JPH02500670A - ある種の抗有糸分裂性化学物質のための新規なアジュバント物質、コレラ菌の培養物から該物質を得る方法、該物質を含有する治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ある種の抗有糸分裂性化学物質のための新規なアジュバント物質、コレラ菌の培 養物から該物質を得る方法、該物質を含有する治療薬本発明は、コレラ菌培地の 上澄み液から得られた、アジュバント効果を有する新規な物質、コレラ菌培地の 上澄み液からの抽出により該物質を得る方法および該物質を含む治療用組成物に 関する。

本発明者は、コレラ菌培地の上澄み液から、下記の点で特徴付けられる“Ｄ、　 Ｇ、Ｚ”と名付けたある物質を単離した： −ウーダン法によりラビットに注射した場合、グロース中での二重拡散法におい て抗原−抗体沈降物のバンドの形態で現われ、また、得られた血清に対する免疫 電気泳動により、単一バンドを呈する抗体をラビットに出現させる； −Ｈ遠心分離および電気泳動により得られたその分子量は、実質的に５７０００ ダルトンのオーダーである；−糖類（約２８．３％）、アミノ酸類（約１７％） および脂肪酸類（約９％）からなっている。

本発明によれば、その糖類組成は、実質的に以下の通りである： ラムノース　約４．１％ マンノース　約４２％ ガラクトース　約３２％ グルコース　約２．３％ さらに、本発明によれば、そのアミノ酸組成は、実質的に以下の通りである： アスパラギン　約８．２〜８．７％ グルタミン　約８．９〜１０．５％ セリン　約５．５〜７．２％ グリシン　約４．４〜８．６％ ヒスチジン　約２．３〜３．４％ アルギニン　約２．８〜４．１％ トレオニン　約５．１〜５．６％ アラニン　約７．２〜８．１％ プロリン　約５．８〜７．６％ アンモニア　約１１．０〜１４．７％ チロシン　約２．０〜２．９％ バリン　約５．６〜６．３％ メチオニン　約０．９〜１．２％ システィン　約０．６〜１．１％ イソロイシン　約２．４〜２．８％ ロイシン　約６．９〜８．８％ フェニルアラニン　約３．４〜４．２％リジン　約４．６〜７．０％ 本発明によれば、その脂肪酸組成は、実質的に以下のＣ１ｏ−Ｃ２ｏ脂肪酸から なっている：Ｃ１ｏ　約４．５％ Ｃ１□　約１５．４％ Ｃ１ｏ、３０Ｈ約１５．５％ Ｃ１２約１４．５％ Ｃ１３約５．２％ Ｃ１゜、３０Ｈ約１．７％ Ｃ１４約０．９１％ Ｃ１３，３０Ｈ約０．１％ Ｃ１４，３０Ｈ約０．１％ 本発明は、さらに本発明によるコレラ菌上澄みから抽出されたアジュバント物質 およびこれと組合わされた少なくとも一種の有糸分裂阻止剤を含むことを特徴と する抗有糸分裂性組成物に関する。

この抗有糸分裂性組成物の好ましい実施例においては、有糸分裂阻止剤は、シス プラチン、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、マイトマイシンからなる グループから選択することがより好ましい。

この抗有糸分裂性組成物の他の好ましい実施例においては、アジュバントと有糸 分裂阻止剤は、組成物中に約１〜１０のアジニバント／有糸分裂阻止剤比で存在 する。

本発明は、さらに、上記の如く定義されたアジニバント効果を有する物質をコレ ラ菌培地から得る方法を目的とする。

本発明によれば、この様な物質を得る方法は、コレラ菌培地上澄み液が沈降せし められ、遠心処理され、遠心処理残渣が蒸溜水に溶解され、次いで、該溶液が加 熱され、遠心処理され、透析され、凍結乾燥されて、上記の抗有糸分裂効果を有 する物質が得られる。

