JPS6379589A - リパーゼ及びリパーゼ抽出物、その調製方法及び治療学上の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、リパーゼ活性を有する酵素、及びそれらを含
有し、酸性または中性に近い溶媒中で安定、活性な抽出
物、それらの調製方法及び医薬の形態におけるそれらの
治療への用途に関する。

従来の技術 加水分解酵素（ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ　）に関連する酵
素であるリパーゼは、バクテリア、菌類から植物及び動
物釦至る異なった生物において広く存在する。

生物の機能におけるそれらの重要性は１９００年頃に消
化現象の研究中にＪ８められた。それらの機能は、ヒト
及び動物の食物中のｉ要なエネルギー源を代表する脂肪
類の同化に必須であることが判明した。続いて、それら
の特性は種々の治療目的に利用されてきた。

ヒト及び哺乳類一般において多くの研究が行なわれてき
たが、そうした研究によって、これらの酵素が消化現象
において必須の触媒機能を果たし、詳細には、乳化され
た、あるいは乳化されていない脂肪の加水分解に関与す
ることが示された。後者の多くは種々の分子量の脂肪酸
と、トリグリセリドにおけるグリセロールのような単機
能（ｍｏｎｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　）または多機能
性（ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）アルコールとの間
に形成されたエステルから成る。

これらの酵素系の欠損または不全が、吸収不良のケース
にしばしば認められ、重症の場合はかなりの体重減少と
食欲欠乏を招く。ヒトの場合、こうした状態は幼い子供
にも大人にも起こり得ることであるが、そうした息者の
天然リパーゼの欠乏を補う為に外来の酵素系を使用する
ことが認められてきた。使用された組成物には、リパー
ゼを分泌することの知られていてしかも生体において通
常、脂肪の同化の為に作用する動物の器官の抽出物が含
まれていた。これらの器官は口腔−胃一且３管（ｂｕｃ
ｃｏ　−ｇａｓｔｒｏ−１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｔｒａ
ｃｔ　）の異なったレベルに位發し、そのうち最も広く
知られているのは、口腔及び膵臓のそれである。

従って哺乳類の口腔の分泌物には、脂肪酸エステルを加
水分解し得ろ酵素が含まれている。それらはプレガスト
リックエステラーゼ（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃｅｓｔｅｒ
ａｓｅ　）及び１０腔′リパーゼであってこれらは、加
水分解し得る、あるいは加水分解し得ない基質に対して
活性を有するか否かという点で互いに異なる。これらの
酵素及びその特性は、Ｊ、Ｈ。

Ｎｅ１ｓｏｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　
５ｃｉｅｎｃｅ、　１９７６゜笠（３）　、　ｐｒＪ、
　３２７−３６２　）によってまとめられた多くの研究
の主題となっている。

これらの存在及び有用性は、まだ離乳していない若い動
物において特に示されている。子ウシ。

子ヤギ及び子ヒツジから得たプレガストリックエステラ
ーゼの市場は急速に発展した。これらの製品は最初液状
抽出物で、以後！ｌ縮粉末の形態となつたが、これらは
子ウシの下痢の治療や、ヒトの為の治療にも現在使用さ
れている。ヒトにおける治療として例えば、経口投与さ
れる粉末形態の組成物による吸収障害の治療法を示す合
衆国特許３２５６１５０がある。この組成物は、離乳し
ていない動物の口腔から取得した食用の組織、詳細には
、子ウシ、子ヤギあるいは子ヒツジから取った舌及びそ
の近隣組織を部分的に含有するものである。

後者の用途は、食用に供する若い動物をそれらが充分な
経済的価値を有する程迄発育する前に屠殺してその器官
を大ｊ、　Ｋ集めろことは困難であるという、多分そう
した理由から、それ程成功していないようである。

こうした実際的及び経済的な問題から解放される為に、
英国特許２１４２３３７は、リパーゼ欠乏症の治療にラ
ットまたはヒトの舌リパーゼを提案している。これらの
酵素は、遺伝子工学によって調製される。

十二指腸レベルでは、膵液のリパーゼも、部分的に分解
された、あるいは分解されていない脂肪類の同化に非常
に重要な作用をする。従って膵臓の酵素分泌が不足する
と、脂肪類の場合、それらの消化吸収異常につながる恐
れのある、吸収不良を起こし得る。ヒトにおいて膵臓に
代わる、経口投与用医薬は、□ブタのようにヒトの食物
に類似した食物を摂取する動物やウシのような草食動物
の膵臓をペースとした組成物の形態で市販されている。

しかしながら、Ｇｕｎｔｅｒ　Ｃｏｒｃｌｅｓによるこ
れらの酵素の特性に関する１９７３年の研究は、そうし
た治療が当てにならないことを示した。これらの器官の
酵素系は、３７℃にて酸性溶媒中で速やかに破壊され、
活性を失うのであって、それらは、胃を通過するとその
活性を確実に保持することができないのである。これら
の医薬の活性を保持する為の溶液が提案された。英国特
許１１３９９９１は、天然の胃底を弱めることによって
胃を通過中の酵素の特性を保持する機能を有する抗−酸
性塩類と膵臓酵素とから成る組成物を記している。シメ
チジンのようなＨ２レセプター拮抗剤化合物を用いる、
同一の方法が、Ｒｅｇａｎ　Ｐ、　Ｔ、ら（１９７８）
　。

Ｈｕｂｂａｒｄ　Ｖ、　Ｓ、ら（１９８０）及びＧｏｎ
　Ｐ、、　Ｂｒａｄｂｅａｒら（１９８１）によって提
案されている。

更に、酵素活性の保持は、胃液に対して耐性を有し、腸
内溶媒に溶けて活性成分を十二指腸内で放出するフィル
ムで医薬をコーティングし、あるいは、最近では、直径
約３ｍの微小球にそれらを包むことにより試みられてき
た。これらの解決法は一時押え的なものに過ぎず、患者
に副作用を起こす危険があり、効果が不確実である。

膵臓疾患は、しばしば長期間の治療を必要とするが、そ
の期間中胃の￥Ｒ，比度を繰り返し城少させることによ
りバクテリアに対する天然の防禦機能が局部的に低下し
、それらの繁殖を高め得ることは、Ｗｅｂｅｒ　Ａ、　
Ｍ、　、　１９８２が記す通りであり、それは、食中毒
を起こし得る。

当該製品のコーティングは、特定の場合には必ずしも完
全に安全性を保障するものではない。例えば膵臓機能不
全の場合、胃−腸管のｐＨ値が不規則であり、酸レベル
が異常であることもあり、所望の位置において胃液に対
する保護膜を溶かすことができない。

異なった！ｉ！ｌＩ物権の胃の内容物にリパーゼ活性が
存在することも指摘された。この活性の由来については
長い間論争の的となっていて、唾液によって運搬されて
きた口腔内分泌物か、膵液の十二指腸における逆流によ
るものかのいずれかであるとされてきた。しかしながら
、最近になって、ＦｉｎｋＣ，Ｓ、ら（Ａｙｎ、　Ｊ、
　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　１９８５．２４８．　ｐｐ、６
Ｂ−７２）は、ウサギの胃腺の分散から、ｐＨ５，８乃
至６．１において最大の効果を有するリパーゼ活性につ
い１示した。ケミカルアブストラクト、第９７巻第１５
号、１１　、１０　、１９８２　、　Ｉ）、　４７７　
、　ｎｏ。

１２４８３２０　、　Ｃｏｌｏｍｂｕｓ　、　０ｈｉｏ
　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　ニオイては、離乳した、ある
いは離乳していない若いウサギの胃レベルにお番ブる脂
肪のＮ＋水分解活性に言及している。この活性はｐｙ（
７にて最大に達する。

特許出願ＷＯ３６／随３２は、ヒト冑リパーゼ欠乏の治
療に有用な、該酵素に相当する蛋白質の遺伝子操作によ
る調製について記している。

発明の解決しようと　る問題点 リパーゼに関し行なわれた研究及びそれらを使用する試
みは、これらの酵素の重要性を明瞭に示すものである。

晴乳類の特定の器官や分泌物におけるそれらの存在が示
され、それらが生物にとって脂肪類の吸収に必要である
ことも認められたが、技術的、経済的に是認し得るよう
な、そして、それを補うことによって脂肪類、特にトリ
グリセリドの口腔−胃一腸管における吸収を確実に保障
し得るようなリパーゼあるいはリパーゼ組成物は未だ提
案されていない。

本発明は、酸性溶媒中で一定時間放置されても活性が低
下せず、ｐＨ３から７の範囲の溶媒中で、部ち、口腔−
胃一腸管において使用する場合に匹敵する酸性度を有す
る溶媒中で、トリグリセリドを加水分解する能力を効果
的に発揮する、リパーゼ及びリパーゼ抽出物に関するも
のであって、上記のような従来技術の状態から脱するも
のである。

従って、先行技術に記されている製品と比較して、本発
明の製品は、口腔と十二指腸との間の経路において消化
作用が行なわれている間にトリグリセリドの加水分解を
確実に進行させる能力故に、しかも大量、容易且つ廉価
に入手し得る原料から得られる故に、特に治療の分野に
おいて、その優越性を否定し得ない。

問題点を解決するための手段 本発明は、従って、以下の特徴を有する、リパーゼまた
はリパーゼ抽出物の調製方法に関する：ａ）リパーゼ抽
出物の取得 一成熟したウマまたはウサギの胃底をｐＨ１，５乃至５
の酸性水溶液に、工重量部の胃底に対し１乃至ＩＯ容量
部の酸性溶液の割合で、４乃至３０℃にて１分乃至１５
時間接触させ、固形物質と、リパーゼ部分を含有する水
溶液を得、 −固形物質から水溶液を分層して単独の水溶液を得、 −その水溶液に適量の水溶性塩を添加し、所望のリパー
ゼ抽出物を塩析し上清溶液を得る為に充分な時間放置し
、 −その上清溶液から所望のリパーゼ抽出物を分離。

