WO1988007864A1 - Adjuvant de certains antimitotiques chimiques a partir de vibrio cholerae - Google Patents

Adjuvant de certains antimitotiques chimiques a partir de vibrio cholerae Download PDF

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WO1988007864A1
WO1988007864A1 PCT/FR1988/000167 FR8800167W WO8807864A1 WO 1988007864 A1 WO1988007864 A1 WO 1988007864A1 FR 8800167 W FR8800167 W FR 8800167W WO 8807864 A1 WO8807864 A1 WO 8807864A1
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adjuvant
substance
culture
vibrio cholerae
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PCT/FR1988/000167
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André Dodin
Alain Guenole
Benjamin Zylberberg
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Institut Pasteur
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/63—Vibrio

Definitions

  • the present invention relates to a new substance having an adjuvant effect, obtained from
  • the inventors have isolated from substances supernatants of Vibrio cholerae a substance which they have called "D.G.Z.” and which is characterized in that:
  • its sugar composition essentially comprises: rhamnose approximately 4.1% annose approximately 42% galactose approximately 32% glucose 2/3% approximately
  • its amino acid composition essentially comprises asparagma 8.2-8.7% approximately glutamine 8.9-10.5% approximately serine 5.5- 7.2% approximately glycine 4.4- 8.6% approximately histidine 2.3- 3.4% approximately arginine 2.8- 4.1% approximately threonine 5.1- 5.6% approximately alanine 7.2- 8.1% approximately proline, 5.8- 7.6% approximately ammonia 11.0-14 Approximately 7% tyrosine 2.0- 2.9% approximately valine 5.6- 6.3% approximately methionine 0.9- 1.1% approximately cysteine 0.6- 1.1% approximately isoleucine 2.4- 2.8% approximately leucine 6.9- approximately 8.8% phenylalanine 3.4- 4.2% approximately lysine 4.6- 7.0% approximately
  • its fatty acid composition essentially comprises C- fatty acids
  • Ci4.30H about 0.1% C- j -j about 0.13%
  • the present invention also relates to an antimitotic composition characterized in that it comprises the adjuvant substance extracted from the supernatant of Vibri cholerae in accordance with the present invention, associated with at least one antimitotic agent.
  • the antimitotic agent is advantageously taken from the group which comprises in particular Cis platinum, 5-fluorouracil, adriamycin, mitomycin.
  • the adjuvant and the anti mitotic are present in the composition in an adjuvant / antimitotic ratio of the order of 1 to 10.
  • the present invention also relates to methods of obtaining the substance having an adjuvanting effe, defined above, from. cultures of Vibri cholerae.
  • a process for obtaining such a substance is characterized in that the supernatant of Vibrio cholerae cultures is precipitated then centrifuged, then the centrifugation pellet is dissolved in distilled water, and the solution heated then centrifuged dialyzed and lyophilized to give rise to the antimitotic effect substance identified above.
  • the culture supernatant is obtained from a culture of Vibrio cholerae on alkaline nutritive agar, cultivated for approximately 8 hours at approximately 37 ° C.
  • Another process for obtaining the substance having an adjuvant effect is characterized in that the culture supernatant of V. cholerae is treated with chloroform, which gives rise to the formation of a gel. chloroform-protein which is eliminated by decanting, while the adjuvant substance according to the invention is found in the aqueous phase.
  • the culture is carried out in a Fernbach flask of 2 liters half-filled with glass beads and sterilized in the autoclave, then made up to 200 ml with trypsinized peptone water of alkaline calf at pH 8.2.
  • the Fernbach flask is inoculated with this culture and is carried for 18 to 20 hours in an oven
  • the culture supernatant is then precipitated with d polyethylene glycol at 28% final concentration.
  • the supernatant is centrifuged at 20,000 G for 20 minutes.
  • the supernatant is then rejected and the pellet dried. This is dissolved in distilled water. Thereof is gradually faley added to obtain complete dissolution of the product with the help of a few beads to homogenize the solution.
