionsförmedlad mikroinjektion av ri- cin-A-kedja med fusogena liposomer De i tabell II sammanfattade resultaten visar, att endast liposomer laddade med ricin-A-kedja och bä- rande det kvaternära ammoniumhydroxidsaltet (Q-saltet) framkallade en stark inhibering av proteinsyntesen och ett höggradigt dödande av HTC. Inget dödande iakttogs vare sig med oladdade liposomer eller med fri ricin-A- kedja. Som synes framkallades mycket litet dödande ut- över kontrollerna av liposomer bärandet det kvaternära ammoniumkloridsaltet (C-saltet), vilket tyder på ingen eller i huvudsak ingen fusion av liposomer och celler.

Tabell II Förmåga hos fusogena liposomer laddade med ricin A att inhibera proteinsyntes och döda HTC HTC inkuberade med Inhibition av HTC dödade proteinsyntes (%) (%) PC/kolesterol-liposomer._.. 0 Fri ricin-A-kedja . . . . . . . . .. 5 PC/kolesterol-liposomer lad- dade med ricin A . . . . . . . . . .. 6 7 PC/kolesterol-liposomer bä- rande Q-salt (OH--salt).... 5 8 PC/kolesterol-liposomer lad- dade med ricin-A-kedja och bärande Q-salt zon'-sawfy.. a 90 95 PC/kolesterol-liposomer lad- dade med ricin-A-kedja och bärande C-salt (Cl_-salt).. 17 14 Ricin-A-kedja fångades först i PC/kolesterol- liposomer med den metod som beskrivs i "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation“, U V) 464 448 13 av Szoka et al, ovan, varefter kvaternärt ammoniumsalt (antingen OH_- eller Cl--saltet) införlivades i liposom- dubbelskiktet, såsom ovan anges. I försöken inkuberades - 20 pg liposomer med 106 celler under 30 minuter vid 37oC, under vilken tid liposomerna reagerade med cellerna. Vid inkubationstidens slut tvättades celler- na och inkuberades ytterligare 12 h i ett odlingsmedium, varefter proteinsyntesen (genom införlivning av 3H-leu- cin) och cellernas viabilitet (genom färgning med try- panblått) bedömdes. (b) Fusionsförmedlad mikroinjektion av SVl, 0 -DNA Resultaten i tabell III visar, att fusogena liposomer kan användas för mikroinjektion av aktiva ge- ner (DNA-molekyler) i celler under kultur, såsom HTC.

Alla försöksbetingelser och inkubationen med HTC var såsom beskrivs i tabell II för ricin A. SVQO-DNA in- stängdes i liposomer, såsom beskrivs i "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation“, av Szoka et al, ovan. Uppträdandet av Svro-T-antigen uppskattades på ovan beskrivet sätt med hjälp av spe- cifik fluorescensmärkt anti-SV~0-T-antigenantikropp.

Tabell III Förmåga hos laddade fusogena liposomer (li- posomer bärande Q-salt) att mikroinjicera Svro-DNA HTC-inkuberad med liposomer SVQO-T-antigen-positiva laddade med Svgo-DNA celler (t av samtliga; PC/kolesterol-liposomer..... 0 PC/kolesterol bärande Q-salt (oH'-salt) . . . . . . . . . . . . . . . . ._ PC/kolesterol bärande C-salt (c1'-salt) . . . . . . . . . . . . . . . . ._ o - 15 464 448 14 Det specifika T-antigenet syntes i kärnan av - 15 % av celler inkuberade med liposomer laddade med SV40-DNA och bärande Q-salt (OH--salt). Inget T-an- tigen syntes i celler inkuberade med PC/kolesterol lad- dade med SVQU-DNA, men bärande C-salt (Cl--salt). (c) Fusionsförmedlad injektion av fluorescent BSA i protoplaster och växtcellssuspension av Petunia hybrida Protoplaster av celler från Petunia hybrida framställdes med konventionella metoder, såsom beskrivs i litteraturen. Fluorescent BSA inneslöts i liposomer, såsom beskrivs för ricin-A-kedja, och sedan införlivades Q-salt i de laddade liposomernas membran, såsom beskrivs ovan. I försöket inkuberades 10 - 20 pg laddade liposo- mer med 5 x 105 protoplaster eller växtceller. Efter - 60 minuters inkubation vid 28°C följdes uppträdan- det av intracellulär fluorescens genom användning av fluorescensmikroskopi.

