JP3866337B2 - 新規なリピドａ及びｌｐｓ並びにこれを産生する光合成細菌 - Google Patents
新規なリピドａ及びｌｐｓ並びにこれを産生する光合成細菌 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なリピドＡ及びリポ多糖（以下ＬＰＳという）並びにこれを産生する光合成細菌に関する。本発明のリピドＡ及びＬＰＳは、ＣＳＦ(colony stimulation factor) の誘導作用活性を有し、かつ毒性が低いので健康食品、食品添加物として、さらには医薬として利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
腸内細菌等グラム陰性菌の細胞壁表面には、ＬＰＳが存在する。ＬＰＳは脂質（リピドＡ）と多糖の複合体であり、菌体内毒素の主成分であることが知られている。菌体内毒素の生物活性については、リピドＡがその活性中心部分であることも知られているが、リピドＡの組成、構造及び生物活性は、菌種によって多少異なる。
【０００３】
代表的腸内細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリピドＡは、以下の化１に示す構造を有することが知られている。
【０００４】
【化１】
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記大腸菌のリピドＡは、血液幹細胞の増殖分化因子であるＣＳＦの誘導作用活性を有することが知られているが、毒性が高いため食用に供することができない。
【０００６】
本発明は、ＣＳＦ活性などの生体の免疫賦活的活性が高く、しかも毒性の低いリピドＡを提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究の結果、ある種の光合成細菌の細胞壁表面にあるＬＰＳから抽出されるリピドＡが、大腸菌由来のリピドＡと比較してＣＳＦ活性はやや劣るが、毒性が極めて低いことを見いだした。
【０００８】
すなわち、本発明は、糖鎖と、該糖鎖とエステル結合した型の脂肪酸及びアミド結合した型の脂肪酸との複合体であるリピドＡにおいて、該糖がグルコサミン、マンノース又は名称不明の糖からなることと；該エステル結合した型の脂肪酸が炭素原子数１２の直鎖飽和脂肪酸であることと；該アミド結合した型の脂肪酸が炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端の炭素原子と末端から２番目の炭素原子との間の結合が二重結合である直鎖不飽和脂肪酸、及び炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端から３番目の炭素原子に結合する水素原子１つが水酸基により置換された直鎖飽和脂肪酸であることと；該リピドＡがリンを包含しないことと；質量が１９２８．９であることとを特徴とするリピドＡを提供する。
【０００９】
本発明は、前記リピドＡを包含するＬＰＳをも提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５８７１で寄託されたランプロバクター（Lamprobacter）属の光合成細菌を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のリピドＡについて詳細に説明する。
【００１２】
本発明のリピドＡを構成する糖は、グルコサミン、マンノースおよび名称不明の糖である。グルコサミン：マンノース：名称不明の糖を合わせると構成糖は、３〜５個と考えられる。
【００１３】
本発明のリピドＡを構成する脂肪酸は、前記糖とエステル結合した型の脂肪酸が炭素原子数１２の直鎖飽和脂肪酸（以下「１２：０の脂肪酸」という）であり、また前記糖にアミド結合した型の脂肪酸が炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端の炭素原子と末端から２番目の炭素原子との間の結合が二重結合である直鎖不飽和脂肪酸（以下「１４：１の脂肪酸」という）、及び炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端から３番目の炭素原子に結合する水素原子１つが水酸基により置換された直鎖飽和脂肪酸（以下「３−ＯＨ−１４：０の脂肪酸」という）である。
【００１４】
本発明のリピドＡには、リンは包含されていない。
【００１５】
本発明のリピドＡは、高速原子衝撃法−重量分析法（以下「ＦＡＢ−ＭＳ」という）により測定した質量が１９２８．９である。
【００１６】
本発明のリピドＡの構造は、それを構成する糖として、マンノース及び名称不明の糖を包含している点、さらにはリンを含んでいない点において大腸菌由来のリピドＡと大きく異なる。
【００１７】
本発明のリピドＡは、後に詳細に説明するLamprobacter属の新規な光合成細菌（以下「ＴＰ−５」という）を出発物質として、それ自体は公知の、リピドＡの抽出方法に準じて製造することができる。以下に、本発明のリピドＡの製造方法の一例を示す。
【００１８】
ＴＰ−５の脱脂乾燥菌体を、温フェノール法により抽出し、水層に粗ＬＰＳを得る。得られた粗ＬＰＳを、酵素処理に供し、精製ＬＰＳを得る。次いで、ＬＰＳを酸加水分解し、精製することによりリピドＡが得られる。
【００１９】
より詳しくは、本発明のリピドＡは、通常、４５％〜５０％のフェノールを用い、通常、６５℃〜７０℃で、１０分〜２０分間抽出する。４５％フェノールで抽出する場合には、例えば、９０％フェノール水溶液と、同量のＴＰ−５の水縣濁液とを混合して、フェノールの終濃度を４５％として抽出することができる。
【００２０】
粗ＬＰＳを含む水層は、水で透析することにより、フェノール、塩類のような低分子を除去することができる。
【００２１】
粗ＬＰＳの酵素処理には、ＲＮａｓｅ−Ａを用いることができる。
【００２２】
酵素処理は、用いる酵素の種類により適宜設定することができるが、通常、ｐＨ５．０、温度３７℃、で１２〜１６時間行なう。
【００２３】
酵素処理した粗ＬＰＳは、通常１０5 ×ｇ〜１．５×１０5 ×ｇの超遠心に３時間〜４時間供すると、沈殿に精製ＬＰＳが得られる。
【００２４】
この精製ＬＰＳは、通常、濃度０．１規定〜０．２規定の例えば酢酸、塩酸等の酸により、１００℃〜１２０℃の温度で、２〜８時間加水分解する。これを遠心に供し、沈殿にリピドＡが得られる。このリピドＡは、クロロホルム：メタノール（４：１、体積比）に溶解し、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いることにより精製することができる。
【００２５】
本発明のリピドＡのＣＳＦ誘導作用活性は、大腸菌リピドＡのそれと同等又はそれよりも若干弱い。しかしながら、本発明のリピドＡは、大腸菌由来のリピドＡに比べて極めて低い毒性を有するという利点を有する。
【００２６】
本発明は、上記方法により製造されたＴＰ−５由来の新規なＬＰＳをも提供するものである。
【００２７】
以下、本発明のＬＰＳを詳細に説明する。
【００２８】
本発明のＬＰＳは、少糖の繰返し単位であるＯ抗原性多糖にＲコアオリゴ糖がつき、それがさらにＫＤＯ(3-keto-3-deoxyoctonate)を介して本発明のリピドＡに結合する複合体であるいわゆるＩ型のＬＰＳである。