  • the activity was demonstrated on cell cultures of Sarcoma 180 cells, by bringing together in a culture medium constituted by trypsinized peptone water of alkaline calf at pH 8.2, the cells and increasing amounts of the substance according to the invention.
  • the activity of said substance was evaluated on the number of living cells by vital staining for 24 hours.
  • Sarcoma 180 multiplies until the 6th - 7th day to give 10 ⁇ cells / l, in the presence of DGZ.
  • FIG. 1 shows the viability% of a culture of Sarcoma 180 cells (10 6 cells / dish) as a function of time in the presence of DGZ alone (curve Ib) by comparison with a control (culture of sarcoma 180 cells alone) (curve la).
  • FIG. 2 shows the viability% of a culture of cells (10 6 cells / dish) of Sarcoma 18 as a function of time, in the presence of a combination of Cisplatin and DGZ; o notes a regular decrease in the rate of viability from 80% on the 1st day to around 15 on the 8th day.
  • FIG. 3 shows the viability% of a culture of cells (10 6 cells / dish) of Sarcoma 18 as a function of time, in the presence of
  • mice were carried out on Balb / c mice weighing approximately 20 g.
  • Acute toxicity an injection of 20 mg intraperitoneally does not cause any problems.
  • Chronic toxicity injections of 16 to 20 mg intraperitoneally twice a week for 4 weeks cause diarrhea.
  • Tests were carried out on Balb / c mice inoculated with 105 Sarcoma 180 cells and treated from the 24th hour intraperitoneally for 4 days with doses of 2 mg of the substance according to the invention, ie alone or in combination with Cisplatin.
  • mice survived without ascites or tumor according to the experimental method. Note that they could not be reinoculated whatever the dose of cells injected.
  • FIG. 6 shows the survival rate of mice in which 10 ⁇ Sarcoma 180 cells were inoculated, treated by injection of buffered physiological water, twice a week for 4 weeks: no mouse surviving on the 12th day.
  • FIG. 7 shows the rate of mice inoculated by 10 ⁇ Sarcoma 180 cells treated by injections of DGZ (in peptone water) heated for one hour at 100 ° C. and of Cisplatin to raiso of:
  • mice 18 were still alive on the 75th day after the start of treatment (2 deaths observed on the 39th day). 2. Tests were also carried out on C57 black mice inoculated with Lewis tumor cells, 10 4 cells in the left hind paw. The progress of the tumor is followed, in controls like che treated mice, by measuring the thickness of the leg. The treatment was carried out intraperitoneally for 4 days, at a rate of 1 mg of the substance according to the invention and 0.0125 mg of Cisplatin in the same syringe per mouse and per day, for 4 days, and under a volume of 0.20 ml
  • Tests were also carried out on LTCH mice inoculated with mouse teratoblastoma cells.
  • the evolution of the tumor is done in 45 days in 20 female mice and in 60 days in males, for the controls.
  • the treatment was carried out as described in connection with the cells inoculated with Lewis tumor cells (1 mg of substance in accordance with the invention and 0.0125 mg of e Cisplatin / mouse / day / for 4 days): on 10 females 25- LTC ' E ,. only one developed tumor ascites within the same time frame as the controls; similarly, only one in ten male mice developed tumor ascites.
  • the survival times were extended specacularly since the failure rate was only 5 and the survival times of the recidivist patients treated reached from 13 months to 92 months, with a total disappearance of the ascites and huge belly linked to the presence of. ascites, thus providing the patients not only with an improvement at least temporarily in terms of the disease itself, but also an important improvement on the psychological level resulting from the improvement of their physical aspect and their comfort.
  • metastasized cancer pulmonary, digestive
  • similar results have been obtained, with reduction of the main tumor and metastases.
  • the administration conditions were identical to those used in the treatment of ovarian cancer.

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Abstract

Nouvelle substance obtenue à partir de surnageant de cultures de vibrio cholerae. Cette nouvelle substance provoque l'apparition d'anticorps chez un mammifère expérimental auquel elle est injectée et son poids moléculaire est sensiblement de l'ordre de 57 kD. Cette substance à effet adjuvant, peut avantageusement être associée à des agents antimitotiques.

