FI87232C - Foerfarande foer framstaellning av lipasextrakt - Google Patents

Description

1 87232

Menetelmä lipaasiuutteiden ja lipaasin valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää lipaasiuutteiden ja lipaasin valmistamiseksi, jotka ovan stabiileja, aktiivi-5 siä tuotteita väliaineissa, jotka ovat happamia tai lähes neutraaleja.

Lipaaseja, jotka ovat hydrolaaseihin liittyviä entsyymejä, esiintyy niinkin erilaisissa organismeissa kuten bakteereissa, sienissä, kasveissa ja eläimissä. Niiden mer-10 kitys elävän aineen toiminnoissa havaittiin noin vuonna 1900 tutkittaessa ruoansulatusilmiötä. Niiden toiminta on osoittautunut oleelliseksi assimiloitaessa rasva-aineita, jotka muodostavat tärkeän energialähteen ihmisten ja eläinten ruoassa. Tämän seurauksena niiden ominaisuuksia on 15 käytetty hoidollisiin tarkoituksiin.

Lukuisia tutkimuksia on suoritettu ihmisellä ja yleisesti nisäkkäillä. Ne ovat osoittaneet näiden entsyymien oleellisen katalyyttisen toiminnan ruoansulatuksen aikana, jolloin ne erityisesti liittyvät enul-20 goitujen tai emulgoimattornien rasvojen hydrolysointiin.

• .·. Viimeksi mainitut muodostuvat pääasiassa estereistä, jot- ka on muodostettu erilaisen molekyylipainon omaavista rasvahapoista ja monofunktionaalisista tai polyfunktionaali-sista alkoholeista kuten glyserolista, kun kyseessä ovat 25 triglyseridit. Näiden entsymaattisten systeemien puuttumi nen tai epätäydellisyys on usein havaittu huonossa absorp- tiossa, jonka välillä vakavat seuraukset saattavat johtaa merkittäviin painon alentumisiin ja ilmeisiin ruokahalutto-- muustiloihin. Ihmisellä nämä tilat, joita voi esiintyä sekä : . : 30 nuorilla lapsilla että aikuisilla, ovat antaneet aihetta ' käyttää hoidossa ulkopuolisia entsymaattisia systeemejä ... korvaamassa näillä potilailla luonnostaan esiintyvää lipaa- sivajetta. Käytettyjä koostumuksia varten tarvitaan niiden 2 87232 uuttamista varten sellaisia eläinten elimiä, joiden lipaa-sieritys on havaittu ja jotka tavallisesti toimivat organismissa assimiloimassa rasvoja. Nämä elimet sijaitsevat erilaisilla tasoilla suu-vatsa-suoli -alueella, useimpien 5 laajemmin tunnettujen ollessa peräisin suun ontelosta ja haimasta.

Nisäkkäiden suuontelon eritteet sisältävät siten entsyymejä, jotka voivat hydrolysoida rasvahappoestereitä. Nämä ovat vatsaa edeltäviä esteraaseja ja "suu"lipaaseja, 10 jotka eroavat toisistaan vain niiden aktiivisuuden kapasiteetin suhteen hydrolysoitaville tai ei-hydrolysoitaville aineille. Nämä entsyymit ja niiden ominaisuudet muodostavat pääasiallisen kohteen lukuisissa töissä, jotka ovat koonneet yhteen J.H. Nelson et ai. (Journal of Dairy 15 Science, 1976, 60(3), sivut 327-362).

Niiden läsnäolo ja niiden käyttökelpoisuus on erityisesti osoitettu vieroittamattomilla nuorilla eläimillä. Seurauksena on suuresti lisääntynyt sellaisten vatsaa edeltävien esteraasien markkinointi, jotka on saatu vasi-20 koista, kileistä ja karitsoista. Näitä tuotteita, jotka ensin olivat nestemäisten uutteiden muodoissa ja sitten konsentroituina jauheina, käytetään yleisesti eläinlääketieteessä hoidettaessa vasikoiden ripulia ja myös ihmis-lääketieteessä kuten esitetään US-patentissa 3 256 150, 25 jossa esitetään menetelmä, jolla hoidetaan huonon absorption oireyhtymä antamalla koostumusta jauhemaisessa muodossa suun kautta. Tämä koostumus sisältää osittain syötäviä kudoksia, jotka on otettu vieroittamattomien eläinten suuontelosta ja vielä erityisemmin vasikalta, kileiltä ja 30 karitsoilta otettuja kieliä ja viereisiä kudoksia. Viimeksi esitetyllä käytöllä ei ole vaikuttanut olevan suurta menestystä mahdollisesti aiheutuen siitä, että on vaikea kerätä suuria määriä elimiä, jotka on otettu nuorten eläinten kustannuksella, jotka on tarkoitettu ruoaksi ja jotka 35 eivät vielä ole kehittyneet taloudellisesti käyttökelpoiseen kokoon.

3 87232

Jotta voitaisiin vapautua näistä käytännön ja taloudellisuuden aiheuttamista ongelmista, esitetään GB-paten-tissa 2 142 337 rotan tai ihmisen kielilipaasi lipaasin vajavuuden hoitamista varten. Nämä entsyymit on valmis-5 tettu geeniteknologian avulla.

Pohjukaissuolen tasolla on haimanesteen lipaaseilla myös hyvin merkittävä aktiivisuus sulatettaessa osittain hajotettua tai hajottamatonta rasva-ainetta. Siten haiman entsyymierityksen vajavuus voi johtaa huonoon absorptioon, 10 joka rasva-aineiden kohdalla johtaa toisinaan poikkeamiin hajottamisessa ja tällaisten aineiden assimiloitumisessa. Ihmisellä suun kautta annosteltavia haiman korvaavia lääkeaineita on markkinoitu koostumuksena, joka perustuu sellaisten eläinten haimoihin (joiden ruoka on samanlaista kuin 15 ihmisellä), kuten sialla tai joilla on kasvissyöjätyyppi- nen ruoka kuten nautakarjalla. Kuitenkin tällaisten entsyymien ominaisuuksien tutkiminen, jota on suorittanut erityisesti Gunter Gordes 1973, on osoittanut tällaisten hoitojen arveluttavuuden. Näiden elinten entsymaattiset systeemit 20 nopeasti tuhoutuvat tai deaktivoituvat happamassa väliaineessa 37°C:ssa ja siten ne eivät voi taata niiden aktiivisuutta vatsaan siirtymisen jälkeen. On ehdotettu liuoksia näiden lääkeaineiden aktiivisuuden säilyttämistä varten. GB-patentti 1 139 991 esittää koostumuksen, jossa on haiman 25 entsyymejä yhdessä suolojen kanssa, joilla on happamuutta estävää vaikutusta ja joiden tehtävänä on säilyttää entsyymin ominaisuuksia siirron aikana pienentämällä luonnollista vatsan happamuutta. Identtisen menetelmän ovat esittäneet Regan P.T. et ai. (1978), Hubbard V.S. et ai. (1980) ja 30 Gon P. Bradbear et ai. (1981), käyttäen H2-reseptori-anta-gonistisia yhdisteitä kuten simetidiiniä.

Lisäksi on tehty yrityksiä säilyttää entsyymien aktiivisuus päällystämällä lääkeaineet vatsalaukkua kestävällä kalvolla, joka liukenee suolessa ja vapauttaa aktiivi-35 set osat pohjukaissuolessa, tai vielä yleisemmin liittämällä ne mikrohiukkasiin, joiden halkaisija on noin 3 mm.

4 87232 Nämä liuokset ovat vain lievittäviä ja ne aiheuttavat sivuvaikutusten riskin potilaalla tai ovat vaikutukseltaan epävarmoja.

Siten haimasairaudet vaativat usein pitkään kestä-5 vää hoitoa, jonka aikana aiheutettu vatsalaukun happamuuden alentaminen voi aiheuttaa paikallisen bakteerien vastustuskyvyn alenemisen ja niiden nopean lisääntymisen, kuten esittävät Weber A.M., 1982 ja jonka seuraukset ovat vakavia mikäli kyseessä on ruokamyrkytys.

10 Tuotteiden päällystämisellä ei voida taata täyttä käyttöturvallisuutta tietyissä tapauksissa kuten haiman vajaatoiminnassa, jossa epäsäännöllisiä pH-arvoja on havaittu vatsa-suoli-alueella ja jossa joskus on epätavallisia happotasoja, jotka eivät sovi yhteen vatsalta suojaa-15 van kalvon halutussa pisteessä tapahtuvan liuotuksen kanssa.

On tutkittu myös lipaasiaktiivisuuden läsnäoloa erilaisten eläinlajien vatsan sisällössä. Tämän aktiivisuuden alkuperä on kauan ollut kiistan alaisena ja sen on arveltu aiheutuvan joko suun eritteiden siirtymisestä syljen mukana 20 tai haimanesteiden pohjukaissuolipalautumisesta. Kuitenkin Fink C.S., et ai. (Am. J. Physiol., 1985, 248, sivut 68-72) ovat esittäneet kaniinin ruoansulatusrauhasia hajottamalla lipaasiaktiivisuuden, jonka vaikutus on suurimmillaan pH:ssa 5,8-6,1. Chemical Abstracts, Voi. 97, no 15, 11.10.1982, 25 s. 477, no 1248320, Columbus, Ohio, USA, viittaa lipolyyt-tiseen aktiivisuuteen vatsan tasolla vieroitetussa tai vie-roittamattomassa nuoressa kaniinissa. Tämä aktiivisuus saavuttaa suurimman tehokkuutensa pH-arvolla 7. Patenttihakemus WO 86/01532 esittää sellaisen proteiinin valmista-30 misen geeniteknologialla, joka vastaa ihmisen vatsan li- paasia ja on käyttökelpoinen hoidettaessa tapauksia, joissa on kyseisen entsyymin vajausta.

Tutkimus, joka on suoritettu lipaaseilla ja niiden käyttöyritykset osoittavat selvästi näihin entsyymeihin 35 liittyvän merkityksen ja vaikka niiden läsnäolo on esitetty tietyissä elimissä ja eritteissä nisäkkäillä ja vaikka li 5 8723? on havaittu niiden merkitys assimiloitaessa rasva-aineita organismissa, ei tähän mennessä ole esitetty lipaasia tai lipaasikoostumusta, joilla olisi teknisesti ja taloudellisesti käyttökelpoinen valmistusmenetelmä ja jotka vas-5 tikkeeksi takaisivat kyseisen rasva-aineen assimiloitumi-sen ja erityisesti triglyseridien assimiloitumisen suu-vatsa-suoli-alueella.