本発明方法の好ましい実施例においては、培地上澄み液は、約３７℃で約８時間 培養され、菌数約１０１°個／ｍ１の割合で緩衝生理水溶液中に集められた栄養 アルカリ性ゲロース上でのコレラ菌培地から得られる。この培地は、子牛トリプ シン処理およびペプトン処理されたアルカリ性の水を含む培養フラスコ中で接種 され、次いで、約３７℃のインキュベーター内の該フラスコ中で連続攪拌下に約 １８〜２０時間にわたり、培養が継続され、培養物が収得され、遠心分離され、 得られた培地上澄み液が、本発明のアジュバント物質を得るために、集められる 。

上記のアジニバント効果を示す物質を得るための他の方法は、コレラ菌の培地上 澄み液をクロロホルムで処理して、デカンテーションにより除去さるべきクロロ ホルム−蛋白質ゲルを形成させ、水相中に本発明のアジュバント物質を形成させ ることを特徴とする。

本発明は、上述の態様以外にも、以下の記載から明らかとなる他の態様を包含す る。

本発明の特徴とするところは、以下の記載からより一層明確なものとなろう。以 下の記載は、本発明によるアジュバント物質の製造の一例、該物質の活性を示す 一例および臨床レポートの一例を示す。

しかしながら、これらの実施例は、本発明の目的を例示するためにのみ挙げられ たものであって、本発明を限定するものでないことは、容易に理解されよう。

実施例１一本発明の新規なアジュバント物質の調製培養は、ガラスポールで半分 充填されており、滅菌器で滅菌された２１−フエルンバッハフラスコ中で行われ 、最終的にｐＨ８，２のアルカリ性ウシトリプシン化ベプトン化水（ｃａｌｆ　 ｔｒｙｐｓｉｎｉｚｅｄ　ｐｅｐｔｏｎｉｚｅｄ　ｗａｔｅｒ　）で２００ｍ１ に調整する。

ビブリオ菌として、ストックホルムＮα２０と称され、発明者により選択された オガヮコレラ菌（アンスティトウー　バストウール（ｌｎｓｔｊｔｕｔ　Ｐａ５ ｔｅｕｒ）内のナショナル　ヴイブリオ　リファレンス　センター（Ｎａｔｉｏ ｎａｌＶｉｂｒｉｏ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託）を用いた。

ｍｌ当たりの菌体数は、３７℃で８時間培養されたアルカリ性栄養ゲロース培養 物の１試験管についての全体菌数に基づく。なお、培養物は、２０ｍ１の緩衝生 理水に採取されている（実質的菌体数１０１０／ｍｌ）。

フェルンバッハフラスコにこの培養物を接種し、連続的に攪拌しつつインキュベ ータ内で３７℃で１８〜２０時間培養し、その後生成物を取り、５０００　ｒｐ ｍで２０分間遠心分離する。

次いで、培養上澄み液を２８％最終濃度でポリエチレングリコールにより沈澱さ せる。上澄みを２０，０００Ｇで２０分間遠心分離する。上澄みを棄て、残渣を 乾燥し、蒸溜水に溶解する。溶液を均質化させるために数個のボールを用い、生 成物を全体的に溶解させるように、蒸溜水を徐々に加える。

かくして得られた溶液を１００℃の水浴で３０分間温める。

２０．０ＯＯＧで２０分間遠心分離した後、蒸溜水で透析し、凍結乾燥し、重量 を計る。

実施例２一本発明の新規なアジュバント物質の製造ストックホルムＮ０．２０株 のコレラ菌培養物の上澄みを実施例１と同様の方法で作成し、５０ｍ１の上澄み につき１００ｍ１の市販のクロロホルムで処理する。デカンテーションにより容 易に除去できるクロロホルム−蛋白質ゲルが形成される。本発明の新規なアジュ バント物質を水層から回収し、実施例１と同様に処理する。

本発明のアジュバント物質の活性をインビトロまたはインビボの方法で測定する 。

Ａ、インビトロ １、サルコーマ１８０　（Ｓａｒｃｏｌａ　１８０　）細胞の細胞培養物につい て活性を調べた。即ち、ｐＨ８，２のアルカリ性ウシトリプシン化ペプトン化水 によって調製された培地に該細胞を接種し、本発明のアジュバント物質の量を増 加させることにより、活性を測定した。