【００２９】
本発明は、上述した本発明のリピドＡの製造方法における出発物質であるＴＰ−５も提供するものである。
【００３０】
以下、本発明のＴＰ−５について詳細に説明する。
【００３１】
ＴＰ−５は、通産省工業技術院 生命工学工業技術研究所に平成８年９月１９日から受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５８７１として寄託された。
【００３２】
ＴＰ−５は、Chromatiaceae 科（紅色硫黄細菌：Purple sulfur bacteria) 、Lamprobacter属に属し、以下に記載する形態、生化学的性状のうち、特にビタミンＢ12要求性がないこと、ＮａＣｌ要求性がないことが、公知の種(Lamprobacter modestohalophilus 種）と異なるため、新規な種と判定した。なお、Lamprobacterは、１種しか報告されていない。（Gorlenko, V.M., E.N. Krasil'nilova, O.G. Kikina and N.Y. Tatarinova, 1988. In Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB, Int. J. Syst. Bacteriol. 38:220-222)
（ａ）形態
（１）卵型状、短桿状
（２）グラム染色性：−
（３）莢膜(slime) ：−
（４）細胞内硫黄粒：＋
（５）ガス胞：＋
（ｂ）生育状態
（１）菌体懸濁液：紅色
（ｃ）生理的性質
（１）微好気ないしは嫌気状態で成長する
（２）細胞中に硫黄粒の生成
（３）成長最適温度：３０℃付近
（４）ＮａＣｌ要求性：−
（ｄ）炭素源の利用性
（１）グルコース：−
（２）シュクロース：−
（３）マンノース：−
（４）フラクトース：＋
（５）ラクトース：−
（６）マンニット：−
（７）ソルビトール：−
（８）スターチ：−
（９）フォルメイト：−
（１０）アセテート：＋
（１１）パイルベート：＋
（１２）プロピオネート：＋
（１３）マレート：＋
（１４）サクシネート：＋
（１５）グリセロール：＋
（１６）メタノール：−
（１７）エタノール：−
（ｅ）その他
（１）ビタミンＢ12要求性：−
（２）培養液（生細胞）の吸収スペクトル：８００、８５５ｎｍ付近に吸収極大を有する。図１に吸収スペクトルを示す。
【００３３】
本発明のＴＰ−５は、以下に記載する方法により製造することができる。
【００３４】
長崎県大村湾河口から採取した泥を０．８％（重量）寒天を加えた実施例１の培養液で培養し、生えてきた菌のコロニーをさらにビタミンＢ12を除いた培養液で培養し、色調、硫黄粒、ガス胞、莢膜及び形態で選択する。
【００３５】
本発明のＴＰ−５には、大腸菌とほぼ同量のＬＰＳが含有されることが分かった。したがって、本発明のＴＰ−５は、本発明のリピドＡ及びＬＰＳの製造に有用に用いることができる。
【００３６】
以上説明したように、本発明のリピドＡ、ＬＰＳ及びＴＰ−５は、ＣＳＦ誘導作用活性が高く、しかも毒性がきわめて低い。したがって、本発明のリピドＡ、ＬＰＳ及びＴＰ−５は、健康食品、食品添加物として、さらには医薬として使用することができる。
【００３７】
本発明のリピドＡを医薬として用いる場合、水溶液中にエマルジョン化した状態で、あるいはカプセル中に封入、又は経口剤に添加した状態で、経口薬として、用量として０．１μｇ〜１ｇの範囲で、好ましくは１０μｇ〜１００ｍｇの範囲で用いることができる。注射薬としては用量として０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇの範囲で用いることができる。また皮膚からの吸収を考慮した湿布薬として、用量としては１μｇ〜１ｇの範囲で用いることができる。
【００３８】
本発明のＬＰＳを健康食品、特定保健用食品あるいは食品添加物として用いる場合、クロレラや他の食物に添加した状態、あるいは水溶液中に添加した状態で、用量として０．１ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０ｇの範囲で用いることができる。
【００３９】
ＬＰＳを医薬として用いる場合、経口剤に添加した状態で、あるいは水溶液中に添加した状態で、用量として０．１ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０ｇの範囲で用いることができる。注射薬としては用量として１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１０μｇ〜１００ｍｇの範囲で用いることができる。また皮膚からの吸収を考慮した湿布薬として、用量としては１０μｇ〜１００ｇの範囲で用いることができる。
【００４０】
本発明のＴＰ−５を健康食品、特定保健用食品あるいは食品添加物として用いる場合、クロレラや他の食品に添加した状態、あるいはＴＰ−５の熱水抽出物（菌体を１００℃の熱水で２０分間加熱した後に得られる抽出物（以下、「熱水抽出物」という））を含む水溶液の状態で、用量として１０ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇの範囲で用いることができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
実施例１
（１）ＴＰ−５の培養
菌体の培養には以下に記載する化合物を１リットルの蒸留水に溶解した培養液（以下「培養液１」という）、以下に記載する培養液２及び培養液３を用いた。
【００４３】
培養液１で用いた化合物
ＣＨ3 ＣＯＯＮａ ０．５ｇ
ＫＨ2 ＰＯ4 １．０ｇ
ＮＨ4 Ｃｌ １．０ｇ
ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ
ＥＤＴＡ- ２Ｎａ ２ ｍｇ
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ ｍｇ
Ｈ3 ＢＯ3 １００ μｇ
ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ １００ μｇ
ＺｎＣｌ2 １００ μｇ
ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ １００ μｇ
Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２０ μｇ
ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２０ μｇ
ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １０ μｇ
Ｎａ2 ＳｅＯ3 １ μｇ
チアミン−ＨＣｌ ５００ μｇ
ナイアシン ５００ μｇ
ｐ−アミノ安息香酸 ３００ μｇ
ビタミンＢ12 ５０ μｇ
ピリドキシン−ＨＣｌ １００ μｇ
ビオチン ５０ μｇ
培養液２：Ｎａ2 Ｓ・９Ｈ2 Ｏ ０．２５ｇ／１０ｍｌ
培養液３：４％のＮａＣＯ3 ２５ｍｌ