Esillä oleva keksintö muuttaa tilanteen esittämällä lipaaseja ja lipaasiuutteita, joiden aktiivisuus ei 10 muutu happamassa väliaineessa ja jotka tehokkaasti hydrolysoivat triglyseridejä väliaineessa, jonka pH on välillä 3-7, siis väliaineessa, jonka happamuus on verrattavissa happamuuteen, joka esiintyy suu-vatsa-suoli-alueella. Siten verrattuna aikaisempiin tuotteisiin, on keksinnön mu-15 kaisesti valmistetuilla tuotteilla kieltämättä se etu, erityisesti hoidossa, että ne pystyvät luotettavasti takaamaan sulatuksen aikana triglyseridien hydrolyysin suun ontelon ja pohjukaissuolen välillä samalla kun ne valmistetaan raaka-aineista, joita on helposti saatavissa suu-20 rina määrinä ja halvalla hinnalla.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää lipaasi-uutteiden tai lipaasin valmistamiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että a) lipaasiuutteen saamiseksi saatetaan täysikas-25 vuisen hevosen tai kaniinin mahanpohjukoita kosketukseen happaman vesiväliainen kanssa, jonka pH on 1,5-5, määränä 10 tilavuusosaa hapanta väliainetta 1 pohjukan paino-osaa kohti lämpötilassa 4-30 °C 1 minuutista 15 tuntiin kestäväksi ajaksi, jolloin saadaan kiinteitä aineita ja vesi-30 pitoinen liuos, joka sisältää lipaasiosan, erotetaan vesipitoinen liuos kiinteistä aineista, jolloin saadaan erillinen vesipitoinen liuos, lisätään erilliseen vesipitoiseen liuokseen sopiva määrä vesiliukoista suolaa ja annetaan olla siinä sopiva 35 aika, jotta halutusta lipaasiuutteesta muodostuu suola ja jotta saadaan pinnalla oleva liuos, ja erotetaan haluttu lipaasiuute pinnalla olevasta liuoksesta ja otetaan se talteen; 6 87232 b) suolasta vapautetun lipaasiuutteen saamiseksi liuotetaan lipaasiuute vesipitoiseen faasiin, suodatetaan vesipitoinen faasi käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saa-5 daan suolasta vapautetun lipaasiuutteen liuos, ja lyofilisoidaan suolasta vapautettu lipaasiuute-liuos suolasta vapautetuksi lipaasiuutteeksi; c) delipidoidun lipaasiuutteen saamiseksi suoritetaan delipidointitoimenpide jollekin 10 kiinteistä osista, jotka sisältävät lipaasiuutteen, joka on saatu mahanpohjukasta, lipaasiuutteelle ja suolasta vapautetulle lipaasiuutteelle; d) ei-delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen saamiseksi, 15 liuotetaan lipaasiuute puskuriin, jonka pH on 2-7, jolloin saadaan puskuroitu liuos, kromatografoidaan puskuroitu liuos, jonka pH on 2-7, käyttäen molekyyliseulaa, jonka raja-arvo ylittää 1 000 000 daltonia, ja otetaan talteen poistettu lipaasi-20 fraktio, joka sisältää ei-delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen puskuroidussa liuoksessa, suodatetaan poistettu eluointifraktio käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 10 000 daltonia, jolloin saadaan suolasta vapautettu fraktio, ja 25 lyofilisoidaan tämä suolasta vapautettu fraktio halutuksi, ei-delipidoiduksi, rikastetuksi lipaasiuutteeksi; e) delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen saamiseksi, 30 e)l liuotetaan lipaasiuute veteen, jolloin saadaan vesipitoinen liuos, joka sisältää lipaasiuutteen, suodatetaan vesipitoinen liuos, joka sisältää lipaasiuutteen, käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan liuos, joka ei si-35 säliä suolaa, adsorboidaan suolaa sisältämätön liuos ioninvaih-tokantajalle, i: 7 «723° desorboidaan kantaja eluointiaineella, jonka ioni-vahvuus kasvaa progressiivisesti ajan funktiona, otetaan talteen eluointifraktio, jolla on lipaasi-aktiivisuutta ja joka sisältää delipidoidun, rikastetun 5 lipaasiuutteen, suodatetaan eluointifraktio, jolla on lipaasiak-tiivisuutta, käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan suolasta vapautettu eluointifraktio ja 10 lyofilisoidaan eluointifraktio halutuksi, delipi- doiduksi, rikastetuksi lipaasiuutteeksi tai e) 2 kromatografoidaan puskuroitu liuos, jonka pH on 2-7 ja joka on saatu kohdassa d), käyttäen molekyyli-seulaa, 15 otetaan talteen pidätetty eluointifraktio, joka vastaa molekyylipainoja 30 000-55 000 daltonia ja joka sisältää delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen, suodatetaan pidätetty eluointifraktio, joka vastaa molekyylipainoja 30 000-55 000 ja joka sisältää rikaste- 20 tun lipaasiuutteen, käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan suolatonta, deli-pidoitua, rikastettua lipaasiuuteliuosta, ja lyofilisoidaan suolasta vapautettu, delipidoitu, rikastettu lipaasiuute; 25 f) lipaasin saamiseksi f) l käyttäen perustana eluointifraktiota, jolla on lipaasiaktiivisuutta ja joka sisältää delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen, joka on saatu edellä kohdassa e)l, 30 kromatografoidaan käyttäen molekyyliseulaa, otetaan talteen pidätetty eluointifraktio, joka vastaa molekyylipainoja 45 000-50 000 daltonia ja joka sisältää lipaasin, suodatetaan kyseinen eluointifraktio, joka sisäl- 35 tää lipaasin, käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan suolasta vapautettu liuos, joka sisältää lipaasin, ja 8 B 7 2 3 2 lyofilisoidaan suolasta vapautettu liuos, joka sisältää lipaasin, tai f)2 käyttäen perustana pidätettyä eluointifraktio-ta, joka vastaa molekyylipainoja 30 000-55 000 daltonia 5 ja joka sisältää delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen, joka on saatu edellä kohdassa e)2, adsorboidaan se ioninvaihtokantajalle, desorboidaan kantaja eluointiaineella, jonka ioni-väkevyys kasvaa progressiivisesti ajan funktiona, 10 otetaan talteen eluointifraktio, jolla on lipaasi- aktiivisuutta ja joka sisältää lipaasin, suodatetaan eluointifraktio, jolla on lipaasiak-tiivisuutta ja joka sisältää lipaasin, käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saa-15 daan suolasta vapautettu eluointifraktio, joka sisältää lipaasin, ja lyofilisoidaan suolasta vapautettu eluointifraktio, joka sisältää lipaasin, jolloin saadaan haluttu li-paasi.

20 Esillä olevassa yhteydessä tarkoitetaan termillä "delipidoitu" tuotetta, joka sisältää lipaasin ilman lipidejä. Oleellisesti menetelmään kuuluu uutosmenetelmä A, joka tekee mahdolliseksi valmistaa uutteita, joilla on spesifinen lipaasiaktiivisuus välillä 1-100 yksikköä pro-25 teiinimilligrammaa kohti ja erotusmenetelmä B, joka edellä esitettyjen uutteiden pohjalta tekee mahdolliseksi valmistaa rikastettuja lipaasifraktioita, joiden spesifinen aktiivisuus on suurempi kuin 100 yksikköä proteiini-milligrammaa kohti ja myös alkuperäisenä puhdistusvaihee-30 na puhtaan lipaasin, jonka spesifinen aktiivisuus on lähellä 1000 yksikköä proteiinin mg kohti. Seuraavana esitetään menetelmät A ja B kuten myös valinnaiset valmistusvaiheet.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään täysi-.35 kasvuisia kaniineja, siis kaniineja, joiden ikä on vähin- 9 87232 tään yksi kuukausi ja edullisesti vähintään kaksi kuukautta. Nämä täysikasvuisen kokoiset kaniinit on tarkoitettu ihmisravinnoksi ja niiden vatsan poistaminen ei vähennä niiden kaupallista arvoa. Keksinnössä ei käytetä vieroitettujen 5 tai vieroittamattomien nuorten kaniinien vatsoja, joissa tiedetään olevan lipaasiaktiivisuutta, jonka pH-arvon maksimi poikkeaa keksinnön mukaisesta lipaasista ja joka johtaisi suuriin hintaongelmiin, jotka johtuvat sekä kaniinien vatsojen pienestä koosta ja siitä, että tapettuja ka-10 niineja ei ole mahdollista myydä.

Samalla tavalla käytetään vain täysikasvuisten hevosten vatsoja, joiden ikä on erityisesti vähintään yksi vuosi ja edullisesti vähintään kolme vuotta.

On havaittu, että kaniinilla etsittyä lipaasia löy-15 detään pääasiassa vatsan pohjukasta, joka on vatsan ylempi osa, joka jatkuu alemmassa osassa onteloa. On havaittu myös, että lipaasia tavataan vain pohjukan isokaarteen ylemmässä osassa. Siten on mahdollista käsitellä kaniinin vatsa kokonaan tai mikä tahansa sen osa, joka sisältää 20 ylemmän osan isokaarteesta. Samoin on asia hevosen kohdalla, lipaasin esiintyessä pääasiassa pohjukassa. Koska pohjukka on vatsan suojaava osa, se on helppo leikata erilleen jäljelle jäävästä osasta, joka on edullista talteenotolle, varastoinnille ja siirtämiselle.

25 Tämä elinten valmistaminen on valinnaista ja sii hen voi kuulua vatsojen valmistaminen, kudosten valinta ja paloittelu ja delipidointi-toimenpiteet. Näiden käsittelyjen valinta tapahtuu käytettävissä olevien elinten luonteen ja tilan perusteella ja myös toivotun lipaasituotteen 30 laadun ja erityisesti puhtauden perusteella. Esimerkiksi seuraava diagrammi esittää edullisen menetelmän ja valmistelevien toimenpiteiden järjestyksen.

10 87232 vatsat 5 späpuhtauksien poistaminen valinta ja paloittelu 10 jauhatus ja delipidointi 1 5

menetelmä A

20 Valmistaviin toimenpiteisiin kuuluu ensinnäkin teu rastamolla erotettujen vatsojen puhdistaminen mahdollisista epäpuhtauksista ja kontaminaatioista kuten myös osista viereisiä elimiä (ruokatorvi, suolet, perna) ja sitten valinnaisesti erotetaan ja puhdistetaan ontelo. Kudokset voidaan 25 valinnaisesti jäädyttää ja pitää -20°C:ssa ennen paloittelua. Viimeksi mainittu voi tapahtua käsin tai laitteiston avulla, jonka avulla on mahdollista saada epäsäännöllisiä palasia, joiden suurin koko on 5 cm tai vähemmän.

Delipidointivaiheeseen kuuluu kudosten tai keksin-30 nön aikana saatujen kiinteiden uutteiden homogenisointi jauhamalla tai uuttamalla hydrofiilisen liuottimen avulla, jolla on alhainen kiehumispiste kuten pienen molekyylipai-non omaavilla ketoneilla ja alkoholeilla. Tietyissä tapauksissa yleisimmin käytetty liuotin on asetoni ja sillä voi-35 daan suorittaa mahdollinen kuivaus ja käsitellyn tuotteen osittainen delipidointi.

11 87232

Homogenointitoimenpiteet ja kaikki tuotteiden valmistuksen aikana suoritetut toimenpiteet suoritetaan lämpötilassa, joka on alle 25°C ja edullisesti alle 10°C, jotta estettäisiin aktiivisten aineosien denaturoituminen 5 mahdollisimman hyvin. Nämä palautumattomat denaturoitumi-set voivat olla luonteeltaan kemiallisia tai fysikokemial-lisia ja ne ovat seurausta uutto-olosuhteista ja käytetyn liuottimen luonteesta.

Tavallisesti elinten homogenoimiseksi jauhamalla 10 käytetään 1-10 osaa liuotinta 1 paino-osaa kohti käsiteltävää tuotetta. Jauhaminen tapahtuu lämpötilassa, joka on alle 25°C, tehokkaassa laitteistossa, joka on tyyppiä "Warring blender", jotta saadaan aikaiseksi 2 mm pienempien kudospartikkelien dispersio. Käyttämällä tätä lait-15 teistoa saavutetaan tämä tulos jauhamalla 30 sekunnista 5 minuuttiin nopeudella 10 000-30 000 kpm.

Liukenematon aineosa erotetaan dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla. Tavallisesti käytetään suodatusta teollisuustyhjössä, joka on noin 50 millibaria. 20 Tässä tapauksessa saatu jauhemainen liukenematon aine delipidoituu ja sillä on homogeeninen koostumus ja sitä voidaan joko suoraan käyttää uuttomenetelmässä A tai jäljellä olevan jäännösliuottimen poistamisen jälkeen, noin 20 millibarin tyhjössä ja lämpötilassa 25°C, sitä voidaan 25 käyttää merkittävimmässä delipidointimenetelmissä tai voidaan valinnaisesti käyttää osittain delipidoituna lipaasi-uutteena, joka saadaan keksinnön menetelmällä.

Näihin menetelmiin kuuluu tuotteiden valmistaminen halutulle delipidointiasteelle käsittelemällä liuottimilla, 30 jotka pystyvät liuottamaan rasva-aineen, kuten hiilivedyillä, eettereillä, ketoneilla, alkoholeilla tai hiili-halideilla, joita voidaan käyttää yksin tai seoksina. Näiden liuottimien pitää olla helposti poistettavia ja niiden kiehumispiste on noin 80°C tai sen alapuolella. Niitä 35 ovat esimerkiksi pentaani, heksaani, petrolieetterit, di-etyylieetteri, tetrahydrofuraani, kloroformi, metyleeni-kloridi, hiilitetrakloridi ja dikloorietaani.

12 87232

Delipidointitoimenpiteet voivat sisältää samaa käsittelyä varten lukuisia peräkkäisiä uuttoja samalla tai eri liuottimilla, kunnes saadaan sopivasti delipidoitu tuote.

5 Keksinnön mukaisesti valmistettujen tuotteiden kiin teiden lipaasiuutteiden lipidipitoisuus määritetään erilaisilla edellä mainituilla menetelmillä. Kun tuotetta on kuivattu 100-105°C:ssa 6 tuntia, uutetaan lipidit meta-noli:kloroformi-seoksella (25:75 til/til) 3 tuntia huoneen-10 lämpötilassa. Liukenematon aine suodatetaan ja liuottimet poistetaan haihduttamalla. Lipidipitoisuus on mahdollista määrittää vertaamalla alkuperäistä näytteen painoa ja haihdutus jäännöksen painoa ja pitoisuus on tavallisesti alle 1 % delipidoiduista uutteista.

15 Tämä delipidointitaso määritetään lopputuotteen muotojen mukaisesti, tuotteet voivat olla esimerkiksi tab-letoituja tai jauhemaisia ja keksinnön mukaisia tuotteita voidaan valmistaa siten, että niillä on erilaisia organo-leptisia ominaisuuksia. Delipidointitaso voidaan arvioida 20 määrittämällä esikokeella kaikki kuumana uutettavissa olevat rasva-aineet ja sitten määrittämällä kylmänä kullekin delipidointikäsittelylle se määrä, joka uuttuu nestefaasin kyseiseen osaan.

