FR2613380A1 - Nouvelle substance adjuvante de certains antimitotiques chimiques, procede d'obtention de cette substance a partir de cultures de vibrio cholerae, agents therapeutiques contenant ladite substance - Google Patents

Nouvelle substance adjuvante de certains antimitotiques chimiques, procede d'obtention de cette substance a partir de cultures de vibrio cholerae, agents therapeutiques contenant ladite substance Download PDF

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Abstract

NOUVELLE SUBSTANCE OBTENUE A PARTIR DE SURNAGEANT DE CULTURES DE VIBRIO CHOLERAE. CETTE NOUVELLE SUBSTANCE PROVOQUE L'APPARITION D'ANTICORPS CHEZ UN MAMMIFERE EXPERIMENTAL AUQUEL ELLE EST INJECTEE ET SON POIDS MOLECULAIRE EST SENSIBLEMENT DE L'ORDRE DE 57 KD. CETTE SUBSTANCE A EFFET ADJUVANT, PEUT AVANTAGEUSEMENT ETRE ASSOCIEE A DES AGENTS ANTIMITOTIQUES.

Description

La présente invention est relative à une nouvelle substance présentant un effet adjuvant, obtenue à partir du surnageant de cultures de Vibrio cholerae, à un procédé d'obtention de cette substance par extraction à partir de surnageant de culture de Vibrio cholerae et à des compositions thérapeutiques contenant ladite substance.
Les Inventeurs ont isolé de surnageants de cultures de Vibrio cholerae une substance qu'ils ont dénommée "D.G.Z." et qui est caractérisée en ce que - injectée au lapin selon la technique de Oudin, elle provo
que chez celui-ci l'apparition d'anticorps qui par la tech
nique de double diffusion en gélose, se manifestent sous
forme d'une bande de précipité antigène-anticorps et par
analyse immunoélectrophorétique contre le sérum obtenu, par
une seule bande - son poids moléculaire, obtenu par ultracentrifugation
et électrophorèse, est sensiblement de l'ordre de
57 000 daltons; - elle se compose de sucres (environ 28,3 %), d'acides aminés
(17 % environ) et d'acides gras (environ 9 %).
Conformément à l'invention, sa composition en sucres comprend essentiellement
rhamnose 4,1 % environ
mannose 42 % environ
galactose 32 % environ
glucose 2,3 % environ
Egalement conformément à l'invention, sa composition en acides amines comprend essentiellement
asparagine 8,2- 8,7 % environ
glutamine 8,9-10,5 % environ
sérine 5,5- 7,2 % environ
glycine 4,4- 8,6 % environ
histidine 2,3- 3,4 % environ
arginine 2,8- 4,1 % environ.
thréonine 5,1- 5,6 % environ
alanine 7,2- 8,1 8 environ
proline 5,8- 7,6 % environ
ammoniac 11,0-14,7 % environ
tyrosine 2,0- 2,9 % environ
valine 5,6- 6,3 8 environ
méthionine 0,9- 1,1 % environ
cystéine 0,6- 1,1 % environ
isoleucine 2,4- 2,8 % environ
leucine 6,9- 8,8 % environ
phénylalanine 3,4- 4,2 % environ
lysine 4,6- 7,0 % environ
Conformément à l'invention, sa composition en acides gras comprend essentiellement des acides gras en C10 à
C20 dans les proportions suivantes
C10 4,5 % environ
C11 15,4 % environ
C10,30H 15,5 % environ
C12 14,5 % environ
C13 5,2 % environ
C12, 30H 1,7 % environ
C14 0,91% environ
C13,30 40,1 % environ
C14,30H < 0,1 % environ
C16 1 0,13% environ
C16 1,05% environ
C18 1 0,5 % environ
C18 2,5 % environ
C19 0,13% environ
C20 0,5 % environ
C15 0,55% environ
La présente invention a également pour objet une composition antimitotique caractérisée en ce qu'elle comprend la substance adjuvante extraite de surnageant de Vibrio cholerae conforme à la présente invention, associée à au moins un agent antimitotique.