Description

Adjuvant de certains antimitotiques chimiques à partir de vibrio cholerae.
La présente invention est relative à une nouvell substance présentant un effet adjuvant, obtenue à partir d
• surnageant de cultures de Vibrio cholerae, à un procéd d'obtention de cette substance par extraction à partir d surnageant de culture de Vibrio cholerae et à des compositions thérapeutiques contenant ladite substance.
Les Inventeurs ont isolé de surnageants de cultures de Vibrio cholerae une substance qu'ils ont dénommée "D.G.Z." et qui est caractérisée en ce que :
- injectée au lapin selon la technique de Oudin, elle provo¬ que chez celui-ci l'apparition d'anticorps qui par la tech¬ nique de double diffusion en gélose, se manifestent sous forme d'une bande de précipité antigène-anticorps et par analyse immunoélectrophorétique contre le sérum obtenu, par une seule bande ;
- son poids moléculaire, *. obtenu par ultracentrifugation et électrophorèse, est sensiblement de l'ordre de 57 000 daltons; - elle se compose de sacres (environ 28,3 %), d'acides aminés (17 % environ) et d'acides gras (environ 9 %).
Conformément à l'invention, sa composition en sucres comprend essentiellement : rhamnose 4,1 % environ annose 42 % environ galactose 32 % environ glucose 2/3 % environ
Egalement conformément à l'invention, sa composition en acides aminés comprend essentiellement asparagme 8.2- 8,7 % environ glutamine 8,9-10,5 % environ serine 5.5- 7,2 % environ glycine 4,4- 8,6 % environ histidine 2.3- 3,4 % environ arginine 2,8- 4,1 % environ thréonine 5.1- 5,6 % environ alanine 7.2- 8,1 % environ proline , 5.8- 7,6 % environ ammoniac 11 ,0-14,7 % environ tyrosine 2,0- 2,9 % environ valine 5.6- 6,3 % environ méthionine 0,9- 1,1 % environ cystéine 0,6- 1,1 % environ isoleucine 2.4- 2,8 % environ leucine 6.9- 8,8 % environ phénylalanine 3,4- 4,2 % environ lysine 4,6- 7,0 % environ
Conformément à l'invention, sa composition en aci¬ des gras comprend essentiellement des acides gras en C-|g à C20 dans les proportions suivantes :
C*ιo 4,5 % environ
C-] 1 15,4 % environ
C-|o,3θH 15,5 % environ
C*|2 14,5 % environ C*i3 5,2 % environ C-|2,30H 1,7 % environ
C-| 4 0,91% environ
C-|3,30H 0,1 % environ
Ci4,30H 0,1 % environ C-j -j 0,13% environ
C-| • 1 ,05% environ
Cis 1 0*5 % environ
C-] 8 2,5 % environ
C-|9 0,13% environ C20 0 5 % environ
C*|5 0,55% environ
La présente invention a également pour objet un composition antimitotique caractérisée en ce qu'elle compren la substance adjuvante extraite de surnageant de Vibri cholerae conforme à la présente invention, associée à a moins un agent antimitotique.
Selon un mode de réalisation avantageux de cett composition antimitotique, l'agent antimitotique est avanta geusement pris dans le groupe qui comprend notamment le Cis platine, le 5-fluorouracile, 1' adriamycine, la mitomycine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux d cette composition antimitotique, l'adjuvant et l'anti mitotique sont présents dans la composition dans un rappor adjuvant/antimitotique de l'ordre de 1 à 10. La présente invention a également pour objet de procédés d'obtention de la substance présentant un effe adjuvant, définie plus haut, à partir de . cultures de Vibri cholerae.
