CA2251009C

CA2251009C - Medicament optimisant la viscosite des mucus et stimulant le fonctionnement de l'intestin

Info

Publication number: CA2251009C
Application number: CA2251009A
Authority: CA
Inventors: Michel Hooreman
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 2013-07-02
Anticipated expiration: 2017-04-04
Also published as: HUP9902421A3; RU2198673C2; BR9708506A; US6440413B1; PL329161A1; JP2000509025A; TR199801976T2; JP4196225B2; PL188157B1; AP9801357A0; CN1168499C; NZ332107A; HUP9902421A2; CN1221347A; OA10894A; CZ298428B6; NO984632D0; AU735340B2; EP0891189A1; AP1018A

Abstract

L'invention se rapporte au domaine de la biologie et plus particulièrement à la chimie thérapeutique. Elle a spécifiquement pour objet des compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif un enzyme ou un complexe enzymatique contenant cet enzyme obtenu par mise en culture de Streptomyces fradiae dans les conditions définies dans le brevet français 2.600.340, en mélange ou en association avec un excipient ou un véhicule inerte non-toxique, physiologiquement acceptable. Ces compositions pharmaceutiques trouvent un emploi pour la prévention ou le traitement des maladies dégénératives notamment liées à un dysfonctionnement intestinal.

Description

MEDICAMENT
OPTIMISANT LA VISCOSITE DES MUCUS ET
STIMULANT LE FONCTIONNEMENT DE L'INTESTIN
L'invention se rapporte au domaine de la biologie et plus particulièrement à
celui de la chimie thérapeutique.
L'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques et/ou diététiques, à
base d'un enzyme ou d'un complexe enzymatique contenant cet enzyme, pouvant contribuer à
la prévention et/ou au traitement de maladies.
Elle a plus particulièrement pour objet des compositions pharmaceutiques à
base d'un enzyme ou d'un complexe enzymatique contenant cet enzyme stimulant les fonctions de l'intestin, et pouvant ainsi contribuer à la prévention et/ou au traitement des maladies dégénératives liées au vieillissement.
Elle a spécifiquement pour objet des compositions pharmaceutiques renfermant à
titre de principe actif un ou plusieurs enzymes extraits ou contenus dans le complexe enzymatique obtenu par mise en culture de Streptomyces fradiae dans les conditions définies dans le brevet français 2.600.340 au nom du Demandeur.
Dans le brevet précité, on a décrit la production et l'utilisation en zootechnie d'un nouveau complexe protéolytique, obtenu à partir d'une bactérie filamenteuse, Streptomyces fradiae ; ce complexe est désigné ci-après par sa dénomination commerciale actuelle :
PANSTIMASE O.
Cette bactérie filamenteuse peut produire simultanément au moins 5 protéinases et 2 peptidases ; ces 7 enzymes ont été décrits par K.MORIHARA et al.(Biochim.Biophys.Acta, 1967, 139, 382). Lorsqu'ils sont ajoutés conjointement dans les aliments consommés par les animaux, ces 7 enzymes provoquent une réduction excessive de la viscosité
du mucus intestinal, et peuvent ensuite provoquer une ulcération de la paroi intestinale. Ces 7 enzymes ont donc des effets négatifs en zootechnie lorsqu'ils sont utilisés conjointement.

