CZ318598A3 - Lék pro optimizování mukosální viskozity a stimulování střevních funkcí - Google Patents

Description

1>V/ ·· »| ·· ·· ·· • ft « · · ·♦ · · ·· • · · • · « · » · · «♦# « «····* · · · ··4 PV 3185-98 • · · · · * · 4« M ·· ···* ··

Lek pro optimizování inukosální viskozity a stimulování střevních funkcí

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti biologie a zvláště pak therapeutic-ké chemie. Týká se farmaceutických a/nebo dietních přípravků, založených na enzymu nebo na enzymových komplexech, obsahujících takový enzym, který může přispět k prevenci a/nebo léčení onemocnění.

Dosavadní stav techniky WO-A-8707905 popisuje způsob přípravy proteolytického komplexu, extrahovaného z S.fradiae, lépe jeho kulruty a obsahujícího v podstatě tři proteasy (typ II, III a IV) s molekulárními hmotnostmi 18, 14 a 16,5 kDa a isometrickým bodem kolem 9,0 (viz nárok 1 a str.5). Proteasový typ II má dominantní pro tedyfickou účinnost (viz str.4, posl.odst.). Tento komplex při použití jako dietní kompozice stimuluje exokriní účinnost pankreasu. Podává se orálně živočichům v dávkách 40 až 160 UA na gram potravy, to ve formě prášku, který může také obsahovat další inertní složky (viz str. 8 a 9, ř.10 až 13).

Takže předmětná podstata nároku 1 se může pokládat za prvé za prvou therapeutickou indikaci a), a a za druhé za dietní kompozici b).

Uvedený spis, pokládaný za nej bližší z disavadního stavu, popisuje použití dietní kompozice, jak je definována v nároku 1 nebo 2, jako dietní kompozice stimulující exokriní účinnost pankreasu. Avšak není zde vůbec úvaha o tom, že by taková kompozice mohla být účinnou při léčení pankreatických nesnází nebo jiných potíží, jak jsou uvedeny v nárocích 3 až 7. V důsledku toho podstata těchto nárfcků zahrnuje vynálezeckou Činnost. _2- ·· ♦ · ·· ···« • · · ··* » · β • ·· ··

Podstata vynálezu

Vynález se zvláště pak týká farmaceutických přípravků, založených na enzymu nebo na enzymovém komplexu ε obsahem takového enzymu, který stimuluje funkci střev a tím přispívá k prevenci a/nebo léčbě degenerativních onemocnění, spojených s problémem stárnutí.

Specificky se pak vynález týká farmaceutických přípravků, obsahujících jako účinno složku jeden či více enzymů, extrahovaných nebo obsažených v enzymovém komplexu, získaném z kultury Streptomyces fradiae za podmínek, jak jsou uvedeny ve Pranc.pat.spise 2 600 340 se jménem přihlašovatele. Výšeuvedený patentový spis popisuje přípravu a použití v zooteohnologii nového proteálytichého enzymu, získaného z vláknitá bakterie Streptomyces fradiae; v dalším textu je tento komplex nadále označován běžným obchodním názvem PAlíSTIMASE.

Vláknitá bakterie může produkovat současně nejméně 5 proteinás a 2 peptidasy; těchto 7 enzymů popsal K.Morihara a spol.,, Blochem.Bioph:/s.Aota 139. 382 (1967). Pokud se společně přidají do potravin, konzumovaných zvířaty, pak těchto 7 enzymů způsobí nadměrné snížení viskožity střevního slizu 8 mohou zav^init vznik vředů na střevní stene. Těchto 7 anzymů má tedy nežádoucí účinek v zooteohnologii, pokud se použijí spole čně,

Za podmínek, uvedených ve výše uvedeném patentovém spise, se získá PAITSTIMASE, kterou tvoří pouze 3 exocelulární proteinasy s velkým přebytkem jedné z nich a s vyloučením ondocelulárních proteinás a peptidás. Pokud se přidá do potrav^» konzumované zvířaty, způsobí PAIíSTIMASE mírnou redukci viskosity střevního slizu s neschopností napadnout stěnu střevního traktu.

Současné pak IvAKoTIL-IASE, jež se vyznačuje poměrně zmírněným působením na proteiny střevního slizu, má podstatně větší ucrnelc na proteiny surového materiálu, použitého v kompozicích krmivá, což vylepšuje jeho stravitelnost. -3- « · » 9 • · Dále pak navíc k tomuto bezprostřednímu účinku na střevní trakz se vyznačuje PAESTIMSE na přímým působením na růzzéé orgány, zvlaste pak pankreas; jak to již bylo uvedeno v předchozím pat.spise, bylo nalezeno, že způsobuje zvýšení koncentrace enzymů měno pro enzymů v tomto orgánu o 50 až 80;á. S přihlédnutím k tomuto příznivému působení se nyní používá PAIISTII.IASB jako z-ivná přísada do potravy pro zvířata s úmyslem zlepšit jejich růst nebo produktivitu. Bylo též zjištěno, že zvyšuje resistenci z vířat proti infekcím, bakteriálním či virovým onemocněním a že redukuje některé nepříjemné a nežádoucí účinky v9 spojitosti se stárnutím.