Conformément à la présente invention, un procéd d'obtention d'une telle substance est caractérisé en ce qu du surnageant de cultures de Vibrio cholerae est précipité puis centrifugé, puis le culot de centrifugation est dissou en eau distillée, et la solution chauffée puis centrifugée dialysee et lyophilisée pour donner lieu à la substance effet antimitotique identifiée ci-dessus. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le surnageant de culture est obtenu à partir d'une culture de Vibrio cholerae sur gélose nutritive alcaline, cultivée pendant 8 heures environ à 37°C environ et récoltée dans du soluté physiologique tamponné, à raison d'environ 1θ"-0 germes/ml, laquelle culture est ensemencée dans des fioles de culture contenant de l'eau peptonée trypsinisée de veau alcaline, après quoi la culture est poursuivie dans ces fioles pendant 18-20 heures environ dans une étuve à 37°C environ sous agitation continue, puis la récolte est recueillie, centrifugée et le surnageant de culture obtenu est recueilli pour être traité en vue de l'obtention "de la substance adjuvante conforme à l'invention.
Un aute procédé d'obtention de la substance présentant un effet adjuvant, définie plus haut, est caracté¬ risé en ce que du surnageant de culture de V. cholerae est traité par du chloroforme, ce qui donne lieu à la formation d'un gel chloroforme-protéine qui est éliminé par décanta¬ tion, tandis que la substance adjuvante conforme à l'inven- tion est retrouvée dans la phase aqueuse.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de préparation de la substance adjuvante conforme à la pré¬ sente invention, à un exemple de mise en évidence de l'acti¬ vité de cette substance et à un compte-rendu d'expérimenta¬ tion clinique. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exem¬ ples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - Préparation de la nouvelle substance adjuvante conforme à l'invention
La culture est réalisée en fiole de Fernbach de 2 litres emplie à moitié de billes de verre et stérilisée l'autoclave, puis complétée à 200 ml par de l'eau peptoné trypsinisée de veau alcaline à pH 8,2.
On utilise comme souche de vibrions, une souche d Vibrio cholerae Ogawa appelée Stockholm n° 20 (déposée a Centre National de Référence des Vibrions à l' INSTITU PASTEUR) et choisie par les Inventeurs. Le nombre de germe par millilitre est constitué par la totalité des germes d'u tube de culture de gélose nutritive alcaline cultivée pendan 8 heures à 37°C, la culture étant récoltée dans 20 ml d'ea physiologique tamponnée (sensiblement 10^0 germes/ml).
La fiole de Fernbach est ensemencée par cett culture et est portée pendant 18 à 20 heures dans une étuve
37°C avec agitation continue, après quoi, la récolte es recueillie, centrifugée à 5000 tours/minute pendant 2 minutes.
Le surnageant de culture est alors précipité par d polyéthylèneglycol à 28 % concentration finale. Le surnagean est centrifugé à 20000 G pendant 20 minutes. Le surnagean est alors rejeté et le culot séché. Celui-ci est dissous e eau distillée. Celle-ci' est ajoutée progressivement de faço à obtenir une dissolution totale du produit avec l'aide d quelques billes pour homogénéiser la solution.
La solution ainsi obtenue est ensuite chauffé pendant une demi-heure au bain-marie à 100°C.
Elle est centrifugée à 20000 'G pendant 20 minute puis dialys e contre de l'eau distillée, lyophilisée e pesée.
EXEMPLE 2 - Préparation de la nouvelle substance adjuvant conforme à 1 'invention
Le surnageant de culture de V. cholerae souch
Stockholm 20 obtenu en procédant comme décrit à l'Exemple 1, est traité par du chloroforme du commerce, à raison de 50 m de surnageant pour 100 ml de chloroforme. Il se forme un gel chloroforme-protéine qui est aisément éliminé par décanta- tion. La nouvelle substance adjuvante conforme à l'invention est retrouvée dans la phase aqueuse, qui est traitée comme décrit à l'Exemple 1.