上記培養液１及び培養液２を、１２１℃、１５分間オートクレーブで別々に滅菌した。培養液３は、ろ過滅菌した。
【００４４】
継代培養
培養液１及び培養液２を冷却後、培養液３を加えすばやく撹拌し、スクリューキャップ付試験管（全容量２０ミリリットル）にほぼ満たすまで入れてから試験管のキャップを閉めた。得られた培地入試験管は、よく振った後、一昼夜冷暗所に放置し、培地内を完全に嫌気的にした。この状態で１カ月程度の保存ができる。１昼夜以上放置した培地に菌を含む溶液を培養液２０ミリリットルに対して１〜２滴加えて培養を開始した。通常、室内（できれば暗所）に数時間から１昼夜放置し、その後光照射下（弱光）に移して光合成培養を開始した。５〜７日間培養を続け、継代を繰返す。
【００４５】
ＴＰ−５の生産培地としては、培養液１のＣＨ3 ＣＯＯＮａを２．０ｇ／リットルに増加した上記の培地を５リットル用して培養し、培養期間５〜７日間で、１．５〜２．０ｇ（乾燥重量）のＴＰ−５を得た。
【００４６】
（２）ＬＰＳの調製
上記（１）で得られた脱脂菌体２０ｇに４５％フェノールを７５０ミリリットル添加し、６８℃で１５分間抽出した。水層を水で透析した後、凍結乾燥し、１．６ｇの粗ＬＰＳが得られた。粗ＬＰＳをｐＨ５．０、３７℃で１２時間ＲＮａｓｅ−Ａ（WORTHINGTON BIOCHEMICAL CORPORATION 製）処理し、超遠心（１０5 ×ｇ、３時間、２回）し、得られた沈殿を凍結乾燥し、０．２ｇの精製ＬＰＳが得られた。
【００４７】
（３）リピドＡの調製
上記（２）で得られた乾燥ＬＰＳ１．０ｇに０．２規定酢酸を１００ミリリットル添加し、１００℃で３時間加水分解した。沈殿（０．０５ｇ）を１〜２ミリリットルのクロロホルム：メタノール（４：１、体積比）溶液に溶解させた。これを薄層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣという）に２回かけ精製した。得られたリピドＡは、以下に示すリソ−リピドＡの調製、並びにリピドＡのリンの測定、糖分析、脂肪酸分析及び質量分析に供した。
【００４８】
（４）リソ−リピドＡの調製
上記（３）で得られたリピドＡ０．０２ｇに０．２規定ＫＯＨ−メタノール２０ミリリットルを添加し、３７℃で１４時間加水分解した。沈殿（０．００４ｇ）をクロロホルム：メタノール（４：１、体積比）に溶解させる。これをＴＬＣに２回かけ、リソ−リピドＡを精製した。リソ−リピドＡは、リピドＡからエステル結合型脂肪酸を除いたものである。
【００４９】
（５）リピドＡのリンの測定
上記（３）で得られたリピドＡをＴＬＣで展開し、ディットマー−レスター(dittmer-Lester)試薬を噴霧してリンの有無を確認したが、リンは確認されなかった。
【００５０】
同様にして、ＴＬＣで展開したリピドＡをバートレット(Bartlett)法により非色定量したが、リンは検知されなかった。
【００５１】
（６）リピドＡの糖分析
上記（４）で得られたリソ−リピドＡを２．０モル／リットルのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて１２０℃で２時間加水分解した。得られた糖画分を回収し、アルジトールアセテイト化し、ガスクロマトグラフィー（5890 SERIES II、HEWLETT-PACKARD 製）（以下「ＧＣ」という）、次いでＧＣで得られたピーク部分の重量分析（JEO L-SX 102、日本電子製）（以下「ＭＳ」という）により分析した。得られた結果を図２（ＧＣ）、図３〜５（ＭＳ）に示す。
【００５２】
図２〜５の結果より、リピドＡは、グルコース、マンノースおよびもう１種未知の糖から構成されることが明らかになった。
【００５３】
７）リピドＡの脂肪酸分析
ａ）エステル結合型脂肪酸の分析
上記（３）で得られたリピドＡに０．２規定ＫＯＨ−メタノールを添加し、３７℃で１４時間加水分解した後、脂肪酸分画を回収し、メチルエステル化し、ＧＣ、次いでＧＣにより得られたピーク部分のＭＳにより分析した。得られた結果を図６（ＧＣ）、図７（ＭＳ）に示す。
【００５４】
図６〜７に示した結果から、エステル型脂肪酸は、１２：０の脂肪酸であることがわかった。
【００５５】
ｂ）アミド結合型脂肪酸の分析
上記（４）で得られたリソ−リピドＡに６．０規定ＨＣｌを添加し、１００℃で２時間加水分解した後、脂肪酸分画を回収し、メチルエステル化し、ＧＣ、次いでＧＣにより得られたピーク部分のＭＳにより分析した。得られた結果を図８（ＧＣ）、図９〜１０（ＭＳ）に示す。
【００５６】
図８〜１０に示した結果から、アミド型脂肪酸は、３−ＯＨ−１４：０の脂肪酸及び１４：１の脂肪酸であることがわかった。
【００５７】
ｃ）全脂肪酸の分析
上記（３）のリピドＡを６．０規定ＨＣｌを用いて１００℃で２時間加水分解した後、脂肪酸分画を回収し、メチルエステル化し、ＧＣ、次いでＧＣにより得られたピーク部分のＭＳにより分析した。得られた結果を図１１（ＧＣ）、図１２〜１４（ＭＳ）に示す。
【００５８】
図１１〜１４から明らかなように、３−ＯＨ−１４：０、１４：１および１２：０の脂肪酸が確認された。
【００５９】
（８）リピドＡの質量分析
上記（３）のリピドＡを高速原子衝撃法−重量分析法（以下「ＦＡＢ−ＭＳ」という）（JEOL-SX 102 、日本電子製）によりその質量を分析した。得られた結果を図１５に示す。
【００６０】
図１５の結果は、リピドＡからＨ＋をはずしたリピドＡマイナスイオンの質量であるので、リピドＡの質量は、１９２８．９であることが分かった。
【００６１】
実施例２
リピドＡのＣＳＦ誘導作用活性
本発明のリピドＡのＣＳＦ誘導作用活性は、次のようにして測定した。
【００６２】
本発明のリピドＡをリン酸緩衝溶液（以下ＰＢＳという）に溶解し、ＣＤＦ１マウスの腹腔内に投与し、６時間後に血清を回収する。この血清（５０マイクロリットル）をＣＤＦ１マウス骨髄細胞（５×１０4 個）と混和し、軟寒天（DIFCO 社製）中に蒔き込み、ＣＯ2 雰囲気下、３７℃で５日間培養する。得られたコロニー数を測定した結果を、図７に示す。本発明のリピドＡの代わりに大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来のリピドＡ（LIST BIOLOGICAL LABORATORIES. INC.製）を用いた以外は同じ条件で測定した結果も図１６に示す。
【００６３】
図１６から、ＣＳＦ誘導作用活性は、０．１μｇ／マウス及び１μｇ／マウスの投与では、大腸菌のリピドＡのほうが高いが、１０マイクログラム／マウスの投与では、ＴＰ−５のリピドＡと大腸菌由来のリピドＡとは有意差がないことが分かる。
【００６４】
実施例３
本発明のＬＰＳのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（以下「ＳＤＳ・ＰＡＧＥ」という）電気泳動のパターンを図１７に示す。
【００６５】
図１７から、本発明のＬＰＳは、段階状に数千〜４、５万の分子量分布を示すものであることがわかる。
【００６６】
実施例４
ＬＰＳの毒性試験及び血中クリアランス試験を次のようにして行った。
【００６７】