アジュバント物質の活性は、２４時間の生着色（ｖｉｔａｌ　ｃｏｌｏｒａｔｉ ｏｎ）による生菌数で評価した。

本発明のアジュバント物質とシスプラチンとを組み合わせた場合の活性を同様の 方法で測定した。

得られた結果を第１図、第２図及び第３図にそれぞれ示す。これらは、インビト ロで培養する場合、サルコーマ１８０細胞は、ＤＧＺの存在下に６日目乃至７日 目まで増殖し、１０ε細胞／ｍｌになることを示している。

第１図は、時間の関数として表したＤＧＺのみの存在下のサルコーマ１８０細胞 培養物（１０６細胞／ボツクス）の％生育能（カーブｌｂ）と、比較対照である サルコーマ１８０細胞のみの培養物の％生育能（カーブｌａ）を示す。

比較培養物の生育能は、５日目と６日目の間に８０％で最大となった後、８日目 に約４０％になる。一方、ＤＧＺのみの存在下においては、生育能は２日目（約 ９０％）から８日目（約６０％）まで規則的に減少する。

第２図は、時間の関数として表したシスプラチン及びＤＧＺの存在下のサルコー マ１８０細胞培養物（１０６細胞／ボツクス）の％生育能を示す。生育能が、１ 日目の８０％から８日目の約１５％まで規則的に低下していることが明らかであ る。

第３図は、時間の関数として表したシスプラチンのみの存在下のサルコーマ１８ ０細胞培養物（１０６細胞／ボツクス）の％生育能を示す。

カーブは、１日目の約９０％から８日目の約１５％への規則的減少を描く。

２、本発明のアジュバント物質の活性を、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）の 存在下または不在下にマイクロウェルにおける単核ヒト血球の培養物の３Ｈ−チ ミジンの取り込みを測定することによって、評価した。なお、フィトヘムアグル チニンは、アジュバント物質の濃度が０．１から１０００ｍｃｇ　／ｍｌとなる ように、１１５００に希釈されている。ＰＨＡの存在下においては、細胞内の３ Ｈ−チミジンの顕著な増加を可能にする用量依存的な活性がみられる。

得られた結果を第４図及び第５図にそれぞれ示す。

第４図において、カーブαは、ＤＧＺ及びシスプラチンの両方の存在下（ＤＧＺ は異なる濃度または一定の濃度で存在する）におけるチミジンの取込みを示す。

カーブβは、ＤＧＺのみの存在下におけるチミジンの取込みを示す。

第５図のカーブα及びβは、第４図の対応するカーブと同じ意味を有する。但し 、被験物質（ＤＧＺ＋シスプラチン又はＤＧＺのみの存在下）は、第４図に比べ て２倍に希釈されて存在する。

３、毒性試験 体重的２０ｇのＢａ１ｂ／ｃマウスを用いて実施された。　急性毒性：２０ｍｇ の腹腔内投与は、毒性を全くもたらさない。

慢性毒性＝１週２回の４週間にわたる１６〜２０ｍｇの腹腔内投与は、下痢を惹 起する。

Ｂ、インビボ １、サルコーマ１８０細胞１０６個をＢａ１ｂ／ｃ７ウスに接種し、２４時間目 から４日間本発明のアジュバント物質２ｍｇを単独で或いはシスプラチンと併用 して腹腔内注射して、試験を行った。

下記の結果が得られたニ 一本発明物質２ｍｇとシスプラチン０．０１２５ｍｇとを併用した場合、この実 験の条件では、８０〜９０％のマウスが腹水又は腫瘍を伴うことなく生存した。

どんな用曾の細胞も再接種できなかったことに注目すべきである。

得られた結果を第６図及び第７図に示す。これらの図は、生存マウス数（縦軸） を時間（日）（横軸）の関数として示したものである。

第６図は、サルコーマ１８０細胞１０６個を接種され、緩衝生理水を週２回４週 間注射されたマウスの生存率を示す＝１２１２日目存マウスは観察されなかった 。

第７図は、１０６個のサルコーマ１８０細胞を接種され、１００℃で１時間加熱 されたＤＧＺ　（含ペプトン水に溶解）及びシスプラチンを下記の用法で注射さ れたマウスの生存率を示す： １群２０匹のマウスの内、１８匹が投与開始後７５日目にも生存していた（２匹 が３９日目に死亡した）。