EXEMPLE 3 - Mise en évidence de l'activité de la nouvelle substance conforme à l'invention
L'activité de la substance conforme à l'invention a été mise en évidence par des méthodes in vitro et in vivo. A, In vitro
1. L'activité a été mise en évidence sur des cultures cellulaires de cellules du Sarcome 180, en mettant en présence dans un milieu de culture constitué par de l'eau peptonée trypsinisée de veau alcaline à pH 8,2, les cellules et des quantités croissantes de la substance conforme à l'invention. L'activité de ladite substance a été évaluée sur le nombre de cellules vivantes par coloration vitale durant 24 heures.
On a évalué selon la même méthode l'activité de l'association de la substance conforme à l'invention avec le Cisplatine.
Les résultats obtenus sont représentés respectivement dans les figures 1 , 2 et 3 annexées qui montrent que cultivées in vitro, des cellules de
Sarcome 180 se multiplient jusqu'au 6ème - 7ème jour pour donner 1O^cellules/ l, en présence de DGZ.
La figure 1 montre la viabilité % d'une culture de cellules de Sarcome 180 (106 cellules/boîte) en fonction du temps en présence de DGZ seule(courbe Ib) par comparaison avec un témoin (culture des cellules de sarcome 180 seule) (courbe la) .
Alors qu'au 8ème jour le taux de viabilité des cellules témoins est de 40 % environ après un maximum à 80 % entre le 5ème et le 6ème jour, en présence de DGZ seule, il décroît régulièrement à partir du 2ème jou
(où il est de 90 %' environ) jusqu'a
8ème jour où il est à environ 60 %.
La figure 2 montre la viabilité % d'une culture d cellules (106 cellules/boîte) de Sarcome 18 en fonction du temps, en présence d'un association de Cisplatine et de DGZ; o constate une décroissance régulière du tau de viabilité de 80 % au 1er jour à 15 environ au 8ème jour.
La figure 3 montre la viabilité % d'une culture d cellules (106 cellules/boîte) de Sarcome 18 en fonction du temps, en présence d
. Cisplatine seul. La courbe décroît régulièrement de 90 environ au 1er joαr à environ 15 %. a 8ème jour. 2. Une activité de la substance conforme à l'inventio a été démontrée en mesurant l'incorporation de l thymidine tritiée, dans des cultures en micropuits d cellules mononucléées sanguines humaines, en présence o en absence de phytohémagglutinine (PHA) phytohémagglutinine diluée au 1/500è avec de concentrations de substance variant de 0,1 à 1000 mcg/ml En présence de PHA, il existe une activité dose-dépendant qui permet une augmentation importante de la thymidin tritiée à l'intérieur de la cellule.
Les résultats obtenus sont représenté respectivement dans les figures 4 et 5 annexées. Dans la figure 4, la courbe représente l'incorporatio de la thymidine en présenc d'associations de DGZ et de Cisplatin dans lesquelles la DGZ est présente soi en quantités variables, soit e quantités fixes, la courbe β représent l'incorporation de thymidine en présence de DGZ seule. Les courbes <x et β de la figure 5 ont la même signification que les courbes corres- pondantes de la figure 4, à ceci près que "la substance étudiée (association de DGZ + cisplatine ou DGZ seule) est présente à une dilution de raison 2 par rapport à la figure 4. 3. Tests de toxicité
Ils ont été effectués sur des souris Balb/c pesant 20 g environ.
Toxicité aiguë : une injection de 20 mg par voie intrapéritonéale ne provoque aucun trouble.
Toxicité chronique : des injections de 16 à 20 mg par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 4 semaines provoquent l'appa- rition de diarrhée.
B. In vivo
1. Des essais ont été réalisés sur des souris Balb/c inoculées par 105 cellules de Sarcome 180 et traitées dès la 24ème heure par voie intrapéritonéale pendant 4 jours avec des doses de 2 mg de la substance conforme à l'inven¬ tion, soit seule soit en association avec du Cisplatine.
Les résultats suivants ont été obtenus : - avec une association comprenant 2 mg de la substance conforme à l'invention et 0,0125 mg de Cisplatine, 80 à 90 % des souris ont survécu sans ascite ni tumeur selon la modalité expérimentale. A signaler qu'elles n'ont pu être réinoculées quelle que soit la dose de cellules injectées.