Selon un mode de réalisation avantageux de cette composition antimitotique, l'agent antimitotique est avantageusement pris dans le groupe-qui comprend notamment le Cisplatine, le 5-fluorouracile, l'adriamycine, la mitomycine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de cette composition antimitotique, l'adjuvant et l'antimitotique sont présents dans la composition dans un rapport adjuvant/antimitotique de l'ordre de 1 à 10.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une substance présentant un effet adjuvant, à partir de cultures de Vibrio cholerae, qui est caractérisé en ce que du surnageant de cultures de Vibrio cholerae est précipité, puis centrifugé, puis le culot de centrifugation est dissous en eau distillée, et la solution chauffée puis centrifugée, dialysée et lyophilisée pour donner lieu à la substance à effet antimitotique identifiée ci-dessus.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, le surnageant de culture est obtenu à partir d'une culture de Vibrio cholerae sur gélose nutritive alcaline, cultivée pendant 8 heures environ à 37-C environ et récoltée dans du soluté physiologique tamponné, à raison d'environ 1010 germes/ml, laquelle culture est ensemencée dans des fioles de culture contenant de l'eau peptonée trypsinisée de veau alcaline, après quoi la culture est poursuivie dans ces fioles pendant 18-20 heures environ dans une étuve à 370C environ sous agitation continue, puis la récolte est recueillie, centrifugée e et le surnageant de culture obtenu est recueilli pour être traité en vue de l'obtention de la substance adjuvante conforme à l'invention.
Outre les dispositions qui précédent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de préparation de la substance adjuvante conforme à la présente invention, à un exemple de mise en évidence de I'ati- vit de cette substance et à un compte-rendu d'exprimentation clinique.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement & titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 - Préparation de la nouvelle substance adjuvante
conforme à l'invention
La culture est réalisée en fiole de Fernbach de 2 litres emplie à moitié de billes de verre et stérilisée à l'autoclave, puis complétée à 200 ml par de l'eau peptonée trypsinisée de veau alcaline à pH 8,2.
On utilise comme souche de vibrions, une souche de
Vibrio cholerae Ogawa appelée Stockholm nO 20 (déposée au
Centre National de Référence des Vibrions à 1'INSTITUT PAS
TEUR) et choisie par les Inventeurs. Le nombre de germes par millilitre est constitué par la totalité des germes d'un tube de culture de gélose nutritive alcaline cultivée pendant 8 heures à 370C, la culture étant récoltée dans 20 ml d'eau physiologique tamponnée (sensiblement 1010 germes/ml).
La fiole de Fernbach est ensemencée par cette culture et est portée pendant 18 à 20 heures dans une étuve à 370C avec agitation continue, après quoi, la récolte est recueillie, centrifugée à 5000 tours/minute pendant 20 minutes.
Le surnageant de culture est alors précipité par du polyéthylèneglycol à 28 % concentration finale. Le surnageant est centrifugé à 20000 G pendant 20 minutes. Le surnageant est alors rejeté et le culot séché. Celu -ci est dissous en eau distillée. Celle-ci est ajoutée progressivement de façon à obtenir une dissolution totale du produit avec l'aide de quelques billes pour homogénéiser la solution.
La solution ainsi obtenue est ensuite chauffée pendant une demi-heure au bain-marie à 100"C.
Elle est centrifugée à 20000 G pendant 20 minutes puis dialysée contre de l'eau distillée, lyophilisée et pesez
EXEMPLE 2 - Mise en évidence de 1'activité de la nouvelle
substance conforme a l'invention
L'activité de la substance conforme a l'invention a été mise en évidence par des méthodes in vitro et in vivo.
A. In vitro
1. L'activité a été mise en évidence sur des cultures
cellulaires de cellules du Sarcome 180, en mettant en pré
sence dans un milieu de culture constitué par de l'eau
peptonée trypsinisée de veau alcaline à pH 8,2, les cellu
les et des quantités croissantes de la substance conforme
à l'invention.
L'activité de ladite substance a e' été évaluée sur le
nombre de cellules vivantes par coloration vitale durant
24 heures.
On a évalué selon la même méthode l'activité de
l'association de la substance conforme à l'invention avec
le Cisplatine.