２、黒色Ｃ５７マウスにルイス（Ｌｅｗｉｓ　）腫瘍細胞を接種しく左後肢に１ ０４細胞）、試験した。投与されたマウス及び対照のマウスにおいて、肢の厚み を測定し、腫瘍の悪化を評価する。０．２０ｍ１の容量で同じ注射器に本発明物 質１ｍｇ及びシスプラチン０．０１２５ｍｇを入れ、これをマウス−匹について の１日量として４日間腹腔内投与した。

結果は以下の通りである：投与されたマウスの７０％が腫瘍または転移を起こす ことなく生存した。

引き続き、１０６〜１０８個のルイス細胞を接種することはできなかった。

結果を第８図〜第１０図に示す。これらの図は、後肢の厚みの増加（關）を時間 の関数（日）として示したものである。

第８図において、１０４個のルイス細胞を接種し、次いでＤＧＺとともにシスプ ラチンを４日間投与した後、投与されたマウスにおいて、接種後１２日目から１ ５日目に突然の厚みの増加（４，７ｍｍから６．２　＋ｎｍ、即ち１．５　ｍｍ ）が観察された。一方、シスプラスチンのみを投与されたマウスの場合（第９図 ）、厚みは２．５龍になった。緩衝生理水を投与した対照のマウスの場合、４． ３ｍｍというはるかに大きい増加が観察された（第１０図）。

３、ＬＴＣＨマウスにマウス奇形芽腫細胞を接種し、更に試験した。

腫瘍の形成は、対照マウスにおいて、雌性マウスで４５日、雄性マウスで６０日 かかった。投与は、ルイス腫瘍細胞を接種された細胞について述べたと同様にし て実施した（本発明物質１＋ｎｇ＋シスプラチン０．０１２５ｍｇ／マウス／日 で４日間）：雌性ＬＴＣＨマウス１０匹の内、１匹で対照のマウスと同じ時に腫 瘍性腹水がみられた；雄性マウスにおいても同様に１０匹の内１匹で腫瘍性腹水 がみられた。投与マウスの９０％が腫瘍または奇形芽腫を発症することなく生存 することを示すこれらの結果は、マウスの奇形芽腫がその悪化状況において女性 の卵巣の腫瘍に最も近い腫瘍であることから、より大きな興味をもたらす。

実施例４−臨床試験報告 Ａ１．外科術後の患者への本発明アジュバント物質の腹腔内投与： ・症例の３３．３％で単独投与 ・症例の６６．６％でその他の抗有糸分裂剤の少なくとも　一種と併用投与 ６０％の生存率が、腹水の消失とともに観察された。

Ａ２．再発した患者への投与 再発患者の生存平均期間は、治療として従来の如何なる抗有糸分裂剤を投与しよ うとも、通常１２力月を越えることはない。

本発明の物質の腹腔内投与を ・単独で或いは ・他の抗有糸分裂剤の少なくとも一種とを併用することにより行なったところ、 目覚ましい結果を得た。

即ち、失敗串は５％にすぎず、再発患者の生存期間は１３〜９２力月であった。

しかも、腹水及び腹水の存在に関連した巨大腹の完全な消失がみられた。従って 、病気そのものの少なくとも一時的な改善ばかりか、患者の肉体的外観及び安楽 さの改善の結果に基づく心理的な点からも相当の改善を得た。

転移性癌の他の形態（肺、消化官）においても、主な腫瘍及び転移腫瘍の減少を 伴う同様の結果を得た。投与条件は、卵巣癌の治療で採用したものと同じであっ た。

以上から明らかなように、本発明は、ここにより明白に記載されている実施方法 、実施態様及び適応方法に限定されるものではなく、それどころか、本発明の範 囲及び意図からはずれることなく、当業者が考え付く全ての方法をも含む。