ＣＤＦ１マウス（５週齢、メス）に上記方法により製造したＬＰＳおよび大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来ＬＰＳ（LIST BIOLOGICAL LABORATORIES. INC.製）を投与し、致死毒性を測定した。得られた結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】
表１から明らかなように、ＴＰ−５由来ＬＰＳのＬＤ50は、大腸菌由来ＬＰＳのＬＤ50の約１００倍であった。
【００７０】
このように、ＴＰ−５由来ＬＰＳの毒性が、大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来ＬＰＳの毒性に比べて極めて低いのは、ＴＰ−５由来ＬＰＳが血中から速やかに除去されるためと見られる。以下に、ＴＰ−５由来ＬＰＳと大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来のＬＰＳについてのそれぞれの血中クリアランス時間測定方法とその結果を示す。
【００７１】
ＣＤＦ１マウス（５週齢、メス）にＴＰ−５由来ＬＰＳまたは大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来のＬＰＳを０．１ミリグラム／マウス腹腔投与し、１、３、および６時間後に血中に放出されるＬＰＳの量をリムルステストにより測定した。得られた結果を表２に示す。
【００７２】
【表２】
【００７３】
表２の結果から、大腸菌由来のＬＰＳは、６時間の測定時間の範囲では血中にとどまるのに対し、ＴＰ−５のＬＰＳは、速やかに血中から除去されることがわかる。
【００７４】
ＬＰＳの毒性試験結果は、ＬＰＳの活性中心がリピドＡであることから、リピドＡの毒性試験結果に比例することは明らかである。
【００７５】
実施例５
ＴＰ−５に含有されるＬＰＳ量の測定
以下の方法により、ＴＰ−５及びＥ．ｃｏｌｉのＬＰＳ、並びに各々の菌体の熱水抽出物のＬＰＳの含有量をリムルステストで測定した。
【００７６】
得られた結果を表３に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
表３の結果から、ＴＰ−５には、菌体として測定したときは、Ｅ．ｃｏｌｉよりも多くのＬＰＳを、熱水抽出物として測定したときは、Ｅ．ｃｏｌｉよりもやや少ないＬＰＳが含有されていることが分かる。なお、熱水抽出物として測定した時のほうが含有量が多いのは、熱水抽出により、ＬＰＳが菌体から遊離し、試薬と反応し易くなるとの理由によるものと思われる。
【００７９】
実施例６
ＴＰ−５の抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスにＭｅｔｈ−Ａ繊維肉腫をマウス１匹当り５×１０6 細胞づつ右側脇腹に皮下移植した。移植の２日後より２日に１回づつ計２回各試料（ＴＰ−５、大腸菌は、死菌各１ｍｇ／マウス）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に縣濁して腫瘍内注射により投与した。腫瘍移植１５日後に腫瘍のサイズを測定した。
【００８０】
得られた結果を表４に示す。
【００８１】
【表４】
【００８２】
表４から明らかなように、ＴＰ−５は、大腸菌に比べるとやや劣るが、高い抗腫瘍活性を有している。
【００８３】
実施例７
ＴＰ−５の安全性を以下に示す動物実験により試験した。
【００８４】
飼育条件
飼料は、オリエンタル酵母のＣＲＦ−１固形飼料をコントロールとして、同飼料にＴＰ−５乾燥菌体をそれぞれ１、５、１０％添加した飼料を作成した。
【００８５】
実験動物としてはＩＣＲマウスを用い、オス、メス各群１０匹、８群に分け５週零より１２週間飼育した。飼料の摂取は、飼育開始より２週間は自由摂取とし、３週目より制限食とし、５ｇ／マウス／日、更に６週目より試験終了時まで６ｇ／マウス／日とした。また、水は自由摂取とした。
【００８６】
実験期間中は体重の変動を調べた。また飼育終了時には、採血後、剖検を行い、臓器を採取して湿重量を測定した。採血した血液については、血液学的検査、血液生化学的検査を行うと共に、１０％投与群については各種の臓器について病理学的検査もあわせて行なった。得られた結果を図１８〜１９及び表５〜７に示す。
【００８７】
ａ）体重
オス、メスともにＴＰ−５の添加量が多い飼料ほど食べ残しが多くなる傾向が観察さたが、飼育中の体重の変動についてはオス、メスとも各群に有意な差は認められなかった。
【００８８】
ｂ）臓器重量
【表５】
【００８９】
臓器重量については、造血臓器である脾臓が肥大した以外、悪影響を示す肥大という点ではオス、メスとも各群に有意な差は認められなかった。
【００９０】
ｃ）血液学的検査
【表６】
【００９１】
血液学的検査では、ＭＣＶ（平均赤血球容積）やヘモグロビン量に一部有意差が見られる群があったが、これはマウスの個体差に基づくばらつきによるものと考えられた。
【００９２】
ｄ）血液生化学的検査
【表７】
【００９３】
血液生化学的検査についても一部に有意の差が認められたが、ＴＰ−５投与量に依存したものではなかった。
【００９４】
ｅ）各臓器の病理学的検査
唾液線、膀胱、子宮、精巣、卵巣、肝臓、腎臓、腸間膜リンパ節について検討した。唾液線、膀胱、子宮、精巣、卵巣、並びに阻害物質の影響を受け易い臓器である肝臓及び腎臓については、コントロール群との間に変化は認められなかった。免疫に係わる臓器である脾臓と腸間膜
総合的に判断すると、ＴＰ−５は、全身的な毒性は低い。
【００９５】
【発明の効果】
本発明により、ＣＳＦ活性などの生体の免疫賦活的活性が高く、しかも毒性の低いリピドＡが提供される。
【００９６】
また、本発明のＴＰ−５により、新規なＬＰＳおよびリピドＡを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＰ−５の培養液の吸収スペクトルの図
【図２】リピドＡの糖のガスクロマトグラムの図
【図３】リピドＡの糖の重量分析の図
【図４】リピドＡの糖の重量分析の図
【図５】リピドＡの糖の重量分析の図
【図６】リピドＡのエステル型脂肪酸のガスクロマトグラムの図
【図７】リピドＡのエステル型脂肪酸の重量分析の図
【図８】リピドＡのアミド型脂肪酸のガスクロマトグラムの図
【図９】リピドＡのアミド型脂肪酸の重量分析の図
【図１０】リピドＡのアミド型脂肪酸の重量分析の図
【図１１】リピドＡの全脂肪酸のガスクロマトグラムの図
【図１２】リピドＡの全脂肪酸の重量分析の図
【図１３】リピドＡの全脂肪酸の重量分析の図
【図１４】リピドＡの全脂肪酸の重量分析の図
【図１５】リピドＡの高速原子衝撃法−重量分析の図
【図１６】リピドＡのＣＳＦ活性を表すグラフ
【図１７】ＬＰＳの電気泳動の写真
【図１８】ＴＰ−５投与マウス（オス）の体重変化を表すグラフ
【図１９】ＴＰ−５投与マウス（メス）の体重変化を表すグラフ
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なリピドＡ及びリポ多糖（以下ＬＰＳという）並びにこれを産生する光合成細菌に関する。本発明のリピドＡ及びＬＰＳは、ＣＳＦ(colony stimulation factor) の誘導作用活性を有し、かつ毒性が低いので健康食品、食品添加物として、さらには医薬として利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