Menetelmässä sekoitetaan sopivassa laitteistossa ; 25 1 paino-osa käsiteltävää tuotetta ja 5-100 paino-osaa va littua delipidointiliuotinta 15 sekunnista 15 minuuttiin lämpötilassa, joka on alle 25°C. Delipidoitu tuote erotetaan liuottimesta suodattamalla tai sentrifugoimalla ja se voidaan käsitellä uudelleen samalla tavalla niin monta ker-30 taa kuin tarvitaan, jotta saadaan haluttu delipidointiaste.

Siten yksityiskohtaisemmin ja käyttäen edullisia liuottimia, joita ovat asetoni, eetteri, kloroformi ja niiden seokset, lisätään 1 paino-osaan käsiteltävää tuotetta 5-25 tilavuusosaa liuotinta, jonka jälkeen sekoite-35 taan voimakkaasti 30 sekunnista 10 minuuttiin lämpötilassa 0-10°C. Delipidoitu tai osittain delipidoitu liukene- i 13 87232 maton aine erotetaan vakuumissa suodattamalla. Kun kyseessä on epätäydellinen delipidointi, käsitellään liukenematon aine uudelleen samalla tavalla. Jotta saavutetaan toivottu delipidointiaste, voidaan toimenpide toistaa 2-5 5 kertaa.

Kuten edellä on esitetty, on erotusvaihe A oleellinen valmistettaessa keksinnön mukaisia tuotteita, joiden spesifinen lipaasiaktiivisuus on välillä 1-100 yksikköä/mg proteiinia. Tämä menetelmä A sisältää käsittelemisen happo-10 vesiliuoksella vatsoille joko sellaisenaan tai jotka on käsitelty edellä esitettyjen menetelmien mukaisesti. Siten on mahdollista käyttää kokonaisia vatsoja tai niiden valittuja osia tai jopa jauhemaista ainetta, joka saadaan homo-genoinnin jälkeen, joka on suoritettu jauhamalla liuotti-15 messa kuten asetonissa, tai käyttää samaa ainetta delipi- doidussa muodossa. Toisessa vaiheessa muodostetaan suoloja lipaasituotteista lisäämällä vesiliukoisia suoloja.

Vielä tarkemmin uuttovaiheessa happamassa vesipitoisessa väliaineessa sekoitetaan hyvin voimakkaasti aineita 20 yhdessä sopivien happoliuosten kanssa ja sitten erotetaan nestefaasi, joka sisältää aktiiviset aineosat, suodattamalla, sentrifugoimalla tai valinnaisesti dekantoimalla. Siten tavallisesti yhtä valmistettua aineen grammaa kohti käytetään 1-100 millilitraa happoliuosta, jonka pH-arvo 25 on välillä 2-4.

Vesiliuoksen happamuus on säädetty sopivan vahvuisilla hapoilla, jotta saadaan haluttuja pH-arvoja. Tavallisesti käytetään vahvoja mineraalihappoja tai orgaanisia happoja, joiden pKa on pienempi kuin 5. Näitä ovat pää-30 asiassa oksaali-, viini-, omena-, sitruuna-, maleiini-, muurahais-, maito- ja etikkahapot ja myös rikki-, fosforeja kloorivetyhapot, joita käytetään eniten.

Tapauksissa, joissa tämä toimenpide suoritetaan ku-doskappaleille, voi proteaasien kuten esimerkiksi pesii-35 nien lisääminen parantaa lipaasin uuttumista happamassa väliaineessa.

14 87232

Toimintaolosuhteet valitaan siten, että estetään palautumaton herkkien aktiivisten aineosien denaturoituminen, erityisesti lämpötiloissa yli 25°C. Tavallisesti uuttamiset suoritetaan sekoittamalla aineosia voimakkaas-5 ti 1 minuutista 15 tuntiin sekoittimen tehon mukaisesti ja lämpötilassa välillä 0-20°C.

Edullisesti käsiteltäessä 1 g ainetta käytetään 3-60 millilitraa kloorivetyhappoliuosta, jonka pH on säädetty arvoon 2-4^0,1; kyseiset liuokset saadaan esimerkik-10 si pH-arvolla 2 lisäämällä 2,0 ml 37 % kloorivetyhappoa 2 litrassa vettä.

Näin saatu liuos homogenoidaan voimakkaasti sekoittaen 5-60 minuuttia ja lämpötilassa 0-20°C. Tämän jälkeen vesifaasi erotetaan suodattamalla, dekantoimalla tai sent-15 rifugoimalla. Viimeksi mainitussa tapauksessa sopivimmat olosuhteet saavutetaan suorittamalla sentrifugoiminen 15 minuutin ja 1 tunnin aikana nopeudella 3 000-12 000 kpm lämpötilan ollessa 4-20°C. Erottaminen voi tapahtua myös suodattamalla ja tässä tapauksessa toimenpide suoritetaan 20 edullisesti nopeuttaen käyttämällä tyhjöä tai painetta suoda tus systeemissä.

Siten seos voidaan väkevöidä ultrasuodatuksella, jäädyttää ja lyofilisoida, jotta saadaan uute kiinteässä muodossa, jolloin se voidaan valinnaisesti delipidoida 25 edellä esitettyjen menetelmien mukaisesti.

Tässä tapauksessa seos ensin jäädytetään jäähdyttämällä -20 - -70°C:seen, kyseinen lämpötila saadaan vesi-glykoliseoksilla tai kiinteillä hiilidioksidi-asetoniseok-silla matalimpia lämpötiloja varten. Nämä toimenpiteet 30 suoritetaan säiliöissä, joihin on liitetty seuraava lyo- filisointimenetelmälaitteisto. Lyofilisointi suoritetaan -1 tyhjössä, joka on alle 10 millibaria. Sublimoimalla poistettu vesi kondensoidaan trappeihin lämpötilan ollessa alle -50°C ja erityisesti -80°C, jäähdytettynä ammoniakil-35 la tai freonilla. Saatu amorfinen dehydrattu tuote jauhetaan sitten kylmänä kuten esimerkiksi kryojauhamalla läm- 15 87232 pötilassa, joka on alle 0°C ennen delipidointia ja uutetaan sitten menetelmän A mukaisesti. Kaikki keksinnön mukaiset lyofilisointitoimenpiteet suoritetaan samalla tavalla.

5 Toinen menetelmän A toimenpide sisältää saostuksen lipaasiaktiivisille aineille, jotka sisältyvät happamiin happovesiliuoksiin, jotka saadaan edellisen toimenpiteen aikana. Tämä saostaminen suoritetaan muodostamalla suola, joka syntyy lisäämällä liuokseen vesiliukoisia suoloja.

10 Kationeina nämä suolat sisältävät magnesiumia, kaliumia, natriumia, ammoniumia ja anioneina asetaattia, sitraattia, fosfaattia ja sulfaattia. Kuitenkin edulliset suolat ovat yhdistelmiä, joissa on moniarvoisia anioneja ja erityisesti fosfaattia ja sulfaattia. Maa-alkalikationit kuten kalsium 15 ja barium, jotka aiheuttavat palautumattomia proteiinien denaturoitumisia, eivät sovi käytettäviksi. Edullinen suola on ammoniumsulfaatti.

Tässä tapauksessa 1 litraan käsiteltävää hapanta liuosta, joka on valmistettu sekoittamalla lämpötilassa 20 0-20°C, lisätään 80-700 g kiteistä ammoniumsulfaattia. Se koittamista jatketaan kunnes suola on pääosin kokonaan liuennut. Tämän jälkeen liuos jätetään lämpötilaan 0-20°C, jotta saavutetaan mahdollisimman suuri aktiivisten aineiden suolan muodostuminen, joka tapahtuu 15 minuutin ja 25 20 tunnin välisenä aikana. Tämä liuos poistetaan sitten tavallisilla menetelmillä kuten dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla.

Erityisen edullisesti tämä suolan muodostamisen toimenpide suoritetaan lisäämällä lämpötilassa 0-10°C, 100-30 600 g ammoniumsulfaattia kutakin käsiteltävää happoliuos- litraa kohti. Kun liuos jätetään noin 10°C:seen 30-60 minuutiksi, saadaan saostumaan optimaalinen määrä liukenematonta ; ' ainetta, jolla on lipaasiaktiivisuutta ja joka erotetaan suodattamalla tyhjössä noin 50 millibarissa tai sentrifu-35 goimalla 10-45 minuuttia nopeudella 3 000-10 000 kpm ja lämpötilassa 4-10°C. Näin saatu tuote sisältää aktiiviset 16 8 7 2 32 aineet, muut biologiset aineet ja erilaisia mineraalisuo-loja mukaan luettuina käsittelyjen aikana lisätyt suolat.

Tällaisenaan voidaan menetelmää käyttää teollista valmistusta varten. Kuitenkin farmaseuttisia toimenpiteitä 5 varten on tarpeellista poistaa parasiittiset suolat ja tämä suoritetaan membraanisuodatuksessa (dialyysi tai ultra-suodatus) , viimeksi mainitun ollessa erityisemmin käytetty. Liukenemattoman aineen veteen liuottamisen jälkeen ultra-suodatetaan liuos samalla kun tuote pidetään tilavuudeltaan 10 vakiollisena lisäämällä vettä kalvolle, jonka rakenne läpäisee pienen molekyylipainon omaavia molekyylejä ja pidättää tuotteet ja erityisesti suuremman molekyylipainon omaavia entsyymejä.

Siten liukenematon aine, joka on saatu muodostamal-15 la suolaa, liuotetaan veteen, liuoksen pH säädetään välille 2-7 lisäämällä laimeaa kloorivetyhappoa ja hapan liuos ultrasuodatetaan tangentiaalista kierrätystä käyttäen kalvolla, jonka leikkausraja-arvo on tavallisesti 5 000-10 000 suolan poistamistarkoituksia varten. Kaikki suolan poista-20 miset tapahtuvat samalla tavalla keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Suodatuksen aikana pidetään vakiollinen virtausnopeus niin suurena kuin mahdollista ja tämä suoritetaan käyttäen peristalttista pumppua. Kuitenkin nesteen painetta 25 kalvolla kontrolloidaan ja se ei saa ylittää 1 baria, jottei tapahtuisi tukkeutumista. Näissä olosuhteissa on 200 2 cm :n kalvolla mahdollista käsitellä 2-3 litraa suodosta tunnissa.

Suodattamisen jälkeen saatu pidätetty aine, joka 30 sisältää aineet, joilla on suurempi molekyylipaino kuin kalvon selektiivisyyden leikkausraja-arvo, väkevöidään 2-5-kertaisesti ultrasuodatuksella edellä esitettyä laitteistoa käyttäen ennen jäädyttämistä ja lyofilisointia 2 suurtyhjössä, joka on noin 10 millibaria, jo aikaisemmin 35 määriteltyjen menetelmien mukaisesti ja esitetyissä toimintaolosuhteissa .

17 87232 Näiden toimenpiteiden avulla on mahdollista saada keksinnön mukaisia tuotteita, uutteita, joiden lipaasi-aktiivisuus on karakterisoitu spesifisellä aktiivisuudella, joka on 1-100 yksikköä/proteiini mg.

5 Käyttäen menetelmää B, on näiden uutteiden avulla mahdollista saada sopivia menetelmiä käyttäen rikastettuja uutteita ja puhdasta lipaasifraktiota, jotka myös ovat keksinnön mukaisia tuotteita.

Tähän menetelmään voi kuulua kaksi puhdistusmenetel-10 mää, jotka ovat ioninvaihtokromatografia, joka käyttää orgaanisten yhdisteiden tiettyjen funktioiden ionisointi-kapasiteettia, ja geelisuodatus, joka sopivan kantajan avulla tekee mahdolliseksi erottaa yhdisteitä, joilla on erilaiset molekyylipainot ja koot. Sellaisissa tapauksissa, 15 joissa edellä esitetyt toiminnat eivät kuulu delipidointi-vaiheeseen, on geelisuodatus edullinen.

Kun lipaasiuute on delipidoitu edellisessä vaiheessa, toinen näistä menetelmistä tekee rtuihdolliseksi valmistaa rikastettuja lipaasiuutteita ja tällaisessa tapauk-20 sessa on ioninvaihtokromatografia edullinen.

Lipaasin valmistaminen vaatii molempien menetelmien peräkkäisen esiintymisen, tällöin ne voivat olla missä järjestyksessä tahansa.

Seuraavana esitetään yhteenvedot näistä puhdistus-25 menetelmistä. Ioninvaihtokromatografia liittyy vesiliukoisten aineiden puhdistamiseen, joihin liittyy ionisoitavia funktioita, jotka sopivassa väliaineessa voivat sisältää positiivisen tai negatiivisen varauksen, joka mahdollistaa sen liittymisen vastakkaismerkkiseen väliaineeseen. Kanta-30 jaan liittyneiden tuotteiden eluointi tapahtuu edullisesti niiden sidosvoiman funktiona ja siten tietyissä tapauksissa on mahdollista erottaa tuotteita seoksista.