2 Dans les conditions indiquées dans le brevet précité, on obtient la PANSTIMASEO, qui est constituée seulement par 3 protéinases exocellulaires, avec prépondérance de l'une d'entre elles, et à l'exclusion des protéinases et peptidases endocellulaires.
Ajoutée dans les aliments consommés par les animaux, la PANSTIMASEO provoque une réduction modérée de la viscosité du mucus intestinal, et n'est pas susceptible d'attaquer la paroi intestinale.
En même temps que son action relativement modérée sur les protéines du mucus intestinal, la PANSTIMASEO exerce une action plus forte sur les protéines de matières premières entrant dans la composition des aliments, ce qui améliore leur digestibilité.
Outre ces actions directes dans l'intestin, la PANSTIMASE8 exerce des actions indirectes sur les différents organes, notamment sur le pancréas ; comme déjà indiqué
dans le brevet antérieur, on a constaté qu'elle provoque une augmentation de 50 à 80 %
de la concentration en enzymes ou en proenzymes dans cet organe.
En raison de ces actions favorables, la PANSTIMASEO est maintenant utilisée comme complément nutritionnel s'ajoutant dans les aliments destinés aux animaux, pour améliorer leur croissance ou leur productivité. C'est ainsi qu'on a pu constater qu'elle améliore aussi la résistance des animaux vis-à-vis des maladies infectieuses, bactériennes ou virales, et qu'elle réduit certains effets négatifs du vieillissement.
Ces constatations ont suggéré l'application possible en thérapeutique, pour l'animal comme pour l'homme, de la PANSTIMASEO, ou des principes actifs dont elle est constituée, à savoir, la protéinase prépondérante exocellulaire produite par Streptomyces fradiae ou le mélange de cette protéinase prépondérante exocellulaire avec au moins l'une des deux autres protéinases exocellulaires produites par Streptomyces fradiae.
Les principes actifs des compositions pharmaceutiques requièrent une purification supplémentaire par rapport au produit utilisé pour l'animal. Dans les conditions indiquées dans le brevet antérieur, on obtient une PANSTIMASEO non purifiée dont le titre est au moins égal à 2.000 U.A./mg.
L'Unité Anson (en abrégé U.A.) est ici définie comme étant la quantité
d'enzyme qui, incubée pendant 10 min à 25 C et à pH 7.5 en présence d'hémoglobine dénaturée, libère

3 de ce substrat l'équivalent de 1 mcg de tyrosine, déterminée par absorption spectrophotométrique à 280 nm sur le filtrat non précipitable par l'acide trichloracétique.
Divers ajustements des conditions indiquées dans le brevet antérieur permettent d'obtenir une PANSTIMASE semi-purifiée dont le titre est au moins égal à 4.000 U.A./mg.
Les techniques classiques de précipitations fractionnées, ou de passages sur colonne, permettent d'obtenir isolément chacune des 3 protéinases composant la PANSTIMASE .
L'activité spécifique de la protéinase prépondérante exocellulaire est supérieure à
100.000 U.A./mg, elle est nettement plus élevée que celle des 2 autres protéinases ; son poids moléculaire est voisin de 32 kDa, et son point isoélectrique est voisin de 7Ø
Cette protéinase prépondérante explique à elle seule les principales propriétés physiologiques de la PANSTIMASE , en raison notamment du fait qu'elle est seule à
exercer une action caractéristique sur deux protéines importantes : la toxine cholérique et le collagène.
La toxine cholérique est l'homologue de la toxine LT produite par certains colibacilles pathogènes ; elle est composée de la sous-unité A qui est agressive, et de la sous-unité B
qui est immuno-stimulante. A faible concentration, comparable à celle qui existe dans l'intestin des animaux recevant un aliment supplémenté en PANSTIMASE , la protéinase prépondérante détruit sélectivement la sous-unité A sans détruire la sous-unité B qui conserve ainsi sa capacité de stimuler le système immunitaire.
Le collagène est la protéine la plus abondante dans le règne animal : chez les mammifères, les différents types de collagène représentent environ un tiers des protéines totales. On sait que la solubilité du collagène musculaire dans l'eau chaude est forte s'il provient d'animaux jeunes, et faible s'il provient d'animaux âgés.
Lorsqu'on traite par la protéinase prépondérante le collagène d'animaux âgés, on augmente sa solubilité dans l'eau chaude qui devient comparable à celle d'animaux jeunes. On peut en conclure que cette protéinase provoque un certain rajeunissement>
du collagène.
La plupart des résultats sur animaux correspondent à des essais effectués avec de la PANSTIMASE non purifiée ou semi-purifiée. Pour l'homme on pourra utiliser soit la PANSTIMASE serni-purifiée, soit la ou les protéinases purifiées dont elle est composée, _