腸内細菌等グラム陰性菌の細胞壁表面には、ＬＰＳが存在する。ＬＰＳは脂質（リピドＡ）と多糖の複合体であり、菌体内毒素の主成分であることが知られている。菌体内毒素の生物活性については、リピドＡがその活性中心部分であることも知られているが、リピドＡの組成、構造及び生物活性は、菌種によって多少異なる。
【０００３】
代表的腸内細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリピドＡは、以下の化１に示す構造を有することが知られている。
【０００４】
【化１】
【発明が解決しようとする課題】
上記大腸菌のリピドＡは、血液幹細胞の増殖分化因子であるＣＳＦの誘導作用活性を有することが知られているが、毒性が高いため食用に供することができない。
【０００６】
本発明は、ＣＳＦ活性などの生体の免疫賦活的活性が高く、しかも毒性の低いリピドＡを提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究の結果、ある種の光合成細菌の細胞壁表面にあるＬＰＳから抽出されるリピドＡが、大腸菌由来のリピドＡと比較してＣＳＦ活性はやや劣るが、毒性が極めて低いことを見いだした。
【０００８】
すなわち、本発明は、糖鎖と、該糖鎖とエステル結合した型の脂肪酸及びアミド結合した型の脂肪酸との複合体であるリピドＡにおいて、該糖がグルコサミン、マンノース又は名称不明の糖からなることと；該エステル結合した型の脂肪酸が炭素原子数１２の直鎖飽和脂肪酸であることと；該アミド結合した型の脂肪酸が炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端の炭素原子と末端から２番目の炭素原子との間の結合が二重結合である直鎖不飽和脂肪酸、及び炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端から３番目の炭素原子に結合する水素原子１つが水酸基により置換された直鎖飽和脂肪酸であることと；該リピドＡがリンを包含しないことと；質量が１９２８．９であることとを特徴とするリピドＡを提供する。
【０００９】
本発明は、前記リピドＡを包含するＬＰＳをも提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５８７１で寄託されたランプロバクター（Lamprobacter）属の光合成細菌を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のリピドＡについて詳細に説明する。
【００１２】
本発明のリピドＡを構成する糖は、グルコサミン、マンノースおよび名称不明の糖である。グルコサミン：マンノース：名称不明の糖を合わせると構成糖は、３〜５個と考えられる。
【００１３】
本発明のリピドＡを構成する脂肪酸は、前記糖とエステル結合した型の脂肪酸が炭素原子数１２の直鎖飽和脂肪酸（以下「１２：０の脂肪酸」という）であり、また前記糖にアミド結合した型の脂肪酸が炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端の炭素原子と末端から２番目の炭素原子との間の結合が二重結合である直鎖不飽和脂肪酸（以下「１４：１の脂肪酸」という）、及び炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端から３番目の炭素原子に結合する水素原子１つが水酸基により置換された直鎖飽和脂肪酸（以下「３−ＯＨ−１４：０の脂肪酸」という）である。
【００１４】
本発明のリピドＡには、リンは包含されていない。
【００１５】
本発明のリピドＡは、高速原子衝撃法−重量分析法（以下「ＦＡＢ−ＭＳ」という）により測定した質量が１９２８．９である。
【００１６】
本発明のリピドＡの構造は、それを構成する糖として、マンノース及び名称不明の糖を包含している点、さらにはリンを含んでいない点において大腸菌由来のリピドＡと大きく異なる。
【００１７】
本発明のリピドＡは、後に詳細に説明するLamprobacter属の新規な光合成細菌（以下「ＴＰ−５」という）を出発物質として、それ自体は公知の、リピドＡの抽出方法に準じて製造することができる。以下に、本発明のリピドＡの製造方法の一例を示す。
【００１８】
ＴＰ−５の脱脂乾燥菌体を、温フェノール法により抽出し、水層に粗ＬＰＳを得る。得られた粗ＬＰＳを、酵素処理に供し、精製ＬＰＳを得る。次いで、ＬＰＳを酸加水分解し、精製することによりリピドＡが得られる。
【００１９】
より詳しくは、本発明のリピドＡは、通常、４５％〜５０％のフェノールを用い、通常、６５℃〜７０℃で、１０分〜２０分間抽出する。４５％フェノールで抽出する場合には、例えば、９０％フェノール水溶液と、同量のＴＰ−５の水縣濁液とを混合して、フェノールの終濃度を４５％として抽出することができる。
【００２０】
粗ＬＰＳを含む水層は、水で透析することにより、フェノール、塩類のような低分子を除去することができる。
【００２１】
粗ＬＰＳの酵素処理には、ＲＮａｓｅ−Ａを用いることができる。
【００２２】
酵素処理は、用いる酵素の種類により適宜設定することができるが、通常、ｐＨ５．０、温度３７℃、で１２〜１６時間行なう。
【００２３】
酵素処理した粗ＬＰＳは、通常１０5 ×ｇ〜１．５×１０5 ×ｇの超遠心に３時間〜４時間供すると、沈殿に精製ＬＰＳが得られる。
【００２４】
この精製ＬＰＳは、通常、濃度０．１規定〜０．２規定の例えば酢酸、塩酸等の酸により、１００℃〜１２０℃の温度で、２〜８時間加水分解する。これを遠心に供し、沈殿にリピドＡが得られる。このリピドＡは、クロロホルム：メタノール（４：１、体積比）に溶解し、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いることにより精製することができる。
【００２５】
本発明のリピドＡのＣＳＦ誘導作用活性は、大腸菌リピドＡのそれと同等又はそれよりも若干弱い。しかしながら、本発明のリピドＡは、大腸菌由来のリピドＡに比べて極めて低い毒性を有するという利点を有する。
【００２６】
本発明は、上記方法により製造されたＴＰ−５由来の新規なＬＰＳをも提供するものである。
【００２７】
以下、本発明のＬＰＳを詳細に説明する。
【００２８】
本発明のＬＰＳは、少糖の繰返し単位であるＯ抗原性多糖にＲコアオリゴ糖がつき、それがさらにＫＤＯ(3-keto-3-deoxyoctonate)を介して本発明のリピドＡに結合する複合体であるいわゆるＩ型のＬＰＳである。
【００２９】
本発明は、上述した本発明のリピドＡの製造方法における出発物質であるＴＰ−５も提供するものである。
【００３０】
以下、本発明のＴＰ−５について詳細に説明する。
【００３１】
ＴＰ−５は、通産省工業技術院 生命工学工業技術研究所に平成８年９月１９日から受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５８７１として寄託された。
【００３２】