Tato zjištění vedla ’K názoru, že lze použít PAUSTIMASE v léčivech, jak pro zvířata tak pro lidi, jakož i aktivního podkladu, na kterém je zaležena, tedy to znamená využití převazující exocelulární proteinasy, produkované Streptomyces fradiae nebo směsi teto převažující exocelulární proteinas^ a nejmene jeanou ci dalšími dvěma exocelulárními proteinasami, produkovanými ve Streptomyces fradiae.

Aktivní složky farmaceutických přípravků vyžadují další čistění, pokud se týká produktu, použitého pro zvířata. Za podmínek, jak jsou uvedeny v předchozím pat.spise, se získá večistena PAríSTIMASE, jejíž titr je nejméně rovný 2 000 A.U./rag.

Ansonova jednotka (Anson Unit, zkráceno A.U.) je zde definována jako množství enzymu, jež při inkubování 10 minut za teploty 25° C a hodnoty pH 7,5 za přítomnosti denaturovaného hemoglobinu uvolňuje z tohoto substrátu 1 meg tyrosinu za stanovování spektrofotometrickou absorpcí při 280 nm filtrátu,

Iterý se nesráží kyselinou trichloroctovou. Různé úpravy podmínek, jak to konečně bylo popsáno v předchozím patentovém spise,, dovoluji získat polo-vyČištěnou FAKSTII/IASE, jejíž titr odpovídá nejméně 4 000 A-*U.(mg. Běžné postupy frakční precipitace nebo průchod kolonou dovolují izolování každího ze 3 proteinů, ze kterého se PASTUTASE skládá. Specifická aktivita převažující exocelulární proteinasy je vyšší než 100 000 A.U.jftng, podstatně vyšší ve srovnání s hodnotami dalších dvou proteinas, mol.hmotnost odpovídá asi -4- • · ·* I * · « I · Μ • · · · < • · · Μ 32 kDA, izoelektrický bod asi 7,0,

Samotná tato převažující proteinasa vysvětluje hlavní fyziologické vlastnosti PANSTIMASY, zvláště pak se zřetelem na skutečnost, že se samotné vyznačuje charakteristickým působením na dva důležitá proteiny: cholerový toxin ε kolla-gen.

Cholerový toxin je homolog IT-toxinu, produkovaného některými pathogenními bacily coli; skládá se z pod jednotky A, jež je agresivní a podjeclnotky B, jež je imuno stimulu jící. 2a nízkých koncentrací ve srovnání s oněmi, jež stávají ve v střevním traktu zvířat, přijímajících doplňkovou potravu s PAíTSTIMASE, převažující proteninasa selektivně poničí pod jednotky A, aniž by zničila pod jednotky B, které si tak poclržují svoji kapacitu stimulovat imunitní systém.

Kollagen je převažující protein v oblasti zvířat, totiž Savců, četné typy kolagenu představují asi třetinu veškerých proteinů. Je známo, že rozpustnost muskulárního kollagenu v hork= vodě je vysoká, pokud jsou původci této látky mladá zvířata a nízká, získá-li se ze starších jedinců.

Pokud se na kollagen ze starších zvířat působí převažující proteinasou, pak její rozpustnost v horké vodě se tím zvýší a je srovnatelná s rozpustností látky ze zvířat mladých. Lze tedy předpokládá ty. že tato proteinasa způsobuje určité "omlazení" kollagenu. Většina výsledků, získaných na zvířatech, odpovídá testům, provedeným a nečištěnou nebo poločistěnou PAITSTEviA, SE. Pro lidi v je možno použít bud poločistěnou PAISTIMASE nebo čištěnou pro-teinasu či Čištěné proteinosy, kt:;ré ji obsahují. Znamená to tedy převažující exocelulární proteinasu nebo směs této převažující exocelulární proteinasy s nejméně jednou či dalšími dvěma exocelulárnimi proteinasami, nebo s proteinasou či pro-teinasami, jejichž sekvence aminokyselin odpovídají nejméně 60/í holomogir aminokyselin převažující extracelulární proteinasy nebo směsi proteinas, jak zde byly výše definovány. -5“ -5“ ·· *· * · · · • · · • · · ·· ··* t «· *· Μ • · · · · · • · · * · · • * · ·Ι· · ♦ • · · · · * «€ ·· ··

Vynález se rovněž týká farmaceutických a/nebo dietních přípravků, obsahujících jako účinnou složku převažující exo-celulární proteinasu, produkovanou v kultuře Streptomyces frs-diae, jež jse vyznačuje specifickou účinností nad 100 000 A.li./mg, mol.hmotnost kolísá od 30 do 36 kDa, s výhodou pak činí asi 32 kDa, izoelektrický bod odpovídá asi 7,0 s tím, že tato složka je schopná selektivně poničit pod jednotku A cholerového toxinu, aniž by zničila podjsdnotku B, jakož i směsí nebo kombinací s inertním, netoxickým, fyziologicky přijatelným nosičem či čxcipiens.