Les résultats obtenus sont représentés respective
ment dans les figures 1, 2 et 3 annexées qui montrent que
cultivées in vitro, des cellules de Sarcome 180 se mul
tiplient jusqu'au 6ème - 7ème jour pour donner 106cel-
lules/ml, en présence de DGZ.
La figure 1 montre la viabilité % d'une culture de cellu
les de Sarcome 180 (106 cellules/boîte) en
fonction du temps en présence de DGZ seule
(courbe Ib) par comparaison avec un témqin
(culture des cellules de sarcome 180 seule)
(courbe Ia).
Alors qu'au 8ème jour le taux de viabilité
des cellules témoins est de 40 % environ
après un maximum à 80 % entre le 5ème et le
6ème jour, en présence de DGZ seule, il dé
croit régulièrement à partir du 2ème jour (où
il est de 90 % environ) jusqu'au 8ème jour o
il est à environ 60 %.
La figure 2 montre la viabilité 8 d'une culture de cellu
les (1.p6 cellules/botte) de Sarcome 180 en
fonction du temps, en présence d'une asso
ciation de Cisplatine et de DGZ on constate
une décroissance régulière du taux de viabi
lité de 80 % au ler jour à 15 % environ au
8ème jour.
La figure 3 montre la viabilité % d'une culture de cellu
les (106 cellules/boîte) de Sarcome 180 en
fonction du temps, en présence de Cisplatine
seul.
La courbe décroît régulièremçnt de 90 8 envi
ron au ler jour à environ 15 % au 8ème jour.
2. Une activité de la substance conforme à l'invention a été démontrée en mesurant l'incorporation de la thymidine tritiée, dans des cultures en micropuits de cellules mononucléées sanguines humaines, en présence ou en absence de phytohémagglutinine (PHA), phytohémagglutinine diluée au l/500è avec des concentrations de substance variant de 0,1 à 1000 mcg/ml. En présence de PHA, il existe une activité dose-dépendante qui permet une augmentation importante de la thymidine tritiée à l'intérieur de la cellule.
Les résultats obtenus sont représentés respectivement dans les figures 4 et 5 > annexées.
Dans la figure 4, la courbe a représente l'incorporation
de la thymidine en présence d'associa
tions de DGZ et de Cisplatine dans les
quelles la DGZ est présente soit en
quantités variables, soit en quantités
fixes, la courbe ss représente l'incorpo
ration de thymidine en présence de DGZ
seule.
Les courbes a et B de la figure 5 ont la même significa
tion que les courbes correspondantes de
la figure 4, à ceci près que la subs
tance étudiée (association de
DGZ + cisplatine ou DGZ seule) est pré
sente à une dilution de raison 2 par
rapport à la figure 4.
3. Tests de toxicité
Ils ont été effectués sur des souris Balb/c pesant
20 g environ.
Toxicité aiguë : une injection de 20 mg par voie
intrapéritonéale ne provoque aucun
trouble.
Toxicité chronique : des injections de 16 à 20 mg
par voie intrapéritonéale
2 fois par semaine pendant
4 semaines provoquent l'appa
rition de diarrhée.
B. In vivo
-1. Des essais ont été réalisés sur des souris Balb/c
inoculées par 105 cellules de Sarcome 180 et traitées dès
la 24ème heure par voie intrapéritonéale pendant 4 jours
avec des doses de 2 mg de la substance conforme à l'inven
tion, soit seule soit en association avec du Cisplatine.
Les résultats suivants ont été obtenus
- avec une association comprenant 2 mg de la substance
conforme à l'invention et 0,0125 mg de Cisplatine, 80 à
90 % des souris ont survécu sans ascite ni tumeur selon
la modalité expérimentale. A signaler qu'elles n'ont pu
être réinoculées quelle que soit la dose de cellules
injectées.
Les résultats obtenus sont représentés aux figures
6 et 7 annexées qui montrent le nombre de souris survivan
tes (en ordonnée) en fonction du temps (en abscisse), ex
primé en jours.
La figure 6 montre le taux de survie de souris auxquelles
ont été inoculées 106 cellules de Sarco
me 180, traitées par des injections d'eau
physiologique tamponnée, 2 fois par semaine
pendant 4 semaines s aucune souris survivante
au 12ème jour.