ＴＰ−５は、Chromatiaceae 科（紅色硫黄細菌：Purple sulfur bacteria) 、Lamprobacter属に属し、以下に記載する形態、生化学的性状のうち、特にビタミンＢ12要求性がないこと、ＮａＣｌ要求性がないことが、公知の種(Lamprobacter modestohalophilus 種）と異なるため、新規な種と判定した。なお、Lamprobacterは、１種しか報告されていない。（Gorlenko, V.M., E.N. Krasil'nilova, O.G. Kikina and N.Y. Tatarinova, 1988. In Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB, Int. J. Syst. Bacteriol. 38:220-222)
（ａ）形態
（１）卵型状、短桿状
（２）グラム染色性：−
（３）莢膜(slime) ：−
（４）細胞内硫黄粒：＋
（５）ガス胞：＋
（ｂ）生育状態
（１）菌体懸濁液：紅色
（ｃ）生理的性質
（１）微好気ないしは嫌気状態で成長する
（２）細胞中に硫黄粒の生成
（３）成長最適温度：３０℃付近
（４）ＮａＣｌ要求性：−
（ｄ）炭素源の利用性
（１）グルコース：−
（２）シュクロース：−
（３）マンノース：−
（４）フラクトース：＋
（５）ラクトース：−
（６）マンニット：−
（７）ソルビトール：−
（８）スターチ：−
（９）フォルメイト：−
（１０）アセテート：＋
（１１）パイルベート：＋
（１２）プロピオネート：＋
（１３）マレート：＋
（１４）サクシネート：＋
（１５）グリセロール：＋
（１６）メタノール：−
（１７）エタノール：−
（ｅ）その他
（１）ビタミンＢ12要求性：−
（２）培養液（生細胞）の吸収スペクトル：８００、８５５ｎｍ付近に吸収極大を有する。図１に吸収スペクトルを示す。
【００３３】
本発明のＴＰ−５は、以下に記載する方法により製造することができる。
【００３４】
長崎県大村湾河口から採取した泥を０．８％（重量）寒天を加えた実施例１の培養液で培養し、生えてきた菌のコロニーをさらにビタミンＢ12を除いた培養液で培養し、色調、硫黄粒、ガス胞、莢膜及び形態で選択する。
【００３５】
本発明のＴＰ−５には、大腸菌とほぼ同量のＬＰＳが含有されることが分かった。したがって、本発明のＴＰ−５は、本発明のリピドＡ及びＬＰＳの製造に有用に用いることができる。
【００３６】
以上説明したように、本発明のリピドＡ、ＬＰＳ及びＴＰ−５は、ＣＳＦ誘導作用活性が高く、しかも毒性がきわめて低い。したがって、本発明のリピドＡ、ＬＰＳ及びＴＰ−５は、健康食品、食品添加物として、さらには医薬として使用することができる。
【００３７】
本発明のリピドＡを医薬として用いる場合、水溶液中にエマルジョン化した状態で、あるいはカプセル中に封入、又は経口剤に添加した状態で、経口薬として、用量として０．１μｇ〜１ｇの範囲で、好ましくは１０μｇ〜１００ｍｇの範囲で用いることができる。注射薬としては用量として０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇの範囲で用いることができる。また皮膚からの吸収を考慮した湿布薬として、用量としては１μｇ〜１ｇの範囲で用いることができる。
【００３８】
本発明のＬＰＳを健康食品、特定保健用食品あるいは食品添加物として用いる場合、クロレラや他の食物に添加した状態、あるいは水溶液中に添加した状態で、用量として０．１ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０ｇの範囲で用いることができる。
【００３９】
ＬＰＳを医薬として用いる場合、経口剤に添加した状態で、あるいは水溶液中に添加した状態で、用量として０．１ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０ｇの範囲で用いることができる。注射薬としては用量として１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１０μｇ〜１００ｍｇの範囲で用いることができる。また皮膚からの吸収を考慮した湿布薬として、用量としては１０μｇ〜１００ｇの範囲で用いることができる。
【００４０】
本発明のＴＰ−５を健康食品、特定保健用食品あるいは食品添加物として用いる場合、クロレラや他の食品に添加した状態、あるいはＴＰ−５の熱水抽出物（菌体を１００℃の熱水で２０分間加熱した後に得られる抽出物（以下、「熱水抽出物」という））を含む水溶液の状態で、用量として１０ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇの範囲で用いることができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
実施例１
（１）ＴＰ−５の培養
菌体の培養には以下に記載する化合物を１リットルの蒸留水に溶解した培養液（以下「培養液１」という）、以下に記載する培養液２及び培養液３を用いた。
【００４３】
培養液１で用いた化合物
ＣＨ3 ＣＯＯＮａ ０．５ｇ
ＫＨ2 ＰＯ4 １．０ｇ
ＮＨ4 Ｃｌ １．０ｇ
ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ
ＥＤＴＡ- ２Ｎａ ２ ｍｇ
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ ｍｇ
Ｈ3 ＢＯ3 １００ μｇ
ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ １００ μｇ
ＺｎＣｌ2 １００ μｇ
ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ １００ μｇ
Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２０ μｇ
ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２０ μｇ
ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １０ μｇ
Ｎａ2 ＳｅＯ3 １ μｇ
チアミン−ＨＣｌ ５００ μｇ
ナイアシン ５００ μｇ
ｐ−アミノ安息香酸 ３００ μｇ
ビタミンＢ12 ５０ μｇ
ピリドキシン−ＨＣｌ １００ μｇ
ビオチン ５０ μｇ
培養液２：Ｎａ2 Ｓ・９Ｈ2 Ｏ ０．２５ｇ／１０ｍｌ
培養液３：４％のＮａＣＯ3 ２５ｍｌ
上記培養液１及び培養液２を、１２１℃、１５分間オートクレーブで別々に滅菌した。培養液３は、ろ過滅菌した。
【００４４】
継代培養
培養液１及び培養液２を冷却後、培養液３を加えすばやく撹拌し、スクリューキャップ付試験管（全容量２０ミリリットル）にほぼ満たすまで入れてから試験管のキャップを閉めた。得られた培地入試験管は、よく振った後、一昼夜冷暗所に放置し、培地内を完全に嫌気的にした。この状態で１カ月程度の保存ができる。１昼夜以上放置した培地に菌を含む溶液を培養液２０ミリリットルに対して１〜２滴加えて培養を開始した。通常、室内（できれば暗所）に数時間から１昼夜放置し、その後光照射下（弱光）に移して光合成培養を開始した。５〜７日間培養を続け、継代を繰返す。
【００４５】