回収し、 ｂ）脱塩したリパーゼ抽出物の取得 −水相にリパーゼ抽出物を溶解し、 −５０００から１０，０００ダルトンの間の切断域（ｃ
ｕｔｏｆｆ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　）を有する膜でその
水相をろ過して脱塩したリパーゼ抽出物を得、 −その脱塩したリパーゼ抽出物の水溶液を凍結乾燥し、 Ｃ）脱脂質化リパーゼ抽出物の取得 −リパーゼ抽出物を含有する胃底の固形部分、リパーゼ
抽出物及び塩を除去したリパーゼ抽出物のうちのいずれ
かについて脱脂質処理を行ない、ｄ）脱脂質処理をしな
い、強化リパーゼ抽出物の取得 −ｐＨ２から７の緩衝液にリパーゼ抽出物を溶解し、緩
衝溶液を得、 −その、ｐＨ２から７の緩衝溶液を、１　、０００　、
０００ダルトンを超える排出限界を有する分子篩による
クロマトグラフィに付し、緩衝溶液として脱脂質処理を
していない強化リパーゼ抽出物を含有する、排出された
溶出画分を回収し、−その、排出さ、ｈた溶出画分を１
０，０００ダルトンの切断域を有する膜でろ過して、脱
環画分を得、−この脱塩虱分を凍結乾燥して、所望のａ
脂質処理をしない強化リパーゼ抽出物とする ｅ）脱脂質化強化リパーゼ抽出物の取得−ｅ）ｌ　　リ
パーゼ抽出物を水に溶解してリパーゼ抽出物含有水溶液
を得、 −そのリパーゼ抽出物含有水溶液を５０００乃至１０．
０００ダルトンの切断域の膜でろ過して脱塩溶液を得、 −その脱塩溶液をイオン交換体に吸着させ、−イオン強
度を経時的に増加させる溶離液により支持体からの脱着
を行ない、 −リパーゼ活性を有し、脱腸質処理した強化リパーゼ抽
出物を含有する溶出画分を回収し、−リパーゼ活性を有
する溶出画分を５０００乃至１０．０００ダルトンの切
断域を有する膜でろ過して脱塩溶出画分を得、 −その脱塩溶出画分を凍結乾燥して所望の脱脂質処理し
た強化リパーゼ抽出物を得、あるいは、ｅ）　２　　前
出ｄ）において得られたｐＨ２から７の間の緩衝溶液を
分子篩によるクロマトグラフィに付し、 一分子量３０　、０００乃至５５　、０００ダルトンに
相当し、脱脂質処理した強化リパーゼ抽出物を含有する
溶出画分を回収し、 −その、分子量３０　、０００乃至５５　、０００ダル
トンに相当し、脱脂質処理した強化リパーゼ抽出物を含
有する溶出画分を５０００から１０．０００ダルトンの
間の切断域を有する膜でろ過して、脱塩、脱脂質処理し
た強化リパーゼ抽出物の溶液を得、−その脱塩、脱脂質
処理した強化リパーゼ抽出物の溶液を凍結乾燥して所望
の脱脂質化２強化リパーゼ抽出物とする ｆ）リパーゼの取得 ｆ）　１　　前出ｅ）　ｌにおいて得られた、リパーゼ
活性を有し、脱脂質処理をした強化リパーゼ抽出物を含
有する溶出画分につき、 一分子篩によるクロマトグラフィに付し、−分子−１！
４５，０００から５０　、０００ダルトンの間に相当し
リパーゼを含有する溶出画分を回収し、−そのリパーゼ
含有溶出画分を５０００乃至１０，０００ダルトンの切
断域を有する膜でろ過してリパーゼを含有する脱塩溶液
を得、 −そのリパーゼ含有脱塩溶液を凍結乾燥し、あるいは、 ｆ）　２　　分子量３０　、０００から５５　、０００
ダルトンの間に相当し、脱脂質処理した強化リパーゼ抽
出物を含有する、前出ｅ）　２において得られた溶出画
分につき、 −イオン交換体に吸着させ、 −イオン強度を経時的に増加させる溶離液によって支持
体からの脱着を行ない、 −リパーゼ活性を有し、リパーゼを含有する溶出画分を
回収し、 ＩＪパーゼ活性を有し、リパーゼを含有する溶出画分を
、５，０００乃至１０，０００ダルトンの切断域を有す
る膜でろ過してリパーゼ含有、脱塩溶出画分を得、 −そのリパーゼ含有脱塩溶出画分を凍結乾燥して、所望
のリパーゼとする。

ここにおいて１脱脂質処理した（　ｄｅｌ　１ｐｉｄａ
ｔｅｄ　）“という語は、脂質を除去した、本発明によ
るリパーゼ含有製品を意味するものとする。本質的に、
この方法は蛋白質１ミリグラム当たり１から１００ユニ
ツトの間のリパーゼ比活性を有する抽出物の取得を可能
にする方法Ａと前述の抽出物を基に、蛋白質１ミリグラ
ム当たり１００ユニツトを超える比活性を有する強化リ
パーゼ画分及び、最終精製段階として、蛋白質１■当た
り約１　、０００ユニツトの比活性を有する純粋リパー
ゼの取得を可能にする分Ｘｉ方法Ｂから成る。方法Ａ及
びＢを、器官の調製方法と併せて以下に説明する。

本発明の方法は、成熟したウサギ、即ち、少なくとも方
今１カ月、好ましくは少なくとも２力月のウサギを使用
する。これらの成熟したウサギは食用のもので、冑を除
去してもその商業的価値は低減しない。離乳前費の若い
ウサギの胃に関し、本発明の場合に比べそのリパーゼ活
性のｐＨ最大値が異なることが知られており、またコス
トの面で解消し難い問題点を有する。胃のサイズが小さ
く、胃を除去されたウサギを売ることが不可能であるこ
とから、これらの若いウサギの胃は、本発明では使用し
ない。

同様に、成熟したウマ、詳細には少なくとも１才、好ま
しくは３才のウマの胃が使用される。

ウサギの場合、胃の上部に位置し、噴門洞（ａΩ−ｔｒ
ｕｍ）下部に続く胃底（ｆｕｎｄｕｓ　）に所望リパー
ゼは専ら見い出されることがわかった。また、リパーゼ
は胃底の大湾部（ｇｒｅａｔｅｒ　ｃｕｒｖａｔｕｒｅ
　）の上の部分にのみ見い出されることも判明した。従
って、ウサギの胃の全部若しくは大湾部の上の部分を含
む一部であればどの部分でも扱い得る。ウマについても
同様であって、リパーゼは胃底にのみ存在する。胃底は
胃の突出部であるから残りの部分から切り離すのが容易
であり、収集、保存及び運搬がし易い。

この器官の：Ａ製作業は任意のものであって、胃の調製
２組織の選択及び分断、脱脂質処理の各作業は、入手し
得る組織の状態や性質、所望リパーゼ製品の質、特に純
度に基づき適宜選択して行なう。例えば、次の図は、本
発明において好ましい手順及び予備作業の手順の概略を
示す。

予備作業としては先ず、屠殺場で除去された胃から不純
物や汚染物、近隣組織（食道、腸、牌１！１ｌｌ）の部
分を除き、適宜、噴門洞（ａｎｔｒｕｍ　）を分離し、
除去する。組織は、分断する前に凍結させ一２０℃に保
つことができる。分断は手で行なうがまたは、最大の大
きさが５儂以下の不規則な断片の得られろ装置の力を借
りて行なう。

脱脂質段階は、組織または、本発明の方法に従い破砕あ
るいは低分子量ケトン及びアルコールのような低沸点の
親水性溶媒による抽出で得られた固形抽出物を均質化す
ることにより行なわれる。

特定の場合には、アセトンが溶媒として最も広く用いら
れ、それＫより、製品の脱水と部分的な脱脂質の両方が
可能となる。

均質化作業及び本発明による製品の調製中に行なわれる
全ての操作は、２５℃未満、好ましくは１０℃未満の温
度にて行なわれる。それは活性成分の変質をでき得る限
り防止する為である。こうした不可逆的変質は、抽出条
件や使用された溶媒の性質に左右される、化学的あるい
は物理化学的性質の現象である。

一般に、器官を破砕して均質化するのに処理の対象とな
る製品１重量部につき溶媒１乃至１０部が用いられる。

破砕操作は２５℃未満の温度にて、２ｆｉ未満の組織粒
子が分散した状態となるように’　Ｗａｒｒｉｎｇ　ｂ
ｌｅｎｄｅｒ　’ｐイブの装置を用イテ行なう。この装
置を使用すると、３０秒から５分間の間、１０．０００
乃至３０，０００　ｒｐｍの速度で破砕を行なって上記
の結果が得られる。

不溶画分は、デカンテーション、ろ過あるいは遠心分離
によって分離する。通常、凡そ５０ミリバールの工業的
真空状態におけろろ過を行なう。

この場合、得られた粒状不溶物は脱脂貧化され、均質で
あり、抽出方法人において直接使用されるかあるいは、
２５℃にて約２０ミリバールの真空下残りの溶媒を除去
した径更なる脱脂質処理に付し、あるいは本発明の方法
により得られる、部分的に脱脂貧化したリパーゼ抽出物
として適宜使用され得る。

これらの操作は、処理対象となる製品を所望の脱脂資化
レベルにすることから成り、それは、製品を脂肪類を可
溶化する漬媒で処理するものである。溶媒としては、炭
化水素、エーテル、ケトン。

アルコールあるいはハロゲン化炭素を単独あるいは混合
して使用する。これらの溶媒は容易に除去し得なければ
ならず、その沸点は凡そ８０℃か８０℃未満である。例
えば、ペンタン、ヘキサン、石油エーテル、ジエチルエ
ーテル、テトラヒドロ７ラン、クロロフォルム、塩化メ
チレン、四ｍ　化炭素及びジクロロエタンである。

脱脂型操作においては、充分脱脂貧化された製品な得る
迄、同一または異なる溶媒を用いて数回連続し℃抽出を
行なうことができる。

本発明によって調製された製品の固形リパーゼ抽出物の
脱脂質含有量は前述の方法の変形によって測定される。

試料を１００乃至１０５℃にて６時ｉ［Ｅ燥後、脂質を
メタノール：クロロフォルム混合物（２５ニア５ｖ／Ｙ
）で３時間環境温度にて抽出する。不溶物をろ過し、溶
媒を蒸発させて除去する。蒸発後の残渣の重量と試料の
最初の重量とから脂質含有量を算定し得、それは一般的
には、脱脂型化抽出物については１％未満である。

この脱脂資化レベルは製品の最終的な形態、例えば、錠
剤か粉末かによって決まり、それは、実際、異なる器官
感覚受容性（ｏｒｇａｎｏｌｅｐｔｉｃ　ｑｕａｌｉ−
ｔｌｅｓ　）を有する本発明による製品それぞれによっ
て決まる。説脂質化レベルは、抽出し得る全脂肪類を予
め測定し、次いで各々の脱脂質操作毎の液相の７リコ一
ト画分に抽出された童を測定することにより算定し得る
。

操作は、適当な装置により、処理すべき材料１重量部を
２５℃未満の温度にて１５秒乃至１５分間脱脂質溶媒５
乃至１００部と良く混ぜ合わせろことから成る。脱脂質
処理された材料をろ過または遠心分離により分離するが
、それを同一の処理に更に何回か付して所望の程度の脱
脂貧化を行なうこともできる。

即ち、詳細には、溶媒として、アセトン、エーテル、ク
ロロフォルム及びそれらの混合物の使用が好ましく、材
料１重量部に５乃至２５容量部の溶媒を加え、３０秒乃
至１０分間、０℃乃至１０℃にて激しく撹拌する。脱脂
貧化した、あるいは部分的に脱脂貧化した不溶物を真空
ろ過により分離する。脱脂貧化が不完全な場合には、不
溶物に同一の処理を再び行なう。所望の脱脂資化レベル
に到達させる為、この操作を２乃至５回繰り返しても良
い。

前述したように分離方法人は、リパーゼ比活性が１乃至
１００ユニツト／ｍ９蛋白質のリパーゼ活性を有する、
本発明による製品の調製にとって重要である。この方法
人は、胃を直接あるいは、前述の任意的な予備操作罠よ
り調製した後、酸性水溶液中で処理することから成る。