Vynález se rovněž týká farmaceutických a/nebo dietních přípravků, obsahujících jako účinnou složku převažující exo-celulární proteinasu, jak zde byla definována, nebo směs této pševsřující exocelulární proteinasy s nejméně jednou ze dvou dalších exooelulárních proteinas, produkovaných v kultuře Streptomyces fr0diae, nebo proteinasu či proteinasy, ve kterých sekvence aminokyselin odpovídá nejméně 605¾ hoaologie ve srovnání s homologií převažující exocelulární proteinasy nebo oněmi se směsi proteinas, jak zde byly výše popsány, to jako směs nebo kombinace s inertním, netoxickým, fyziologicky vhodným nosičem či excipienso Homologní proteinasy lze extrahovat z kultur různých mokroorgsnismů, zvláště pak za použití Streptomyces fradiae nebo Streptomyces griseuš. Účinná látka se podává orálně, plicne nebo cestou genitálií v dávkách mezi 5 000 až 100 000 A-*U, K tomuto účelu se účinná složka, nebo směs či kombinace s běžnými:*.' excipientii upraví do formy farmaceutického přípravku, vhodného typu pro podávánío Účinná látka může být přítomná v některé formě, běžné v oblasti farmakotechnologia, jako jsou tablaty, případně s krycí vrstvou, želatinové kapsle, kapsle vůbec, prášky, roztoky nebo suspenze, suché aerosoly, kuličky či vaginální tablety.

Podávání: jednou až třikrát denně, to v závislosti na therapeuticfeých požadavcích. Výsledky, jak byly získány na zvířatech, mají zřejmě stejn&u příčinu: zásadní účinek PATíSTIMASE ve střevním traktu. -6- -6- l ·· ·· · · • · · • « · • f * ·«· «· ♦ A ·· Μ» • ·

• I 1« • » I · • · · • · * · • * * ·· ·* %· íBůsobení může mít různé aspekty, což se popisuje zde dále o

Farmakologieké studium farmaceutických přípravků dle tohoto vynálezu; působení PAB3TIMASE ns střevní trakt, L.-Villi U krys poměrně mladých (asi 2 nosíce) .je patrné z testování pod fotonovým mikroskopem, že v případě villi dochází k normálnímu vývoji, a to jak u krys kontrolních, tak ošetřovaných, U poměrně starších krys (asi 7 měsíců) vede podobné sledování k uzávěru, že u kontrolních krys dochází k strofii villi, zatím co u krys, ošetřovaných při jejich odstavení ve 4 týdnech dochází ke stejnému vývoji, jako u krys stáří 2 měsíce. Bylo tedy zjištěno, že PAITSTIiíASE způsobuje určité "omlazení'1 střevního traktu, villi podržuje svoji počáteční kapacitu pro vývoj a rychlé regenerování po delší dobu.

Střevní trakt je nejen fyziologicky neaktivní filtr, je to také největší z endokrinních žláz, viz B.Leblanc a spol., Rec.Med.Vet. 157. 629 (1981); K.Uvnas-Koberg, Science, září 1989, 24. Střevní trakt je tvořen z malých buněk, regenerují-cích rychle běhám celého života, a je to také orgán nejbohatší nukleovými kyselinami: DM + RITA, viz G.Duřená a spol,, Ann. Biol.Anim.Bioch.Biophys. 6_, 389 (1966). Má tedy proto nejvyšší latentní kapacitu pro syntézu proteinů.

Sledování histologických sekcí střevního traktu vede k závěru, že PAU3TIMABE dovoluje lepší expresi této latentní ks-pscity a v důsledku toho k vyšší produkci některých fyziologicky aktivních látek, trávících enzymů, hoimoaů (působících v pankreasu, játrech, mozku), imunoglobulinů, cytokinů, neuro-trans-přenášěčíinapř. VIP = Vasoactive intestinal peptide), růstových buněk a dalších faktorů, vhodných k přežití. Tím se vysvětluje, že PAESTIMASE, jejíž působení se projevuje ve střevním traktu přímo,,může nepřímo působit na orgány jiné, jakož i na fyziologické symptomy, ovlivněné výše uvedenými látkami. Vysvětlí se tím například pozoruhodné působení na pankreas, vis A.Estival a spol., Sdělení na konferenci o metabolismu, Nancy, 25/26.01.1979, Universita v Nancy.

Střevní trakt je rovněž orgán, nejbohatší imunitními buňkami, které cirkulují v krevním a lymfetickém oběhu., nebo kde se spojují a násobují ΡΒΪΕΗ-ovy plošky. Tyto imunitní buňky jsou složkou MALT (mucosae associated lymphoid tissue), které jsou podrosdeleny do GALT (ve střevním traktu) a BALT (dýchací orgány), které se vyznačují analogiemi se SALT, situovanými v kůži. GALT a BALT js&ou nezávislé a účinkují synergicky k zajištění obrany sliznice, takže tím přispívají k ochraně a obrané organizmu jako celku.

Sledování histologických sekcí střevního traktu vede k závěru, že PAIÍ3TIMASE stimuluje přímo GALT, může tedy nepřímo stimulovat celkovou imunitní ochranu. Tím by se tedy vysvětlilo, proč LAHSTIKASE zvyšuje odolnost zvířat proti infekčním chorobám. 2·- Nicrovilii V případě krys, mladých i starších, lze zjistit pod elektro novým mikroskopem, že microvilli kontrolních krys jsou kryty hyperviskozním slizem a stopami zbytků potravy, na druhé straně se jeví u krys po podání PAITSTIMASE tyto podíly čistší, vetší a četnější. PAUSTJKASE tedy zvyšuje celkový vývoj povrchu microvilli, jinak řečeno jejich kapacitu pro absorbování. Při zjišťováních "in vitro", tedy sledováním fragmentů střevního traktu kontrolních krys při použití PAITSTIMASE, bylo nalezeno, že aniž by došlo k poškození microvilli, bylo možno odstranit hyperviskozní sliz, který je kryje. Toto mírné deter-gentní působení může proběhnout během několika málo minut. Při zjišťování ”in vivo” umožňuje toto Čistění střevního slizu těsnější kontakt mezi infekčními zárodky a slizem, což může znásobit ve střevním traktu imunitu buněk, schopných zlikvi dovát uvedené zárodky. 3. Sekreční buňky a exokrinní mikrožlázky bunky,