Siten entsyymeillä, joilla on proteiinirakenteet, on sekä aminofunktioita että karboksyylifunktioita yhdessä 35 nollavarauksena molekyylin isoelektrisessä pH:ssa. Liuosten tekeminen happamaksi kyseisen pH-arvon alapuolelle 18 8723? vaikuttaa karboksyylifunktioihin ja tekee entsyymille positiivisen varauksen, kun taas emäksiseksi tekeminen vaikuttaa aminofunktioihin ja antaa tuotteelle negatiivisen varauksen.

5 Tämä proteiinien amfoteerinen ominaisuus tekee mah dolliseksi niiden puhdistamisen kationi- tai anioninvaih-tokromatografia-menetelmillä.

Tällaisissa menetelmissä käytetyt kantaja-aineet ovat aineita, jotka ovat liukenemattomia eluointiväliai-10 neeseen ja joissa on ionisoitavia funktioita.

Kantaja-aineiden päätyyppejä ovat hartsit, kolmi-dimensionaaliset styreeni- ja polyvinyylibentseenisystee-mit, substituoidut selluloosat, dekstraanijohdannaiset ja agaroosijohdannaiset. Viimeksi mainittujen joukossa tarjoaa 15 Pharmacia voimakkaasti ristisidoksellista agaroosipolymee-rikantajaa, jolla saavutetaan erityisen nopeita erotuksia (Fast Flow kauppanimi).

Näillä erilaisilla kantaja-aineilla on rakenteessaan ionisoitavia funktioita kuten rikki-, karboksyyli-, 20 fosfori- ja arseenifunktioita kationivaihtoa varten ja primaarisia, sekundaarisia tai tertiaarisia amiinifunktioi-ta anioninvaihtoja varten.

Edullisesti keksinnön mukaiset tuotteet on puhdistettu kationinvaihtokromatografiällä käyttäen pylväitä, . 25 jotka ovat tyyppiä Fast Flow S ja Sepharose tyyppejä (Phar macia), joiden halkaisija on 2,6 mm ja korkeus 30 cm, joiden kantaja-aineessa on sulfopropyyliradikaaleja ja jotka ovat siten kationinvaihtajia, tai pylväitä, joissa on identtinen kantaja-aine, mutta joilla on pienempi kapasiteetti 30 (1 ml) Fast Flow mono S tyyppiä (Pharmacia).

Puhdistettavat uutteet on liuotettu puskureihin, joiden pH-arvo on välillä 3-5 ja erityisesti 4. Seuraa-vana annetaan esimerkkejä puskureista.

li 19 8 79 '*> o a) Natriumasetaatti 20 mmol/litra

Natriumkloridi 100 mmol/litra

Etikkahappoa kunnes pH 4 b) Natriumasetaatti 20 mmol/litra 5 Etikkahappoa kunnes pH 4

Uutteiden liuokset saostetaan geeleihin, jotka on etukäteen tasapainotettu puskurilla, jota käytetään puhdistamiseen. Jälkimmäinen poikkeaa funktioltaan käytetyn 10 pylvään tyypistä.

Käytettäessä "mono S" tyyppistä pylvästä uute liuotetaan puskuriin b). Tuotteet puhdistetaan samalla puskurilla, joka on progressiivisesti rikastettu toista tyyppiä olevalla puskurilla, mutta joka sisältää 500 mmol natrium-15 kloridia litraa kohti, jotta saadaan eluointigradientti, jonka pH on 4 ja joka progressiivisesti sisältää 0-500 mmol natriumkloridia litraa kohti. lonivahvuuden progressiivinen muuntaminen tekee mahdolliseksi erottaa, konsentraation ollessa noin 250 mmol natriumkloridin litraa kohti, frak-20 tio, joka sisältää rikastetun lipaasiuutteen.

Käytettäessä "S Sepharose" tyyppistä pylvästä puhdistettava tuote liuotetaan puskuriin a) ja saostetaan pylvääseen. Eluointi tapahtuu samalla puskurilla ja sitten liuoksella, jossa on 20 mmol/litra natriumasetaattia ja 25 200 mmol/litra natriumkloridia, jolloin on mahdollista elu- oida lipaasifraktio rikastettuna halutulla uutteella.

Kun käytetään tätä puhdistusmenetelmää uutteeseen, joka saadaan menetelmällä a) ja poistamalla suola, on mahdollista saada fraktioita, jotka sisältävät rikastettua 30 lipaasiuutetta, jonka spesifinen aktiivisuus on välillä 100-500 yksikköä proteiinin milligrammaa kohti.

Näissä puhdistuksissa saadut vesifraktiot voidaan joko käyttää täydentävissä puhdistusmenetelmissä, jolloin saadaan lipaasia, tai ne voidaan puhdistaa suolasta dialyy-' 35 sillä tai ultrasuodatuksella, jäädyttää sen jälkeen ja lyofilisoida jo aikaisemmin kuvatuilla menetelmillä, 87232 20 jolloin saadaan rikastettua lipaasiuutetta amorfisessa kiinteässä muodossa.

Suodattamalla "molekyyliseula" tyyppisellä geelillä voidaan erottaa molekyylit niiden koon funktiona, siis 5 joko tilavuuden tai dimensioiden mukaan. Käytetyt liukenemattomat geelit muodostetaan erilaisista 3-dimensionaali-sista systeemeistä, joilla saadaan sopiva molekyylikoko.

Siten eri kokoisia molekyylejä sisältävästä seoksesta vain ne tuotteet, joilla on geelisysteemiin sopiva koko, 10 pidättyvät systeemiin, kun taas molekyylit, joilla on suurempi koko, eivät pidäty ja ne eluoituvat nopeasti. Geeliin jääneiden molekyylien pidätysaika vaihtelee myös niiden koon mukaan ja näiden tuotteiden eluoituminen tapahtuu verrannollisena siihen, siten että pienempiä molekyy-15 lejä pidätetään kauemmin.

Seuraavilla geeleillä on nämä erotusominaisuudet: - Sephadex G, muodostettu dekstraaneista, joissa sillat epikloorihydriinin kanssa, - Biogels P, ovat polyakryyliamidiketjuja, joissa on sillat 20 N,N 1-metyleenibisakryyliamidin kanssa, - Ultrogeelit ja Sephacryls, joissa yhdistetään sekoitettu polyakryyliamidi ja agaroosihila.

Esillä olevan keksinnön tuotteet käsitellään edullisesti Sephakryyli-tyyppisillä polyakryyliamidigeeleillä.

25 Ei-delipidoidut uutteet käsitellään seulalla, jonka poistoraja on suurempi kuin 1 000 000 daltonia.

Siten puhdistettavien tuotteiden vesiliuokset kaadetaan pylvääseen, jonka korkeus on noin 1 metri ja joka sisältää 1-7 litraa geeliä.

30 Tämän jälkeen eluointi suoritetaan pH-arvossa 6 ole valla liuoksella, jossa on 100-500 mmol natriumkloridia ja 10-30 mmol dinatriumfosfaattia. Eluaatti otetaan talteen fraktioina ja lipaasiaktiivisuus tutkitaan näistä fraktioista. Siten aktiivisuutta sisältävät fraktiot vapautetaan 35 suolasta dialyysillä tai ultrasuodatuksella, jonka jälkeen jäädytetään ja lyofilisoidaan, jotta saadaan etsittyjä rikastettuja lipaasiuutteita kiinteässä muodossa.

|i 2i 9723?

Delipidoidut lipaasiuutteet käsitellään seulalla, jonka avulla on mahdollista erottaa aineet, joiden mole-kyylipaino on välillä 30 000-50 000 daltonia ja erityisesti 45 000-55 000 daltonia. Siten puhdistettavien tuotteiden 5 vesiliuokset kaadetaan pylvääseen, jonka korkeus on noin 1 metri ja jossa on noin 400-500 ml geeliä.

Tämän jälkeen eluointi suoritetaan liuoksella, jonka pH-arvo on 6 ja joka sisältää 200 mmol/litra natrium-kloridia. Eluaatti otetaan talteen fraktioina ja lipaasi-10 aktiivisuus tutkitaan näistä fraktioista.

Tällä tavalla havaitut lipaasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot voidaan käyttää joko seuraavassa puhdistus-vaiheessa, jolloin saadaan lipaasia, tai siitä voidaan poistaa suola dialyysillä tai ultrasuodatuksella, jäädyttää ja 15 lyofilisoida, jolloin saadaan rikastettu lipaasiuute kiinteässä muodossa ja joka tietyissä tapauksissa voidaan de-lipidoida.

Keksinnön mukaista menetelmää on käytetty vasikoiden, lampaiden, sikojen, siipikarjan, kaniinien ja hevosten vat-20 soille. Kuitenkin yllättävästi ja toisin kuin esimerkiksi mitä havaitaan lähdettäessä liikkeelle sianvatsoista, on lipaasiaineilla ja lipaaseilla, jotka saadaan kaniinien ja hevosten vatsoista, suurin lipaasiaktiivisuus pH-arvolla 4-5 ja erityisesti 4,5, kun tämä arvo on sialla 6-7 ja siten se 25 ei ole kovin aktiivinen vatsan nesteissä.

Lisäksi on yllättäen havaittu, että toisin kuin sian vatsoista saaduissa uutteissa, säilyttivät kaniinin ja hevosen vatsauutteet lipaasiaktiivisuutensa happamassa väliaineessa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen. Kaksi tuntia kestä-30 neen 37°C:ssa ja pH-arvossa 2 tapahtuneen inkuboinnin jälkeen eivät nämä aktiivisuudet muuttuneet, kun taas samalla tavalla käsitellyt sikojen vatsat eivät kestäneet pH-arvoa alle 4.

Lisäksi hevosen ja sian vatsojen uutteiden aktiivi-35 suuksia on tutkittu pH-alueella 3-9. Kun pH-arvo oli välillä 3-7, oli uutteiden lipaasiaktiivisuus sama tai suurempi 22 87232 kuin 50 % niiden suurimmasta aktiivisuudesta, joka esiintyy noin pH-arvolla 4,5. Kokeiden suorittaminen esitetään seuraavassa selostuksessa.

Siten kaniinin ja hevosen vatsauutteiden lipaasien 5 merkittävä kestävyys happaman väliaineen aiheuttamaa denaturoitumista vastaan ja niiden laaja aktiivisuusalue tekevät niiden käytön oikeutetuksi lääkeainemuodossa lipaasi-aktiivisuuden lisääjinä erilaisissa ihmisten ja eläinten sairaalloisissa puutostiloissa.

10 Keksinnön mukaisesti saadaan lipaasia, jonka molekyyli- paino on Laemmlin menetelmän mukaisesti 49 000 daltonia, jossa 9 000 vastaa sokeria ja 40 000 proteiinia, aminohappo-tyyppien lukumäärän ollessa seuraavia: Asp. Asn : 45 : Thr : 19 : Ser : 28 : Glx : 30 : Pro : 29 : Gly : 25 : Ala : 28 : 15 Vai : 27 : Met : 8 : Ile : 18 : Leu : 26 : Tyr : 16 : Phe : 18 : Lys : 17 : His : 7 : Arg : 10 : Cys : 9 ja Trp : 6, jonka N-päätteinen osa on: Lys-Ser-Ala-Pro-Thr-Asn-Pro-G1u-Val-Asn-Met-X-Ile-Ser-Glu-Met-Ile-Ser-Tyr-Trp-Gly-Tyr-Pro-Ser-Glu-Lys-Tyr-Glu-Val-Val, jossa X tarkoittaa mää-20 rittämätöntä aminohappoa, jonka spesifinen lipaasiaktiivi-suus Gargouri-menetelmän mukaisesti on suurempi kuin 1 000 U/mg proteiinia, jonka suurin aktiivisuus havaitaan pH-arvolla noin 4,5, jonka aktiivisuus pH-arvoilla 3 ja 7 on vähintään puolet suurimmasta aktiivisuudesta ja jonka ak-25 tiivisuus säilyy 2 tunnin kestävän 37°C:ssa tapahtuvan inkuboinnin jälkeen pH-arvossa 2 ja jonka aminohappo, joka tarvitaan lipolyyttiseen aktiivisuuteen, on kysteiini, joka pystyy kestämään pepsiiniä ja jota huonontavat kymo-trypsiini ja trypsiini, joiden isoelektrinen pH on välillä 30 5,7 ja 7,1 ja joka voidaan valmistaa keksinnön mukaisella menetelmällä käyttäen kaniinin vatsanpohjukkaa.

Keksinnön mukaisesti saadaan myös lipaasia, jonka spesifinen lipaasiaktiivisuus Gargouri-menetelmän mukaisesti on suurempi kuin 1000 U/proteiinin mg ja jonka suurin aktiivi-35 suus havaitaan pH-arvolla noin 4,5 ja jonka aktiivisuus pH-arvoilla 3 ja 7 on vähintään yhtä suuri kuin puolet I· 87232 23 suurimmasta aktiivisuusarvosta ja jonka aktiivisuus säilyy inkuboitaessa 2 tuntia 37°C:ssa ja pH-arvossa 2 ja joka voidaan valmistaa keksinnön mukaisella menetelmällä hevosen vatsoista.