従って胃の全部を使用しても、その一部でも、あるいは
、アセトンのような溶媒中で破砕し均質化して得られる
粉末、あるいは、それを脱脂質処理したものを使用して
も良い。第二の操作は、水溶性の塩を用いてリパーゼ製
品を塩析することから成る。

更に詳細には、酸性水浴液中における抽出操作は、適切
な酸性溶液中で材料を激しく撹拌し、次いでろ過、遠心
分離、あるいは場合によってはデカンテーションにより
、活性成分を含有する液相な分離することから成る。通
常、材料１グラムに対し、ｐＨ２乃至４に調整された酸
性溶ｇＸ！乃至１００ミリリツトルを使用する。

水相の酸性度は、上記ｐＨ値の保持に適切な強度の酸に
よって与えられる。そのｐＫａが５を下回る無機または
有機の強酸が用いられる。それらは本質的に、シュウ酸
、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、マレイン酸、ギ酸、乳
酸及び酢酸、あるいは、最も広く使用される、硫酸、リ
ン酸及び塩酸である。

この操作が組織片に対して行なわれる場合、ペプシン等
のプロテアーゼを添加すると、酸性水溶液中におけるリ
パーゼ抽出が促進される。

操作条件は、特に２５℃を上回る温度における、敏感な
活性成分の不可逆的変性を防止すべく設定される。一般
に、抽出は、成分を０℃から２０℃の間の温度にて、ミ
キサーの効率に応じ１分から１５時間激しく混合させる
ことにより行なわれる。

処理すべき材料１ｇに対し、例えば、水２リットル中に
３７％塩酸ＺＯｄを加えてｐＨ２とする等の方法でｐＨ
２乃至４±０．１に調整した塩酸３乃至６０ミリリツト
ルを使用する。

このようにして得た混合物を０℃から２０℃の間の温度
にて５乃至６０分間激しく撹拌して均質化する。次いで
水相をろ過、デカンテーションあるいは遠心分離により
分離する。後者の場合の最適条件は、４℃乃至２０℃、
３　、０００乃至１２　、００Ｏｒｐｍの速度にて、１
５分間から１時間の間の遠心分離である。分たばろ過に
よっても行なわれるが、この場合、真空または圧力ろ過
を用いると操作を加連し得るという利点がある。

混合物は、限外ろ過によりａ縮し、冷凍及び凍結乾燥し
て固形抽出物が得られる。その際、固形抽出物は前述の
操作により適宜脱脂質処理し得る。

この場合、混合物を先ず−２０乃至−７０℃に冷却して
凍結する。この温度は、水−グリコール混合物または最
も低温にするには、固体二酸化炭素−ア七トン混合物に
よって得られる。これらの操作は、それに続く凍結乾燥
操作の為の装置に適合する容器内で行なう。凍結乾燥は
、１０−”　ミ！７パールを下回る真空下行なわれる。

昇華によって除かレタ水は、アンモニアまたは７レオン
による冷却で得られた一５０℃未満、特に−８０℃の温
度にてトラップに凝縮される。得られたアモルファスな
脱水物を、方法ＡＫ従い脱脂質処理し次いで抽出する前
に、例えば０℃を下回る温度にて凍結破砕（ｃｒｙｏｇ
ｒｉｎｄｉｎｇ　）等により低温粉砕する。本発明によ
る凍結乾燥操作は全て同様に行なう。

方法Ａの第二の操作は、前の操作で得られた酸性水溶液
中に含まれるリパーゼ活性物質を沈澱させることから成
る。この沈澱は、溶液に水溶性の塩を加えて塩析するこ
とにより行なう。カチオンとしてこれらの塩は、マグネ
シウム、カリウム。

ナトリウム、アンモニウムを、アニオンとして酢酸塩、
クエン酸塩、リン酸塩及び硫酸塩を含む。

しかしながら、塩として好ましいのは、多価アニオン、
特にリン酸塩と硫酸塩、の組合わせである。

カルシウムやバリウムのようなアルカリ土類のカチオン
は、蛋白質の不可逆的変性を起こすので除外すべきであ
る。好適な塩は、硫酸アンモニウムである。

この場合、０℃から２０℃の間にて撹拌しながら、処理
すべき溶液１リツトルに対し、結晶硫酸アンモニウム８
０乃至７００９を添加する。塩が実質的に全部溶解する
迄撹拌を続ける。次いで、混合物を０℃から２０℃の間
の温度にて１５分間乃至２０時間放置し、活性物質を最
大限に塩析させる。デカンテーション、ろ過あるいは遠
心分離のような、通常の手段により溶液を除去する。

特に好適な方法として、との塩析操作を０℃から１０℃
の間にて、処理すべき酸性溶液１リツトル毎に１００乃
至６００ｇの硫酸アンモニウムを添加して行なうことが
できる。約１０℃にて、３０分間から６０分間の間溶液
を放置するとリパーゼ活性を有する不溶物が最大量に沈
澱する。その沈澱を約５０ミリバールの真空下における
ろ過、または、４℃から１０℃の間にて、３　、０００
乃至１０．００Ｏｒｐｍの速度による１０乃至４５分間
の遠心分離により分離する。このようにして得られた製
品は、活性物質、その他の生物学的物質及び、処理中に
加えたものを含め、種々の無機塩を含有する。

工業的操作においてはこうした状態のものを使用し得る
が、製薬宇土の操作においては、透析または限外ろ過の
ような膜ろ過によって、混在する塩を除去する必要があ
る。その際、限外ろ過が特に使用される。この方法は、
先ず不溶物を水に再び溶かした後、その溶液を、低分子
を透過し、より高分子の酵素を保持する構造を有する膜
に水を加えて試料を一定体積に保ちながら、限外ろ過に
付す。

このように、塩析で得られた不溶物を水に溶かし、希塩
酸の添加により溶液のｐＨを２から７の間に調整し、そ
の酸性溶液を、脱塩処理の目的でおおむねｓ　、　ｏｏ
ｏ乃至１０．０００ダルトンのカットオフ選択性（ｃｕ
ｔ　ｏｆｆ　５ｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　）を有する膜上
で接線循環（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｃｉｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ　）により限外ろ過する。本発明による場合、脱
塩操作は全て同様にして行なう。

ろ過が行なわれている間、流速（ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｆ
ｌｏｔｖ−ｒａｔｅ　）を可能な限り速く保つが、それ
は制動ポンプを用いると可能である。しかしながら、膜
にかかる流体の圧力を制御し、クロラギングを起こさせ
ない為に１バールを超えぬようにしなければならない。

こうした条件下、２００ｃＩ！Ｌ２の膜で１時間当たり
２乃至３リツトルのろ過動を処理し得る０ ろ過後啼膜のカットオフ選択性（ｃｕｔ　ｏｆｆ　５ｅ
ｌｅｃ−ｔｉｖｉｔｙ　）よりも高分子量の物質を含み
膜上に保持された物質は、前述の４竹による限外ろ過に
よって２乃至５回濃縮した後、既に定めた方法及び操作
東件で、冷凍し、約１ｏ２＜　＋）パールの高真空下、
凍結乾燥する。

これらの操作によって、本発明の製品としての、比活性
１乃至１００ユニツト／〜蛋白質で特徴づけられるリパ
ーゼ活性を有する抽出物が得られろ。

方法Ｂに依れば、これらの抽出物から適切な手段により
、強化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ　）抽出物及び純粋リパーゼ
画分が得られ、これらも本発明による製品である。

この方法は、有機化合物の特定官能基のイオン化能力を
利用するイオン交換クロマトグラフィー及び、適切な支
持体の助けにより異なる分子量及びサイズの化合物の分
離を可能にするゲルろ過の２つのｍｓ−手段を採り得る
。先行する操作が脱脂質段階を＠呼ない場合は、ゲルろ
過のほうが好適である。

先行する段階においてリパーゼ抽出物が脱脂式処理され
ている場合は、これらの操作のいずれかによって強化リ
パーゼ抽出物が得られるが、この場合、イオン交換クロ
マトグラフィーがより好ましい。

リパーゼの取得には、両方の操作を連続的に行なう必要
があるが、順序は任意である。

これらの精製方法について以下に要約して説明する。イ
オン交換クロマトグラフィーは、適切な溶媒中で、正ま
たは負の電荷を獲得し、逆の電荷を帯びる支持体への付
着を可能にする、イオン化し得る官能基を結合した水溶
性物質の精製に関与する。支持体に付着した試料の溶出
は、それらの結合力の強さく応じて起こり、それにより
混合物から試料の分離が可能となる。

蛋白質の構造を有する酵素は、その分子の等電ｐＨにお
いて全体で電荷がゼロとなる、アミン基とカルボキシル
基の両方を持っている。そのｐＨを下回るように溶液を
酸化すると、それはカルボキシル基に作用し、酵素は正
に帯電し、逆に、アルカリ化は、アミノ基に作用し、そ
の物質は負の電荷を帯びる。

蛋白質の、酸にも塩基にも反応するこうした特性は、カ
チオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー法による
それらの精製を可能にしている。

こうした方法に用いられる支持体は、使用されている溶
出液に不溶で、イオン化官能基を結合している物質であ
る。

支持体の主要なタイプとして、樹脂、３次元スチレン及
びポリビニルベンゼン系、置換セルロース、デキストラ
ン誘導体あるいはアガロース誘導体がある。後者では、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ社が高度に架橋されたアガロースポ
リマーで特に迅速な分離の可能な支持体（Ｆａｓｔ　Ｆ
ｌｏｗ商標）を提供している。

その構造において、これらの異なる支持体は、カチオン
交換用としてスルフォン、カルボキシル。

リン及びヒ素、アニオン交換用として、第１．第２ある
いは第３級アミン、のようなイオン化官能基を有する。

好適な方法として、本発明による製品は、直径Ｚ６ｍ、
高さ３０αで支持体にスルフォプロビルラジカルを有し
、カチオン交換体である、ＦａｓｔＦｌｏｗ　Ｓ及び５
ｅｐｈａｒｏｓｅタイプ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のカ
ラム、あるいは同一の支持体を含むが、容量がより低い
（１ｒｄ　）　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　ｍｏｎｏ　Ｓタイ
プ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）のカラムを用いたカチオン
交換クロマトグラフィーによって精製した。

精製する抽出物はｐＨ３から５の間、特にｐＨ４の緩衝
液に溶解する。緩衝液の例を以下に示す。

ａ）　　酢酸ナトリウム　　　２０　ｍＭ／リットル塩
化ナトリウム　　　１００ｍＭ／リットル酢酸　ａｄ　
　　　　　　ｐＨ４ ｂ）酢酸ナトリウム　　　２０　ｍＭ／リットル酢酸　
ａｄ　　　　　　ｐＨ４ 抽出物の溶液は、精製に用いる緩衝液で予め平衡化した
ゲル上に注ぐ。使用するカラムのタイプによって緩衝液
が異なる。