Ve střevním traktu jsou distribuovány různé sekreční produkující sliz, lysozyme atd... a četné exokrinni mik- rožlázky, a do nich vyměšují podstatná množství sekrece (u lidí asi 2 000 ml za den).lok těchto sekrecí může být omezen nebo i zastaven přítomností mikroplošek ve slizu.

Testování histologických sekcí střevního traktu vede k uzávěru, ze PAKSΤΙΜΑSE rozruší agregace těchto mikroplošek, znovu obnoví normální tok těchto sekrecí a způsobí i reaktivní zvyšení jejich produkce0 I® známo, že vylučované sliny obsahují buněčný růstový faktor: epitheliální růstový faktor (IGF); dále pak střevní sekrety mohou obsahovat růstové faktory, které jsou schopné působit na efoterocyty, lymphocyty atd. Zvýšení tahové produkce působením PASTIMASe může vysvětlit lepší vývoj villi a GALT, jek to bylo zjištěno histologií sekcí střevních traktů ošetřených krys* 4* PEYER-ovy destičky PEYER-ovy destičky, což jsou shluky imunitních buněk, distribuovaných ve střevním traktu, jsou početn jší v případe ošetřovaných krys. objevují se od cvanácterníku u těchto krys, ale u kontrolních krys pouze od lačníku (jejunutn). Také jsou hustší, jejich lymfocyty jsou menší, kompaktnější a zdají se být aktivnější (jsou intensivněji zbarvené působením reagen-cií, použíbených v histologii). 5. Prodloužená neadheze infekčních zárodků PANSTIMASE může protipůsobit proti prodloužené adhezi infekčních zárodků ve sliznici, zvláště pak ve střevní sliznici.

Toto prodloužené adheze vyústí tvorbou chemických vazeb mezi adhezními místy těchto zárodků a jejich receptory, navázanými na sliznici. Adhezní místa a receptory jsou komplexními (ilyko-lipo)-proteiny. Při testech "in vitro" se ukázalo, že MAITSTIMASE, jež se vyznačuje určitou afinitou pro komplexní proteiny, může odříznout adhezní místa nebo oddělit receptory od sliznice, na kterou jsou připojeny. Často dojde k rozrušení adheze, což může proběhnout v několika desítkách minut. Dále pak PANSTIMASE může stimulovat regeberování villi ve střevním traktu, to jest eliminovaz staré buňky, které jsou -9-

• I • ♦ abnormální nebo porušené adhezí infekčních hárodků. Tato elimi- v nace je usnadňována intenzifikováním toku střevních sekretů* jejichž produkce se zvýší působením právě PAITSTIMASE.

Lze tedy konstatovat, že ačkoliv PAITSTIMASE může za prvé umožnit bližší kontakt mezi infekčními zárodky a střevní sliznicí (a indukovgtmultiplikování imunitních buněk ve střevním traktu s tím, že tyto buňky jsou schopné likvidovat uvedené zárodky, může rovněž protipůsobit před prodlužováním adheze těchto zárodků ke sliznici, jakož i jejich proniknutí do pod tím ležící tkáně. 6. Destrukce proteinových enterotoxinů

Za koncentrací mezi 10 až 100 A.U./ml a za zahřívání na 37° C po několik desítek minut zničí PAITSTIMASE některé proteinová toxiny a může tak přispět k prevenci a/nebo léčení průjmů, Mezi toxiny, takto ničenými působením PAITSTIMASE, lze uvést botulctoxin, cholerový toxin a LT toxin, produkované pathogenními colibacily, může nekrotizovat cytotoxický faktor, produkovaný také uvedenými colibacily.

Za stejných podmínek endogenní proteinasy, jako je trypsin, chymotripsin aid nezničí tyto toxiny, takže nemohou nijak přispět k prevenci a/nebo léčbě takových průjmů. V případě LT-toxinu zničí PAITSTIMASE podjetnotku A, jež je agresivní, aniž by došlo ke zničení podjednotky B, jež je imuno s t imuluj íc í. 7. Uzávěry PAITSTIMASE se vyznačuje zásadním působením v celém střevním traktu, což stimuluje globální funkci tohoto klíčového oggá-nu a v důsledku toho organismus jako takový. Odtud jsou četné příklady therapeutického využití.

Therapeutická využití farmaceutických přípravků dle tohoto vynálezu. Zásadní působení PAITSTIMASE ve střevním traktu umožňuje její použití nebo využití aktivních látek, ze kterých je složena, to znamená využití převažující exocelulární proteinasy nebo směsi této převažující exocelulární proteinasy s nejméně jednou ze dvou -10- dalsích exocelulárnich proteinás tak, že to přispívá k prevenci nebo i léčení onemocnění, na která je třeba vzít zřetel. 1. Cystová fibrosa a dýchací nesnáze

Cystová fibrosa je charakterizována nadměrným vylučováním příliš viskozního slizu v oblasti střevního traktu i v dýchacích cestách. Veškerý sliz má z chemického hlediska stejnou biochemickou strukturu a v důsledku toho PLASTIhlASS může ootimalizo-vat viskozitu střevního slizu, brinchiálního slizu i případné genitálního slizu.