5 Lisäksi keksinnön mukaisesti voidaan valmistaa delipi- doituja tai ei-delipidoituja rikastettuja lipaasiuutteita valinnaisesti vesiliuoksena, jonka spesifinen lipaasiaktiivi-suus on Gargouri- menetelmän mukaisesti välillä 100 ja 1000 U/proteiini mg ja jonka suurin aktiivisuus havaitaan pH-arvolia 10 noin 4,5 ja jonka aktiivisuus pH-arvoilla 3 ja 7 on vähintään puolet suurimmasta aktiivisuudesta ja jonka aktiivisuus säilyy inkuboitaessa 2 tuntia 37°C:ssa ja pH-arvossa 2 ja joka voidaan valmistaa keksinnön mukaisella menetelmällä.

Keksinnön mukaisesti voidaan myös valmistaa delipidoi-15 tua tai ei-delipidoitua lipaasiuutetta, jolla on lipaasiaktii-visuus Gargouri-menetelmän mukaisesti välillä 1 ja 100 U/proteiini mg ja jonka suurin aktiivisuus havaitaan pH-arvolla noin 4,5 ja jonka aktiivisuus pH-arvoilla 3 ja 7 on vähintään yhtä suuri kuin puolet suurimmasta aktiivisuusarvosta ja jonka ak-20 tiivisuus säilyy inkuboitaessa 2 tuntia 37°C:ssa ja pH-arvossa 2 ja joka voidaan valmistaa keksinnön mukaisella menetelmällä.

Näitä pepsiiniä kestäviä uutteita huonontavat tryp-siinit ja niissä on kysteiiniä aminohappona, joka tarvi-25 taan lipolyyttistä aktiivisuutta varten.

Näillä tuotteilla on tyypillisesti ominaisuudet, jotka tavallisesti määritetään entsyymeille ja entsyymi-pitoisille uutteille, nimittäin: a - spesifinen aktiivisuus, 30 b - aktiivisuus pH:n funktiona, c - lipaasiaktiivisuuden kestävyys happamassa väliaineessa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen, d - näennäisen ominaispainon määrittäminen, e - aktiivisuus triglyseridejä vastaan, 35 f - isoelektrisen pH:n määrittäminen, g - lipolyyttiseen aktiivisuuteen tarvittavan oleellisen aminohapon läsnäolon määrittäminen, 24 8 7 2 3 2 h - proteaasien kestävyyden määrittäminen, i - sokerien läsnäolon määrittäminen.

Tämän jälkeen on koottu yhteen menetelmät näitä määrityksiä varten.

5 a. Spesifinen aktiivisuus määritetään entsymaat- tisen aktiivisuuden ja näytteessä olevien proteiinien milligrammoina esitetyn määrän suhteena. Lipaasiaktiivisuus määritetään titrimetrisesti Y. Gargouri-menetelmällä (Aix-Marseille University PhD thesis, 1985), jossa käytetty 10 substraatti on tributyriini. Annosteluun kuuluu lipaasin vaikutuksesta vapautuvan voihapon neutralointi 0,1N sooda-liuoksella vakiona pysyvässä pH-arvossa 6 ja lämpötilassa 37°C. Näissä koeolosuhteissa vastaa entsymaattinen aktiivisuus hapon mikromoolien lukumäärää, joka on vapautunut 15 yhdessä minuutissa tutkittavan tuotteen vaikutuksesta.

Käytännössä kokeessa johdetaan titrausastiaan, joka on lämpötilaltaan säädetty 37°C:seen, 0,50 ml tributyrii-niä ja 14,50 ml natriumtaurodesoksikolaattia ja karjasee-rumialbumiinin isotonista liuosta (koostumus: 100 mg karja-20 seerumialbumiinia, 2 mmol natriumtaurodesoksikolaattia, 9 % NaCl isotonista liuosta 1 litraan asti).

Sähkömagneettisella sekoittamisella tai sekoituksella ja käyttäen automaattista titraajaa säädetään liuoksen pH-arvo arvoon 6 lisäämällä 0,1 N soodaa. Kun pH sta-25 biloituu tähän arvoon, lisätään tarkasti mitattuna 0,5-1 ml annosteltavan entsymaattisen yhdisteen vesiliuosta. Näissä olosuhteissa on mahdollista laskea käyttäen 0,1 N sooda-liuoksen määrää, joka tarvitaan pitämään pH arvossa 6 2 minuuttia, lipaasiaktiivisuus kuten määritellään tässä edellä. 30 Proteiinit määritetään Folin Ciocalteu reagenssin läsnäollessa. Kun läsnä on kupri-ioneja emäksisessä väliaineessa ja kyseisen fosfo-molybdo-volframi(6) reagenssin läsnäollessa, muodostuu värillinen kompleksi, jonka intensiteetti on verrannollinen proteiinin määrään (Lowry et ai, 35 1951). Värjäytymistä verrataan standardialueeseen, joka on valmistettu tunnetuilla karjaseerumialbumiinimäärillä, 25 87232 joten näin voidaan määrittää tutkittavan näytteen proteiinipitoisuus .

b. Aktiivisuus pH:n funktiona määritetään pH-alueel-la 3-9 käyttäen liitososaa edellä esitetyssä annostelumene- 5 telmässä. Siten titrausliuos säädetään valittuun pH-arvoon tutkimista varten joko lisäämällä 0,1 N soodaliuosta tai lisäämällä 0,1 N kloorivetyhappoa. Lisätään entsymaattinen liuos ja pH pidetään tässä arvossa 2 tuntia.

Voihapon dissosiaatiovakio (pKa = 4,75) tekee mah-10 dolliseksi annostelun pH-arvolla 6, annostelut korjausteki-jän kanssa pH-arvoon 5 asti ja niin kutsutut "palautus"an-nostelut tämän pH-arvon alapuolelle.

c. Lipaasiaktiivisuuden säilymisen määrittäminen happamassa väliaineessa tapahtuneen inkuboinnin 15 jälkeen Tähän kokeeseen kuuluu lipaasiaktiivisuuden määrittäminen sen jälkeen, kun koetuotteelle on suoritettu korkeintaan 2 tunnin inkubointi 37°C:ssa vesiliuoksessa pH-arvoissa 3-9.

20 Tutkittavan entsymaattisen uutteen vesiliuoksen pH- arvoja säädetään eri arvoihin lisäämällä 0,1 N kloorivetyhappoa tai soodaliuosta. Nämä liuokset sijoitetaan hautee

seen, jonka lämpötila on termostoitu 37°C:een. Näytteitä otetaan 0, 30 minuutin, 1 tunnin ja 2 tunnin kuluttua ja 25 ne sisältävät tributyriiniä substraattina. Säädetään pH

nopeasti arvoon 6, jonka jälkeen lipaasiaktiivisuuden annostelu suoritetaan 2 minuutin aikana lisäten 0,1 N soodaliuosta, jotta pH-arvo pysyy arvossa 6. Näin saatua lipaa-siaktiivisuutta verrataan saman tuotteen vertailunäyttee-30 seen, jota ei ole inkuboitu ja joka on suoraan titrattu pHrssa 6 (siis näyte hetkellä t = 0), jolloin on mahdollista saada lipaasiaktiivisuus prosentteina inkuboinnin jälkeen koeolosuhteissa.

d. Näennäinen molekyylipaino määritetään elektrofo-35 reesilla Laemmlin menetelmän mukaisesti (Nature, 1970, 227, sivut 680-685), johon kuuluu näytteen käsitteleminen 26 8 7 2 3 2 natriumdodekyylisulfaatilla ja näytteen siirtyminen poly-akryyliamidigeeliin, jossa on peräkkäin 5 % geeliä ja 12,5 % geeliä (paino/til.). Identtisestä käsitellään proteiineja, joiden tunnetut molekyylipainot ovat välillä 5 14 000-94 000 daltöniä. Seuraavana proteiinit tehdään nä kyviksi Coomassie-sinisellä, määritetään näytteen näennäinen molekyylipaino vertaamalla sen siirtymistä vertailu-proteiinien siirtymiseen. Tämän menetelmän avulla on mahdollista havaita molekyylipainoja, jotka ovat 48 000 dal-10 töniä puhdistetulle lipaasille, joka on saatu lähtemällä kaniinin vatsoista (esimerkki 6).

e. Lipaasin tai lipaasiuutteiden aktiivisuudet on tutkittu 3 substraattityypille, nimittäin triglyserideille, joilla on lyhyt ketju: tributyriini (C^) ja keskipitkäket- 15 ju: LIPROCILE (CgC^) ja pitkä ketju: INTRALIPIDI, 30 % soijaöljy.

Käytännössä 2 yksikköä lisätään 0,5 ml tributyriini ä tai 0,5 ml:aan LIPROCILE:a tai 5 ml:aan 30 % INTRA-LIPIDI-liuosta ja 10 yksikköä lipaasiaktiivisuutta inku-20 boidaan 9 % NaCl-puskurissa, CaC^^n 150 nmol:ssa ja nauta-albumi iniseerumissa .

Aktiivisuuden tutkiminen pH:n funktiona osoittaa, että lipaasin aktiivisuus on suurimmillaan noin pH:ssa 5 tributyriinille, pH:ssa noin 6 LIPROCILE:lie ja pH:ssa 4 25 INTRALIPIDI:lie.

Lipaasituotteiden havaittu aktiivisuus määritetään pH:ssa 5 edellä luetelluille substraateille. LIPROCILE:lie ja INTRALIPIDI:lie havaitut aktiivisuudet ovat vastaavasti välillä 50-75 % ja 25-40 % tributyriinille havaitusta ak-30 tiivisuudesta.

f. Isoelektrisen pH-arvon määrittäminen

Proteiinit, jotka on sijoitettu sähkökenttään ja amfolyyttien muodostamaan pH-gradienttiin, siirtyvät kohti niiden isoelektristä pH:ta. Gradientti muodostuu 35 polyelektrolyyttien seoksesta, jonka molekyylipaino on 1 000 tai sen alle ja joka koostuu polykarboksyyli- ja

II

27 87232 polyaminoalifaattisista hapoista, joiden isoelektriset pisteet ovat välillä 2-11.

2-5^,ug lipaasiuutetta kaadetaan etukäteen valmistettuun horisontaaliseen geeliin ja proteiinit, joihin kohdis-5 tetaan sähkökenttä, saavat siirtyä noin 1 tunnin ajan.

Vyöhykkeiden esiintyminen tehdään näkyväksi hopeanitraatti-reagenssilla. Lipaasin pH on välillä 5,7-7,1. Useiden vyöhykkeiden esiintyminen tällä pH-kentällä aiheutuu proteiiniin sitoutuneiden sokeriketjujen heterogeenisyydestä.

10 g. Lipolyyttisessä aktiivisuudessa olevien oleellis ten aminohappojen määrittäminen Tässä kokeessa lisätään lipaasiin tai lipaasiuut-teeseen reagenssi, joka pystyy sulkemaan entsyymin aktiivisuuden. Käytetyt reagenssit ovat DNTB (5,51-ditiobis-2-15 nitrobentsoehappo) ja 4 PDS (4,4'-ditiopyridiini), jotka tietyissä olosuhteissa kiinnittyvät proteiinin vapaisiin sulfhydrisiin ryhmiin. Sitoutumisen seurauksena näistä rea-gensseista vapautuu seuraavat värilliset ryhmät: DNTB vapauttaa 5-tio-3-nitrobentsoehapon, joka voidaan mi-20 tata aallonpituudella 420 nm; 4 PDS vapauttaa 4-tiopyridoniryhmän, joka voidaan havaita ja jonka määrä voidaan määrittää aallonpituudella 324 nm.

Siten 1 millilitran spektrofotometrikyvetissä inku-boidaan tris HC1 0,25 mol puskurissa jonka pH on 8, hapan 25 lipaasi ja reagenssiylimäärä. Eri aikoina mitataan vapautuneen aineosan absorptio ja konsentraatio lasketaan molaa-risen ekstiktiokertoimen avulla: (E 1 , M = 13 600 aallonpituudella 420 nm) cm (E 1 , M = 19 800 aallonpituudella 324 nm) cm 30 samanaikaisesti otetaan näyte ja siten on mahdollista mitata jäljellä oleva lipolyyttinen aktiivisuus a-kohdassa esitetyllä menetelmällä. Puhdistetun lipaasin lipaasiaktii-: visuus estyy kokonaan näiden reagenssien vaikutuksesta.

