CA2251009A1 - Medicament optimisant la viscosite des mucus et stimulant le fonctionnement de l'intestin - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte au domaine de la biologie et plus particulièrement à la chimie thérapeutique. Elle a spécifiquement pour objet des compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif un enzyme ou un complexe enzymatique contenant cet enzyme obtenu par mise en culture de Streptomyces fradiae dans les conditions définies dans le brevet français 2.600.340, en mélange ou en association avec un excipient ou un véhicule inerte non-toxique, physiologiquement acceptabl e. Ces compositions pharmaceutiques trouvent un emploi pour la prévention ou le traitement des maladies dégénératives notamment liées à un dysfonctionnement intestinal.

Description

CA 022~1009 1998-10-0~

MEDICAMENT
OPTIMISANT LA VISCOSITE DES MUCUS ET
STIMULANT LE FONCTIONNEMENT DE L'INTESTIN

L'invention se rapporte au domaine de la biologie et plus particulièrement à celui de la chimie thérapeutique.

L'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques eVou diététiques, à base d'un enzyme ou d'un complexe enzymatique contenant cet enzyme, pouvant contribuer à la prévention eVou au traitement de maladies.

Elle a plus particulièrement pour objet des compositions pharmaceutiques à base d'un enzyme ou d'un complexe enzymatique contenant cet enzyme stimulant les fonctions de l'intestin, et pouvant ainsi contribuer a la prévention eVou au traitement des maladies dégénératives liées au vieillissement.

Elle a spécifiquement pour objet des compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif un ou plusieurs enzymes extraits ou contenus dans le complexe enzymatique obtenu par mise en culture de Streptomyces fradiae dans les conditions definies dans le brevet français 2.600.340 au nom du Demandeur.

Dans le brevet précité, on a décrit la production et I utilisation en zootechnie d'un nouveau complexe protéolytique, obtenu à partir d'une bactérie filamenteuse, Streptomyces fradiae; ce complexe est désigné ci-après par sa dénomination commerciale actuelle:
25 PANSTIMASE ~.

Cette bactérie filamenteuse peut produire simultanément au moins 5 protéinases et 2 peptidases; ces 7 enzymes ont été décrits par K.MORIHARA et al.(Biochim.Biophys.Acta, 1967, 139, 382). Lorsqu'ils sont ajoutés conjointement dans les aliments consommés par 30 les animaux, ces 7 enzymes provoquent une réduction excessive de la viscosité du mucus intestinal, et peuvent ensuite provoquer une ulcération de la paroi intestinale. Ces 7 enzymes ont donc des effets négatifs en zootechnie lorsqu'ils sont utilisés conjointement.

CA 022~1009 1998-10-0~

2 PCT/FR97100614 Dans les conditions indiquées dans le brevet précité, on obtient la PANSTIMASE~, qui est constituée seulement par 3 protéinases exocellulaires, avec prépondérance de l'une d'entre elles, et à l'exclusion des protéinases et peptidases endocellulaires. Ajoutée dans les aliments consommés par les animaux, la PANSTIMASE(~ provoque une réduction 5 modérée de la viscosité du mucus intestinal, et n'est pas susceptible d'attaquer la paroi intestinale.

En même temps que son action relativement modérée sur les protéines du mucus intestinal, la PANSTIMASE(~) exerce une action plus forte sur les protéines de matières 10 premières entrant dans la composition des aliments, ce qui améliore leur digestibilité.

Outre ces actions directes dans l'intestin, la PANSTIMASE(~) exerce des actions indirectes sur les différents organes, notamment sur le pancréas; comme déjà indiqué dans le brevet antérieur, on a constaté qu'elle provoque une augmentation de 50 à 80 % de la 15 concentration en enzymes ou en proenzymes dans cet organe.

En raison de ces actions favorables, la PANSTIMASE~) est maintenant utilisée comme complément nutritionnel s'ajoutant dans les aliments destines aux animaux, pour améliorer leur croissance ou leur productivité. C'est ainsi qu'on a pu constater qu'elle 20 améliore aussi la résistance des animaux vis-a-vis des maladies infectieuses,bactériennes ou virales, et qu'elle réduit certains effets négatifs du vieillissement.

Ces constatalions ont suggéré l'application possible en thérapeutique, pour l'animal comme pour l'homme, de la PANSTIMASE(~), ou des principes actifs dont elle est 25 constituée, à savoir, la protéinase prépondérante exocellulaire produite par Streptomyces fradiae ou le mélange de cette protéinase prépondérante exocellulaire avec au moins l'une des deux autres protéinases exocellulaires produites par Streptomyces fradiae.