Tabell IV Fusionsförmedlad injektion av fluorescent bovinserumalbumin i växtprotoplaster av växtcellssus- pension av Petunia hybrida Petunia-protoplaster inkuberade med liposomer laddade med fluor- escent BSA PC/kolesterol........ . . . . . . . . . _.

PC/kolesterol bärande Q-salt (OH_-salt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

Petunia-cellsuspension inkuberad med liposomer laddade med fluorescent BSA PC/kolesterol . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

PC/kolesterol bärande Q-salt (oflf-salt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

Förekomst av intra- cellulär fluorescens (% av samtliga celler) 80 60 (å 464 448 Av resultaten i tabell IV framgår, att lipo- somer bärande Q-salt (OH_-salt) också kan mikroinjice- ” ra sitt innehåll i växtprotoplaster. Uppträdandet av fluorescens kan resultera endast från fusion av de laddade liposomerna med växtprotoplasterna. Varje annan process skulle leda till ett annat slags uppträdande av fluorescens. Resultaten i tabell IV visar, att förutom fusion (eller mikroinjektion) med växtprotoplaster lad- dade liposomer kunde smälta ihop med och mikroinjicera sitt innehåll i växtceller som omges av en cellvägg.

Till följd av närvaron av det starkt laddade Q-saltet synes liposomerna kunna gå genom cellväggen och smälta ihop med cellmembranen.

Användningar av de kvaternärt ammoniumhyd- roxidsalt bärande liposomerna Sedan framställningen av liposomer innehål- lande kvaternära ammoniumhydroxidsalter åskådliggjorts och de kvaternärt ammoniumhydroxidsalt i vesikelmembra- nerna innehållande liposomernas förmåga att smälta ihop med celler och framkalla cellfusion, under mikroinjek- tion av vesiklernas innehåll i cellen påvisats, anges olika användningar av liposomerna enligt uppfinningen. (1) Användning av fritt Q-salt (OH-) eller liposomer bärande Q-salt (OH-) som reagens för att fram- kalla cellfusion Djurcellsfusion, såsom har påvisats för de föreliggande liposomerna, är av största betydelse för genexpressionsundersökningar. Vidare har växtprotoplast- fusion många kommersiella tillämpningar, som kan reda till utveckling av nya växtarter med förbättrade egen- skaper. (2) Användning av fusogena liposomer för mik- roinjektion av olika komponenter i odlade djur- och växtceller Laddade fusogena liposomer kan användas för mikroinjektion av DNA, RNA, proteiner (enzymer, hormoner) *464 44s 16 och läkemedel i odlade celler. Dessutom kan de användas för mikroinjektion av organeller eller andra komponen- ter eller molekyler, som kan inneslutas i liposomerna.

Mikroinjektion av DNA, RNA eller organeller i celler, särskilt i växtprotoplaster eller växtceller, har en väsentlig kommersiell betydelse liksom hela fältet av genetisk teknik med växt- och djurceller. Vidare kan på grundval av försök med växt- och djurceller sägas, att liposomer bärande ett kvaternärt ammoniumhydroxidsalt kan smälta ihop med och mikroinjicera sitt innehåll i vilka som helst celler varmed de kan inkuberas. Såle- des kan dessa liposomer även smälta ihop med bakterie-, jäst- och algprotoplaster. (3) Användning av fusogena liposomer för av- givning av olika komponenter i celler in vivo, nämli- ggn vävnad eller celler av hela djur Fusogena liposomer kan efter injektion i la- boratoriedjur eller människor användas som bärare för avgivning av läkemedel, hormoner eller proteiner, såsom enzymer, och DNA. Denna metod kan användas för drog-, enzym- och genterapi. Icke fusogena laddade liposomer används för närvarande som bärare för läkemedel för te- rapi. Fusogena liposomer kan emellertid bli mycket ef- fektivare än icke fusogena liposomer som biologiska bä- rare, eftersom de injicerar sitt innehåll direkt i cell- cytoplasmat. (4) Användning av fusogena liposomer för ut- veckling av ett nytt icke isotopiskt känsligt analys- system för diagnostiska syften Liposomer bärande kvaternära ammoniumhydroxid- salter smälter ihop med andra liposomer. Fusion mellan liposomerna leder till läckning av deras innehåll. Den- na läckning beror specifikt på samverkan och fusion mel- lan liposomerna. Beroende på närvaro av de positivt lad- dade molekylerna av kvaternärt ammoniumhydroxidsalt, samverkar liposomer bärande dessa kvaternära ammonium- 464 448 17 molekyler inte med varandra, utan repellerar varandra.