’　ｍｏｎｏ　８　’タイプカラムの場合、抽出物は、
緩衝液ｂ）に溶かす。試料は、これと同一の緩衝液によ
って精製するが、この緩衝液は、１リツトル当たり５０
０　ｍＭの塩化ナトリウムを含有する異なるタイプの緩
衝液の添加により、１リツトル当たりＯから５００　ｍ
Ｍ迄の塩化ナトリウムを累進的に含有するｐＨ４の溶出
勾配となるようにして使用する。イオン強度の累進的変
化により、強化リパーゼ抽出物を含有する両分は、塩化
ナトリウム濃度的２５０　ｍＭ／ｌの位置において分離
される。

’　Ｓ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　’ｐイブカラムの場合に
は、精製すべき試料を緩衝液ａ）に溶かして、カラムに
注ぐ。溶出は、これと同一の緩衝液、次いで酢酸ナトリ
ウム２０　ｍＭ／ｌ及び塩化ナトリウム２００ｍＭ／７
３を含む溶液によって行ない、所望抽出物から成るリパ
ーゼ画分が溶出する。

塩析に続く方法ａ）の操作によって得られる抽出物に対
して適用されるこの精製法は、１００乃至５００ユニツ
ト／〜蛋白質の比活性を有する強化リパーゼ抽出物を含
有する両分の取得を可能にする。

これらの精製操作によって得られた水層画分は、リパー
ゼ取得の為の補足的精製にも、アモルファスな固体とし
ての強化リパーゼ抽出物取得の為の、迅析または限外ろ
過によろ塩析、既に説明した方法による冷凍及び凍結乾
燥処理にも使用し得る。

１分子篩（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　５ｉｅｖｅ　）　　’
タイプのゲルによるろ過においては、分子のサイズ、即
ちその体積またはディメンジョンによる分離が可能であ
る。使用される不溶性ゲルは、分子サイズに適合した種
々の３次元システムで形成されている。

従って異なるサイズの分子の混合物のうち、ゲルのシス
テムに適合するサイズの試料のみ保持され、それより大
きなサイズの分子は保持されずに迅やかに溶出する。ゲ
ル上に保持された分子に関してもその保持時間はそれら
のサイズに依存し、試料の溶出は、分子サイズに比例し
て行なわれ、より小さな分子がより長く保持される。

以下のゲルは、こうした分離特性を有する。

−３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　　　エビクロロヒドリンで架
橋したデキストランから成る。

−Ｂｉｏｇｅｌｓ　Ｐ、Ｎ　、　Ｎ’−メチレンビスア
クリルアミドで架橋したポリアクリル アミ　ド鎖 −Ｕｌｔｒｏｇｅｌｓ及び ８ｅｐｈａｃｒｙｌｓ　　　混合ポリアクリルアミドと
アガロースグリッドの組み合わせ 本発明の製品については５ｅｐｈａｃｒｙｌタイプのポ
リアクリルアミドゲルでの処理が好ましい。

脱脂質処理していない抽出物は、排除限界がｉ　、　ｏ
ｏｏ　、　ｏｏｏダルトンを超える篩（５ｉｅｖｅ　）
で処理する。

こうして精製すべき試料の水溶液を高さ約１メートル、
ゲル１乃至７リツトルを含むカラムに注ぐ。

塩化ナトリウム１００乃至５００　ｍＭ　、リン酸二ナ
トリウム１０乃至３３　ｍＭを含有するｐＨ５の溶液に
よって溶出を行なう。溶出液を両分によって集め、これ
らの画分のリパーゼ活性を調べろ。

活性を有する画分は、３析または限外ろ過により脱塩し
、次いで冷凍、疎結乾燥して所望の固形強化リパーゼ抽
出物を得る。

脱塩処理したリパーゼ抽出物は、３０，０００から５５
　、０００ダルトンの間、特に４５　、０００から５５
　、０００ダルトンの間の分子量の物質を分離できる分
子篩にかける。こうして、精製すべき試料の水溶液を高
さ約１メートル、ゲル４００乃至５００−を入れたカラ
ムに注ぐ。

塩化ナトリウム２００ｍＭ／リットルを含有するｐＨ６
の溶液によって溶出を行なう。溶出液は両分に集め、こ
れらの両分からリパーゼ活性を捜し出す。

このようにして取得したリパーゼ活性含有画分は、リパ
ーゼ取得の為の補足的精製過程に用いてもよいし、透析
または限外ろ過により脱塩し次いで冷凍、凍結乾燥して
固形の強化リパーゼ抽出物を得、場合によってはそれを
更に脱脂質処理に付すこともできる。

本発明による方法は、子ウシ、ヒツジ、ブタ。

家禽、ウサギ及びウマの胃に適用してきた。しかしなが
ら、驚くべきことに、例えば最初、ブタの胃から得たリ
パーゼ物質及びリパーゼの最大リパーゼ活性がｐＨ６乃
至ｐＨ７、従って胃内の環境、すなわち胃液（ｇａｓｔ
ｒｉｃ　ｍｅｄｉｕｍ　）中ではそれほど活発でないの
に反し、ウサギやウマから得たそれはｐＨ４から５の間
、特にｐＨ４，５であった。

またブタの胃と異なりウサギ及びウマの胃の抽出物は、
酸性溶媒中でインキュベートした後もそのリパーゼ活性
を保持していたことも予想に反することであった。ブタ
の胃については、３７℃における２時間のインキュベー
トでは、ｐＨ４を下回るｐＨ値に耐えられないのに対し
、ウサギやウマの胃の場合、同一条件で、ｐＨ２におい
ても活性は低下しない。

更に１ウマ及びブタの抽出物のｐＨ３から９の範囲にお
ける活性についても調査した。これらのｍ出物に関して
は、ｐＨ３から７の間において、約ｐＨ４，５Ｋ出現す
る最高活性値と同等若しくはその５０％を超すリパーゼ
活性が認められた。この実験結果の記録を後に記す。

ウサギ及びウマの腎由来のリパーゼはこのように広い活
性範囲を有し、しかも酸性溶媒中でも変質しないという
注目すべき特性を有するので、ヒトや動物の種々の病理
学的欠陥においてそのリパーゼ活性を代行する医薬とし
て使用され得る。

従って本発明は、Ｌａｅｍｍｌ　ｉ法による分子量が、
４９　、０００ダルトン、そのうち９　、０００が糖、
４０　、０００が蛋白質に相当するリパーゼであって、
アミノ酸タイプの数は、Ａｓｐ、　Ａｓｎ　：　４５　
：　Ｔｈｒ　；　１９　：　Ｓｅｒ：２８　：　Ｇｌｘ
　：　３０　：　Ｐｒｏ　：　２９　：　Ｇｌｙ　：　
２５　：　Ａｌａ　：２８　：　Ｖａｌ　：　２７　：
　Ｍｅｔ　：　３　：　Ｉｌｅ　：　１８　：　Ｌｅｕ
　：２６　：　Ｔｙｒ　：　１６　：　Ｐｈｅ　：　１
８　：　Ｌｙｓ　：　１７　：　Ｈｉｓ　ニア　：　Ａ
ｒｇ　：　１０　：　ＣＹｓ　：　９　：及びＴｒｐ：
６、そのＮ−末端配列が、Ｌｙｓ　−Ｓｅｔ　−Ａｔ　
ａ　−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−５ｅｒ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　−Ａｓｎ　−Ｍｅｔ　−Ｘ
　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｕ　−Ｍｅｔ　−１１
ｅ　−５ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ　−Ｇｌｕ　−Ｖａ　１−　Ｖａ　
１　、うちＸは不定７ミ／酸ヲ示シ、Ｇａｒｇｏｕｒｉ
法によるリパーゼ比活性が１，０ＯＯＵ／７Ｖ蛋白質を
超え、その最高活性が約４．５のｐＨ値において得られ
、ｐＨ３及び７におけるその活性が最高値の少なくとも
半分に等しく、３７℃、ｐＨ２における２時間のインキ
ュベーション後その活性は保持され、その脂肪分解に関
与するアミノ酸力、ヘプシン耐性であるところのシステ
ィンであってｐＨ値が５．７から７．１の間の等電点な
有するキモトリプシン及びトリプシンによって分解され
、本発明による方法に従いウサギの胃の基底から調製さ
れ得る、リパーゼに関する。

本発明はまた、Ｇａｒｇｏｕｒｉ法によるリパーゼ比活
性が１．ｏｏｏＵ／＊蛋白質を超え、その最高活性が釣
ｐＨ４，５において得られ、ｐｆ（３及び７におけるそ
の活性が最高値の少なくとも半分に等しく、３７℃、Ｐ
Ｈ２における２時間のインキュベーション後その活性が
保持され、本発明の方法によりウマの胃から調製され得
る、リパーゼに関する。

本発明は最終的には、Ｇａｒｇｏｕｒｉ法によるリパー
ゼ比活性が１００から１，０００Ｕｚ４’５＋蛋白質の
間、その最高活性が約４．５のｐＨ値において得られ、
ｐＨ３及び７におけるその活性が最高値の少なくとも半
分に等しく、ｐＨ２，３７Ｃにおける２時間のインキュ
ベーション後その活性を碌持し、本発明による方法によ
ってり１製され得る、脱脂質処理した、または、説脂質
処理しない、場合によつては水溶液形態をとり得る、強
化リパーゼ抽出物に関する。

本発明は更に、Ｇａｒｇｏｕｒｉ法によるリパーゼ活性
が１からｌ　Ｑ　Ｑ　Ｕ７ｆｎｇ蛋白質の間であり、そ
の最高活性が約４．５のｐＨ値にて得られ、ｐＨ３及び
７におけるその活性が最高値の少なくとも半分く等しく
、ｐＨ２，３７℃における２時間のインキュベーション
後その活性を保持し、本発明による方法によって調製さ
れ得る、脱脂質処理した、または脱脂質処理しないリパ
ーゼ抽出物に関する。

これらのペプシン耐性抽出物はトリプシンにより分解さ
れ、脂肪分解に関与するアミノ酸としてシスティンを有
する。

これらの製品は酵素及び酵素抽出物について通常測定さ
れている、以下のような特性によって定義される。即ち
、 ａ−比活性 ｂ　−ｐＨの関数としての活性 Ｃ−酸性溶媒中におけるインキュベート後のリパーゼ活
性の耐性 ｄ−見かけ上の（ａｐｐａｒｅｎｔ　）分子量ｅ−）リ
グリセリドに対する活性 ｆ−等電ｐＨ ｇ−脂肪分解に関与する必須アミノ酸の存在ｈ−プロテ
アーゼに対する耐性 ｉ−糖の存在 以下、これらの測定法について概説する。

ａ、比活性は、酵素活性とミリグラム単位で表したサン
プルの蛋白質量との比として定義される。

リパーゼ活性はＹ、　Ｇａｒｇｏｕｒｉ　（Ａｉｘ−Ｍ
ａｒｓｅｌｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ＰｈＤ　ｔｈｅ
ｓｉｓ、　１ｇＢ５　）の、トリブチリンを基質として
使用する滴定法によって測定される。それは、リパーゼ
の作用によって遊離した酪酸を３７℃にてｐＨ５の不変
ｐＨ値を有する０、ＩＮナトリウム溶液で中和すること
から成る。この実験条件下、酵素活性は、テストされて
いる物質の作用により１分後に遊離した酸のマイクロモ
ル数に相当する。