Les principes actifs des compositions pharmaceutiques requièrent une purification 30 supplémentaire par rapport au produit utilisé pour l'animal. Dans les conditions indiquées dans le brevet antérieur, on obtient une PANSTIMASE~ non purifiée dont le titre est au moins égal à 2.000 U.A./mg.
L'Unite Anson (en abrégé U.A.) est ici définie comme étant la quantité d'enzyme qui, incubée pendant 10 min à 25~C et à pH 7.5 en présence d'hémoglobine dénaturée, libère CA 022~1009 1998-10-0~

3 PCT/FR97/00614 de ce substrat l'équivalent de 1 mcg de tyrosine, déterminée par absorption spectrophotométrique à 280 nm sur le filtrat non précipitable par l'acide trichloracétique.

~ Divers ajustements des conditions indiquées dans le brevet antérieur permettent d'obtenir 5 une PANSTIMASE(~ semi-purifiée dont le titre est au moins égal à 4.000 U.A./mg. Les techniques classiques de précipitations fractionnees, ou de passages sur colonne, permettent d'obtenir isolément chacune des 3 protéinases composant la PANSTIMASE~.
L'activité spécifique de la protéinase prépondérante exocellulaire est supérieure à
100.000 lJ.A./mg, elle est nettement plus élevée que celle des 2 autres protéinases; son 10 poids moléculaire est voisin de 32 kDa, et son point isoélectrique est voisin de 7Ø

Cette protéinase prépondérante explique à elle seule les principales propriétés physiologiques de la PANSTIMASE~). en raison notamment du fait qu'elle est seule à
exercer une action caractéristique sur deux protéines importantes: la toxine cholérique et 15 le collagène.

La toxine cholérique est l'homologue de la toxine LT produite par certains colibacilles pathogènes; elle est composée de la sous-unité A qui est agressive, et de la sous-unité B
qui est immuno-stimulante. A faible concentration, comparable à celle qui existe dans 20 I'intestin des animaux recevant un aliment supplémenté en PANSTIMASEa~), la protéinase prépondérante détruit sélectivement la sous-unité A sans détruire la sous-unité B qui conserve ainsi sa capacité de stimuler le système immunitaire.

Le collagène est la protéine la plus abondante dans le règne animal: chez les 25 mammifères, les différents types de collagène représentent environ un tiers des protéines totales. On sait que la solubilité du collagène musculaire dans l'eau chaude est forte s'il provient d'animaux jeunes, et faible s'il provient d'animaux âgés.
Lorsqu'on traite par la protéinase prépondérante le collagène d'animaux âgés, onaugmente sa solubilité dans l'eau chaude qui devient comparable à celle d'animaux 30 jeunes. On peut en conclure que cette proteinase provoque un certain ~ rajeunissement ~
du collagène.
La plupart des résultats sur animaux correspondent à des essais effectués avec de la PANSTIMASE~ non purifiee ou semi-purifiée. Pour l'homme on pourra utiliser soit la PANSTIMASE~ semi-purifiée, soit la ou les protéinases purifiées dont elle est composée, CA 022~l009 l998-lO-0~

4 PCT/I;'R97/00614 à savoir la protéinase prépondérante exocellulaire ou le mélange de cette protéinase prépondérante exocellulaire avec l'une au moins des deux autres protéinases exocellulaires, ou avec une ou des protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la protéinase prépondérante exocellulaire ou

5 avec celles du mélange de protéinases tel que défini précédemment.

La présente invention a pour objet des compositions pharmaceutiques eVou diététiques renfermant à titre de principe actif la protéinase prépondérante exocellulaire produite par mise en culture de Streptomyces fradiae présentant une activité spécifique supérieure à
100.000 U.A./mg, un poids moléculaire variant de 30 à 36 kDa et de préférence voisin de 32 kDa, un point isoélectrique voisin de 7.0, et susceptible de détruire sélectivement la sous-unité A de la toxine cholérique sans détruire la sous-unité B, en mélange ou en association avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, physiologiquement acceptable.
La présente invention a encore pour objet des compositions pharmaceutiques eVou diététiques renfermant à titre de principe actif la protéinase prepondérante exocellulaire telle que définie, ou le mélange de cette protéinase prépondérante exocellulaire avec l'une au moins des deux autres protéinases exocellulaires produites par mise en culture 20 de Streptomyces fradiae, ou, une ou des protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la protéinase prépondérante exocellulaire ou avec celles du mélange de protéinases tel que défini précédemment, en mélange ou en association avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, physiologiquement acceptable. Les protéinases homologues peuvent être extraites de 25 culture de différents micro-organismes et en particulier de Streptomyces fradiae ou de Streptomyces griseus.