La figure 7 montre le taux -de souris inoculées par
106 cellules de Sarcome 180 traitées par des
injections de DGZ (en eau peptonée) chauffée
une heure à 100,C et de Cisplatine à raison
de
Figure img00080001
<tb> 2 <SEP> mg <SEP> de <SEP> DGZ <SEP> 2fois <SEP> par <SEP> semaine
<tb> 0,0250 <SEP> mg <SEP> de <SEP> Cisplatine <SEP> /4 <SEP> semaines
<tb>
Sur un lot de 20 souris, 18 étaient toujours
vivantes au 75ème jour après le début du
traitement (2 décès observés au 39ème jour).
2. Des essais ont été réalisés également sur des souris C57 black inoculées avec des cellules de la tumeur de
Lewis, 104 cellules dans la patte arrière gauche. L'évolution de la tumeur est suivie, chez les témoins comme chez les souris traitées, par mesure de l'épaisseur de la patte. Le traitement a été réalisé par voie intrapéritonéale pendant 4 jours, à raison de 1 mg de la substance conforme à l'invention et de 0,0125 mg de Cisplatine dans la meme seringue par souris et par jour, pendant 4 jours, et sous un volume de 0,20 ml
Les résultats ont été les suivants : 70 % des souris traitées ont survécu sans développer ni tumeur ni métastase.
Elles n'ont pu être réinoculées ultérieurement par des quantités de 106 à 108 cellules de Lewis.
Ces résultats sont reproduits aux figures 8 à 10 annexées qui montrent l'augmentation d'épaisseur de la patte (exprimée en mm) en fonction du temps (exprimé en jours).
Dans la figure 8 après inoculation de 104 cellules de
Lewis suivie d'un traitement pendant
4 jours par le Cisplatine associé à la
DGZ : on observe une augmentation
d'épaisseur brusque entre le 12ème et le
15ème jour après l'inoculation chez les
souris traitées,de 4,7 mm à 6,2 mm, soit
1,5 mm,
alors que dans le cas de souris traitées par le Cisplatine
seul (figure 9), l'augmentation d'épaisseur atteint 2,5 mm
et que dans le cas des souris témoins traitées par de
l'eau physiologique, on observe une augmentation d'épais
seur bien plus considérable, puisqu'elle est de 4,3 mm
(figure 10).
EXEMPLE 3 - Compte-rendu d'expérimentations cliniques
A. Cancers de l'ovaire
Al. Traitement de malades après intervention chirurgicale,
par la substance adjuvante conforme à l'invention
administrée par voie intrapéritonéale
seule dans 33,3 % des cas
en association avec au moins un autre antimitotique
dans 66,6 % des cas
60 % de taux de survie ont été observés avec dispari
tion de l'ascite.
A2. Traitement de malades présentant une récidive
La moyenne de survie de ces malades qui récidivent
ne dépasse pas 6 mois habituellement quel que soit
l'antimitotique de l'Art antérieur utilisé pour le
traitement.
Avec la substance conforme à l'invention adminis
trée par voie intrapéritonéale
. soit seule
. soit en association avec au moins un autre anti
mitotique,
Les durées de survie ont été prolongées de façon spec
taculaire puisque le taux d'échecs n'a été que de 5 %
et que les durées de survie des malades récidivistes
traités ont atteint de 13 mois à 92 mois, avec une
disparition totale de l'ascite et du ventre énorme li
à la présence de l'ascite, procurant ainsi aux malades
non seulement une amélioration au moins temporaire sur
le plan de la maladie elle-même, mais aussi une amé-
lioration importante sur le plan psychologique résul
tant de l'amélioration de leur aspect physique et de
leur confort.
Dans d'autres formes de cancers métastasés (pulmo
naires, digestifs) des résultats similaires ont été obte
nus, avec réduction de la tumeur principale et des métas
tases. Les conditions d'administration ont été identiques
à celles mises en oeuvre dans le traitement des cancers de
l'ovaire.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims (1)

    REVENDICATIONS 1.) Nouvelle substance à effet adjuvant, caractérisée en ce que - injectée à un mammifère expérimental, elle provoque chez celui-ci l'apparition d'anticorps , - son poids moléculaire est sensiblement de l'ordre de
  1. 57 000 daltons - elle se compose de sucres (environ 28,3 %), d'acides aminés
    (17 % environ) et d'acides gras (environ 9 t).