Pro přípravu léčiva, která se může a má použít pro optimalizování viskozity střevního, bronchálního a/nebo genitálního slizu se může použít exocelulární proteinasa nebo proteinosy dle tohoto vynálezu, nebo proteinasa či proteinasy, ve kterých sekvence aminokyselin mají z nejméně 6055 homologii exocelulární proteinosy nebo proteinás dle tohoto vynálezu.

Exocelulární proteinasa nebo proteinasy dle tohoto vynálezu nebo proteinasa či proteinasy, kde sekvence aminokyselin odpovídá nejméně z 60% homologii exocelulární proteinasy nebo pro-teinas dle tohoto vynálezu se mohou použít pro přípravu léku, uvažovaného pro léčení cystové řibrosy a onemocnění ve spojitosti s nadměrnou sekrecí intesfcinálního, bronchiálního a/nebo genitálního slizu, zvláště pak, je-li příliš kiskozní. 2. Zlepšení absorpce a cirkulace krve

Svým zmírněným detergentním účinkem na stěny střevního traktu přispívá PANSTIMASE ke zlepšení absorpce.

Takové zlepšení absorpce se dá potvrdit analyzováním léků, podávaných orální ceszou do krve zvířete. Tak například bylo podáváno 50 mg tetracyklinu bez PAHSTIMASE (kontrolní skupina) nebo v kombinaci s 3 mg PAHSTIMASE s titrem 400 A.U./mg (léčená skupina) kuřatům cestou gastrické trubičky. Po podání byla odebrána krev, vzorek 2,5 ml a bylo zjištěno, že střední koncentrace tetracyklinu v seru odpovídá 1,35 mcg/ml pro kont- -11- • · • · » • * rolní skupinu a 1,90 mcg/ml pro léčenou skupinu.

Uvedené zlepšení absorpce lze analyzovat přesněji sledováním fixování léčiv v různých orgánech. fJ}ak například do potravy po dva dny bylo přidáváno léčivé krmivo s obsahem 4g/kg oxytetracyklinu bez PAUSΤΙΜΑ5E jako dodatku (kontrolní skupina) nebo s přídavkem 300 mg/kg PAHSTIMASE o titru 400 A.U. (léčená skupina). V tomto případe použité ryby byly usmrcetnx a obsah antibiotika byl analyticky zjistován v játrech, svalech a ledvinách. Bylo zjištěno, že PAUSTIMASE umožňuje podstatný v vzestup tkáňové koncentrace antibiotika, ale hodnota se mění značně dle toho či onoho orgánu. +100£> v játrech, t.j. 5,75 LIcg/g pro léčenou skupinu proti 2,5 mcg/g kontrolní skupiny, +4-00% ve svalovině, tj. 1,75 mcg/g pro léčenou skupinu versus 0,3 mcg/g kontrolní skupiny, +10005b v ledvinách, t.j. 5,75 mcg/g léčené skupiny versus 0,5 mcg/g kontrolní skupiny.

Zdá se tedy, že PAUSTIMASE způsobuje lepší absorbování oxytetracyklinu a lepší destribuování tohozo antibiotika celým v organismem, coz zrejme ovlivňuje vylepšení krevního cirkulování.

Sxocelulární proteinasa nebo proteinasy dle tohoto vynálezu, nebo proteinasa či proteinasy, kde sekvence aminokyselin odpovídá nejméně G0% homologii exocelulární proteinasy či pro-teinas dle tohoto vynálezu se mohou použít při přípravě léčiva, určeného pro zlepšení špatné absorpce léků či živin i pro léčení nepořádků v cirkulaci krve. Zvláště pak jsou léčiva určena pro chřadnoucí starší lidi či pacienty, kteří dostávají léky, které mají sekundární účinky, ovlivňující nepříznivě vlastní fungování střevního traktu. 3. Zažívací v?ídky a enterotoxaemias Původem zažívacích wídků je adheze bakterií (Helico-bacter pylori) na žaludeční stěnu a některé z enterotoxaemias mají svůj původ v adhezi různých infekčních zárodků na stěny zažívacího traktu, najmě střevního. PANSTIMASE působí proéi prodlužované adhezi infekčních zárodků na sliznici a ničí četné enterotoxiny. Může tak tedy přispět ke stimulování regenerování střevního traktu, může přispět k prevenci a/nebo léčbě vřídkň v zažívacím traktu a k léčbě -12- • · · · • •Μ • · < ·· · · enterotoxaemias.

Ve skutečnosti z ^praktického hlediska bylo zjištěno,

Se PAUSΤΙΜΑSE je schopna zredukovat počet prasat, postižených zažívacími vřídky jakož i snížit úmrtnost v důsledku entero-toxaemias.