Le principe actif est administré par voie orale, pulmonaire ou genitale à des doses comprises èntre 5.000 et 100.000 U.A. A ces fins, le principe actif est mis, en mélange ou 30 en association avec des excipients classiques, sous une des formes pharmaceutiques convenant à ces types d'administration Le principe actif est présenté notamment sous l'une des formes usuelles en pharmacotechnie comme les comprimés, les drages. Ies gélules, les capsules, les CA 02251009 1998-lO-0~

poudres, les solutions ou suspensions, les aérosols secs, les ovules, les comprimés vaginaux.
L'administration se fera en fonction du besoin thérapeutique, d'une à trois fois par jour.

Les résultats obtenus sur animal semblent avoir tous une même origine: I'action fondamentale de la PANSTIMASE(I~) sur l'intestin; cette action présente différents aspects qui seront décrits successivement.

ETUDE PHARMACOLOGIQUE
DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES SELON L'INVENTION
ACTION DE LA PANSTIMASE DANS L'INTESTIN

1. - Villosités 15 Sur des rats relativement jeunes (environ 2 mois), des examens en microscopiephotonique montrent que les villosités présentent un développement normal, pour les rats témoins comme pour les rats traités.

Sur des rats relativement âgés (environ 7 mois), ces examens montrent que les villosités 20 des rats témoins sont atrophiées, tandis que celles des rats traités depuis leur sevrage à 4 semaines sont aussi développées que celles des rats âgés de 2 mois. On constate donc que la PANSTIMASE~3 provoque un certain ~ rajeunissement ~ de l'intestin, dont les villosités conservent plus longtemps leur capacité initiale de développement et de renouvellement rapide.
L'intestin n'est pas seulement un filtre, physiologiquement inactif; c'est aussi la plus grande des glandes endocrines (B.LEBLANC et al.Rec. Med. Vet. 1981, 157 629;
K.UVNAS-MOBERG, pour la SCIENCE, Septembre 1989, 24). Constitué de petites cellules en renouvellement rapide durant toute la vie, I'intestin est l'organe la plus riche en 30 Acides Nucléiques: ADN+ARN (G.DURAND et al. Ann. Biol. Anim. Bioch. Biophys. 1.966.

6. 389); il a donc la plus forte capacité latente de synthese protéique.
L'examen de coupes histologiques de l'intestin indique que la PANSTIMASE~3 permet une meilleure expression de cette capacité latente, et par suite une production plus forte de nombreux composés physiologiquement actifs: enzymes digestifs, hormones (agissant CA 022~1009 1998-10-0~

sur le pancréas, le foie, le cerveau), immunoglobines, cytokines, neurotransmetteurs (par exemple le VIP = Vasoactive Intestinal Peptide); facteurs de croissance (ou de survie) celluiaire... On peut ainsi expliquer que la PANSTIMASE(~), qui agit directement dans l'intestin, puisse agir indirectement sur les organes et les systèmes physiologiques 5 influences par les composés précédents; ainsi s'expliquerait notamment son action remarquable sur le pancréas (A.ESTIVAL et al. Communication aux Journées Métabolisme de Nancy 25-26 Janvier 1979 - Université de Nancy 1).

L'intestin est également l'organe le plus riche en cellules immunitaires, qui circulent dans 10 ses vaisseaux sanguins et Iymphatiques, ou qui se rassemblent et se multiplient dans les plaques de PEYER. Ces cellules immunitaires sont une composante du MALT (MucosaeAssociated Lymphoid Tissue) qui se subdivise en GALT situé dans l'intestin, et en BALT
situé dans les bronches, et qui présente des analogies avec le SALT situé dans la peau.
Le GALT et le BALT sont interdependants et agissent en synergie pour assurer la défense 15 immunitaire des muqueuses, et pour contribuer à la défense de l'organisme dans son ensemble.

L'examen de coupes histologiques de l'intestin montre que la PANSTIMASE(~ stimule directement le GALT; elle peut donc stimuler indirectement la défense immunitaire 20 générale. Ainsi s'expliquerait le fait que la PANSTIMASE~ augmente la résistance des animaux vis-à-vis des maladies infectieuses.

2 - Microvillosités 25 Sur des rats, jeunes ou âgés, des examens en microscopie électronique montrent que les microvillosités des rats témoins sont enrobées par du mucus hypervisqueux et par des traces de résidus alimentaires; au contraire, celles des rats traités par la PANSTIMASE(~) apparaissent plus nettes, plus hautes, plus nombreuses. La PANSTIMASE~ peut doncaugmenter la surface développée totale des microvillosités, c'est-à-dire leur capacité
30 d'absorption.
~ In vitro ~, en traitant par la PANSTIMASE(~) des fragments d'intestin prélevés sur des rats témoins, on a constaté qu'on pouvait, sans endommager les microvillosités, éliminer le mucus hypervisqueux qui les enrobe; cette action détergente modérée peut s'effectuer en quelques minutes.