Som ovan berörts, kan de samverka och smälta ihop en- dast med liposomer saknande det kvaternära ammoniumhyd- roxidsaltet. Två molekyler med förmåga att samverka med varandra med hög affinitet tvingar emellertid liposomer bärande det kvaternära ammoniumhydroxidsaltet att smälta ihop med varandra genom att övervinna den positiva ladd- ningens repulsionskrafter. Om ett specifikt antigen in- förlivas i de kvaternärt ammoniumhydroxidsalt bärande liposommembranerna, kommer således en mot detta antigen framställd antikropp att driva liposomerna att samverka.

Samverkan mellan liposomer bärande kvaternärt ammonium- hydroxidsalt leder till fusion och frigivning av liposom- innehållet. En kvantitativ uppskattning av frigivnings- processen (frigivning av fluorescerande färgämne eller annat reagens) blir ett mått på samverkan mellan antigen och antikropp. Således kan fusion mellan liposomer bä- rande ett kvaternärt ammoniumhydroxidsalt användas för att kvantitativt bedöma samverkan mellan antikropp och dess antigen eller hormon och dess passande receptor.

Detta system kan därför användas för att bestämma små mängder antigen eller hormon i en biologisk vätska.

Claims (9)

464 448 18 PATENTKRAV

1. Fosfolipidvesikel, k ä n n e t e c k n a d av att den innehåller ett kvarternärt ammoniumhydroxidsalt i ve- sikelns membran, vilket salt ingår i tillräcklig mängd för att göra vesikeln Fusogen.

2. Fosfolipidvesikel enligt patentkrav 1, k ä n n e - t e c k n a d av att det kvarternära ammoniumhydroxidsaltet är en medlem av den grupp som består av cetylbensyldimetyl- ammoniumhydroxid, hexadecyltrimetylammoniumhydroxid, cetyl- trimetylammoniumhydroxid, diisobutylkresoxietoxietyldimetyl- bensylammoniumhydroxid, diisobutylFenoxietoxietyldimetylben- sylammoniumhydroxid, metyldodecylbensyltrimetylammoniumhydroxid, metyldodecylxylenbis(trimetylammoniumhydroxid) och oktylcres- oxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid.

3. Fosfolipidvesikel enligt patentkrav 1, k ä n n e- t e c k n a d av att det kvarternära ammoniumhydroxidsaltet är oktylkresoxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid.

4. Fosfolipidvesikel enligt patentkrav 1, k ä n n e- t e c k n a d av att fosfolipiden är en medlem av den grupp som består av Fosfatidylkolin, dimyristoylfosfatidylkolin, dioleoylfosfatidylkolin, dipalmitoylfosfatidylkolin, distea- roylfosfatidylkolin, sfingomyelin, kolesterol och blandningar därav.

5. Fosfolipidvesikel enligt patentkrav 1, k ä n n e- t e c k n a d av att DNA eller DNA-fragment inkapslats däri.

6. Fosfolipidvesikel enligt patentkrav 1, k ä n n e- t e c k n a d av att en Farmaceutiskt aktiv förening eller beredning är inkapslad däri.

7. Förfarande för att göra en Fosfolipidvesikel fusogen, k ä n n e t e c k n a t av att man i vesikelns membran under bildningen eller efter bildningen av fosfolipidvesikeln in- Förlivar ett kvarternärt ammoniumhydroxidsalt i en mängd, som är tillräcklig För att göra fosfolipidvesikeln fusogen.

8. Förfarande enligt patentkrav 7, k ä n n e t e c k- n a t av att det kvarternära ammoniumhydroxidsaltet är en medlem av den grupp som består av cetylbensyldimetylammonium- hydroxid, hexadecyltrimetylammoniumhydroxid, cetyltrimetyl- ammoniumhydroxid, diisobutylkresoxietoxietyldimetylbensyl- WW 464 443 19 ammoniumhydroxid, diisobutylfenoxietoxietyldimetylbensylammo- niumhydroxid, metyldodecylbensyltrimetylammoniumhydroxid, metyl- dodecylxylenbis(trimetylammoniumhydroxid) och oktylkresoxí- etoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid.

9. Förfarande enligt patentkrav 7, k ä n n e t e c k- n a d av att det kvarternära ammoniumhydroxidsaltet är oktylkresoxietoxietyldimetylbensylammoniumhydroxid.