Exocelulární proteinasa či proteinasy dle tohoto vyná-r lezu, jakož i proteinasa Či proteinasy se sekvencí aminokyselin nejméně z 60%ní homologií ve srovnání s exocelulární pro-teinasou či proteinasami dle tohoto vynálezu se mohou použít při přípravě léčiv k prevenci a/nebo léčbě prodloužené adhe-ze infekčních zárodků na sliznici, což usnadňuje regenerování atrofovaných nebo zničených vilii střevní sliznice, a přispívá k prevenci a/nebo léčbě zažívacích wídků a enterotoxaemiass. 4. Cukrovka, nedostatečná funkce jater a nesnáze při střevním průchodu* V předchozím patentovém spise byl již uvedeno, že PAHSTI-HASE stimuluje exokrinní funkci pankresu. Ve skutečnosti bylo analyzováním zjištěno podstatné zvýšení koncentrace všech enzymů a proenzymů pankreasu, a to + 50% pro amalysu, +70% pro trypsinogen a chymotrypsinogen, +8P% pro lipasu, viz A.Estival a spol., Sdělení na konferenci o metabolismu, Hancy, 25/26.01.1979, Univerzita v Hancy.

Sledováním histologických řezů sekcí pankrease se ukázalo, že Langerhans-ovy ostrůvky jsou četnější a u léčených krys mají lepší vzezření. Z těchto výsledků lze soudit, že PAHSTI-MASE nejprve stimuluje endokrinní funkci pankreasu s následným obecným zlepšením proteinového anabolizmu, výsledkem čehož je následné stimulování exokrinních funkcí.

Stimulování, ke kterému dochází v pankreasu se projeví rovněž v játrech, důsledkem čehož je lepší střevní průchod.

Ve velkých stádech prasat se často pozorují střevní zácpy.

Bylo zjištěno, že dodá-li se do krmivá PAHSTIMASE, zabrání se tím nežádoucím následkům při poruchách střevnách průchodů.

Exocelulární proteinasa či proteinasy dle tohoto vynálezu, nebo proteinasa či proteinasy se skvencí aminokyselin nejméně s 60%ní homologií ve srovnání s exocelulární proteinasou či proteinasami dle tohoto vynálezu se mohou použít při přípravě léku s úmyslem předejít a/nebo léčit cukrovku, svízele ve spo- -13- • · · « jitosti s játry, jakož i nesnáze při střevním průchodu. 5.

Infekční nemoci, imunitní dysfunkce a vakcinování

Bylo zde již uvedeno, že PAITSTIMASE se vyznačuje příznivým působením na GALT a v důsledku toho na celý imunitní systém. Zlepšení se projeví na třech úsecích. A. Infekční nemoci

Pozorování na velkých stádech vedla ke zjištění, že PAITSTIMASE zlepšuje často zdravit ní stav zvířat, což bylo původně spojováno se skutečností, že se tím usnadňuje absorpce antibiotik, která jsou přkšřádána do velké většiny běžně dostup-nch krmiv. Avšak bylo zjištěno, že toto vylepšení se zvláště významné projeví v případě onemocnění různými viry, přičemž txto jsou obvykle imunní proti účinku antibiotik. Tato zjištění se týkají chřipky a v případě prasat onemocnění typu Aujesky, u zvířat onemocnění typu Gumboro a ecthyma u koz. V posléze uvedeném případě virové ohemocnění během průběhu na pokusné stanici bylo předmětem těchto studií celkem 120 koz. Procento zvířat nedotčených onemocněním bylo 34^ u kontrolní skupiny a 10c/s v případě léčené skupiny. Procento těžce postižených zvířat kontrolní skupiny: 28£>, v případě léčené skupiny bez takového případu.

Antivirové působení lze vysvětlit tak, že PLASΤΙΜΑSE zvyšuje počet a hustotu PSÍER-ovýoh destiček, což jsou shluky imunitních buněk, distribuovaných ve střevním traktu. B . Imunitní dysfunkce Z dalších pozorování na velkých stádech malých prasátek vyplynulo, že PAITSTIMASE uredukuje dobu trvání arthritidy, což je sánětlivá reakce, následná po poraněních kloubů zvířat, žijících v kovocých klecích. Po za jizvě ní takových poranění jsou zánětlivé reakce více podřízeny působení tzv. supresivních imunizních buněk, které jsou četné v střevním traktu a nohou se přemístit do zaníceného pásma. Je možné, že PAITSTIMASE stimuluje pomnožení těchto buněk v střevním traktu a že usnadňuje -14- • I · · • · « • · · • · * · « • · « • · ·· jejich migraci, což by vysvětlovalo tu skutečnost, že se sníží doba trvání arthritidy asi o 50$'S. G, Vakcinace

Zlepšení zdravotního stavu, zjištěného v případě velkých stád, lze vysvětlit lepší odezvou zvířat na vakcinování při přijímaní potravin s dodatkem PAHSTIIJA3E. Předběžné testy na laboratorních myších potv-dily jednoznačně, že PAH3TIM5E zvyšuje úžinnost vakcinování, zvláště při orálním podávání.

Exo&elulární proteinasa či proteinasy dle tohoto vynálezu, nebo proteinasa či proteinasy se sledem aminokyslin nejméně s 60ýbní homologií ve srovnání s exocelulární proteinasou či proteinssami dle tálioto vynálezu se nohou použít pro přípravu léku, uvažovaného k prevenci a/nebo léčbě infekčních onemocnění a imunitnich dysfunkcí a pro zvýšení účinnosti vakcinování. 6, Hormonální insuficience a generační onemocnění ve spojitosti se stárnutím.