CA 022~1009 1998-10-05

7 PCTIFR97/00614 ~ In vivo ~, ce nettoyage de la muqueuse intestinale permet l'établissement d'un contact plus étroit entre les germes infectieux et cette muqueuse, ce qui peut induire la multiplication dans l'intestin de cellules immunitaires aptes à lutter contre ces germes.

3 - Cellules sécrétrices et microqlandes exocrines Diverses cellules sécretrices (productrices de mucus, de Iysozyme...) et de nombreuses microglandes exocrines sont réparties tout au long de l'intestin dans lequel elles déversent 10 d'importantes quantités de sécrétions (environ 2 000 ml par jour chez l'homme) L'écoulement de ces sécrétions peut être freiné, ou même bloqué, par la présence de microbouchons muqueux.

L'examen de coupes histologiques de l'intestin montre que la PANSTIMASE(~ désagrège 15 ces microbouchons. rétablit l'écoulement normal de ces sécrétions, et provoque une augmentation réactionnelle de leur production.

On sait que la sécrétion de salive contient un facteur de croissance cellulaire: Epithélial Growth Factor (E G F); de même, les sécrétions intestinales peuvent contenir des20 facteurs de croissance susceptibles d'agir sur les entérocytes, les Iymphocytes...
L'augmentation de la production de tels facteurs, sous l'action de la PANSTIMASE~, peut expliquer le meilleur développement des villosités et du GALT, constaté sur les coupes histologiques de l'intestin des rats traités.

25 4 - Plaques de PEYER

Les plaques de PEYER, qui sont des agrégats de cellules immunitaires répartis tout au long de l'intestin, sont plus nombreuses chez les rats traites: elles apparaissent dès le duodénum chez ces rats, mais seulement à partir du jéjunum chez les rats témoins; elles 30 sont aussi plus denses: leurs Iymphocytes sont plus petits, plus serrés, et semblent plus actifs (ils sont plus intensément colorés par les réactifs utilisés en histologie~

5 - Non adhérence prolonqée des qermes infectieux CA 022~l009 l998-lO-0~

8 PCT/FR97/00614 La PANSTIMASE~) peut s'opposer à l'adhérence prolongée des germes infectieux sur les muqueuses, et notamment sur la muqueuse intestinale.

Cette adhérence prolongée resulte de la formation de liaisons chimiques entre des 5 adhésines fixées sur ces germes et leurs récepteurs fixés sur la muqueuse: adhésines et récepteurs sont des (glyco-lipo) protéines complexes.
Des essais ~ in vitro ~ ont montré que la PANSTIMASE(3), qui a une certaine affinité pour les protéines complexes, peut couper des adhésines, ou détacher des récepteurs de la muqueuse où ils sont fixés; il en résulte souvent une rupture de l'adhérence qui peut 10 s'effectuer en quelques dizaines de minutes.
En outre, la PANSTIMASE(~) peut stimuler le renouvellement des villosites de l'intestin, c'est-à-dire l'élimination d'anciennes cellules anormales ou affectées par l'adhérence des germes infectieux; cette élimination est facilitée par l'intensification du flux des sécrétions intestinales, dont la production est augmentée sous l'action de la PANSTIMASE~.
On voit que, si la PANSTIMASE(~ peut d'abord permettre un contact plus étroit entre les germes infectieux et la muqueuse intestinale (et induire la multiplication dans l'intestin de cellules immunitaires aptes à lutter contre ces germes), elle peut aussi s'opposer ensuite à l'adhérence prolongée de ces germes sur la muqueuse et à leur pénétration dans le 20 tissu sousjacent.

6 - Destruction des entérotoxines protéiques A des concentrations comprises entre 10 et 100 U.A./ml, et par chauffage a 37~ C25 pendant quelques dizaines de minutes, la PANSTIMASE(~) détruit de nombreuses toxines protéiques, et peut ainsi contribuer à la prévention et/ou au traitement de diarrhées. Parmi les toxines détruites par la PANSTIMASE(~, on peut citer la toxine botulique, la toxine cholérique, la toxine LT produite par des colibacilles pathogènes, le ~acteur Cytotoxique Nécrosant également produit par ces colibacilles...
Oans les mêmes conditions, les protéinases endogènes (Trypsine, Chymotrypsine...) ne détruisent pas ces toxines, et ne peuvent donc pas contribuer à la prévention eVou au traitement de ces diarrhées.