Lisäksi laskujen avulla on mahdollista määrittää, että yk-35 si tietty vapaa sulfhydryyliryhmä ottaa osaa lipolyyttiseen aktiivisuuteen ja kyseinen ryhmä kuuluu aminohapolle kyste- 28 87232 iini. Lipaasiuutteet, jotka käsitellään samoissa olosuhteissa, estyvät samalla tavalla.

h. Proteaasien kestävyyden määrittäminen Tämä tutkimus suoritettiin sian pepsiinillä, joka 5 erittyy vatsassa, sian kymotrypsiinillä ja trypsiinillä, joita erittyy haiman vaikutuksesta pohjukaissuolessa.

Lipaasiuutteita ja lipaasia inkuboidaan 2 tuntia pHrssa 7,5 kymotrypsiinille ja trypsiinille ja pH:ssa 2 pepsiinille 37°C:ssa. Näytteitä otetaan säännöllisesti 15 10 minuutin välein ja jäljellä oleva lipaasiaktiivisuus määritetään kohdassa a. esitetyllä menetelmällä.

Siten 2 mg pepsiiniä sekoitetaan 3 mg lipaasia tai lipaasiuutetta puskurissa, jonka pH-arvo on 2. Samalla tavalla sekoitetaan 2 mg trypsiiniä tai kymotrypsiiniä 15 3 mg:aan lipaasia tai lipaasiuutteita, jonka pH-arvo on 7.

Vertailuna käytetty aktiivisuus määritettiin kohdassa c.

Pepsiiniä käytettäessä pysyy alkuperäinen aktiivisuus muuttumattomana 2 tuntia. Kahden tunnin lopussa pienenee aktiivisuus kymotrypsiinin läsnäollessa 50 %:lla ja 20 trypsiini tuhoaa lipaasin aktiivisuuden kokonaan 2 tunnissa.

i. Sokerien läsnäolon määrittäminen Tähän tutkimukseen kuuluu proteiiniin sitoutuneiden sokeriketjujen hydrolysointi spesifisellä endoglykosidaa-25 silla, ENDOF, entsyymillä, joka on liittynyt kahteen N-ase-tyyliglukosamiiniin.

Menetelmässä määritetään näennäinen molekyylipaino tuotteelle, joka on saatu tällä entsyymillä käsitellystä lipaasista. Hydrolyysin ja menetelmässä d. esitetyn mene-30 telmän mukaisen käsittelyn jälkeen esiintyy pääasiallinen intensiteettivyö, joka vastaa molekyylipainoa, joka on pienempi kuin alkuperäiselle entsyymille havaittu ja joka on noin 40 000 daltonia. Lisäksi aminohappokoostumus tekee mahdolliseksi määrittää kunkin aminohapon painon perusteel-35 la proteiinin painoksi noin 40 000 daltonia. Ero Laemmlin menetelmällä määritettyyn painoon on noin 9 000 daltonia ja vastaa entsyymin sokeriosaa.

23 87232

Puhdistettu lipaasi on tehnyt mahdolliseksi määrittää lipaasin biokemialliset ominaisuudet, nimittäin sen aminohappokoostumus ja N-päätteinen osa.

Aminohappokoostumus määritettiin proteiinin hydro-5 lyysin jälkeen, joka suoritettiin kloorivetyhapolla, 24, 38 ja 72 tunnin ajanhetkillä. Tämän jälkeen hydrolysaatit analysoitiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet D.H. Spackmann, W.H. Stein ja S. Moore (Anal. Chem., 1957, 228, s. 999) automaattisella aminohappoanalysaattorilla (Spinco-10 Beckman), analyyttiset tulokset käsiteltiin sitten menetelmällä, jonka on esittänyt M. Delaage, (Biochem. Biophys. Acta, 1968, 168, s. 573).

Kysteiinijäännökset määritetään performiaattihape-tuksella ja tryptofaanit hydrolyysillä merkaptoetaanisul-15 fonihapon läsnäollessa menetelmän mukaisesti, jonka ovat esittäneet B. Penke, R. Ferenzi ja K. Fouacs (Analytical Biochemistry, 1974, 60, sivut 45-50).

Erilaisten määritettyjen aminohappotyyppien lukumäärät olivat seuraavat: Asp. Asn-45; Thr-19; Ser-28; 20 Glx-30; Pro-29; Gly-25; Ala-28; Val-27; Met-8? Ile-18;

Leu-26; Tyr-16; Phe-18; Lys-17; His-7; Arg-10; Cys-9;

Trp-6.

Proteiinin N-päätteinen osa määritettiin menetelmän mukaisesti, jonka on esittänyt Fred.S. Esch (Anal. Bio-25 chem., 1984, 136, sivut 39-47). 30 aminohapon muodostama päätösosa on seuraava: Lys-Ser-Ala-Pro-Thr-Asn-Pro-Glu-Val-Asn-Met-X-Ile-Ser-Glu-Met-Ile-Ser-Tyr-Trp-Gly-Tyr-Pro-Ser-Glu-Lys-Tyr-Glu-Val-Val.

(X = määrittämätön).

30 Seuraavat esimerkit valaisevat kyseistä keksintöä.

30 87232

Esimerkki 1

Ei-delipidoituja lipaasiuutteitay jotka on valmistettu menetelmän A mukaisesti 2-3 kuukautta vanhojen kaniinien vatsoja kerätään 5 teurastamosta. Ylin kolmannes pohjukasta avataan ja sen sisältö tyhjennetään. Kudokset jäädytetään -20°C:seen ja paloitellaan sitten osiin, jotka ovat pienempiä kuin 2 cm.

Homogenointi ja uuttaminen happamassa väliaineessa menetelmän A mukaisesti 10 160 g paloiteltuja kudoksia lisätään 600 ml:aan kloorivetyhappoliuosta pH:ssa 2,5, lämpötilassa 10-12°C ja sisältäen 0,06 % p/p pepsiiniä. Homogenointi suoritetaan lämpötilassa, joka on lähellä 20°C sekoittaen seosta 45 minuuttia noin 900 kierrosta minuutissa käyttäen ruu-15 visekoitinta.

Liukenematon aine erotetaan sentrifugoimalla 500 kpm 30 minuuttia. Vaalean keltainen, pinnalla oleva happo-faasi erotetaan: - tilavuus: 540 ml 20 - spesifinen aktiivisuus: - kokonaisaktiivisuus: 175 000 yksikköä

Ammoniumsulfaattisaostus

Sekoittaen lämpötilassa 12°C lisätään hitaasti 147 g ammoniumsulfaattia happamaan liuokseen, joka on saa-25 tu edellä esitetyn menetelmän aikana. Lisäyksen jälkeen liuos jätetään 15 minuutiksi 15°C:seen. Suolakseen muutettu saostuma erotetaan sentrifugoimalla 3500 kpm 20 minuuttia.

Pohjalla oleva tuote, joka sisältää entsyymifrak-30 tion, liuotetaan 175 mlraan fosfaattipuskuria pH:ssa 6.

Näin saadaan vaalean keltainen, kirkas liuos, jossa on vähän mekaanisia epäpuhtauksia.

- tilavuus: 175 ml - spesifinen aktiivisuus: 35 - kokonaisaktiivisuus: 124 250 yksikköä 31 87232

Esimerkki 2

Ei-delipidoitu, rikastettu lipaasiuute, joka on valmistettu menetelmän B mukaisesti Edellä esitetty liuos suodatetaan suodattimilla, 5 joiden huokoisuus on 5^,un.

Näin saatu liuos puhdistetaan kromatografoimalla Sepharyl S 300 geelillä, jota toimittaa Pharmacia (korkeus 1 metri, tilavuus 7,5 litraa), eluoiden jo aikaisemmin esitetyllä puskurilla pH:ssa 6 ja virtausnopeudella 115 10 ml/h. Etsityn lipaasiaktiivisuuden havaitaan esiintyvän ensimmäiseksi kerätyissä fraktioissa. Nämä fraktiot otetaan talteen, jolloin saadaan homogeeninen fraktio.

- tilavuus: 830 ml - spesifinen lipaasiaktiivisuus: 15 - kokonaislipaasiaktiivisuus: 100 642 yksikköä Tämän konsentroidun, suolasta vapautetun liuoksen avulla on mahdollista saada 317 g vaalean keltaista, amorfista jauhetta ei-delipidoidusta uutteesta, jonka entsyymiaktiivisuus on 98 000 yksikköä ja spesifinen aktiivisuus 20 31 yksikköä jauheen mg kohti.

Erilaisten pH-arvojen aktiivisuus pH 3: 4 503 yksikköä pH 5: 8 750 yksikköä pH 7: 4 412 yksikköä 25 Happamien pH-arvojen kestävyys pH ajanhetkellä: 0 8 300 yksikköä : 2 tuntia 8 000 yksikköä Aktiivisuus triglyserideille, joilla on seuraavat ketjut: 30 lyhyt: 8 750 yksikköä keskipitkä: 6 829 yksikköä pitkä: 3 233 yksikköä

Aktiivisuuden estyminen kysteiinien spesifisillä reagensseilla 35 Lipaasiaktiivisuus estyy täysin pH:ssa 8 reagens- silla DNTB.

32 87232

Proteaasin vaikutus

Huonontuminen - nolla pepsiinillä, - 40-50 % kymotrypsiinillä, 5 - täydellinen estyminen trypsiinillä edellä esite tyissä olosuhteissa.

Lipiditaso

Esimerkki 3

Delipidoitu lipaasiuute, joka on valmistettu mene-10 telmän A mukaisesti a. Valmistaminen

Teurastamolta otetaan talteen syötävät sisälmysten osat kaniineilta, jotka ovat Janny-lajia tai maatiaisiajia ja joiden ikä on 2-3 kuukautta. Vatsat käsitellään poistaen 15 kaikki epäpuhtaudet kuten myös ruokatorven, suolen ja pernan osat.

Homogenointi, dehydraus ja delipidointi 225 g kudosta jauhetaan 5°C:ssa 2 250 ml:ssa asetonia liekin/räjähdyksen kestävässä astiassa 30 sekuntia 20 30 000 kpm. Liukenematon aine suodatetaan tyhjössä BUchner- suodattimella ja pestään 100 ml:11a kylmää asetonia. Liukenematon aine otetaan talteen ja menetelmä toistetaan samoissa olosuhteissa peräkkäin seuraavilla delipidointiliuot-timilla: asetonilla (3 kertaa), kloroformi (3 kertaa) ja 25 dietyylieetteri (3 kertaa).

Lopuksi jauhe kuivataan vakuumissa eksikkaattorissa vakiopainoon: paino 45 g.

b. Menetelmä A

Uuttaminen happamassa vesiliuoksessa 30 Delipidoitu jauhe lisätään 1 125 mitään kloorivety- liuosta, jonka pH on 2,5 ja joka etukäteen on jäähdytetty 5°C:seen. Seosta sekoitetaan 4°C:ssa 30 minuuttia ja sitten liukenematon fraktio erotetaan sentrifugoimalla 10 000 kpm 30 minuuttia. Vesifaasi erotetaan.

35 - tilavuus: 1 125 ml - spesifinen lipaasiaktiivisuus: 7 U/proteiini mg

- kokonaislipaasiaktiivisuus 75 000 U

il 33 87232

Aktiivisuus säilyi muuttumattomana sen jälkeen kun oli inkuboitu 2 tuntia 37°C:ssa ja pH:ssa 2.

Ammoniumsulfaattisaostus

Sekoittaen lämpötilassa 4°C lisätään vähitellen 5 352 g ammoniumsulfaattia happamaan liuokseen, joka saatiin edellisen menetelmän aikana. Lisäämisen jälkeen seos jätetään 30 minuutiksi samaan lämpötilaan ja sentrifugoidaan sitten 10 000 kpm 30 minuuttia.

Pinnalla oleva aine dekantoidaan ja sentrifugoin-10 nissa pohjalla oleva aine, joka sisältää entsyymifraktion, liuotetaan 300 ml:aan vettä. Liuoksen entsymaattiset ominaisuudet määritetään: - spesifinen lipaasiaktiivisuus: 73 U/proteiini mg

- kokonaislipaasiaktiivisuus: 37 500 U

15 Tämä liuos käytetään suoraan puhdistukseen menetel män B mukaisesti kuten esitetään esimerkissä 4, kun sille ensin suoritetaan seuraava käsittely. Liuoksessa oleva ammoniumsulfaatti poistetaan dialysoimalla 4°C:ssa ja siihen lisätään sekoittaen 15 litraa puskuriliuosta pH:ssa 4 (20 20 mmol/1 natriumasetaattia, 100 mmol/1 natriumkloridia ja etikkahappoa kunnes pH on 4). Tunnin kuluttua poistetaan puskuri ja menetelmä toistetaan kahdesti, siten että puskuri välillä uudistetaan. Lopuksi saadaan 300 ml lipaasi-aktiivista liuosta, josta ammoniumsulfaatti on poistettu.

. 25 Tämä liuos puhdistetaan kuten esitetään seuraavassa esimer kissä.