Bylo zjištěno, že u starších reprodukčních prasat způsobu- v» je EAlíSTIMASE redukci stavů, omezujících opl-dnující intervaly (které se naopak zvyšují u sviní) a stimuluje se tím sexuální žádostivost, která má klesající charakter u kanců. Takže se zdá, že PAH3TIMASE nahrazuje hormonální nedostatečnosti a asi a i jinak způsobuje vylepšení jiných nepříznivých stavů, daných stárnutím.

Bylo ve skutečnosti zjištěno, že PAHoTIMASE způsobuje "omlazení" starších reproduktivních krys ženského rodu, jakož i způsobuje snížení nepříznivých stavů v důsledku stárnutí starších reproduktivních sviní a slepic. A. Prvé vyrovnání krys jako samic se obvykle dosahuje asi ve věku 7 0 dní, a pokud se postupuje po asi 140 dnů, pak reprodukční způsobilost kontrolní skupiny je chabá, ale lepší u léčené skupiny, jež dostává stejnou potravu s doplňkem 300 mg/kg PAKSTIMASE s tifcrem 400 A.U./mg. • ♦ • • · • * · · φ · · • · » » · • » · ♦ · · • · · * · ···· ··· ·» • ♦ · · • » ·· • · · ♦ · · « « · • * · · -15- Kontrolhí skupina Ošetřené zjištění za 70 dní 140 dní za 140 iJroven oplodnění Perinatální morta 62% 2 9% 45% lita krys 18% 35% 18% Počet krys oplodněných samcem 9 6,6 8,1

Bylo nalezeno, že u kontrolní skupiny krys jako samic se jeví po 140 dnech chabé výsledky, ale u léčených samic krys se jeví výsledky po 140 dnech takové, že se blíží normálním výsůedkům kontrolní skupiny krys-samiček za 70 dní a hladina perinatální mortality se ztotožňuje. Lze tedy říci, že PAiíSTI-I.IASB ovlivňuje omlazení krys-samiček ve stáří 140 dní. B. Reproduktivní svině byly ztaženy zpět poté, co bylo zjištěno, že jejich "stav je chabý", například když bylo zjištěno, že nejsou schopné stát přizpůsobivě, aniž ležet (zatím co by mohly padnout a zalehnout nove zrozená prasátka).

Ve stádu 80 sviní před podáním P AiiSTIIíASB byly svině vzaty z oběhu v průměru po 4,4 reprodukčních cyklů. Za 6 měsíců po podání loku bylo zjištěno, že svine lze odebrat zpět v průměru po 5,8 reprodukčních cyklů. Lze tedy mít za prokázané, že PáITSTILÍáSB umožňuje prodloužení produktivního věku sviní asi o 30% bez jakýchkoli nepřijatelných změn jejich "dobrého zdraví" a jejich výkonnosti. V průběhu doby stárnutí mají slepice snahu produkovat vejce, která mají více lomivou skořápku, takže procento proražených vajec stoupne nad 10% na konci snůšky. PANSTIMASE umožňuje snížení tohoto procenta na polovinu, což zahrnuje také stimulování fosfokalciového netabolizmu.

Exocelulární proteinasa nebo proteinasy dle tohoto vynálezu, nebo proteinasa či proteinasy ge sekvencí aminokyselin s nejméně -16- • · · ♦ · «· • · · · # · · · • · · · · · ··· » · • · · • · · · • · ♦ * · · « · • ♦ · · · · • · ···· ··· ·· 60%ní homologií v porovnání s exocelulární proteinasou Či proteinasami dle tohoto vynálezu se mohou použít při přípravě léku, určeného k prevenci a/nebo hormonální nedostatečnosti „ regenerativních onemocnění ve spojitosti se stárnutím, jako je například arthritis, arthrosa s osteoporosa. Předběžná vyhodnocení tolerance farmaceutických ůřípravků dle tohoto vynálezu

Toxikologieké sledování ukázalo, že PAKSTIMASiD se nevyš na Ču je toxicitou vůči prasátkům, podává-li se po jeden měsíc v dávce 20x vyšší, než jak je to dosavadně doporučováno, cos znamená 40 000 á.U. na 1 kg potrávy; nejeví se zde toxicita na krysy při podávání po 3 měsíce v dávce 200x vyšší, než je dosud podávána dávka. V důsledku toho je možno předpokládat při provádění předběžných pokusů tolerance pro lidi za použití dávky, jež je relativně vyšší, než jak je tomu dosud. Ve skutečnosti kapsle s obsahem 750 000 A.U. čištěné PÁHSTIMASe v želatině (tj. 50 mg dávky s titrem 15.000 A.U./mg) byly použity při podávání pacientům v množství 2 až 3 kapsle denně po 2 až 3 týdny,

Bylo zvoleno 24 pacientů (12 mužů a 12 žen) v průměrném věku 44 roků s extremy v rozsahu od 25 do 70 let. Z těchto pacientů 17 trpělo dyspepsií v nejširším slova smyslu, aniž by byla dokázatelna jakákoli organické leze para klinickými zkoušo.ami (laoora^orni oesty, paprsky X, v některých případech endos^opie). n těchto pacientu trpělo 7 organickými lezemi, 3 pankreaticke, 2 žaludeční (1 vřed, i neoplasm), 2 kolektomií (jeden: ulcerohaemorrhagická rectolitis, další neoplasm).