CA 022~1009 1998-10-0~

9 PCT/17:R97/00614 Dans le cas de la toxine LT, la PANSTIMASE(~) détruit la sous-unité A qui est agressive, sans détruire la sous-unité B qui est immunostimulante.

7 - Conclusion La PANSTIMASE(~ exerce, tout au long de l'intestin, une action fondamentale qui stimule le fonctionnement global de cet organe-clé, et par suite de tout l'organisme; d'où la grande diversité des exemples d'applications thérapeutiques.

APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES SELON L'INVENTION

L'action fondamentale de la PANSTlMASE(g) sur l'intestin permet d'envisager son utilisation ou l'utilisation des principes actifs dont elle composée, à savoir la protéinase 15 prépondérante exocellulaire ou le mélange de cette protéinase prépondérante exocellulaire avec l'une au moins des deux autres protéinases exocellulaires, pour contribuer à la prévention ou au traitement de maladies.

1 - Mucoviscidose et maladies respiratoires La mucoviscidose est caractérisée par la sécrétion excessive d'un mucus trop visqueux, au niveau intestinal comme au niveau bronchique. Tous les mucus ont le même type de structure biochimique; c'est pourquoi la PANSTIMASE~) peut optimiser la viscosité du mucus intestinal. du mucus bronchique ou du mucus génital.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné à optimiser la viscosité des mucus intestinal, bronchique eVou 30 génital.

La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les proteinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisees pour la fabrication d'un CA 022~l009 l998-lO-0~

WO 97~37681 1 0 PCT/FRg7/00614 médicament destiné au traitement de la mucoviscidose et des maladies en rapport avec un excès de sécrétion d'un mucus intestinal, bronchique et/ou génital, et notamment quand celui-ci est trop visqueux.

2 - Amélioration de la résorption et de la circulation san~uine Par son action détergente modérée sur la paroi intestinale, la PANSTIMASE(~ contribue à
l'amélioration de la résorption.
Cette amélioration de la résorption peut se constater en dosant dans le sang des animaux

10 des médicaments administrés par voie orale. Par exemple, on a administré à des poulets, par sonde gastrique, 50 mg de tétracycline sans PANSTIMASE(~) (lot témoin) ou enassociation avec 3 mg de PANSTIMASE(~) titrant 400 U.A.lmg (lot traité); on a prélevé 2.5 ml de sang 2 heures après cette administration, et on a constaté que la concentration moyenne de tétracycline dans le sérum est de 1.35 mcg/ml pour le lot témoin et de 1.90 15 mcg/ml pour le lot traité.

Cette amélioration de la résorption peut s'analyser plus précisément en étudiant la fixation des médicaments dans différents organes. Par exemple, on a donné à des truites, pendant 2 jours, un aliment médicamenteux contenant 4g/kg d'Oxytétracycline non 20 supplémenté en PANSTIMASE(~3 (lot témoin), ou supplémenté par 300 mg/kg de PANSTIMASE titrant 400 U.A./mg (lot traité). On a ensuite sacrifié ces poissons et on a dosé l'antibiotique dans le foie, les muscles et les reins. On a constaté que laPANSTIMASE~ permet d'obtenir une augmentation importante de la concentration tissulaire en antibiotique, qui varie beaucoup suivant l'organe considéré:
25 + 100 % dans le foie soit 5,75 mcg/g pour le lot traité vs 2,5 mcg/g pour le lot témoin + 400 % dans les muscles soit 1,75 mcg/g pour le lot traité vs 0,3 mcg/g pour le lot témoin + 1.000 % dans les reins soit 5,75 mcg/g pour le lot traité vs 0,5 mcg/g pour le lot témoin Il apparaît que la PANSTIMASE~ provoque une meilleure résorption de l'Oxytétracycline, 30 et une meilleure distribution de cet antibiotique dans tout l'organisme, ce qui semble impliquer une amélioration de la circulation sanguine.

La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les CA 022~1009 1998-10-0~

11 PCTIFR97100614 protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des malabsorptions de médicaments ou de nutrimentsl ainsi qu'au traitement des troubles de la circulation sanguine; en particulier, ce médicament est destiné au traitement de la dénutrition constatée chez les personnes 5 agees ou chez les malades ayant reçu des médicaments dont les effets secondaires affectent le bon fonctionnement de l'intestin.

3 - Ulcères diqestifs et entérotoxémies 10 Les ulcères digestifs ont pour origine l'adhérence sur la paroi stomacale d'une bactérie (Helicobacter pylori), et certaines entérotoxémies ont pour origine l'adhérence sur la paroi intestinale de divers germes infectieux.
La PANSTIMASE(~ s'oppose à l'adhérence prolongée de germes infectieux sur les muqueuses, et détruit de nombreuses entérotoxines; elle peut ainsi contribuer à stimuler 15 le renouvellement de l'intestin et peut prévenir eVou traiter des ulcères digestifs et des entérotoxémies.