実際には、この実験はトリブチリン０．５０ｍ。

タウロデソキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｔ
ａｕ−ｒｏｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ　）とウシ血７
’Ｊ　７　ルプミンノ等張ｉ　１４．５０　ｄ　（組成
：ウシ血清アルブミン１００ｆｆｌｐ、２　ｍＭタウロ
デソキシコール酸ナトリウム、９％ＮａＣ１等張溶質、
ａｄ１リットル）をサーモスタットにより３７℃にコン
トロールされた滴点セルに導入することから成る。

自動滴定器を使用し、電磁振どう下、混合物に０、ＩＮ
ソーダを加えてｐＨ６とする。ｐＨ値をこの値に安定さ
せた後、滴定する酵素化合物の水溶液を正確に測定して
０．５乃至１−添加する。この実験条件下、２分間ｐＨ
値を６に保つのに必要とされろ０．　Ｉ　Ｎソーダ溶液
の量によって前に定砂したリパーゼ活性の算定が可能と
なる。

蛋白質は、Ｆｏｌｉｎ　Ｃ１ｏｃａｌｔｅｕ試薬の存在
下、測定する。アルカリ溶媒中の第二銅イオンとそのフ
ォスフオーモリブド−タングスティック（ｐｈｏｓｐｈ
。

−ｍｏｌｙｂｄｏ　−ｔｕｎｇｓｔ　ｔｃ　）試薬が存
在すると、蛋白質量に比例する強さで有色の複合体が形
成される（　Ｌｏｃｏｒｙ　ｅｔ　ａｌ、　１９５１　
）　。発色度を既知のウシ面苅アルブタン与Ｆ？、？、
周池笛Ｒシψお１　箒ストされるサンプルの蛋白質濃度
を測定することができろ。

ｂ、　　ｐＨの関数としての活性は、既述の滴定による
方法を適用し、ｐＨ３乃至９の範囲で測定される。即ち
、滴定混合物を０．１Ｎゾーダ溶液または０．１　Ｎ塩
酸の添加により適切なｐＨにする。酵素溶液を加えて、
このｐＨ値に２時間保持する。

酪酸の解離係数（ｐＫａ−４，７５）から、ｐＩＩ５に
おける直接滴定、ｐＨ５迄の中和因子゛り併う滴定及び
このｐＨを下回るいわゆる’　ｒｅｔｕｒｎ　’滴定が
可能である。

Ｃ６酸性溶媒中におけるインキュベーション後のリパー
ゼ活性の耐性。この実験は、試験試料を３から９の間の
ｐＨ値の水溶液中に３７℃にて最高２時間インキュベー
トした後にリパーゼ活性を測定することから成る。

試験する酵素抽出物水溶液に０．　Ｉ　Ｎ塩酸またはソ
ーダ溶液を加えて異なるｐＨ値にする。これらの溶液を
、サーモスタットで３７℃にコントロールされた櫂の中
に入れる。サンプルを０分、３０分、１時間、及び２時
間後に取り出し、基質としてトリブチリンを含有させる
。迅やかにｐＨ値を６に調整し、Ｏ，ＩＮソーダ溶液を
添加してｐＨ値を６に維持させながらリパーゼ活性の滴
定を２分間行なう。このように測定されたリパーゼ活性
をインキュベートしないで直接ｐＨ６にて滴定（ｉ。

ｅ、　Ｑ分経過後のサンプル）した対照試料のリパーゼ
活性と比較すると、実験条件下のインキュベーション後
のリパーゼ活性パーセンテージが得られる。

ｄ、見かけ上の分子量は、Ｌａｅｍｍｌ　ｉ法（Ｎａｔ
ｕｒｅ。

１９７０　、主１．　ｐｐ、　６８０−６８５　）によ
る電気泳動法によって測定される。それは、サンプルを
ドデシル硫酸す）ＩＪウムで処理し、５％ゲル及び１２
．５％ゲル（ｗｔ／ｖｏｌ　）で連続的に構成されるポ
リアクリルアミドゲル中へ移動させることから成る。

１４．０００から９４，０００ダルトンの間の既知分子
量の蛋白質は同一に処理する。クーマシープル（Ｃｏｏ
−ｍａｓｉｅ　ｂｌｕｅ　）で蛋白質を可視化した後、
サンプルの見かけ上の分子量をその移動度と基準蛋白質
の移動度との比較によって測定する。この方法によって
ウサギの胃から得た精製リパーゼ（実施例６）の分子量
４８　、０００ダルトンが得られる。

６、　９パーゼあるいはリパーゼ抽出物の活性を３タイ
プの基質、即ち短鎖トリグリセリド：中程度の鎖を有す
るトリブチリン（Ｃ４）　：　ＬＩＰ几０ＣＩ−ＬＥ　
（Ｃ，Ｃ，。）　、長＊　：　ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤＥ
、　　３０　％大豆油、について調べた。

実際には、トリブチリン０．５−またはＬ　Ｉ　ＰＲＯ
＋ＣＩＬＤ０．５−または３０％ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ
Ｅ　５　ｒｎｔに２ユニツトを加え、リパーゼ活性１０
ユニツトを９％ＮａＣ１綬衝液、　Ｃａ（Ｊ２１５０　
ｎＭ及びウシ血清アルブミン中でインキュベートした。

ｐＨ値の関数としての活性の調査は、リパーゼはトリブ
チリンに対し約ｐＨ５で、ＬＩＰＲＯＣＩＬＥに対して
約ｐＨ６、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤＦｉに対してはｐＨ４
にて最大活性を有することを示している。

取得されたリパーゼ製品の活性は、前に列挙した基質に
対し、ｐＨ５において測定される。ＬＩＰ−ＲＯＣＩＬ
Ｅ及びＩＮＴ几ＡＬＩＰＩＤＥに対してはそれぞれトリ
ブチリンに対する活性の５０乃至７５％及び２５乃至４
０％の活性が詔ぬられている。

蛋白質を電界中及び電性電解質によるｐＨ勾配中に置く
とその等電ｐＨへと移動する。勾配は、等電点２から１
１の間のポリカルボン及びポリアミノ脂肪酸で構成され
る、分子量１　、０００以下の高分子電解質の混合物で
形成されている。

予め形成した水平ゲル上にリパーゼ抽出物２乃至５μり
を置き、この蛋白質を電界内で約１時間泳動させろ。硝
酸銀試薬によってバンドの存在を可視化する。リパーゼ
のｐＨは５．７かう７．１の間である。このｐＨ域に数
本のバンドが存在するのは、蛋白質に結合している糖鎖
の不均一による。

の決定 この実験は、リパーゼまたはリパーゼ抽出物に酵累活性
を遮断する特性の試望を添加することから成る。ここで
使用した試薬は、特定のｐＨ条件下、蛋白質の遊離スル
フヒドリル（５ｕｌｐｈｙｄｒｉｃ　）基に結合する、
ＤＮＴＢ　（５、５’−ジチオ−ビス−２−二トロ安息
香酸）及び４ＰＤＳ　（４、４’−ジチオピリジン）で
ある。結合後、これらの試薬は次のような有色基（ｃｏ
ｌｏｕｒｅｄ　ｇｒｏｕｐｓ　）を遊離する。ＤＮＴＢ
は、４２０ｎｍの波長において吸収されろ５−チオ−３
−二トロ安息香酸を遊ｆ工し、４ＰＤＳは、３２４ｎｍ
において観察され、定ｔされる４−チオピリドン基を遊
離する。

１ミリリツトルの分光光度セル中て、トリスＨＣ７０，
２５ＭのｐＨ８ｔＨ４ｆ液、酸性リパーゼ（ａｃｉｄｌ
ｉｐａｓｅ　）及び過剰士の試薬のインキュベーション
を行なう。異なる時点において、遊潴した蛋白質の吸収
を測定し、モル吸光係数によってその濃度を計算し、 （Ｅ　１　ｃｍ　、　Ｍ−１３６００、４２０ｎＭ　）
（Ｅ　１　ｃｍ　、　Ｍ−１９８００、３２４ｎＭ　）
同時に、サンプルを採取する。ａ、に記した方法で、残
された脂肪分解活性を測定し得る。精製リパーゼのリパ
ーゼ活性は、これらの試薬によって結果として、全部ｒ
！Ａ害きれる。更に、計算により、アミノ酸システィン
に属する単離（ｓｉｎｇｌｅ　ｆｒｅｅ　）スルフヒド
リル基が脂肪分解活性に携わることが判定され得る。同
一条件で処理したリパーゼ抽出物もまた医書される。

ｈ、プロテアーゼに対する耐性の測定 この調査は、胃に分泌される酵素であるブタペプシン、
膵臓によって十二指腸内に分泌されろ酵素であるブタの
キモトリプシン及びトリプシンについて行なった。

リパーゼ抽出物及びリパーゼを２時間、３７℃にて、キ
モトリプシン及びトリプシンについてはｐＨ７，５、ペ
プシンについてはｐＨ２でインキユベートシた。サンプ
ルを１５分毎に規則的に取り出しａ、に記した方法で、
残されたリパーゼ活性を測定する。

ヘラシン２ダをｐＨ２緩衝液中でリパーゼまたはリパー
ゼ抽出物３〜と混合する。同様にして、キモトリプシン
またはトリプシン２■をｐＨ７緩衝液中でリパーゼまた
はリパーゼ抽出物３■と混合する。標準として用いられ
る活性はｃ、　において測定された。

ペプシンに関しては初期の活性が２時間保たれている。

キモトリプシン存在下における活性は２時間経過後５０
％減少し、トリプシンによれば、リパーゼ活性は２時間
後に完全に破壊される。

ｉ、糖の存在の確認 この実験では、２つのＮ−アセチルグルフサミンの間を
切断する酵素、特異的なエンドグリコシダーゼ、ＥＮＤ
ＯＦ、によって蛋白質に結合する糖鎖な加水分解する。

その方法は、この酵素で処理されたリパーゼから得られ
た物質の見かけ上の分子量を測定することから成る。加
水分解及びｄ、に記載した方法による処理の後、元の酵
素について得られた分子量よりも低い、約４０　、００
０ダルトンの分子量に相当する位置に主要なバンドが認
められる。更に、アミノ酸組成によって、各アミノ酸の
重量を基に蛋白質の分子量を約４０　、０００と測定す
ることができる。ｄ、に記載のＬａｅｍｍｌ　ｉ法によ
って測定された分子量との差異は約９　、０００ダルト
ンであって、それは、その酵素の糖画分に相当する。

精製リパーゼによってリパーゼの生化学的性質、即ち、
アミノ酸組成及びＮ−末端配列を決定することができた
。

蛋白質を塩酸で加水分解し、２４．３８及び７２時間後
のアミノ酸組成を決定した。次いで、加水分解物をり、
　Ｈ，Ｓｐａｃｋｍａｎｎ　、　Ｗ、　Ｈ，５ｔｅｉｎ
及びＳ。