    2") Substance selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa composition en sucres comprend essentiellement
    rhamnose 4,1 % environ
    mamnose 42 % environ
    galactose 32 % environ
    glucose 2,3 % environ.
    3-) Substance selon au moins l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que sa composition en acides aminés comprend essentiellement
    asparagine 8,2- 8,7 % environ
    glutamine 8,9-10,5 % environ
    sérine 5,5- 7,2 % environ
    glycine 4,4- 8,6 % environ
    histidine 2,3- 3,4 % environ
    arginine 2,8- 4,1 % environ
    thréonine 5,1- 5,6 % environ
    alanine 7,2- 8,1 % environ
    prolo 5,8- 7,6 % environ
    ammoniac 11,0-14,7 % environ
    tyrosine 2,0- 2,9 % environ
    valine 5,6- 6,3 % environ
    méthionine 0,9- 1,1 % environ
    cystéine 0,6- 1,1 % environ
    isoleucine 2,4- 2,8 % environ
    .leucine 6,9- 8,8 % environ
    phénylalanine 3,4- 4,2 t environ
    lysine 4,6- 7,0 t environ.
    4t) Substance selon au moins l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que sa composition en acides gras comprend essentiellement des acides gras en
    C10 à C20 dans les proportions suivantes
    C10 4,5 % environ
    C11 15,4 % environ
    C10,30H 15,5 % environ
    C12 14,5 % environ
    C13 5,2 % environ
    C12, 30H 1,7 % environ
    C14 0,91% environ
    C13,30H C0,1 % environ
    C14,30H (0,1 % environ
    C16 1 0,13% environ
    C16 1,05% environ
    C18 1 0,5 % environ
    C18 2,5 % environ
    C19 0,13% environ
    C20 0,5 % environ
    C15 0,55% environ.
    5 ) Composition antimitotique, caractérisée en ce qu'elle comprend la substance adjuvante extraite de surnageant de Vibrio cholerae selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, associée à au moins un agent antimitotique.
    66) Composition selon la reverSication 5, caractérisée en ce que l'agent antimitotique est avantageusement pris dans le groupe qui comprend notamment le Cisplatine, le 5-fluorouracile, l'adriamycine, la mitomycine.
    70) Composition selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisée en ce que l'adjuvant et l'antimitotique sont présents dans la composition dans un rapport adjuvant/antimitotique de l'ordre de 1 à 10.
    8 ) Procédé d'obtention d'une substance présentant un effet adjuvant, à partir de cultures de Vibrio cholerae, caractérisé en ce que du surnageant de cultures de Vibrio cholerae est précipité, puis centrifugé, puis le culot de centrifugation est dissous en eau distillée, et la solution chauffée puis centrifugée, dialysée et lyophilisée pour donner lieu à une substance à effet adjuvant telle que définie dans la revendication 1.
    90) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le surnageant de culture est obtenu à partir d'une culture de Vibrio cholerae sur gélose nutritive alcaline, cultivée pendant 8 heures environ à 370C environ et récoltée dans du soluté physiologique tamponné, à raison d'environ 1010 germes/ml, laquelle culture est ensemencée dans des fioles de culture contenant de l'eau peptonée trypsinisée de veau alcaline, après quoi la culture est poursuivie dans ces fioles pendant 18-20 heures environ dans une étuve à 37"C environ sous agitation continue, puis la récolte est recueillie, centrifugée et le surnageant de culture obtenu est recueilli pour etre traité en vue de l'obtention de la substance adjuvante selon la revendication 1.
FR8704799A 1987-04-06 1987-04-06 Nouvelle substance adjuvante de certains antimitotiques chimiques, procede d'obtention de cette substance a partir de cultures de vibrio cholerae, agents therapeutiques contenant ladite substance Expired FR2613380B1 (fr)

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