4 à savoir la protéinase prépondérante exocellulaire ou le mélange de cette protéinase prépondérante exocellulaire avec l'une au moins des deux autres protéinases exocellulaires, ou avec une ou des protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la protéinase prépondérante exocellulaire ou avec celles du mélange de protéinases tel que défini précédemment.
La présente invention a pour objet des compositions pharmaceutiques et/ou diététiques renfermant à titre de principe actif la protéinase prépondérante exocellulaire produite par mise en culture de Streptomyces fradiae présentant une activité spécifique supérieure à
100.000 U.A./mg, un poids moléculaire variant de 30 à 36 kDa et de préférence voisin de 32 kDa, un point isoélectrique voisin de 7.0, et susceptible de détruire sélectivement la sous-unité A de la toxine cholérique sans détruire la sous-unité B, en mélange ou en association avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, physiologiquement acceptable.
La présente invention a encore pour objet des compositions pharmaceutiques et/ou diététiques renfermant à titre de principe actif la protéinase prépondérante exocellulaire telle que définie, ou le mélange de cette protéinase prépondérante exocellulaire avec l'une au moins des deux autres protéinases exocellulaires produites par mise en culture de Streptomyces fradiae, ou, une ou des protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la protéinase prépondérante exocellulaire ou avec celles du mélange de protéinases tel que défini précédemment, en mélange ou en association avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, physiologiquement acceptable. Les protéinases homologues peuvent être extraites de culture de différents micro-organismes et en particulier de Streptomyces fradiae ou de Streptomyces griseus.
La présente invention a pour objet l'utilisation de la protéinase exocellulaire prépondérente de type Il extraite des cultures de streptomyces fradiae, ou le mélange de celle-ci avec l'une au moins des deux autres protéinases exocellulaires produites dans les cultures de streptomyces fradiae, présentant une activité spécifique supérieure à 100.000 U.A./mg, un poids moléculaire d'environ 30-36 kDa et un point isoéléctrique d'environ 7.0, en mélange ou en association avec un véhicule ou un excipient inerte non toxique, pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les malabsorptions de médicaments ou des nutriments.

4a Le principe actif est administré par voie orale, pulmonaire ou génitale à des doses comprises entre 5.000 et 100.000 U.A. A ces fins, le principe actif est mis, en mélange ou en association avec des excipients classiques, sous une des formes pharmaceutiques convenant à ces types d'administration Le principe actif est présenté notamment sous l'une des formes usuelles en pharmacotechnie comme les comprimés, les dragés, les gélules, les capsules, les

5 poudres, les solutions ou suspensions, les aérosols secs, les ovules, les comprimés vaginaux.
L'administration se fera en fonction du besoin thérapeutique, d'une à trois fois par jour.
Les résultats obtenus sur animal semblent avoir tous une même origine :
l'action fondamentale de la PANSTIMASEO sur l'intestin ; cette action présente différents aspects qui seront décrits successivement.
ETUDE PHARMACOLOGIQUE
DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES SELON L'INVENTION
ACTION DE LA PANSTIMASE DANS L'INTESTIN
1. - Villosités Sur des rats relativement jeunes (environ 2 mois), des examens en microscopie photonique montrent que les villosités présentent un développement normal, pour les rats témoins comme pour les rats traités.
Sur des rats relativement âgés (environ 7 mois), ces examens montrent que les villosités des rats témoins sont atrophiées, tandis que celles des rats traités depuis leur sevrage à 4 semaines sont aussi développées que celles des rats âgés de 2 mois. On constate donc que la PANSTIMASEO provoque un certain rajeunissement de l'intestin, dont les villosités conservent plus longtemps leur capacité initiale de développement et de renouvellement rapide.
L'intestin n'est pas seulement un filtre, physiologiquement inactif ; c'est aussi la plus grande des glandes endocrines (B.LEBLANC et al.Rec. Med. Vet. 1981, 157 629 ;
K.UVNAS-MOBERG, pour la SCIENCE, Septembre 1989, 24). Constitué de petites cellules en renouvellement rapide durant toute la vie, l'intestin est l'organe la plus riche en Acides Nucléiques : ADN+ARN (G.DURAND et al. Ann. Biol. Anim. Bioch. Biophys.
1.966.