Esimerkki 4

Rikastettu lipaasiuute, joka on valmistettu menetelmän B mukaisesti: 30 Ioninvaihtokromatografia

Puhdistaminen suoritetaan Fast Flow Sepharose pylväällä (toimittaa Pharmacia), jossa on 60 ml geeliä ja jonka halkaisija on 26 mm.

Pylväs on tasapainoitettu pH 4:n puskurilla val-35 mäiksi käytettäväksi dialyysiä varten, virtausnopeudella 100 ml/h. Tämän jälkeen sisään lasketaan 300 ml liuosta ja 34 87232 eluointia jatketaan samoissa olosuhteissa pH 4:n liuoksella ja sen jälkeen toisella liuoksella, jossa on 20 mmol/1 natriumasetaattia ja 200 inmol/1 natriumkloridia pH-arvos-sa 6,5.

5 Eluoidaan 480 ml, jonka jälkeen otetaan talteen 40 ml eluaattia, joka sisältää lipaasiaktiivisuuden, jolla on seuraavat ominaisuudet: - spesifinen aktiivisuus: 350 U/proteiini mg

- kokonaislipaasiaktiivisuus: 28 000 U

10 Liuoksen avulla, joka on jäädytetty ja sitten lyo- filisoitu, on mahdollista saada 2,8 g rikastettua uutetta, jonka rikastettu lipaasiaktiivisuus on 10 000 U/g tuotetta.

Esimerkki 5

Lipaasiuute, joka on valmistettu menetelmällä A 15 a. Valmistus 50 g tuotetta, joka on identtistä esimerkin 2 tuotteen kanssa, homogenisoidaan ja dehydrataan ja osittain de-lipidoidaan asetonilla esimerkissä 2 annetun menetelmän mukaisesti. Jäännösvesi ja asetoni poistetaan vakuumissa 20 40 millibarissa ja 25°C:ssa, jonka jälkeen saadaan 10 g tuotetta, joka käsitellään menetelmän A mukaisesti.

b. Menetelmä A

Käytetään myös esimerkin 2 mukaisesti

Uuttaminen happamassa vesiliuoksessa 25 - havaittu tilavuus: 222 ml - spesifinen lipaasiaktiivisuus: 2,6 U/mg proteiinia

- kokonaislipaasiaktiivisuus: 8 850 U

Ammoniurosulfaattisaostus

Sentrifugoinnin jälkeen otetaan pohjalla oleva aine 30 19 ml:aan puskuriliuosta (150 mmol/1 natriumkloridia, pH

säädetty arvoon 3 etikkahapolla): - spesifinen lipaasiaktiivisuus: 17 U/mg proteiinia

- kokonaislipaasiaktiivisuus: 6 550 U

Liuos käytetään sellaisenaan esimerkissä 6 csite-35 tyssä menetelmässä.

35 87232

Esimerkki 6

Puhdas lipaasi, joka on valmistettu menetelmällä B Suodatus molekyyliseulalla

Edellisessä esimerkissä saatu liuos puhdistetaan 5 Sephacryl S 200 geeliliuoksella (toimittaa Pharmacia), jonka halkaisija on 26 cm ja korkeus 1 m, käyttäen eluoimi-seen puskuria, jonka pH on 3 ja joka on aikaisemmin esitetty, käyttäen virtausnopeutta 16 ml/h. 300 ml:n eluaatin jälkeen saadaan 50 ml:n liuos, joka sisältää puhdistetun 10 lipaasiaktiivisuuden: - spesifinen lipaasiaktiivisuus: 257 U/mg proteiinia

- kokonaislipaasiaktiivisuus: 4 550 U

Ioninvaihtokromatograf ia

Menetelmä suoritetaan käyttäen mono S Fast Flow 15 pylvästä (toimittaa Pharmacia) tilavuuden ollessa 0,98 ml.

Aikaisemmin saatu 50 ml:n liuos lisätään pylvääseen, suoritetaan eluointi nopeudella 1 ml/min käyttäen pH 4:n puskuriliuosta (20 mmol/litra natriumasetaattia, jossa on lineaarinen natriumkloridigradientti välillä 0-500 mmol/litra).

20 Lipaasi eluoidaan konsentraatiolla 250 mmol/litra natrium- kloridia tilavuuden ollessa 20 ml. Saadulla tuotteella on seuraavat ominaisuudet: - kokonaisproteiinipaino: 3,4 mg - spesifinen lipaasiaktiivisuus: 1 067 U/mg proteiinia

25 - kokonaislipaasiaktiivisuus: 3 630 U

- näennäinen molekyylipaino: 48 000 (Laemmlin menetelmä)

Aktiivisuus erilaisilla pH-arvoilla pH 3: 100 yksikköä .30 pH 5: 170 yksikköä pH 7: 85 yksikköä

Kestävyys happamia pH-arvoja vastaan pH 2 ajanhetkellä: 0 150 yksikköä 2 h 145 yksikköä 35 Molekyylipaino

Molekyylipainovyöhyke on 49 000:ssa.

87232 36

Aktiivisuus triglyserideille, joilla on seuraavat ketjut: lyhyt: 1 200 yksikköä keskipitkä: 760 yksikköä 5 pitkä: 300 yksikköä

Isoelektrisen pH:n määrittäminen 12 vyöhykettä välillä 5,7-7,1.

Aktiivisuuden estyminen kysteiinien spesifisillä reagensseilla 10 DNTB: estyminen 240 minuutissa ja yksi molekyyli DNTB:ta ehkäisee yhtä moolia lipaasia.

4PDS: estyminen 60 minuutissa ja yksi molekyyli 4PDS:aa estää yhtä moolia lipaasia.

Proteaasin vaikutus 15 Huonontuminen - nolla pepsiinillä - välillä 40-50 % kymotrypsiinillä - täydellinen estyminen trypsiinillä edellä esitetyissä menetelmäolosuhteissa.

20 Sokerien läsnäolon määrittäminen

Alkuperäisen elektroforeettiselle geelille lisätyn lipaasin molekyylipainovyö on 49 000. Kun inkuboidaan endo F:llä erilaisia aikoja, saadaan vyö, jonka intensiteetti kasvaa ajan mukana ja vastaten molekyylipainoa .25 40 000 daltonia.

Esimerkki 7

Lipaasiuute, joka on valmistettu menetelmän A mukaisesti

Valmistaminen suoritetaan käyttäen hevosen syötäviä 30 limakalvoja käyttäen suoraan menetelmää A.

Uuttaminen happamassa vesiliuoksessa 228 g syötäviä hevosen limakalvojen kappaleita pie-2 nennettyinä noin 1 cm kappaleisiin, lisätään 910 ml:aan vettä, joka on jäähdytetty 4°C:seen, seoksen pH säädetään 35 arvoon 2,5 +_ 0,1 lisäämällä 37 % konsentroitua kloorivety-happoa (p/til). Jauhetaan 4°C:ssa 30 000 kpm 30 sekuntia 37 87232 ja 2 minuutin väliajoin. Jauhettua ainetta sekoitetaan sähkömagneettisella sekoittimella 40 minuuttia ja sitten hap-poliuos erotetaan sentrifugoimalla 10 000 kpm 30 minuuttia. 892 ml happoliuosta sisältää lipaasiaktiivisia ai-5 neita määränä 15,5 spesifistä yksikköä liuoksen millilitraa kohti tai 0,74 spesifistä yksikköä proteiinin mg kohti. Kokonaisspesifinen lipaasiaktiivisuus 13 800 U.

Ammoniumsulfaattisaostus

Sekoittaen sähkömagneettisesti 4°C:ssa lisätään 10 500 g ammoniumsulfaattia edellä esitettyyn happoliuokseen.

Sekoittamista jatketaan 30 minuuttia tässä lämpötilassa ja sitten liukenematon aine erotetaan sentrifugoimalla 10 000 kpm 30 minuuttia. Pohjalla oleva aine otetaan talteen 50 ml:aan 9 % natriumkloridiliuosta ja seos sentrifu-15 goidaan jälleen samoissa olosuhteissa.

Pinnalla oleva aine sisältää rikastetun lipaasi-aktiivisuuden: - tilavuus: 51 ml

- spesifinen lipaasiaktiivisuus: 192 U/ml-5,6 U/mg proteiinia 20 - kokonaislipaasiaktiivisuus: 9 800 U

Tämä liuos voidaan käsitellä jo aikaisemmin esitetyn menetelmän mukaisesti, jolloin saadaan kiinteä tuote. Esimerkki 8 Käytetään kaniinin vatsoja kuten käytetään esimer-25 kissa 1. Ontelo (osa A) erotetaan pohjukasta (osa B). Pohjukka itse segmentoidaan neljään yhtä suureen osaan leikaten elimen leveyssuuntaan (B^, B2, B^/ B^ luokiteltuna ontelosta) . Nämä erilaiset kudokset käsitellään samoin kuin esimerkissä 1. Kussakin happouutteessa havaitut lipaasi-30 aktiivisuudet määritetään Gargouri-menetelmällä ja näin saadaan seuraavat tulokset: A = 0 B1 =0 B2 = o 35 B3 = 0 =6 000 yksikköä 38 8 7 2 3 2

Lipaasiaktiivisuus sijaitsee pohjukan ylimmässä osassa.

Eläinten myrkyttömyyden takia on keksinnön tuotteilla edullisia vaikutuksia ihmisen ruoansulatuksen sairaal-5 loisiin tiloihin.

Myrky11isyystutkimus suoritettiin 7-8 viikkoa vanhoilla Wistar-rotilla, joille suun kautta annosteltiin vesiliuosta, joka oli kyllästetty lipaasiuutteella, jota oli saatu kaniinien vatsoista, määränä 1 ml, jossa on 50 10 lipaasiyksikköä eläimen 100 g:n painoa kohti ja tätä annostelua jatkettiin 4 viikkoa.

Käsittelyn lopuksi suoritettiin seuraavat OCDE:n suosittamat tutkimukset: elävän eläimen hematologiset tutkimukset, biokemialliset tutkimukset, veri- ja virtsatut-15 kimukset ja kuolleelle eläimelle kudospatologiset tutki mukset.

Verrattuina käsittelemättömiin vertailueläimiin, ei havaittu mitään poikkeamia eläimillä, jotka olivat saaneet lipaasiuutetta. Nämä tutkimukset ja eläinten täydelli-20 nen sietokyky hoidon aikana osoittavat, ettei tuote ole myrkyllinen tai haitallinen.

Tutkittiin myös keksinnön mukaisten tuotteiden tehokkuutta ihmisen ruoansulatustaudeissa joko yksin tai liittyneinä muihin entsyymeihin.

25 Tuotteita annetaan joko jauheena tai kapseleina määränä 300-6000 lipaasiyksikköä päivässä potilaan tilan mukaisesti potilaille, joiden iät olivat välillä 18-75 vuotta ja jotka kärsivät alkoholiperäisestä kroonisesta haimatulehduksesta. Potilaat, joilla ennen hoitoa oli 30 rasvaripuli, joka oli yhtä suuri tai suurempi kuin 10g/ 24 tuntia, saivat tuotteet aterioiden aikana tai sekoitettuna ruokaan 6 kuukauden aikana.

Useimmissa tapauksissa havaittiin rasvaripulin vähenemistä ja vastaava vaikutus ulosteiden tiheydessä ja 35 painossa. Samalla tavalla vähenivät epämiellyttävät oireet kuten vatsakivut ja turpoaminen. Vastaavasti havaittiin I: 39 87232 painon lisääntymistä. Intoleranssia ei havaittu tämän tutkimuksen aikana, ja se tuo esille tutkittavien tuotteiden tehokkuutta ja tilanne oli sama myös verrattaessa muihin entsyymeihin kuten pankreatiineihin, joilla ei saavutettu 5 tällaista merkittävää parantavaa vaikutusta potilaiden yleistilassa.

Lisäksi pieniä lapsia, jotka kärsivät sitkeälimais-eritetaudista ja joiden rasvanabsorptiokerroin oli alle 90 %, käsiteltiin 14 päivää tuotteella annosten ollessa 10 verrattavissa edellä esitettyyn kokeeseen. Tämän tutkimuksen aikana ulosteiden lipiditaso, niiden paino ja päivittäinen lukumäärä mitattiin ja arvioitiin kipuja ja vatsan turpoamista. Havaittiin merkittävää paranemista rasvaripu-lissa ja yleisessä tilassa. Jälleen olivat keksinnön mu-15 kaiset tuotteet tehokkaampia kuin pankreatiini.

Keksinnön tuotteita annosteltiin lääkeaineen muodossa, niiden muodon vaihdellessa hoidettavan sairauden luonteen ja vakavuuden mukaisesti. Siten käytettiin tabletteja, gelatiinipäällysteisiä pillereitä, pehmeitä kapse-20 leita, rakeita, mikrorakeita tai osittain nestemäisiä muotoja kuten siirappeja, suspensioita ja geelejä.