De fait, en élevage industriel, on a constaté que la PANSTIMASE(~ est capable de réduire le nombre de porcs souffrant d'ulcères digestifs, ainsi que la mortalité par entérotoxémies.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destine à prévenir eVou à traiter l'adhérence prolongée des germes 25 infectieux sur les muqueuses, à faciliter la régénération des villosités atrophiées ou détruites de la muqueuse intestinale, ainsi qu'à prévenir eVou à traiter les ulcères digestifs et les entérotoxémies.

4 - Diabète, insuffisances héPatiques et troubles du transit intestinal Dans le brevet antérieur, on a déjà indiqué que la PANSTIMASE(~ stimulait la fonction exocrine du pancreas; on a en effet constaté une importante augmentation de la concentration dans le pancréas de tous les enzymes ou proenzymes dosés: + 50 % pour l'amylase, + 70 % pour le trypsinogène et le chymotrypsinogène, + 80 % pour la lipase CA 022~1009 1998-10-0~

WO g7/37681 1 2 PCT/FRg7/00614 (A.ESTIVAL et al. Communication aux Journées Métabolisme de Nancy 25-26 Janvier 1979 - Université de Nancy 1).

L'examen de coupes histologiques de pancréas a ensuite montré que les îlots de 5 LANGERHANS, sont plus nombreux et ont un meilleur aspect chez les rats traités. Ces examens suggèrent que la PANSTIMASE(~) stimule d'abord la fonction endocrine du pancréas, avec pour conséquence une amélioration générale de l'anabolisme protéique, d'où la stimulation consécutive de sa fonction exocrine.

10 Cette stimulation qui s'exerce sur le pancréas, s'exerce également sur le foie, ce qui a pour conséquence une amélioration du transit intestinal. En élevage intensif, on observe souvent des constipations chez les truies gestantes attachées; on a constaté que la supplémentation de leur alimentation en PANSTIMASE(~) permet d'éviter ces perturbations nuisibles du transit intestinal.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir eVou à traiter le diabète, les insuffisances hépatiques et 20 les troubles du transit intestinal.

5 - Maladies infectieuses, dysfonctionnements immunitaires, et vaccination On a déjà indiqué que la PANSTIMASE~ agit favorablement sur le GALT, et par suite sur 25 I'ensemble du système immunitaire. Il en résulte des améliorations dans 3 domaines différents.

A - Maladies infectieuses 30 Certaines observations en élevage intensif ont montré que la PANSTIMASE~ améliorait souvent l'état sanitaire des animaux, ce qu'on a d'abord attribué au fait qu'elle facilitait la résorption des antibiotiques qui sont ajoutés dans la plupart des aliments industriels. Mais on a constaté ensuite que cette amélioration était particulièrement nette en casd'infections par différents virus, alors que ceux-ci sont en général insensibles à l'action CA 022~1009 1998-10-0~

WO 97/37681 1 3 PCT/FRg7/00614 des antibiotiques. Ces constatalions concernent la grippe et la maladie d'AUJESKY chez les porcins, la maladie de GUMBORO chez les poulets et I ecthyma chez les chevreaux Dans ce dernier cas, I'infection virale constatée au cours dun essai en station 5 expérimentale, a fait l'objet d'observations précises, portant au total sur 120 chevreaux; le pourcentage d'animaux non atteints a été de 34 % pour le lot témoin, et de 70 % pour le lot traité; le pourcentage d'animaux très atteints a été de 28 % pour le lot témoin, alors qu'aucun animal n'a été très atteint dans le lot traité.

10 Cette action antivirale peut s'expliquer par le fait que la PANSTIMASE(~ augmente le nombre et la densité de plaques de PEYER qui sont des agrégats de cellules immunitaires repartis tout au long de l'intestin.

B - Dysfonctionnements immunitaire D'autres observations sur des porcelets en élevage intensif ont montré que la PANSTIMASE(~ réduisait la durée des arthrites qui sont des réactions inflammatoires consécutives à des blessures aux articulations affectant les animaux élevés sur caillebotis métalliques. Aprbs cicatrisation des blessures, ces réactions inflammatoires peuvent 20 s'estomper progressivement sous l'action de cellules immunitaires dites suppressives, qui sont nombreuses dans l'intestin, et qui peuvent migrer vers les zones d'inflammation. Il est possible que la PANSTIMASE(!~) stimule la multiplication de ces cellules dans l'intestin, et qu'elle facilite leur migration, ce qui expliquerait le fait qu'elle réduit la durée des arthrites~
d'environ 50 %.
C - Vaccinations Les améliorations de l'état sanitaire constatées en élevage intensif peuvent s'expliquer par une meilleure réponse aux vaccinations des animaux recevant un aliment supplémenté en 30 PANSTIMASE~3. Des essais préliminaires en laboratoire, sur des souris, ont effectivement confirmé que la PANSTIMASE(~) peut augmenter l'efficacité des vaccinations, notamment lorsque celles ci sont effectuées par voie orale.