6. 389) ; il a donc la plus forte capacité latente de synthèse protéique.
L'examen de coupes histologiques de l'intestin indique que la PANSTIMASEO
permet une meilleure expression de cette capacité latente, et par suite une production plus forte de nombreux composés physiologiquement actifs : enzymes digestifs, hormones (agissant -sur le pancréas, le foie, le cerveau), immunoglobines, cytokines, neurotransmetteurs (par exemple le VIP = Vasoactive Intestinal Peptide) ; facteurs de croissance (ou de survie) cellulaire... On peut ainsi expliquer que la PANSTIMASEO, qui agit directement dans l'intestin, puisse agir indirectement sur les organes et les systèmes physiologiques influencés par les composés précédents ; ainsi s'expliquerait notamment son action remarquable sur le pancréas (A.ESTIVAL et al. Communication aux Journées Métabolisme de Nancy 25-26 Janvier 1979 - Université de Nancy l).
L'intestin est également l'organe le plus riche en cellules immunitaires, qui circulent dans ses vaisseaux sanguins et lymphatiques, ou qui se rassemblent et se multiplient dans les plaques de PEYER. Ces cellules immunitaires sont une composante du MALT
(Mucosae Associated Lymphoid Tissue) qui se subdivise en GALT situé dans l'intestin, et en BALT
situé dans les bronches, et qui présente des analogies avec le SALT situé dans la peau.
Le GALT et le BALT sont interdépendants et agissent en synergie pour assurer la défense immunitaire des muqueuses, et pour contribuer à la défense de l'organisme dans son ensemble.
L'examen de coupes histologiques de l'intestin montre que la PANSTIMASEO
stimule directement le GALT ; elle peut donc stimuler indirectement la défense immunitaire générale. Ainsi s'expliquerait le fait que la PANSTIMASEO augmente la résistance des animaux vis-à-vis des maladies infectieuses.
2 - Microvillosités Sur des rats, jeunes ou âgés, des examens en microscopie électronique montrent que les microvillosités des rats témoins sont enrobées par du mucus hypervisqueux et par des traces de résidus alimentaires ; au contraire, celles des rats traités par la PANSTIMASEO
apparaissent plus nettes, plus hautes, plus nombreuses. La PANSTIMASE0 peut donc augmenter la surface développée totale des microvillosités, c'est-à-dire leur capacité
d'absorption.
In vitro , en traitant par la PANSTIMASEO des fragments d'intestin prélevés sur des rats témoins, on a constaté qu'on pouvait, sans endommager les microvillosités, éliminer le mucus hypervisqueux qui les enrobe ; cette action détergente modérée peut s'effectuer en quelques minutes.

7 In vivo , ce nettoyage de la muqueuse intestinale permet l'établissement d'un contact plus étroit entre les germes infectieux et cette muqueuse, ce qui peut induire la multiplication dans l'intestin de cellules immunitaires aptes à lutter contre ces germes.
3 - Cellules sécrétrices et microqlandes exocrines Diverses cellules sécrétrices (productrices de mucus, de lysozyme...) et de nombreuses microglandes exocrines sont réparties tout au long de l'intestin dans lequel elles déversent d'importantes quantités de sécrétions (environ 2 000 ml par jour chez l'homme).
L'écoulement de ces sécrétions peut être freiné, ou même bloqué, par la présence de microbouchons muqueux.
L'examen de coupes histologiques de l'intestin montre que la PANSTIMASEO
désagrège ces microbouchons, rétablit l'écoulement normal de ces sécrétions, et provoque une augmentation réactionnelle de leur production.
On sait que la sécrétion de salive contient un facteur de croissance cellulaire : Epithélial Growth Factor (E G F) ; de même, les sécrétions intestinales peuvent contenir des facteurs de croissance susceptibles d'agir sur les entérocytes, les lymphocytes...
L'augmentation de la production de tels facteurs, sous l'action de la PANSTIMASE , peut expliquer le meilleur développement des villosités et du GALT, constaté sur les coupes histologiques de l'intestin des rats traités.
4 - Plaques de PEYER
Les plaques de PEYER, qui sont des agrégats de cellules immunitaires répartis tout au long de l'intestin, sont plus nombreuses chez les rats traités : elles apparaissent dès le duodénum chez ces rats, mais seulement à partir du jéjunum chez les rats témoins ; elles sont aussi plus denses : leurs lymphocytes sont plus petits, plus serrés, et semblent plus actifs (ils sont plus intensément colorés par les réactifs utilisés en histologie).
5 - Non adhérence prolongée des germes infectieux