Lipaasiuutteita voidaan lisätä erilaisiin aineisiin, joiden aktiivisuus liittyy oireisiin, jotka liittyvät huonon absorption oireistoon. Siten on mahdollista käyttää 25 ruoansulatusta suojaavia aineita, vatsahaavaa vastustavia aineita, närästystä vastustavia aineita ja muita ruoansulatuksessa aktiivisia entsyymejä.

Edellä esitetyt lääkeaineiden muodot valmistetaan tavallisten menetelmien mukaisesti ja käyttäen farmaseutti-30 sessa käytännössä tavallisesti käytettyjä lisäaineita kuten neutraaleja aineita, joiden avulla voidaan sopivasti laimentaa aktiiviset aineosat, kuten laktoosi, sakkaroosi, sorbitoli, mannitoli, tärkkelys, selluloosa tai suolat kuten fosfaatit. Voidaan käyttää myös hajottavia, sitovia 35 tai liukastavia aineita. Valinnaisesti voivat valmistetut muodot olla sokerilla päällystettyjä tabletteja tai ne 40 87232 voidaan päällystää vesiliukoisella kalvolla. Näiden päällysteiden tehtävänä on peittää valmisteen mahdollinen epämiellyttävä maku.

Edellä esitetyissä nestemuodoissa, jotka ovat eri-5 tyisen käyttökelpoisia lapsilla ja vanhuksilla, sisältävät edullisesti makuaineita ja väriaineita, jotta niille saadaan miellyttävät organoleptiset ominaisuudet.

Erilaisten valmisteiden stabiilisuus voidaan varmistaa lisäämällä antioksidantteja tai säilöntäaineita 10 kuten tokoferoli, askorbiinihappo, sorbiinihappo, sen suolat, jne.

Seuraavat tabletit ja jauheet esitetään, jotta voitaisiin paremmin kuvailla lääkeaineita, jotka sisältävät keksinnön tuotteita.

15 Tabletit

Muoto, jossa yhteen 180 mg tablettiin on lisätty 1000 lipaasiyksikköä.

Esimerkin 3 tuote, jossa on 73 U/mg proteiinia. Määrä, joka riittää 1000 yksiköksi, siis 100 mg: 20 - maissitärkkelys 22 mg - dikalsiumfosfaatti 30 mg - mikrokiteinen selluloosa 15 mg - piidioksidi 12 mg - magnesiumstearaatti 1 mg 2 5 Valmist aminen

Lukuunottamatta magnesiumstearaattia sekoitetaan tabletit huolellisesti, tuote puristetaan yhteen ja kalibroidaan sitten seulan läpi, jonka mesh-koko en 1 mm.

Saadut rakeet voidellaan lisäämällä magnesiumstearaattia 30 ja puristetaan sitten pyörivällä koneella 180 mg käsittäviksi yksiköiksi.

Jauhe

Muoto 1 g:n jauheelle, johon on lisätty 400 lipaasiyksikköä grammaa kohti.

35 Tuote esimerkistä 5, jossa on 17 U/mg proteiinia: t 41 87232 - 400 yksikköön riittävä määrä siis 0,8215 g - askorbiinihappo 0,0025 g - laktoosi 0,0760 g - luonnon appelsiiniaromi jauheena 0,1000 g 5 Valmistaminen

Aineosat lisätään peräkkäin sopivaan ruostumattomasta teräksestä valmistettuun sekoittimeen. Homogenoidaan ja sitten seos jaetaan ruskeisiin lasipulloihin, jotka suljetaan hermeettisesti.

10 Lääkeaine sisältää siten 56-82 p-% aktiivista aineosaa ja 44-18 p-% lisäainetta.

Kuten tässä on esitetty, on keksinnön mukaisten tuotteiden myrkyllisyys merkityksetöntä, joten on mahdollista erityisen tapauksen vaikeuden takia annostella 300 15 yksiköstä alkaen enemmän kuin 6000 yksikköä lipaasia päivässä.

Tämä annoksen suuruus riippuu potilaan iästä ja yleisemmin päivittäinen annos on 600-4000 lipaasiyksikköä, jotka tavallisesti annostellaan kolme kertaa päivittäin 20 ruokien yhteydessä.

Farmaseuttiset koostumukset, jotka sisältävät keksinnön mukaisesti valmistettuja tuotteita sopivat erityi sesti hoidettaessa häiriötiloja, jotka liittyvät rasva-aineiden huonoon absorbtioon, erityisesti eri tyyppisissä haima-• 25 tulehduksissa kuten alkoholiperäisessä, perinnöllisessä, hyperkalsemiassa liikakalsiumverisyyden aiheuttamassa tai ··. trooppisessa haimatulehduksessa.

Niitä käytetään tavallisesti parannusvaiheena leikkauksen jälkeen kuten vatsanpoistossa ja haiman täydelli-30 sessä poistamisessa, joka voi johtaa rasvaripuliin.

Ne soveltuvat myös sitkeälimaiseritesairauteen ja lipaasiin, kolipaasiin ja suolen liikkeen vajavuuteen.

' Näihin sairauksiin liittyviä oireita ovat tavalli sesti rasvaripuli, ripuli, vatsakivut ja vajaaravitsemus-35 tilat. Nämä oireet vähenevät hoidettaessa keksinnön mukai- 42 87232 sesti valmistetuilla tuotteilla käyttäen sopivia annoksia ja annosteltuna riittävän kauan.

Yleisesti kyseiset koostumukset ovat käyttökelpoisia ja suositeltavia liittyneinä ruoansulatuksen rasva-aineiden 5 assimiloitumiseen. Lisäksi näitä tuotteita voidaan antaa tavallisille ihmisille säätelemään ja/tai täydentämään rasvahappojen luonnollista assimiloitumista ja siten säätämään ja/tai lisäämään henkilöiden energian tarpeita.

Claims (8)

1. Menetelmä lipaasiuutteiden tai lipaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 a) lipaasiuutteen saamiseksi saatetaan täysikas vuisen hevosen tai kaniinin mahanpohjukoita kosketukseen happaman vesiväliainen kanssa, jonka pH on 1,5-5, määränä 10 tilavuusosaa hapanta väliainetta 1 pohjukan paino-osaa kohti lämpötilassa 4-30 °C 1 minuutista 15 tuntiin kestä-10 väksi ajaksi, jolloin saadaan kiinteitä aineita ja vesipitoinen liuos, joka sisältää lipaasiosan, erotetaan vesipitoinen liuos kiinteistä aineista, jolloin saadaan erillinen vesipitoinen liuos, lisätään erilliseen vesipitoiseen liuokseen sopiva 15 määrä vesiliukoista suolaa ja annetaan olla siinä sopiva aika, jotta halutusta lipaasiuutteesta muodostuu suola ja jotta saadaan pinnalla oleva liuos, ja erotetaan haluttu lipaasiuute pinnalla olevasta liuoksesta ja otetaan se talteen; 20 b) suolasta vapautetun lipaasiuutteen saamiseksi liuotetaan lipaasiuute vesipitoiseen faasiin, suodatetaan vesipitoinen faasi käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan suolasta vapautetun lipaasiuutteen liuos, ja 25 lyofilisoidaan suolasta vapautettu lipaasiuute- liuos suolasta vapautetuksi lipaasiuutteeksi; c) delipidoidun lipaasiuutteen saamiseksi suoritetaan delipidointitoimenpide jollekin kiinteistä osista, jotka sisältävät lipaasiuutteen, joka on 30 saatu mahanpohjukasta, lipaasiuutteelle ja suolasta vapautetulle lipaasiuutteelle; d) ei-delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen saamiseksi, liuotetaan lipaasiuute puskuriin, jonka pH on 35 2-7, jolloin saadaan puskuroitu liuos, 44 8 7 2 S 2 kromatografoidaan puskuroitu liuos, jonka pH on 2-7, käyttäen molekyyliseulaa, jonka raja-arvo ylittää 1 000 000 daltonia, ja otetaan talteen poistettu lipaasi-fraktio, joka sisältää ei-delipidoidun, rikastetun lipaa-5 siuutteen puskuroidussa liuoksessa, suodatetaan poistettu eluointifraktio käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 10 000 daltonia, jolloin saadaan suolasta vapautettu fraktio, ja lyofilisoidaan tämä suolasta vapautettu fraktio 10 halutuksi, ei-delipidoiduksi, rikastetuksi lipaasiuut- teeksi; e) delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen saamiseksi, e)l liuotetaan lipaasiuute veteen, jolloin saadaan 15 vesipitoinen liuos, joka sisältää lipaasiuutteen, suodatetaan vesipitoinen liuos, joka sisältää lipaasiuutteen, käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan liuos, joka ei sisällä suolaa, 20 adsorboidaan suolaa sisältämätön liuos ioninvaih- tokantajalle, desorboidaan kantaja eluointiaineella, jonka ioni-vahvuus kasvaa progressiivisesti ajan funktiona, otetaan talteen eluointifraktio, jolla on lipaasi-25 aktiivisuutta ja joka sisältää delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen, suodatetaan eluointifraktio, jolla on lipaasiak-tiivisuutta, käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan suolasta vapautettu 30 eluointifraktio ja lyofilisoidaan eluointifraktio halutuksi, delipi-doiduksi, rikastetuksi lipaasiuutteeksi tai e)2 kromatografoidaan puskuroitu liuos, jonka pH on 2-7 ja joka on saatu kohdassa d), käyttäen molekyyli-35 seulaa, 45 87232 otetaan talteen pidätetty eluointifraktio, joka vastaa molekyylipainoja 30 000-55 000 daltonia ja joka sisältää delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen, suodatetaan pidätetty eluointifraktio, joka vastaa 5 molekyylipainoja 30 000-55 000 ja joka sisältää rikastetun lipaasiuutteen, käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan suolatonta, deli-pidoitua, rikastettua lipaasiuuteliuosta, ja lyofilisoidaan suolasta vapautettu, delipidoitu, 10 rikastettu lipaasiuute; f) lipaasin saamiseksi f)l käyttäen perustana eluointifraktiota, jolla on lipaasiaktiivisuutta ja joka sisältää delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen, joka on saatu edellä kohdassa 15 e)l, kromatografoidaan käyttäen molekyyliseulaa, otetaan talteen pidätetty eluointifraktio, joka vastaa molekyylipainoja 45 000-50 000 daltonia ja joka sisältää lipaasin, 20 suodatetaan kyseinen eluointifraktio, joka sisäl tää lipaasin, käyttäen kalvoa, jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan suolasta vapautettu liuos, joka sisältää lipaasin, ja lyofilisoidaan suolasta vapautettu liuos, joka si-25 sältää lipaasin, tai f)2 käyttäen perustana pidätettyä eluointifraktiota, joka vastaa molekyylipainoja 30 000-55 000 daltonia ja joka sisältää delipidoidun, rikastetun lipaasiuutteen, joka on saatu edellä kohdassa e)2, 30 adsorboidaan se ioninvaihtokantajalle, desorboidaan kantaja eluointiaineella, jonka ioni-väkevyys kasvaa progressiivisesti ajan funktiona, otetaan talteen eluointifraktio, jolla on lipaasiaktiivisuutta ja joka sisältää lipaasin, 35 suodatetaan eluointifraktio, jolla on lipaasiak tiivisuutta ja joka sisältää lipaasin, käyttäen kalvoa, 46 87232 jonka läpäisyraja on 5 000-10 000 daltonia, jolloin saadaan suolasta vapautettu eluointifraktio, joka sisältää lipaasin, ja lyofilisoidaan suolasta vapautettu eluointifrak-5 tio, joka sisältää lipaasin, jolloin saadaan haluttu lipeäsi .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdassa a) kosketus vesivä-liaineen kanssa suoritetaan lämpötilassa 4-20 °C.

3. Patenttivaatimusten 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen liuos erotetaan kiinteistä aineista suodattamalla, dekantoimalla tai sen-trifugoimalla lämpötilassa, joka on alle 25 °C ja edullisesti 4-20 °C.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että lisätään 80-700g vesiliukoisia suoloja ja että ne jätetään 15 minuutista 20 tuntiin lämpötilaan 0-20 °C.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että suolat ovat magnesium-, kalium-, natrium- ja edullisesti ammoniumsuoloja ja moniarvoisia anioneja, erityisesti fosfaatteja ja sulfaatteja.

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että delipidointi- 25 toimenpide suoritetaan saattamalla kiinteät osat kosketukseen liuottimien kanssa, jotka pystyvät liuottamaan rasva-aineita, kuten hiilivetyjen, eettereiden, ketonien, alkoholien tai hiilihalogenidien kanssa, joiden kiehumispiste on alle 80 °C.

7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että adsorptiot ioninvaihtokantajalle suoritetaan käyttämällä kationin-vaihtokantaj aa.

8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai- 35 nen menetelmä, tunnettu siitä, että ennen pohju- I: 47 8723? koiden saattamista kosketukseen happaman vesiväliaineen kanssa ne paloitellaan alle 1 cm:n kokoisiksi kappaleiksi . 48 8 7 2 3 7