Ｍｏｏｒｅ　（Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　１９５７　
、２２８　＋　ｐ、　９９９　）の方法に従い自動アミ
ノ酸分析器（Ｓｐ　１ｎｃｏ　−Ｂｅｃｋ−ｍａｎ　）
を用いて分析し、分析結果をＭ、Ｄｅｌａａｇｅ（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　１９６
８　、１６８　、　ｐ５７３）の方法で処理した。

システィン性基は、過ギ酸酸化（ｐｅｒｆｏｒｍｉｃｏ
）（ｉｄａｔｉｏｎ　）により、トリプトファンは、Ｂ
、　Ｐｅｎｋｅ。

Ｒ，Ｆｅｒｅｎｚｉ及びに、　Ｆｏｕａｃｓ　（Ａｎａ
ｌｙｆｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ、　１９
７４　、６０　、　ｐｐ、４５　５０　）の方法により
メルカプトエタンスルフォン酸存在下加水分解により測
定した。

測定された！Ａなるアミノ酸タイプの数は以下の通りで
ある。即ち、 Ａｓｐ　、　Ａｓｎ　−４５；　Ｔｈｒ　−１９；　　
Ｓｅｒ　−２８；　Ｇｌｘ−３０ｉ　　Ｐｒｏ　−２９
ｉ　Ｇｌｙ　−２５；　Ａｌａ　−２８：　Ｖａｔ−２
７ｉ　Ｍｅｔ−１３；　　ｌ１ｅ−１８ｉ　　Ｌｅｕ−
２６；　　Ｔｙｒ１６　　；　　Ｆｉｌｅ−１８；　　
Ｌｙｓ　　　１７　　；　Ｈｓｓ　　　７　　；　Ａｒ
ｇ−１０ｉ　　Ｃｙｓ　−９７Ｔｒｐ　−６゜蛋白質の
Ｎ−末端配列は、Ｆｒｅｄ、　８．　Ｂｓｃｈ　（Ａｎ
ａｌ。

Ｂｉｏｃｂｅｍ、、　１９８４　＋　１３６　＋　Ｉ）
ｐ３９−４７　）の方法に従い決定した。３０個のアミ
ノ酸の末端配列は以下の通りである。即ち、 Ｌｙｓ−８ｅｔ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ　−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　−Ａｓｎ　−Ｍｅｔ　−
Ｘ　−１１ｅ　−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ　−１１ｅ　
−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｙ　−Ｔｙｒ　
−Ｐｒｏ　−８ｅｒ　−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ　
−Ｇｌｕ　−Ｖａｔ　−Ｖａｌｏ（Ｘ；不定） 本発明は、活性成分として、本発明によるリパーゼ及び
／またはリパーゼ抽出物を有する、ヒト及び動物におけ
る吸収不良を治療する医葵をその最婆目的とする。

本発明は以下の実施例により例示される。

実施例１ 方法人に従い調製される、脱脂質処理をしない刃金２乃
至３力月のウサギの胃を屠殺場より入手し、その基底部
（胃底）の上部３分の１を切開して内容物を除去する。

組織は一２０℃にて凍結させ、２ｃｒＩＬ未満の断片に
分ける。

方法Ａによる、酸性溶媒中における均質化及び抽出処理 ０、０６　％　ｗｔ／ｗｔ　（１）　ヘブシンヲ含有す
６　ｐＨ２，５の塩酸６００−に１０乃至１２℃にて１
６０ｇの組織片を加える。らせん状振どう器を用い、凡
そ２０℃、９００　ｒｐｍにて４５分間、この混合物を
振とつすることにより、均質化処理を行う。

不溶物は、５０００　ｒｐｍにて３０分間遠心に付して
分離する。淡黄色の酸性上清層を分離するニ一体　積　
：　５４０ゴ ー比活性　ニ ー総活性　：　　１７５，０００ユニツト硫酸アンモニ
ウム沈澱 前述の操作によって得られた酸性溶液に、硫酸アンモニ
ウム１４７ｇを１２℃にて振どうを行ないながらゆっく
りと添加し、次いで溶液を１５℃にて１５分間放置する
。塩析した沈澱物を３５０Ｏｒｐｍ、２０分間遠心に付
して分離する。

酵素画分を含む底部をｐＨ５のリン酸緩衝液１７５ｄに
溶解する。機械的不純物をわずかに含む淡黄色の透明な
溶液を得る。

一体　　積　　：　　　１７５ｍ −比活性　ニ ー総活性　：　　１２４．２５０ユニツト実施例２ 前記溶液を５μｎの多孔フィルタでろ過する。

得られた溶液をＰｈａｒｍａｃｉａ社の８ｅｐｈａｒｙ
ｌ　Ｓ　３００ゲル（高さ１メートル、体積７．５リツ
トル）を用いたクロマトグラフィにより、ｐＨ６の既述
の緩衝液で流速１１５ψにて溶出し、精製する。所望の
リパーゼ活性は、最初に収集された両分に認められる。

これらの画分を採取し、均質な画分にする。

一体　積　　　　　：　　８３０ｍ１ −リパーゼ比活性　ニ ーリパーゼ総活性　：　　１００．６４２ユニツトこの
溶液を濃縮、凍結乾燥、脱塩処理すると、酵素活性９８
，０００ユニツト、比活性３１ユニツト／　ｙｖの淡黄
色のアモルファスな、脱脂質処理しない抽出物の粉末３
１７ｇが得られる。

異なるｐＨ値における活性 ｐＨ３；　　４，５０３Ｕ ｐＨ５７８，７５０Ｕ ｐＨ７：　　４，４１２　Ｕ 酸性ｐＨに対する耐性 ｐＨ２時間：　０　　　　８，３００ユニツト時間＝２
時間　　ｓ　、　ｏｏｏユニット異する長さの鎖を有す
るトリグリセリドに対する活性 短　　　　　　　　　　８，７５０ユニツト中　　　　
　　　　　　６，８２９ユニツト長　　　　　　　　　
　３．２３３ユニツトシステインの特定試薬による活性
阻害 リパーゼ活性は、ｐＨ８にて試５　ＤＮＴＢにより完全
に因害される。

プロテアーゼの作用 変質ニ ーペプシンではＯｏ −キモトリプシンでは４０乃至５０％。

−トリプシンでは既述の操作条件下、完全に阻害。

皿ｊユ：二と 実施例３ ａ、調製 刃金２乃至３力月のＪａｎｎｙ種またはｃｏｕｎｔｒｙ
種のウサギの内臓の背部を屠殺場から入手する。食道、
那及び牌臓の部分と共に胃の不純物を除去する。

均質化、脱水及び脱脂質処理 組［２２５ｇを２，２５０−のアセトン中で５℃にて火
炎／爆発耐性（ｆｌａｍｅ／ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ−ｐｒ
ｏｏｆ　）　装置で３０．００Ｏｒｐｍ、　３０秒間す
りつぶす。不溶物をブ７ナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ　）フィ
ルタで真空ろ過し冷アセトン１００ｒＩＬｔで洗浄する
。不溶物を取り出し、同一条件にて、操作を引き続き繰
り返す。その際、脱脂質溶媒として、アセトン（３回）
、クロロフォルム（３回）及びジエチルエーテル（３回
）を用いる。

最後に真空下、デシケータ中で粉末を乾燥し、一定重量
４５ｇとする。

ｂ、方法Ａ 酸性水溶液による抽出 脱脂質処理をした粉末を予め５℃に冷却したｐＨｚ５の
塩酸１，１２５−に加えろ。混合物を４℃にて３０分間
撹拌し、不溶画分を１０，０ＯＯｒｐｎにて３０分間遠
心に付し分離する。水層を分取する。

一体　積　　　　　：　　　１，１２５ゴーリパーゼ比
活性　：　　　　７物蛋白質−リパーゼ総活性　：　　
７５，０００　ＵｐＨ２，３７℃にて２時間インキュベ
ート後も活性は不変。

硫酸アンモニウム沈澱 前記操作により得られた酸性水溶液に、３５２ｑの硫酸
アンモニウムを、４℃にて撹拌しながら徐々に加える。

添加後、混合物を同一温度にて３０分間放置し、次いで
３０分間１０．００Ｏｒｐｍにて遠心に付す。

上清をデカントし、酵素画分を含有する遠心底部を水３
００ゴに溶解する。水溶液の酵素特性を測定する。

−リパーゼ比活性　：　　　　７３０＃蛋白質−リパー
ゼ総括性　：　　３７，５００　Ｕこの水溶液は、以下
の処理を予め行うことにより、実施例４の方法Ｂによる
精製に直接使用される。水溶液に含まれる硫酸アンモニ
ウムを４℃にて撹拌しｐＨ４の緩衝液（２０ｍＭ／／ｌ
酢酸す）　ＩＪウム、１００ｍＭ＃塩化ナトリウム及び
酢酸ｐＨ４）１５リツトルと置き換えながら透析して除
去する。１時間後、緩衝液を除去し、新たな緩衝液に対
し、操作を２回繰り返す。最終的に、硫酸アンモニウム
の取り除かれたリパーゼ活性溶液３００−が得られる。

この溶液を以下の実施例に記すように精製する。

実施例４ ゲル６０−を含有する直径２６簡のＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ
Ｓ　５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａよ
り入手）により、精製を行う。

カラムは透析で既に用いた緩衝液ｐＨ４で、流速１００
ｄ／時間にて平衡化する。そこへ溶液３００−を通し、
同一条件下、ｐＨ４溶液で溶出を続け、次いで、２０　
ｍｂ４ｉｚ酢酸ナトリウム及び２００　ｍＭ／ｌ塩化ナ
トリウムから成るｐＨ６，５の第２の溶液で溶出する。

４８０ゴ溶出後、以下の特性を有するリパーゼ活性含有
溶出液４０１ｎｅを採取）−る：−リパーゼ比活性　：
　　　　３５０　ＵＡ９蛋白質−リパーゼ総括性　７　
２８，０００　Ｕ溶液を冷凍し疎結乾燥すると製品ｌグ
ラム肖りリパーゼ比活性１０，０ＯＯＵの強化抽出物２
．８りを取得することができろ。

実施例５ 方法Ａに従い調製したリパーゼ抽出物 ａ、調製 実施例２におけると同一の組織５（ｌを実施例２の方法
により均質化、脱水及び部分的脱脂質処理する。残りの
水及びアセトンを２５℃にて４０ミＩＪバールの真空下
除去して、製品１０ｇを得、これを方法人に従い処理す
る。