8 La PANSTIMASEO peut s'opposer à l'adhérence prolongée des germes infectieux sur les muqueuses, et notamment sur la muqueuse intestinale.
Cette adhérence prolongée résulte de la formation de liaisons chimiques entre des adhésines fixées sur ces germes et leurs récepteurs fixés sur la muqueuse :
adhésines et récepteurs sont des (glyco-lipo) protéines complexes.
Des essais in vitro ont montré que la PANSTIMASEO, qui a une certaine affinité pour les protéines complexes, peut couper des adhésines, ou détacher des récepteurs de la muqueuse où ils sont fixés ; il en résulte souvent une rupture de l'adhérence qui peut s'effectuer en quelques dizaines de minutes.
En outre, la PANSTIMASEO peut stimuler le renouvellement des villosités de l'intestin, c'est-à-dire l'élimination d'anciennes cellules anormales ou affectées par l'adhérence des germes infectieux ; cette élimination est facilitée par l'intensification du flux des sécrétions intestinales, dont la production est augmentée sous l'action de la PANSTIMASEO.
On voit que, si la PANSTIMASEO peut d'abord permettre un contact plus étroit entre les germes infectieux et la muqueuse intestinale (et induire la multiplication dans l'intestin de cellules immunitaires aptes à lutter contre ces germes), elle peut aussi s'opposer ensuite à l'adhérence prolongée de ces germes sur la muqueuse et à leur pénétration dans le tissu sous-jacent.
6 - Destruction des entérotoxines protéiques A des concentrations comprises entre 10 et 100 U.A./ml, et par chauffage à 37 C
pendant quelques dizaines de minutes, la PANSTIMASEO détruit de nombreuses toxines protéiques, et peut ainsi contribuer à la prévention et/ou au traitement de diarrhées. Parmi les toxines détruites par la PANSTIMASE , on peut citer la toxine botulique, la toxine cholérique, la toxine LT produite par des colibacilles pathogènes, le Facteur Cytotoxique Nécrosant également produit par ces colibacilles...
Dans les mêmes conditions, les protéinases endogènes (Trypsine, Chymotrypsine...) ne détruisent pas ces toxines, et ne peuvent donc pas contribuer à la prévention et/ou au traitement de ces diarrhées.

9 Dans le cas de la toxine LT, la PANSTIMASE détruit la sous-unité A qui est agressive, sans détruire la sous-unité B qui est immunostimulante.
7 - Conclusion La PANSTIMASE exerce, tout au long de l'intestin, une action fondamentale qui stimule le fonctionnement global de cet organe-clé, et par suite de tout l'organisme ;
d'où la grande diversité des exemples d'applications thérapeutiques.
APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES SELON L'INVENTION
L'action fondamentale de la PANSTIMASE sur l'intestin permet d'envisager son utilisation ou l'utilisation des principes actifs dont elle composée, à savoir la protéinase prépondérante exocellulaire ou le mélange de cette protéinase prépondérante exocellulaire avec l'une au moins des deux autres protéinases exocellulaires, pour contribuer à la prévention ou au traitement de maladies.
1 - Mucoviscidose et maladies respiratoires La mucoviscidose est caractérisée par la sécrétion excessive d'un mucus trop visqueux, au niveau intestinal comme au niveau bronchique. Tous les mucus ont le même type de structure biochimique ; c'est pourquoi la PANSTIMASE peut optimiser la viscosité du mucus intestinal, du mucus bronchique ou du mucus génital.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné à optimiser la viscosité des mucus intestinal, bronchique et/ou génital.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un

10 médicament destiné au traitement de la mucoviscidose et des maladies en rapport avec un excès de sécrétion d'un mucus intestinal, bronchique et/ou génital, et notamment quand celui-ci est trop visqueux.
2 - Amélioration de la résorption et de la circulation sanguine Par son action détergente modérée sur la paroi intestinale, la PANSTIMASEO
contribue à
l'amélioration de la résorption.
Cette amélioration de la résorption peut se constater en dosant dans le sang des animaux des médicaments administrés par voie orale. Par exemple, on a administré à des poulets, par sonde gastrique, 50 mg de tétracycline sans PANSTIMASEO (lot témoin) ou en association avec 3 mg de PANSTIMASE0 titrant 400 U.A./mg (lot traité) ; on a prélevé 2.5 ml de sang 2 heures après cette administration, et on a constaté que la concentration moyenne de tétracycline dans le sérum est de 1.35 mcg/ml pour le lot témoin et de 1.90 mcg/ml pour le lot traité.
Cette amélioration de la résorption peut s'analyser plus précisément en étudiant la fixation des médicaments dans différents organes. Par exemple, on a donné à des truites, pendant 2 jours, un aliment médicamenteux contenant 4g/kg d'Oxytétracycline non supplémenté en PANSTIMASE0 (lot témoin), ou supplémenté par 300 mg/kg de PANSTIMASE titrant 400 U.A./mg (lot traité). On a ensuite sacrifié ces poissons et on a dosé l'antibiotique dans le foie, les muscles et les reins. On a constaté que la PANSTIMASEO permet d'obtenir une augmentation importante de la concentration tissulaire en antibiotique, qui varie beaucoup suivant l'organe considéré :
+ 100 % dans le foie soit 5,75 mcg/g pour le lot traité vs 2,5 mcg/g pour le lot témoin + 400 % dans les muscles soit 1,75 mcg/g pour le lot traité vs 0,3 mcg/g pour le lot témoin + 1.000 % dans les reins soit 5,75 mcg/g pour le lot traité vs 0,5 mcg/g pour le lot témoin Il apparaît que la PANSTIMASEO provoque une meilleure résorption de l'Oxytétracycline, et une meilleure distribution de cet antibiotique dans tout l'organisme, ce qui semble impliquer une amélioration de la circulation sanguine.
La ou les protéinases exoceilulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les