ＴＰ−５の生産培地としては、培養液１のＣＨ3 ＣＯＯＮａを２．０ｇ／リットルに増加した上記の培地を５リットル用して培養し、培養期間５〜７日間で、１．５〜２．０ｇ（乾燥重量）のＴＰ−５を得た。
【００４６】
（２）ＬＰＳの調製
上記（１）で得られた脱脂菌体２０ｇに４５％フェノールを７５０ミリリットル添加し、６８℃で１５分間抽出した。水層を水で透析した後、凍結乾燥し、１．６ｇの粗ＬＰＳが得られた。粗ＬＰＳをｐＨ５．０、３７℃で１２時間ＲＮａｓｅ−Ａ（WORTHINGTON BIOCHEMICAL CORPORATION 製）処理し、超遠心（１０5 ×ｇ、３時間、２回）し、得られた沈殿を凍結乾燥し、０．２ｇの精製ＬＰＳが得られた。
【００４７】
（３）リピドＡの調製
上記（２）で得られた乾燥ＬＰＳ１．０ｇに０．２規定酢酸を１００ミリリットル添加し、１００℃で３時間加水分解した。沈殿（０．０５ｇ）を１〜２ミリリットルのクロロホルム：メタノール（４：１、体積比）溶液に溶解させた。これを薄層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣという）に２回かけ精製した。得られたリピドＡは、以下に示すリソ−リピドＡの調製、並びにリピドＡのリンの測定、糖分析、脂肪酸分析及び質量分析に供した。
【００４８】
（４）リソ−リピドＡの調製
上記（３）で得られたリピドＡ０．０２ｇに０．２規定ＫＯＨ−メタノール２０ミリリットルを添加し、３７℃で１４時間加水分解した。沈殿（０．００４ｇ）をクロロホルム：メタノール（４：１、体積比）に溶解させる。これをＴＬＣに２回かけ、リソ−リピドＡを精製した。リソ−リピドＡは、リピドＡからエステル結合型脂肪酸を除いたものである。
【００４９】
（５）リピドＡのリンの測定
上記（３）で得られたリピドＡをＴＬＣで展開し、ディットマー−レスター(dittmer-Lester)試薬を噴霧してリンの有無を確認したが、リンは確認されなかった。
【００５０】
同様にして、ＴＬＣで展開したリピドＡをバートレット(Bartlett)法により非色定量したが、リンは検知されなかった。
【００５１】
（６）リピドＡの糖分析
上記（４）で得られたリソ−リピドＡを２．０モル／リットルのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて１２０℃で２時間加水分解した。得られた糖画分を回収し、アルジトールアセテイト化し、ガスクロマトグラフィー（5890 SERIES II、HEWLETT-PACKARD 製）（以下「ＧＣ」という）、次いでＧＣで得られたピーク部分の重量分析（JEO L-SX 102、日本電子製）（以下「ＭＳ」という）により分析した。得られた結果を図２（ＧＣ）、図３〜５（ＭＳ）に示す。
【００５２】
図２〜５の結果より、リピドＡは、グルコース、マンノースおよびもう１種未知の糖から構成されることが明らかになった。
【００５３】
７）リピドＡの脂肪酸分析
ａ）エステル結合型脂肪酸の分析
上記（３）で得られたリピドＡに０．２規定ＫＯＨ−メタノールを添加し、３７℃で１４時間加水分解した後、脂肪酸分画を回収し、メチルエステル化し、ＧＣ、次いでＧＣにより得られたピーク部分のＭＳにより分析した。得られた結果を図６（ＧＣ）、図７（ＭＳ）に示す。
【００５４】
図６〜７に示した結果から、エステル型脂肪酸は、１２：０の脂肪酸であることがわかった。
【００５５】
ｂ）アミド結合型脂肪酸の分析
上記（４）で得られたリソ−リピドＡに６．０規定ＨＣｌを添加し、１００℃で２時間加水分解した後、脂肪酸分画を回収し、メチルエステル化し、ＧＣ、次いでＧＣにより得られたピーク部分のＭＳにより分析した。得られた結果を図８（ＧＣ）、図９〜１０（ＭＳ）に示す。
【００５６】
図８〜１０に示した結果から、アミド型脂肪酸は、３−ＯＨ−１４：０の脂肪酸及び１４：１の脂肪酸であることがわかった。
【００５７】
ｃ）全脂肪酸の分析
上記（３）のリピドＡを６．０規定ＨＣｌを用いて１００℃で２時間加水分解した後、脂肪酸分画を回収し、メチルエステル化し、ＧＣ、次いでＧＣにより得られたピーク部分のＭＳにより分析した。得られた結果を図１１（ＧＣ）、図１２〜１４（ＭＳ）に示す。
【００５８】
図１１〜１４から明らかなように、３−ＯＨ−１４：０、１４：１および１２：０の脂肪酸が確認された。
【００５９】
（８）リピドＡの質量分析
上記（３）のリピドＡを高速原子衝撃法−重量分析法（以下「ＦＡＢ−ＭＳ」という）（JEOL-SX 102 、日本電子製）によりその質量を分析した。得られた結果を図１５に示す。
【００６０】
図１５の結果は、リピドＡからＨ＋をはずしたリピドＡマイナスイオンの質量であるので、リピドＡの質量は、１９２８．９であることが分かった。
【００６１】
実施例２
リピドＡのＣＳＦ誘導作用活性
本発明のリピドＡのＣＳＦ誘導作用活性は、次のようにして測定した。
【００６２】
本発明のリピドＡをリン酸緩衝溶液（以下ＰＢＳという）に溶解し、ＣＤＦ１マウスの腹腔内に投与し、６時間後に血清を回収する。この血清（５０マイクロリットル）をＣＤＦ１マウス骨髄細胞（５×１０4 個）と混和し、軟寒天（DIFCO 社製）中に蒔き込み、ＣＯ2 雰囲気下、３７℃で５日間培養する。得られたコロニー数を測定した結果を、図７に示す。本発明のリピドＡの代わりに大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来のリピドＡ（LIST BIOLOGICAL LABORATORIES. INC.製）を用いた以外は同じ条件で測定した結果も図１６に示す。
【００６３】
図１６から、ＣＳＦ誘導作用活性は、０．１μｇ／マウス及び１μｇ／マウスの投与では、大腸菌のリピドＡのほうが高いが、１０マイクログラム／マウスの投与では、ＴＰ−５のリピドＡと大腸菌由来のリピドＡとは有意差がないことが分かる。
【００６４】
実施例３
本発明のＬＰＳのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（以下「ＳＤＳ・ＰＡＧＥ」という）電気泳動のパターンを図１７に示す。
【００６５】
図１７から、本発明のＬＰＳは、段階状に数千〜４、５万の分子量分布を示すものであることがわかる。
【００６６】
実施例４
ＬＰＳの毒性試験及び血中クリアランス試験を次のようにして行った。
【００６７】
ＣＤＦ１マウス（５週齢、メス）に上記方法により製造したＬＰＳおよび大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来ＬＰＳ（LIST BIOLOGICAL LABORATORIES. INC.製）を投与し、致死毒性を測定した。得られた結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
表１から明らかなように、ＴＰ−５由来ＬＰＳのＬＤ50は、大腸菌由来ＬＰＳのＬＤ50の約１００倍であった。
【００７０】
このように、ＴＰ−５由来ＬＰＳの毒性が、大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来ＬＰＳの毒性に比べて極めて低いのは、ＴＰ−５由来ＬＰＳが血中から速やかに除去されるためと見られる。以下に、ＴＰ−５由来ＬＰＳと大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来のＬＰＳについてのそれぞれの血中クリアランス時間測定方法とその結果を示す。