Souběh symptometolegie a hmotnosti, pokud byla nedostačující, s nebo bez jídla, byl zvolen jako začátek sledování za studování na všech 24 pacientech. V běkterých případech se projevilo zlepšení ve vztahu k regulování střevního průchodu v případech zácpy, nebo na druhé straně průjmů, jakož i vzestup hmotnosti .17- • · • · jako důsledek podávané stravy. Předběžné pokusy byly taká provedeny s ohledem na cys-tovou fibrosu u pacienta stáří 18 let, který dostával 2 želatino ve kapsle, z nichž každé obsahovala 10 000 A .U. PAIéSTILlASB denně po 3 týdny. Bylo zjištěno zlepšení symptomů v oblasti střev (odpad méně častý a méhe lepivý), jakož i v bronchiál-ní oblasti (snazší a méně časté kašlání). V důsledku toho lze říci, že PAlíSTILIASB se dobře snáší, a zdá se, že je zvláště účinná v případe přijímání potravy.

Bxocelulární proteinssa nebo proteinasy dle tohoto vynálezu, nebo proteinasa či proteinasy se sekvencí aminokyselin s nejméně 6 Oji ní homologií ve srovnání s exocelvlární proteinasou či proteinasami dle tohoto vynálezu se nohou použít při přípravě dietních kompozic pro podávání stravy poškozeným nebo vyhladovělým jedincům. 1» »7 4J U .

Pn?r C. cnr.) .advokátní kancelář

VŠETECKA CVORCÍK KALENSKY A PARTNER! 120 00 Praha 2, Hálkova 2 Česká republika

Claims (11)

1. -18- ř A T B II Τ O V á B / R O K Ϊ 1. Farmaceutický a/nebo dietní přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku převažující exocelulární proteinasu, produkovanou . kulturou Streptomyces řradiae se specifickou účinnosti nad 100 000 A.U./mg,s molekulární hmotností,kolísající od 30 do 36 kDA a izoelektrickým bodem asi 7,0, který je schopný selektivně zničit podjednctku A cholerového toxinu, aniž by došlo ke zničení poajednotky 3, jako směs nebo v kombinaci s inertním, fysiologicky přijatelným farmaceutickým nosičem či vehikulem, netoxickým.
2. 2. Farmaceutický a/nebo dietní přípravek, vy*Bačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku převažující exo-celulární proteinasu podle nároku 1, nebo směs této převažující exocelulární proteinasy s nejméně jednou z dalších dvou exo-celulárních proteinás, produkovaných Streptomyces fradiae, nebo proteinasu či proteinasy se sekvencí aminokyselin s nejméně 6Op;ní homologií ve srovnání s převažující exocelulární protei-nasou nebo s těmi ve směsi proteánás, jak jsou definovány zde výše, nebo jest jako směs či kombinace s inertním, netoxickým fysiologicky přijatelným nosičem či vehikulem.
3. 3. Farmaceutický a/nebo dietní přípravek podle jednoho z nároků 1 či 2, vyznačující se tím, že se účinná složka podává orálně, pulmonárně a nebo cestou genitálií v dávkách mezi 5 000 až 100 000 A.U.
4. 4. Použití proteinasy nebo proteinás podle jednoho z nároků 1 nebo 2 k přípravě léku s úmyslem optimalizovat viskositu střevniho, bronchiálního a/nebo genitálního sl$zu.
5. 5. Použití proteinasy nebo proteinás podle jednoho z nároků 1 nebo 2 k přípravě léku pro lečení ohemocnění ve vztahu k nadměrné sekreci střevního, bronchiálního a/nebo genitálního 5 slizu, zvláště tehdy, je-li příliš vjskozní. -19- ~V’V rte>
6. 6. Použití proteinasy na bií proteinas podle jednoho z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léku s^imyslem upravit špatné absorbování léků či živin a pro léčbu nesnází ve spojitosti s krevní cirkulací.
7. 7. Použití proteinasy či proteinas podle jednoho z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léku k prevenci a/nebo léčbě prodloužených adhezí infekčních zárodků na sliznici, pro usnadnění regenerování stropovaných nebo zničených vilii na střevní sliznici, nebo pro prevenci a/nebo lučení vředů v zažívacím traktu a enterotoraemias.
8. 8. Použití proteinasy nebo proteinas podle jednoho z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léku k prevenci a/nebo léčbě cukrovky, nesnázích v oblasti jater a nepořádků při průchodu střevním traktem.
9. 9. Použití proteinasy nebo proteinas podle jednoho z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léku pro prevenci a/nebo léčení inřeneních nemocí a imunitní dysfunkce, nebo pro zlepšení účinnosti vakcinování.
10. 10. Použití proteinasy nebo proteinas podle jednoho z nároků 1 nebo 2 pro přípravu léku k prevenci a/nebo léčbě hormonální insuficience a degenerativních nesnází ve spojitosti se stárnutím.
11. 11. Použití proteinasy nebo proteinas podle jednoho z nároků 1 nebo 2 pro přípravu diethí kompozice pro stravování poraněných a vyhladovělých jedinců. P-,‘r advokát ?p0lFČMÁ ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VŠřTtECK* ZéucnV SVORČÍK kalenský A PARTNEŘI 120 00 Praha 2, Hálkova 2 Česká republika