11 protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des malabsorptions de médicaments ou de nutriments, ainsi qu'au traitement des troubles de la circulation sanguine ; en particulier, ce médicament est destiné au traitement de la dénutrition constatée chez les personnes âgées ou chez les malades ayant reçu des médicaments dont les effets secondaires affectent le bon fonctionnement de l'intestin.
3 - Ulcères digestifs et entérotoxémies Les ulcères digestifs ont pour origine l'adhérence sur la paroi stomacale d'une bactérie (Helicobacter pylori), et certaines entérotoxémies ont pour origine l'adhérence sur la paroi intestinale de divers germes infectieux.
La PANSTIMASE0 s'oppose à l'adhérence prolongée de germes infectieux sur les muqueuses, et détruit de nombreuses entérotoxines ; elle peut ainsi contribuer à stimuler le renouvellement de l'intestin et peut prévenir et/ou traiter des ulcères digestifs et des entérotoxémies.
De fait, en élevage industriel, on a constaté que la PANSTIMASEO est capable de réduire le nombre de porcs souffrant d'ulcères digestifs, ainsi que la mortalité par entérotoxémies.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter l'adhérence prolongée des germes infectieux sur les muqueuses, à faciliter la régénération des villosités atrophiées ou détruites de la muqueuse intestinale, ainsi qu'à prévenir et/ou à traiter les ulcères digestifs et les entérotoxémies.
4 - Diabète, insuffisances hépatiques et troubles du transit intestinal Dans le brevet antérieur, on a déjà indiqué que la PANSTIMASEO stimulait la fonction exocrine du pancréas ; on a en effet constaté une importante augmentation de la concentration dans le pancréas de tous les enzymes ou proenzymes dosés : + 50 % pour l'amylase, + 70 % pour le trypsinogène et le chymotrypsinogène, + 80 `)/0 pour la lipase

12 (A.ESTIVAL et al. Communication aux Journées Métabolisme de Nancy 25-26 Janvier 1979- Université de Nancy I).
L'examen de coupes histologiques de pancréas a ensuite montré que les îlots de LANGERHANS, sont plus nombreux et ont un meilleur aspect chez les rats traités. Ces examens suggèrent que la PANSTIMASEO stimule d'abord la fonction endocrine du pancréas, avec pour conséquence une amélioration générale de l'anabolisme protéique, d'où la stimulation consécutive de sa fonction exocrine.
Cette stimulation qui s'exerce sur le pancréas, s'exerce également sur le foie, ce qui a pour conséquence une amélioration du transit intestinal. En élevage intensif, on observe souvent des constipations chez les truies gestantes attachées ; on a constaté
que la supplémentation de leur alimentation en PANSTIMASEO permet d'éviter ces perturbations nuisibles du transit intestinal.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter le diabète, les insuffisances hépatiques et les troubles du transit intestinal.
5 - Maladies infectieuses, dysfonctionnements immunitaires, et vaccination On a déjà indiqué que la PANSTIMASEO agit favorablement sur le GALT, et par suite sur l'ensemble du système immunitaire. Il en résulte des améliorations dans 3 domaines différents.
A - Maladies infectieuses Certaines observations en élevage intensif ont montré que la PANSTIMASEO
améliorait souvent l'état sanitaire des animaux, ce qu'on a d'abord attribué au fait qu'elle facilitait la résorption des antibiotiques qui sont ajoutés dans la plupart des aliments industriels. Mais on a constaté ensuite que cette amélioration était particulièrement nette en cas d'infections par différents virus, alors que ceux-ci sont en général insensibles à l'action