【００７１】
ＣＤＦ１マウス（５週齢、メス）にＴＰ−５由来ＬＰＳまたは大腸菌（Ｏ−１１１：Ｂ４）由来のＬＰＳを０．１ミリグラム／マウス腹腔投与し、１、３、および６時間後に血中に放出されるＬＰＳの量をリムルステストにより測定した。得られた結果を表２に示す。
【００７２】
【表２】
表２の結果から、大腸菌由来のＬＰＳは、６時間の測定時間の範囲では血中にとどまるのに対し、ＴＰ−５のＬＰＳは、速やかに血中から除去されることがわかる。
【００７４】
ＬＰＳの毒性試験結果は、ＬＰＳの活性中心がリピドＡであることから、リピドＡの毒性試験結果に比例することは明らかである。
【００７５】
実施例５
ＴＰ−５に含有されるＬＰＳ量の測定
以下の方法により、ＴＰ−５及びＥ．ｃｏｌｉのＬＰＳ、並びに各々の菌体の熱水抽出物のＬＰＳの含有量をリムルステストで測定した。
【００７６】
得られた結果を表３に示す。
【００７７】
【表３】
表３の結果から、ＴＰ−５には、菌体として測定したときは、Ｅ．ｃｏｌｉよりも多くのＬＰＳを、熱水抽出物として測定したときは、Ｅ．ｃｏｌｉよりもやや少ないＬＰＳが含有されていることが分かる。なお、熱水抽出物として測定した時のほうが含有量が多いのは、熱水抽出により、ＬＰＳが菌体から遊離し、試薬と反応し易くなるとの理由によるものと思われる。
【００７９】
実施例６
ＴＰ−５の抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスにＭｅｔｈ−Ａ繊維肉腫をマウス１匹当り５×１０6 細胞づつ右側脇腹に皮下移植した。移植の２日後より２日に１回づつ計２回各試料（ＴＰ−５、大腸菌は、死菌各１ｍｇ／マウス）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に縣濁して腫瘍内注射により投与した。腫瘍移植１５日後に腫瘍のサイズを測定した。
【００８０】
得られた結果を表４に示す。
【００８１】
【表４】
表４から明らかなように、ＴＰ−５は、大腸菌に比べるとやや劣るが、高い抗腫瘍活性を有している。
【００８３】
実施例７
ＴＰ−５の安全性を以下に示す動物実験により試験した。
【００８４】
飼育条件
飼料は、オリエンタル酵母のＣＲＦ−１固形飼料をコントロールとして、同飼料にＴＰ−５乾燥菌体をそれぞれ１、５、１０％添加した飼料を作成した。
【００８５】
実験動物としてはＩＣＲマウスを用い、オス、メス各群１０匹、８群に分け５週零より１２週間飼育した。飼料の摂取は、飼育開始より２週間は自由摂取とし、３週目より制限食とし、５ｇ／マウス／日、更に６週目より試験終了時まで６ｇ／マウス／日とした。また、水は自由摂取とした。
【００８６】
実験期間中は体重の変動を調べた。また飼育終了時には、採血後、剖検を行い、臓器を採取して湿重量を測定した。採血した血液については、血液学的検査、血液生化学的検査を行うと共に、１０％投与群については各種の臓器について病理学的検査もあわせて行なった。得られた結果を図１８〜１９及び表５〜７に示す。
【００８７】
ａ）体重
オス、メスともにＴＰ−５の添加量が多い飼料ほど食べ残しが多くなる傾向が観察さたが、飼育中の体重の変動についてはオス、メスとも各群に有意な差は認められなかった。
【００８８】
ｂ）臓器重量
【表５】
臓器重量については、造血臓器である脾臓が肥大した以外、悪影響を示す肥大という点ではオス、メスとも各群に有意な差は認められなかった。
【００９０】
ｃ）血液学的検査
【表６】
血液学的検査では、ＭＣＶ（平均赤血球容積）やヘモグロビン量に一部有意差が見られる群があったが、これはマウスの個体差に基づくばらつきによるものと考えられた。
【００９２】
ｄ）血液生化学的検査
【表７】
血液生化学的検査についても一部に有意の差が認められたが、ＴＰ−５投与量に依存したものではなかった。
【００９４】
ｅ）各臓器の病理学的検査
唾液線、膀胱、子宮、精巣、卵巣、肝臓、腎臓、腸間膜リンパ節について検討した。唾液線、膀胱、子宮、精巣、卵巣、並びに阻害物質の影響を受け易い臓器である肝臓及び腎臓については、コントロール群との間に変化は認められなかった。免疫に係わる臓器である脾臓と腸間膜
総合的に判断すると、ＴＰ−５は、全身的な毒性は低い。
【００９５】
【発明の効果】
本発明により、ＣＳＦ活性などの生体の免疫賦活的活性が高く、しかも毒性の低いリピドＡが提供される。
【００９６】
また、本発明のＴＰ−５により、新規なＬＰＳおよびリピドＡを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＰ−５の培養液の吸収スペクトルの図
【図２】リピドＡの糖のガスクロマトグラムの図
【図３】リピドＡの糖の重量分析の図
【図４】リピドＡの糖の重量分析の図
【図５】リピドＡの糖の重量分析の図
【図６】リピドＡのエステル型脂肪酸のガスクロマトグラムの図
【図７】リピドＡのエステル型脂肪酸の重量分析の図
【図８】リピドＡのアミド型脂肪酸のガスクロマトグラムの図
【図９】リピドＡのアミド型脂肪酸の重量分析の図
【図１０】リピドＡのアミド型脂肪酸の重量分析の図
【図１１】リピドＡの全脂肪酸のガスクロマトグラムの図
【図１２】リピドＡの全脂肪酸の重量分析の図
【図１３】リピドＡの全脂肪酸の重量分析の図
【図１４】リピドＡの全脂肪酸の重量分析の図
【図１５】リピドＡの高速原子衝撃法−重量分析の図
【図１６】リピドＡのＣＳＦ活性を表すグラフ
【図１７】ＬＰＳの電気泳動の写真
【図１８】ＴＰ−５投与マウス（オス）の体重変化を表すグラフ
【図１９】ＴＰ−５投与マウス（メス）の体重変化を表すグラフ
Claims (3)
- 糖鎖と、該糖鎖とエステル結合した型の脂肪酸及びアミド結合した型の脂肪酸との複合体であるリピドＡにおいて、
該糖がグルコサミン、マンノース又は名称不明の糖からなることと、
該エステル結合した型の脂肪酸が炭素原子数１２の直鎖飽和脂肪酸であることと、
該アミド結合した型の脂肪酸が炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端の炭素原子と末端から２番目の炭素原子との間の結合が二重結合である直鎖不飽和脂肪酸、及び炭素原子数１４の直鎖脂肪酸であって、該直鎖の末端から３番目の炭素原子に結合する水素原子１つが水酸基により置換された直鎖飽和脂肪酸であることと、
該リピドＡがリンを包含しないことと、
質量が１９２８．９であることと
を特徴とするリピドＡ。 - 請求項１に記載のリピドＡを包含するポリ多糖。
- 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５８７１であるランプロバクター属の光合成細菌。
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Applications Claiming Priority (1)
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