国際調査報告 、ＪＣＴ／ｒＰ、　８８７００１６７ 国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．アジュバント効果を有する新規材料であって、−試験哺乳動物に注射した場 合に、該動物に抗体を発現せしめ； −その分子量が実質的に約５７０００ダルトンであり；−糖類（約２８．３％） 、アミノ酸類（約１７％）および脂肪酸類（約９％）を含む ことを特徴とする新規材料。
2. ２．糖類の組成が、実質的に ラムノース約４．１％ マンノース約４２％ ガラクトース約３２％ グルコース約２．３％ からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の材料。
3. ３．アミノ酸類の組成が、実質的に アスパラギン約８．２〜８．７％ グルタミン約８．９〜１０５％ ヤリン約５．５〜７．２％ グリシン約４．４〜８．６％ ヒスチジン約２．３〜３．４％ アルギニン約２．８〜４．１％ トレオニン約５．１〜５．６％ アラニン約７．２〜８．１％ プロリン約５．８〜７．６％ アンモニア約１１．０〜１４．７％ チロシン約２．０〜２．９％ バリン約５．６〜６．３％ バリン約５．６〜６．３％ メチオニン約０．９〜１．２％ システイン約０．６〜１．１％ イソロイシン約２．４〜２．８％ ロイシン約６．９〜８．８％ フェニルアラニン約３．４〜４．２％ リシン約４．６〜７．０％ からなることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の材料。
4. ４．脂肪酸類の組成が、実質的に Ｃ１０約４．５％ Ｃ１１約１５．４％ Ｃ１０，３０Ｈ約１５．５％ Ｃ１２約１４．５％ Ｃ１３約５．２％ Ｃ１２′３０Ｈ約１．７％ Ｃ１４約０．９１％ Ｃ１３′３０Ｈ約０．１％ Ｃ１４′３０Ｈ約０．１％ Ｃ１６１約０．１３％ Ｃ１６約１．０５％ Ｃ１８１約０．５％ Ｃ１８約２．５％ Ｃ１９約０．１３％ Ｃ２０約０．５％ Ｃ１５約０．５５％ なる割合のＣ１０からＣ２０までの脂肪酸で構成されていることを特徴とする請 求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の材料。
5. ５．コレラ菌上澄み液から抽出されたことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第 ４項のいずれかに記載の材料。
6. ６．請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載のアジュバント物質と少なく とも一種の有糸分裂阻止剤との組合わせからなる抗有糸分裂性組成物。
7. ７．有糸分裂阻止剤が、シスプラチン、５−フルオロウラシル、アドリアマイシ ン、マイトマイシンからなるグループから選択されることを特徴とする請求の範 囲第６項に記載の組成物。
8. ８．アジュバントと有糸分裂阻止剤が、組成物中に約１〜１０のアジユバント／ 有糸分裂阻止剤の割合で存在することを特徴とする請求の範囲第６項または第７ 項に記載の組成物。
9. ９．コレラ菌の培地からアジュバント効果を有する物質を得る方法であって、コ レラ菌培地上澄み液を沈降させ、遠心処理し、遠心処理残渣を蒸溜水に溶解し、 次いで、該溶液を加熱し、遠心処理し、透析し、凍結乾燥して、請求の範囲第１ 項乃至第５項のいずれかに記載のアジュバント効果を有する物質を得る方法。
10. １０．培地上澄み液が、約３７℃で約８時間培養され、菌数約１０１０個／ｍｌ の割合で緩衝生理水溶液中に集められる栄養アルカリ性ゲロース上のコレラ菌培 地から得られ、この培地は、子牛トリプシン処理およびペプトン処理されたアル カリ性の水を含む培養フラスコ中で接種され、次いで、約３７℃のインキニベー ター内の該フラスコ中で連続撹拌下に約１８〜２０時間にわたり、培養が継続さ れ、培養物が収得され、遠心分離され、得られた培地上澄み液が、請求の範囲第 １項乃至第５項のいずれかに記載のアジュバント物質を得るために、集められる ことを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．コレラ菌の培地からアジュバント効果を有する物質を得る方法であって、 コレラ菌培地上澄み液をクロロホルムで処理して、デカンテーションにより除去 さるべきクロロホルムー蛋白質ゲルを形成させ、水相中に請求の範囲第１項乃至 第５項に記載のアジュバント物質を集めることを特徴とするアジュバント効果を 有する物質の製造方法。