13 des antibiotiques. Ces constatations concernent la grippe et la maladie d'AUJESKY chez les porcins, la maladie de GUMBORO chez les poulets et l'ecthyma chez les chevreaux.
Dans ce dernier cas, l'infection virale constatée au cours d'un essai en station expérimentale, a fait l'objet d'observations précises, portant au total sur 120 chevreaux ; le pourcentage d'animaux non atteints a été de 34 % pour le lot témoin, et de 70 % pour le lot traité ; le pourcentage d'animaux très atteints a été de 28 % pour le lot témoin, alors qu'aucun animal n'a été très atteint dans le lot traité.
Cette action antivirale peut s'expliquer par le fait que la PANSTIMASE
augmente le nombre et la densité de plaques de PEYER qui sont des agrégats de cellules immunitaires répartis tout au long de l'intestin.
B - Dysfonctionnements immunitaire D'autres observations sur des porcelets en élevage intensif ont montré que la PANSTIMASE réduisait la durée des arthrites qui sont des réactions inflammatoires consécutives à des blessures aux articulations affectant les animaux élevés sur caillebotis métalliques. Après cicatrisation des blessures, ces réactions inflammatoires peuvent s'estomper progressivement sous l'action de cellules immunitaires dites suppressives, qui sont nombreuses dans l'intestin, et qui peuvent migrer vers les zones d'inflammation. Il est possible que la PANSTIMASE stimule la multiplication de ces cellules dans l'intestin, et qu'elle facilite leur migration, ce qui expliquerait le fait qu'elle réduit la durée des arthrites, d'environ 50 %.
C - Vaccinations Les améliorations de l'état sanitaire constatées en élevage intensif peuvent s'expliquer par une meilleure réponse aux vaccinations des animaux recevant un aliment supplémenté en PANSTIMASE . Des essais préliminaires en laboratoire, sur des souris, ont effectivement confirmé que la PANSTIMASE peut augmenter l'efficacité des vaccinations, notamment lorsque celles ci sont effectuées par voie orale.

14 La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter les maladies infectieuses et les dysfonctionnements immunitaires, ainsi qu'à augmenter l'efficacité des vaccinations.
6 - Insuffisances hormonales et maladies dégénératives liées au vieillissement On a constaté que, sur les porcins reproducteurs âgés, la PANSTIMASE8 provoque une réduction de l'intervalle sevrage-saillie fécondante (qui tend à augmenter chez les truies), et une stimulation de l'ardeur sexuelle, (qui tend à décliner chez les verrats). Il apparaît donc que la PANSTIMASEO permet de remédier aux insuffisances hormonales, et probablement à d'autres effets négatifs dûs au vieillissement.
On a effectivement constaté que la PANSTIMASEO provoque un rajeunissement chez les rates reproductrices âgées, et une réduction des effets négatifs du vieillissement chez les truies et les poules reproductrices âgées.
A. La première saillie des rates est normalement affectée vers l'âge de 70 jours ;
lorsqu'elle est effectuée vers 140 jours, les performances de reproduction sont mauvaises pour le lot témoin et sont meilleures pour le lot traité (recevant le même aliment supplémenté par 300 mg/kg de PANSTIMASEO titrant 400 U.A./mg).
Lot témoin Lot témoin Lot traité
saillie à 70 j saillie à 140 j saillie à 140 j Taux de fécondation 62 h 29 % 45 %
Mortalité périnatale des ratons 18 % 35 % 18 %
Nombre de ratons sevrés par portée 9 6,6 8,1 On constate que les rates témoins saillies à 140 j donnent de mauvais résultats mais que les rates traitées également saillies à 140 j donnent des résultats qui se rapprochent des résultats normaux donnés par les rates témoins saillies à 70 j, et même deviennent