CA 022~1009 1998-10-0~

WO97/37681 14 PCT~R97/~614 La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la ~abrication d'un médicament destiné à prévenir eVou à traiter les maladies infectieuses et les dysfonctionnements immunitaires, ainsi qu'à augmenter l'efficacité des vaccinations.

6 - Insuffisances hormonales et maladies déqénératives liées au vieillissement On a constaté que, sur les porcins reproducteurs âgés, la PANSTIMASE(~) provoque une 10 réduction de l'intervalle sevrage-saillie fécondante (qui tend à augmenter chez les truies), et une stimulation de l'ardeur sexuelle, (qui tend à décliner chez les verrats). Il apparaît donc que la PANSTIMASE~) permet de remédier aux insuffisances hormonales, et probablement à d'autres effets négatifs dûs au vieillissement.

15 On a effectivement constaté que la PANSTIMASE~) provoque un ~ rajeunissement ~ chez les rates reproductrices âgées, et une réduction des effets négatifs du vieillissement chez les truies et les poules reproductrices âgées.

A. La première saillie des rates est normalement affectée vers l'âge de 70 jours;
lorsqu'elle est effeduée vers 140 jours, les performances de reproduction sont mauvaises pour le lot témoin et sont meilleures pour le lot traité (recevant le même aliment supplémenté par 300 mg/kg de PANSTIMASE(~ titrant 400 U.A./mg).

Lot témoin Lot témoin Lot traité
saillie à 70 jsaillie à 140jsaillie à 140j Taux de fécondation 62 % 29 % 45 %
Mortalité périnatale des ratons 18 % 35 % 18 %
Nombre de ratons sevrés par portée 9 6,6 8,1 25 On constate que les rates témoins saillies à 140j donnent de mauvais résultats mais que les rates traitées également saillies à 140 j donnent des résultats qui se rapprochent des résultats normaux donnés par les rates témoins saillies à 70 j, et même deviennent CA 022~1009 1998-lO-OS

WO 97/37681 15 PCT~R97/00614 identiques dans le cas du taux de mortalité périnatale. On peut donc dire que laPANSTIMASE(~ a provoqué un ~ rajeunissement ~ des rates âgées de 140 j.

B. Les truies reproductrices sont réformées dès qu'elles apparaissent en ~ mauvais état ~, par exemple lorsque l'éleveur estime qu'elles ne peuvent plus se tenir bien d'aplomb, ni se coucher en souplesse (au lieu de se laisser tomber lourdement en risquant d'écraser les porcelets nouveau-nés). Dans un élevage de 80 truies, avant l'utilisation de la PANSTIMASE~, les truies sont réformées après 4,4 cycles de reproduction en moyenne; six mois après cette utilisation, il est apparu que l'on pouvait réformer les truies après 5,8 cycles de reproduction en moyenne. On peut donc considérer que la PANSTIMASE(~) a permis de prolonger, d'environ 30%, la vie productive des truies, sans altération inacceptable de leur ~ bon état ~ et de leurs performances.

En vieillissant, les poules pondeuses ont tendance à produire des oeufs ayant une 15 coquille plus fragile, de sorte que le pourcentage d'oeufs fêlés peut devenir supérieur à 10 % en fin de ponte. La PANSTIMASE~ a permis de réduire de moitié ce pourcentage, ce qui implique une stimulation du métabolisme phosphocalcique.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les 20 protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir eVou à traiter les insuffisances hormonales et les maladies dégénératives liées au vieillissement, par exemple l'arthrite, I'arthrose, I'ostéoporose.

EVALUATION PRELIMINAIRE DE LA TOLERANCE
DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES SELON L'INVENTION

Des essais toxicologiques ont montré que la PANSTIMASE(~) n'a aucune toxicité sur les porcelets lorsqu'elle est administrée pendant 1 mois à une dose 20 fois supérieure à la dose d'emploi actuellement recommandée qui est de 40.000 U.A. par Kg d'aliment, ni 30 aucune toxicité sur le rat lorsqu'elle est administrée pendant 3 mois à une dose 200 fois supérieure à cette dose d'emploi.