ｂ、方法人 実施例２にても適用。

酸性水溶液による抽出 一取得された体ｆｊｔ　　：　　　２２２ｙｄ−リパー
ゼ比活性　：　　　　２．．６　ＵＡｌ）蛋白質−リパ
ーゼ総活性　：　　８．８５００硫酸アンモニウム沈澱 遠心処理後、底部な縫衝溶液（１５０ミＩＪモル／リッ
トル垣化ナトリウム、ｐＨを酢酸によって３にＭｆｆｌ
ｉしたン１９ｍ／で取り出す：−リパーゼ比活性　：　
　　　１７Ｕ＃蛋白質−リパーゼ総活性　：　　６，５
５０　Ｕ溶液は、実施例６に記した精製操作等に使用す
る０ 実施例６ 前例において得られた溶液を、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５
２００ゲル溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手、直径２
６１、高さ１ｆｆｌ）で既述のｐＨ３緩衝液を用い、流
速１６−７時間にて精製する。３００−溶出後、体積５
０−中、以下の精製リパーゼ活性を有する溶液が得られ
ろニ ーリパーゼ比活性　’　　　２５７ＵＡ９蛋白質−リパ
ーゼ総活性　：　　４，５５０　Ｕイオン交換クロマト
グラフィ ％　／　Ｓ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａより入手）、容積０．９８ｍ、を用いて操作を行
う。予め得られた溶液５０−をカラムに入れ、ｐＨ４の
緩衝溶液（０から５００　ｍｍｏＡ！／Ａ！の塩化ナト
リウム直線密度勾配から成る２　０　ｍｍ０Ｊ／ｌ酢酸
ナトリウム）を用い流速１　ｍｌ　／　ｍ１ｌｌにて溶
出する。リパーゼは、体積２〇−中、塩化ナトリウムｌ
ｌに対し２５０ｍ　ｍｏｌの濃度で溶出する。得られた
製品は以下の特性を有するニ ー総蛋白質重量　　°３．４Ｉｎ９ −リパーゼ比活性　’　　１．０６７ＵＡ＋蛋白質−リ
パーゼ総活性　：　　３，６３０　Ｕ−見かけの分子量
　：　　４８，０００（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ法） 異なるｐＨ値における活性 ｐＨ３：　　１００ユニツト ｐｉ（５：　　１７０ユニット ｐＨ７；８５ユニツト 酸性ｐＩｉ値に対する耐性 ｐＨ２時間　：　　Ｏ１５０ユニツト 時間　：　２時間　１４５ユニツト 分子量 分子量バンドは４９，０００に存在。

以下の鎧を有するトリグリセリドに対する活性短　７　
１，２００ユニツト 中　ニア６０ユニツト 長　＝３００ユニット ｐＨ５，７及び７．１の間に１２本のバンド有り。

システィンの特定試薬による活性阻害 ＤＮＴＢ　：　２４０分後阻害、ＤＮＴＢ　１分子によ
りリパーゼ１分子が阻害される。

４　ＰＤＳ　：　６０分後阻害、４　ＰＤＳ　を分子に
よりリパーゼ１分子が阻害される。

プロテアーゼの作用 変質 一ベプシンにより、〇 一キモトリプシンにより、４０乃至５０％−既述の操作
条件下、トリプシンにより完全に阻害。

糖の存在下における測定 リパーゼをそのまま電気泳動ゲル上に置くと、分子量バ
ンドは４９　、０００を示す。ｅｎｄｏ　Ｆとインキュ
ベートすると、分子−１４ｏ、ｏｏｏダルトンに相当す
る位置で経時的に鮮明に現れてくる一本のバンドが認め
られる。

実施例７ 方法Ａに従い調製されたリパーゼ抽出動力法人を直接に
用い、ウマの胃粘膜について調製を行う。

酸性水溶液による抽出 凡そ１　ａｒｔ２の断片に分けたウマの胃粘膜２２８り
を、４℃に冷却された水９１０　ｒｒｔ中に入れ、３７
％の濃縮塩酸（ｗｔ７’ｖ　）を加えて混合物のｐＨを
２，５±０．１とする。４℃にて３０秒ずつ２分間の間
隔を入れ２回、３０．ＯＯＯｒｐｍにて試料をすりつぶ
す。

すりつぶされた試料を低温電磁板とうに４０分間付し、
次いで酸性溶液を１０．ＯＯＯｒｐｍにて３０分間遠心
して分離する。

酸性溶液８９２−は、リパーゼ活性物質を溶液１−当た
り１５．５比ユ＝　ット（５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｕｎｉｔ
ｓ　）または蛋白質１〜当たり０．７４比ユニツトの割
合で含有する。総リパーゼ比活性は１３，８００［Ｊ０
硫酸アンモニウム沈澱 電磁板とう下４℃にてｇｅＪ記酸性溶液に硫酸アンモニ
ウム５００りを加える。同温にて振どうを３０分間続け
、次いで不溶物は１０．００Ｏｒｐｍにて３０分間遠心
に付して分離する。９％塩化ナトリウム５０ｍ１Ｋより
底部を取り出し、同−東件下その混合物を再び遠心分離
に付す。

上清は、強化リパーゼ活性を有するニ 一体　積　　　　　：　　　５１１ｎｔ−リパーゼ比活
性　：　　１９２　ｔｒｉ　−５，６Φ〜蛋白質−リパ
ーゼ総括性　：　９，８００　Ｕこの溶液を既述の方法
により処理すると固形の製品を得ることができる。

実施例８ 実施例１において使用したと同一のウサギの胃を使用す
る。

筒底（ｆｕｎｄｕｓ　）　（パートＢ）から噴門洞（ａ
ｎｔ−ｒｕｍ　）　（パートＡ）を分離する。基底自体
は、組織の横方向に４等分して（腔部からＢ、　、　Ｂ
２．　Ｂ、。

Ｂ４と、）ける）切り分ける。これらの異なる組織を実
施例１におけると同様に処理する。各々におけろ敵抽出
物のリパーゼ活性をＧａｒｇｏｕｒｉ法により測定し、
以下のような結果を得る： 　−Ｏ Ｂ、−Ｏ ２−Ｏ Ｂ、−０ Ｂ４−６，０００ユニツト リパーゼ活性は、筒底の上部に局在している。

動物における毒性が無いことのほか、本発明による製品
は、ヒトの消化作用に関する病変に対し好ましい効果を
与えるものである。

毒性調査は、７乃至８週令のＷｉｓｔａｒラットにウサ
ギの胃から取得したリパーゼ抽出物で飽和した水溶液を
体重１００ｇ当たり、５０リパーゼユニツトを含有する
１−の割合で、４週間、毎日経口投与して行なった。

この処理の後、０ＣＤＥ推奨の、次のような試験を行な
った。即ち、生きた動物に対しては、血液学的、生化学
的、血液及び尿検査を、死んだ動物に対しては、組織病
理学的検査を行なった。

処理しなかった対照区と比較したところ、リパーゼ抽出
物を摂取した動物に異常は認められなかった。こうした
研究から、そしてこうした処理に対する動物の完全な耐
性から、当該製品が無害であり毒性を欠くことが示され
る。

本発明による製品の、単独での、あるいはヒト消化病理
学で用いられるその他の酵素との併用での効果も示され
た。

慢性アルコール性／慢性膵臓炎を患う１８才から７５オ
迄の患者に１粉末またはカプセル形態で本発明の製品を
毎日３００から６，０００リパーゼユニツトを容態に応
じて与えた。治療前に２４時間当たり１０ｇ以上の脂肪
便の排出のある患者は、当該製品を６力月間食事時に摂
取するかまたは、食物に混合させて摂取する。

はとんどのケースで、脂肪便が減少し、排便の頻度と量
に改善が見られた。腹痛や膨満などの不快症状もまた軽
減した。しばしば、体重増加も認められた。この試験中
、本発明の製品の効果に帰因する不耐性は、患者の全般
的症状にそれほど顕著な改善をもたらさなかったパンク
レアチン等の他の酵素と比較しても認められなかった。

更に、肺線維症（ｍｕｃｏｖｏｓｃｉｄｏｓｉｓ　）を
患う脂肪吸収率９０％未満の小児に対し、当該製品を前
記試験に匹敵する量、１４日間与えて治療した。

この試験中、便の脂肪レベル、重量及び１８洒たつの頻
度を、痛みの強さと腹部の膨満と共にチェックした。脂
肪便や一般的症状に顕著な改善が認められた。本発明の
製品は、パンクレアチンと比較してより効果的である。

本発明の製品は、医薬として、病状に応じた形態で投与
される。従って、錠剤、ゼラチン被覆錠。

軟カプセル、顆粒、微小顆粒（ｍｉｃｒｏｇｒａｎｕｌ
ｅｓ　）あるいは、シロップ、懸濁液及びゲルのような
液状形態に近いものも使用されろ。

リパーゼ抽出物は、吸収不良に関連する症状に作用する
種々の物質と併用し得る。従って、冑の保護剤（ｇａｓ
ｔｒｉｃ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇｅｎｔ　）　、
抗潰瘍剤、胃食道間逆流防止剤（ａｎｔｉ　−ｇａｓｔ
ｒｏｅｓｏｐｈａ−ｇｅａｌ　ｒｅｆｌｕｘ　ａｇｅｎ
ｔ　）その他消化現象において活性を有する酵素を使用
することができる。

上記の医薬形態は、従来技術により、現在製剤の分野で
使用されている補助剤を用いて製造される。神助剤とし
ては、ラクトース、サッカロース。

ソルヒトール、マンニトール、スターｆ、＊ルロースあ
るいはリン酸塩のような塩類等、活性成分なせ切に希釈
させろ中性的充填物が挙げられる。

崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ　）材、結合材あ
るいは潤滑材等も使用し得ろ。糖衣錠や水溶性フィルム
に包んだ形態とすることもできる。このようにコーティ
ングするのは、調製物の不快な味を隠す為である。

前述の液状形態は、小児科、老人病科において特に有用
であって、香料や色素を加えることによって、Ｖ覚的に
、服用し易くなる。

各種調製物の安定性は、トコフェロール、アスコルビン
酸、ソルビン酸、その塩等、酸化防止剤や保存剤の使用
によって確保される。

不発明の製品を含有する医薬を例示する為、以下に錠剤
及び粉末の製剤例を記す。

錠剤 １８０〜の錠剤１個で１０００リパーゼユニツトを服用
する処方。

実施例３における７　３　ＴＪ／ｆｎ５／蛋白質の製品
。

１０００ユニツトを供給し得る量、即ち１００１ｎｙ：
−コーンスターチ　　　　　　２２ダ ーリン酸２カルシウム　　　　３０！ｎ９−微結晶状セ
ルロース　　　　１５〜 −シリカ　　　　　　　　　　　１２１ｎ９−ステアリ
ン酸マグネシウム　　１〜 調農 ステアリン酸マグネシウムを除き、錠剤の成分はよく混
合し、固めてその大きさを１ｎｏｎのメツシュサイズに
調整する。得られた粒子にステアリン酸マグネシウムを
加えて潤滑化し、ユニット当たり１８０〜の割合で回転
機（ｒｏｔａｒｙ　ｍａｃｈｉｎｅ　）上で圧縮する。

粉末 １ｇの粉末でダラム当たり４００リパーゼユニツトを服
用する処方 実施例５におけろ１７物蛋白質の製品：−４００ユニツ
トを供給し得る量、即ち０．８２１５ｇ−アスコルビン
酸　　　　　　　　　　　０．００２５９−ラクトース
　　　　　　　　　　　　　　０．０７６０９−粉末形
態の天然オレンジ香料　　　　０．１０００９調製 適当なステンレススチールのミキサーに成分を次々に入
れる。均質化した後、混合物を茶色のガラスビンに入れ
密封する。