15 identiques dans le cas du taux de mortalité périnatale. On peut donc dire que la PANSTIMASEO a provoqué un rajeunissement des rates âgées de 140 j.
B. Les truies reproductrices sont réformées dès qu'elles apparaissent en mauvais état , par exemple lorsque l'éleveur estime qu'elles ne peuvent plus se tenir bien d'aplomb, ni se coucher en souplesse (au lieu de se laisser tomber lourdement en risquant d'écraser les porcelets nouveau-nés). Dans un élevage de 80 truies, avant l'utilisation de la PANSTIMASEO, les truies sont réformées après 4,4 cycles de reproduction en moyenne; six mois après cette utilisation, il est apparu que l'on pouvait réformer les truies après 5,8 cycles de reproduction en moyenne. On peut donc considérer que la PANSTIMASEO a permis de prolonger, d'environ 30%, la vie productive des truies, sans altération inacceptable de leur bon état et de leurs performances.
En vieillissant, les poules pondeuses ont tendance à produire des oeufs ayant une coquille plus fragile, de sorte que le pourcentage d'oeufs fêlés peut devenir supérieur à 10 % en fin de ponte. La PANSTIMASEO a permis de réduire de moitié ce pourcentage, ce qui implique une stimulation du métabolisme phosphocalcique.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter les insuffisances hormonales et les maladies dégénératives liées au vieillissement, par exemple l'arthrite, l'arthrose, l'ostéoporose.
EVALUATION PRELIMINAIRE DE LA TOLERANCE
DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES SELON L'INVENTION
Des essais toxicologiques ont montré que la PANSTIMASEO n'a aucune toxicité
sur les porcelets lorsqu'elle est administrée pendant 1 mois à une dose 20 fois supérieure à la dose d'emploi actuellement recommandée qui est de 40.000 U.A. par Kg d'aliment, ni aucune toxicité sur le rat lorsqu'elle est administrée pendant 3 mois à une dose 200 fois supérieure à cette dose d'emploi.
En conséquence, on a pu engager un essai préliminaire de tolérance chez l'homme, sous une dose d'emploi relativement élevée par rapport à la dose actuellement prévue ; on a

16 en effet utilisé des gélules contenant 750.000 U.A. de PANSTIMASE purifiée (soit 50 mg d'un lot tirant 15.000 U.A./mg) qu'on a administrées à raison de 2 à 3 gélules par jour pendant 2 ou 3 semaines à des malades.
On a sélectionné 24 patients (12 hommes - 12 femmes), ayant 44 ans d'âge moyen avec des extrêmes allant de 25 à 70 ans; 17 de ces patients souffraient de dyspepsie au sens le plus large du terme sans qu'aucune lésion organique n'ait pu être mise en évidence par les investigations paracliniques (examens de laboratoire, radiologies, dans certains cas endoscopie ; 7 de ces patients étaient porteurs de lésions organiques : 3 pancréatiques, 2 gastrectomie (l'une pour ulcère, l'autre pour néoplasme), 2 colectomie (l'une pour rectocolite ulcérohémorrhagique, l'autre pour néoplasme).
Sur l'ensemble de ces 24 patients, on a étudié l'évolution de la symptomatologie et du poids, lorsqu'une insuffisance pondérale, avec ou sans dénutrition, existait au début du traitement. Plusieurs sujets ont signalé une amélioration portant sur la régularisation du transit intestinal en cas de constipation ou au contraire de diarrhée, ainsi qu'une reprise de poids en cas de dénutrition.
On a également engagé un essai préliminaire concernant la mucoviscidose chez un malade âgé de 18 ans qui a reçu chaque jour, pendant 3 semaines, 2 gélules contenant chacune 10.000 U.A. de PANSTIMASE ; on a constaté une amélioration des symptômes, au niveau intestinal (fèces moins abondantes et moins collantes) et au niveau bronchique (expectorations plus faciles et moins fréquentes).
En conclusion, on peut dire que la PANSTIMASE a été bien tolérée, et qu'elle semble particulièrement efficace en cas de dénutrition.
La ou les protéinases exocellulaires selon l'invention, ou la ou les protéinases dont les séquences en acides aminés ont au moins 60 % d'homologie avec celles de la ou les protéinases exocellulaires de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'une composition diététique pour l'alimentation des sujets fragiles ou dénutris.

Claims

REVENDICATIONS

1. Utilisation de la protéinase exocellulaire prépondérente de type II
extraite des cultures de streptomyces fradiae, ou le mélange de celle-ci avec l'une au moins des deux autres protéinases exocellulaires produites dans les cultures de streptomyces fradiae, présentant une activité spécifique supérieure à 100.000 U.A./mg, un poids moléculaire d'environ 30-36 kDa et un point isoéléctrique d'environ 7.0, en mélange ou en association avec un véhicule ou un excipient inerte non toxique, pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les malabsorptions de médicaments ou des nutriments.

2. L'utilisation selon la revendication 1 dans laquelle le médicament est formulé
par une administration par la voie orale, pulmonaire, ou génitale.

3. L'utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le médicament est formulé par une administration à des doses comprises entre 5000 et 100.000 unités Anson.

4. L'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, le médicament étant sous la forme de comprimés, de comprimés enrobés, de capsules, de gélules, de poudres, de solutions, de suspensions, d'aérosols, d'ovules ou de comprimés vaginaux.