En conséquence, on a pu engager un essai préliminaire de tolérance chez l'homme, sous une dose d'emploi relativement élevée par rapport à la dose actuellement prevue; on a CA 022~1009 1998-10-0~

en effet utilisé des gélules contenant 750.000 U.A. de PANSTIMASE(~) purifiée (soit 50 mg d'un lot tirant 15.000 U.A./mg) qu'on a administrées à raison de 2 à 3 gélules par jour pendant 2 ou 3 semaines à des malades.

On a sélectionné 24 patients (12 hommes - 12 femmes), ayant 44 ans d'âge moyen avec des extrêmes allant de 25 à 70 ans; 17 de ces patients souffraient de dyspepsie au sens le plus large du terme sans qu aucune lésion organique n ait pu être mise en évidence par les investigations paracliniques (examens de laboratoire, radiologies, dans certains cas endoscopie; 7 de ces patients étaient porteurs de lésions organiques: 3 pancréatiques, 2 gastrectomie (I'une pour ulcère, I'autre pour néoplasme), 2 colectomie (I'une pour rectocolite ulcérohémorrhagique, I'autre pour néoplasme).
Sur l'ensemble de ces 24 patients, on a étudié l'évolution de la symptomatologie et du poids, lorsqu'une insuffisance pondérale, avec ou sans dénutrition, existait au début du traitement. Plusieurs sujets ont signalé une amélioration portant sur la régularisation du transit intestinal en cas de constipation ou au contraire de diarrhée, ainsi qu'une reprise de poids en cas de dénutrition.

On a également engagé un essai préliminaire concernant la mucoviscidose chez un malade âgé de 18 ans qui a reçu chaque jour, pendant 3 semaines, 2 gélules contenant chacune 10.000 U.A. de PANSTIMASE(!~) ; on a constaté une amélioration des symptômes, au niveau intestinal (fèces moins abondantes et moins collantes) et au niveau bronchique (expectorations plus faciles et moins fréquentes).

En conclusion, on peut dire que la PANSTIMASE(~) a été bien tolérée, et qu'elle semble particulierement efficace en cas de dénutrition.

La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'une composition diététique pour l'alimentation des sujets fragiles ou dénutris.

Claims (8)

1. Compositions pharmaceutiques et/ou diététiques destinées à contrôler l'hyperviscosité
des mucus intestinal, bronchique et/ou génital chez l'homme ou l'animal, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif la protéinase prépondérante exocellulaire de type 11 produite par Streptomyces fradiae, et définie par sa capacité de lyser sélectivement la sous-unité A de la toxine cholérique et de la toxine LT sans affecter la sous-unité B, en mélange ou en association avec un véhicule ou un excipient inerte, non toxique, physiologiquement acceptable.

2. Compositions pharmaceutiques et/ou diététiques selon la revendication 1 caractérisées en ce qu'elles contiennent comme principe actif la protéinase exocellulaire prépondérante de type 11 de Streptomyces fradiae, ou le mélange de celle-ci avec une au moins des deux autres protéinases exocellulaires produites par Streptomyces fradiae, ou bien une ou plusieurs protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celle de la protéinasé exocellulaire préponderante ou avec celles du mélange de protéinases exocellulaires, en mélange ou en association avec un véhicule ou un excipient inerte, non toxique, physiologiquement acceptable.

3. Utilisation des protéinases selon l'une des revendications 1 ou 2, pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les malabsorptions de médicaments ou de nutriments.

4. Utilisation des protéinases exocellulaires selon l'une des revendications 1 ou 2, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter les troubles du transit intestinal, l'adhérence prolongée des germes infectieux sur les muqueuses, à faciliter la régenération des villosités de la muqueuse intestinale, ainsi qu'à prévenir et/ou traiter les ulcères digestifs et les entérotoxémies, tout en assurant la régulation de la sécrétion du mucus intestinal, bronchique ou génital.

5. Utilisation de la ou des protéinases exocellulaires selon l'une des revendications 1 ou 2, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou a traiter les troubles pancréatiques et les insuffisances hépatiques.

6. Utilisation de la ou des protéinases exocellulaires selon l'une des revendications 1 ou 2, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter les maladies infectieuses, les dysfonctionnements immunitaires, ainsi qu'à augmenter l'efficacité des vaccinations.

7. Utilisation de la ou des protéinases exocellulaires selon l'une des revendications 1 ou 2, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter les insuffisances hormonales et les maladies dégénératives liées au vieillissement.

8. Utilisation de la ou des protéinases exocellulaires selon l'une des revendications 1 ou 2, pour la fabrication d'une composition diététique pour l'alimentation des sujets fragiles ou dénutris.