本発明による医薬は、従って、活性成分５６乃至８２重
量パーセント及び賦形剤４４乃至１８重量パーセントか
ら成る。

先に示したように本発明による製品の毒性は、無視し得
、従って、個々の症状に応じて毎日３００乃至６０００
リパーゼユニツト以上投与し得る。

この服用量の割合は、患者の年令に合わせるものである
が、一般的には、−日当たり６００乃至４０００リパー
ゼユニツトを通常食事の際に毎日３回服用する。

発明の効果 本発明による医薬組成物は、特に、脂質の吸収不良に関
連する病気の治療、就中、アルコール性。

遺伝性等の種々のタイプの膵臓炎、低カルシウム血症、
あるいは熱帯性膜臓炎の治療に適する。

これらの組成物は、一般に、胃切除術、膵臓の一部また
は全部切除等の外科手術の結果、脂肪側の原因となり得
る後遺症の治療に有用である。

これらの組成物は肺線維症及びリパーゼ、フリパーゼ、
エンテロキナーゼ不全症にも用いられ得る。

これらの病気に伴う症状は、一般に、脂肪側。

下痢、腹痛及び栄養障害である。本発明による製品を適
切な量及び期間服用することによりそれらの症状を退け
ることができる。

一般的には、本発明の製品を含有する組成物は、栄養と
なる脂肪類の同化現象に有用である。更にこれらの製品
は、健常人に対しても保健薬として、脂肪類の自然な吸
収を加速しあるいは完全くし、且つエネルギー供給を同
様に加速し、あるいは高める為にも使用し得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の事項から成ることを特徴とする、リパーゼ抽
   出物またはリパーゼの調製方法、 ａ）リパーゼ抽出物の取得： −成熟したウマまたはウサギの胃底をｐＨ１．５乃至５
   の酸性水溶液に、１重量部の胃底に対し１乃至１０容量
   部の酸性溶液の割合で、４乃至３０℃にて１分乃至１５
   時間接触させ、固形物質と、リパーゼ部分を含有する水
   溶液を得、 −固形物質から水溶液を分離して単独の水溶液を得、 −その水溶液に適量の水溶性塩を添加し、所望のリパー
   ゼ抽出物を塩析し上清溶液を得る為に充分な時間放置し
   、 −その上清溶液から所望のリパーゼ抽出物を分離、回収
   し、 ｂ）脱塩したリパーゼ抽出物の取得： −水相にリパーゼ抽出物を溶解し、 −５０００から１０，０００ダルトンの間の切断域（ｃ
   ｕｔｏｆｆ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を有する膜でその水
   相をろ過して脱塩したリパーゼ抽出物を得、 −その脱塩したリパーゼ抽出物の水溶液を凍結乾燥し、 ｃ）脱脂質化リパーゼ抽出物の取得： −リパーゼ抽出物を含有する胃底の固形部分、リパーゼ
   抽出物及び塩を除去したリパーゼ抽出物のうちのいずれ
   かについて脱脂質処理を行ない、 ｄ）脱脂質処理をしない、強化リパーゼ抽出物の取得： −ｐＨ２から７の緩衝液にリパーゼ抽出物を溶解し、緩
   衝溶液を得、 −その、ｐＨ２から７の緩衝溶液を、１，０００，００
   ０ダルトンを超える排出限界を有する分子篩によるクロ
   マトグラフィに付し、緩衝溶液として脱脂質処理をして
   いない強化リパーゼ抽出物を含有する、排出された溶出
   画分を回収し、 −その、排出された溶出画分を１０，０００ダルトンの
   切断域を有する膜でろ過して脱塩画分を得、 −この脱塩画分を凍結乾燥して、所望の脱脂質処理をし
   ない強化リパーゼ抽出物とする ｅ）脱脂質化強化リパーゼ抽出物の取得： −ｅ）１リパーゼ抽出物を水に溶解してリパーゼ抽出物
   含有水溶液を得、 −そのリパーゼ抽出物含有水溶液を５０００乃至１０，
   ０００ダルトンの切断域の膜でろ過して脱塩溶液を得、 −その脱塩溶液をイオン交換体に吸着させ、 −イオン強度を経時的に増加させる溶離液により支持体
   からの脱着を行ない、 −リパーゼ活性を有し、脱脂質処理した強化リパーゼ抽
   出物を含有する溶出画分を回収し、 −リパーゼ活性を有する溶出画分を５０００乃至１０，
   ０００ダルトンの切断域を有する膜でろ過して脱塩溶出
   画分を得、 −その脱塩溶出画分を凍結乾燥して所望の脱脂質処理し
   た強化リパーゼ抽出物を得、あるいは、 ｅ）２前出ｄ）において得られたｐＨ２から７の間の緩
   衝溶液を分子篩によるクロマトグラフィに付し、 −分子量３０，０００乃至５５，０００ダルトンに相当
   し、脱脂質処理した強化リパーゼ抽出物を含有する溶出
   画分を回収し、 −その、分子量３０，０００乃至５５，０００ダルトン
   に相当し、脱脂質処理した強化リパーゼ抽出物を含有す
   る溶出画分を５０００から１０，０００ダルトンの間の
   切断域を有する膜でろ過して、脱塩、脱脂質処理した強
   化リパーゼ抽出物の溶液を得、 −その脱塩、脱脂質処理した強化リパーゼ抽出物の溶液
   を凍結乾燥して所望の脱脂質化、強化リパーゼ抽出物と
   する ｆ）リパーゼの取得： ｆ）１前出ｅ）１において得られた、リパーゼ活性を有
   し、脱脂質処理をした強化リパーゼ抽出物を含有する溶
   出画分につき、 −分子篩によるクロマトグラフィに付し、 −分子量４５，０００から５０，０００ダルトンの間に
   相当しリパーゼを含有する溶出画分を回収し、 −そのリパーゼ含有溶出画分を５０００乃至１０，００
   ０ダルトンの切断域を有する膜でろ過してリパーゼを含
   有する脱塩溶液を得、 −そのリパーゼ含有脱塩溶液を凍結乾燥し、あるいは、 ｆ）２分子量３０，０００から５５，０００ダルトンの
   間に相当し、脱脂質処理した強化リパーゼ抽出物を含有
   する、前出ｅ）２において得られた溶出画分につき、 −イオン交換体に吸着させ、 −イオン強度を経時的に増加させる溶離液によって支持
   体からの脱着を行ない、 −リパーゼ活性を有し、リパーゼを含有する溶出画分を
   回収し、 −リパーゼ活性を有し、リパーゼを含有する溶出画分を
   、５，０００乃至１０，０００ダルトンの切断域を有す
   る膜でろ過してリパーゼ含有、脱塩溶出画分を得、 −そのリパーゼ含有脱塩溶出画分を凍結乾燥して、所望
   のリパーゼとする。 ２、０℃から２０℃の間の温度にて接触を行なうことか
   ら成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項による方
   法。 ３、水溶液を２５℃より低い温度、好ましくは４から２
   ０℃の間にて、ろ過、デカンテーシヨンまたは遠心分離
   によって固形物質から分離することから成ることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項または第２項による方法。 ４、水溶性塩８０乃至７００グラムを加え、０℃から２
   ０℃の間の温度にて１５分乃至２０時間放置することか
   ら成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至３項
   の何れか１項による方法。 ５、前記塩が、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及
   び好ましくはアンモニウムの塩、及び多価アニオン、特
   にリン酸塩または硫酸塩であることを特徴とする特許請
   求の範囲第４項による方法。 ６、前記固形部分を、８０℃より低い沸点を有する炭化
   水素、エーテル、ケトン、アルコールまたはハロゲン化
   炭素のような、脂肪類を可溶化し得る溶媒に接触させる
   ことにより脱脂質処理することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項乃至５項の何れか１項による方法。 ７、イオン交換体への吸着をカチオン交換支持体上へ行
   なうことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至６項の
   いずれか１項による方法。 ８、基底を１ｃｍより小さいサイズに分断することによ
   り酸性水溶液との接触を予め行うことを特徴とする特許
   請求の範囲第１項乃至７項のいずれか１項による方法。 ９、Ｌａｅｍｍｌｉ法による分子量が４９，０００ダル
   トン、うち、９，０００が糖に、４０，０００が蛋白質
   に相当し、アミノ酸タイプの数が、 【アミノ酸配列があります】 であって、Ｎ末端配列が、 【アミノ酸配列があります】 、Ｘは不定アミノ酸、 であり、Ｇａｒｇｏｕｒｉ法によるリパーゼ比活性が、
   １，０００Ｕ／ｍｇ蛋白質を超え、最高活性が約４．５
   のｐＨ値において得られ、ｐＨ３及び７における活性が
   最高活性の少なくとも半分であり、３７℃、ｐＨ２にお
   いて２時間インキュベート後もその活性を保持し、脂肪
   分解活性に関与するアミノ酸がシステインであってペプ
   シンに耐性、キモトリプシン及びトリプシンによって分
   解され、等電ｐＨが５．７から７．１の間に在り、ウサ
   ギの胃の基底から特許請求の範囲第１項の方法によって
   調製される、リパーゼ。 １０、Ｇａｒｇｏｕｒｉ法による比活性が１，０００Ｕ
   ／ｍｇ蛋白質を超え、最高活性が約４．５のｐＨ値にお
   いて得られ、ｐＨ３及び７における活性が最高活性の少
   なくとも半分であり、３７℃、ｐＨ２において２時間イ
   ンキュベート後も活性を保持し、特許請求の範囲第１項
   の方法によりウマの胃から調製される、リパーゼ。 １１、Ｇａｒｇｏｕｒｉ法によるリパーゼ比活性が１０
   ０から１，０００Ｕ／ｍｇ蛋白質の間であり、最高活性
   が約４．５のｐＨ値において得られ、ｐＨ３及び７にお
   ける活性が最高活性の少なくとも半分に等しく、３７℃
   、ｐＨ２において２時間インキュベート後も活性を保持
   し、ペプシンに耐性、キモトリプシン及びトリプシンに
   よって分解され、脂肪分解活性に関与するアミノ酸がシ
   ステインであり、特許請求の範囲第１項の方法により調
   製される、水溶液形態をとり得る、強化リパーゼ抽出物
   。 １２、Ｇａｒｇｏｕｒｉ法によるリパーゼ比活性が１か
   ら１００Ｕ／ｍｇ蛋白質の間であり、最高活性が約４．
   ５のｐＨ値において得られ、ｐＨ３及び７における活性
   が最高活性の少なくとも半分に等しく、３７℃、ｐＨ２
   において２時間インキュベート後もその活性を保持し、
   ペプシンに耐性、キモトリプシン及びトリプシンによっ
   て分解され、脂肪分解活性に関与するアミノ酸が、シス
   テインであり、特許請求の範囲第１項の方法により調整
   される、リパーゼ抽出物。 １３、活性成分としての、特許請求の範囲第９項乃至１
   ２項のうちのいずれか１項によるリパーゼ及び／または
   リパーゼ抽出物から成ることを特徴とする、ヒト及び動
   物における脂肪類の吸収不良を治療する為の医薬。