Les résultats obtenus sont représentés aux figures 6 et 7 annexées qui montrent le nombre de souris survivan- tes (en ordonnée) en fonction du temps (en abscisse) exprimé en jours.
La figure 6 montre le taux de survie de souris auxquelle ont été inoculées 10^ cellules d Sarcome 180, traitées par des injection d'eau physiologique tamponnée, 2 fois pa semaine pendant 4 semaines : aucune souri survivante au 12ème jour.
La figure 7 montre le taux de souris inoculées pa 10^ cellules de Sarcome 180 traitées par de injections de DGZ (en eau peptonée) chauffé une heure à 100°C et de Cisplatine à raiso de :
2 mg de DGZ 2 fois par semain 0,0250 mg de Cisplatine / 4 semaines
Sur un lot de 20 souris, 18 étaient toujour vivantes au 75ème jour après le début d traitement (2 décès observés au 39ème jour). 2. Des essais ont été réalisés également sur des sou ris C57 black inoculées avec des cellules de la tumeur d Lewis, 104 cellules dans la patte arrière gauche. L'évolu tion de la tumeur est suivie, chez les témoins comme che les souris traitées, par mesure de l'épaisseur de l patte. Le traitement a été réalisé par voie intrapérito néale pendant 4 jours, à raison de 1 mg de la substance conforme à l'invention et de 0,0125 mg de Cisplatine dans la même seringue par souris et par jour, pendant 4 jours, et sous un volume de 0,20 ml
Les résultats ont été les suivants : 70 % des sou ris traitées ont survécu sans développer ni tumeur ni mé¬ tastase.
Elles n'ont pu être réinoculées ultérieurement par des quantités de 10^ à 108 cellules de Lewis.
Ces résultats sont reproduits aux figures 8 à 10 annexées qui montrent l'augmentation d'épaisseur de la patte (exprimée en mm) en fonction du temps (exprimé en jours) .
Dans la figure 8 après inoculation de 10^ cellules de
Lewis suivie d'un traitement pendant 5 4 jours par le Cisplatine associé à la
DGZ t on observe une augmentation d'épaisseur brusque entre le 12ème et le 15ème jour après l'inoculation chez les souris traitées,de 4,7 mm à 6,2 mm, soit 1.& 1,5 mm, alors que dans le cas de souris traitées par le Cisplatine seul (figure 9), l'augmentation d'épaisseur atteint 2,5 mm et que dans le cas des souris témoins traitées par de l'eau physiologique, on observe une augmentation d'épais- 15 seur bien plus considérable, puisqu'elle est de 4,3 mm (figure 10) .
3. Des essais ont en outre été réalisés sur des souris LTCH inoculées par des cellules de teratoblastome de souris. L'évolution de la tumeur se fait en 45 jours chez 20 les souris femelles et en 60 jours chez les mâles, pour les témoins. Le traitement a été réalisé comme décrit en liaison avec les cellules inoculées par des cellules de tumeur de Lewis (1 mg de substance conforme à l'invention et 0,0125 mg d'e Cisplatine/souris/jour/pendant 4 jours) : sur 10 femelles 25- LTC'E,. une seule a développé une ascite tumorale dans les mê¬ mes délais que les témoins ; de même, chez les souris mâles, une seule souris sur dix a développé une ascite tumorale. Ces résultats,qui montrent que 90 % des souris traitées ont sur¬ vécu sans développer de tumeur, ni de métastases, présentent 30 d'autant plus d'intérêt que le teratoblastome de souris est la tumeur la plus proche des tumeurs de l'ovaire de la femme dans ses modalités évolutives.
35
Figure imgf000012_0001
EXEMPLE 4 - Compte-rendu d'expérimentations cliniques Cancers de l'ovaire
A1. Traitement de malades après intervention chirurgicale par la substance adjuvante conforme à l'invention administrée par voie intrapéritonéale
. seule dans 33,3 % des cas . en association avec au moins un autre antimitotiqu dans 66,6 % des cas 60 % de taux de survie ont été observés ave disparition de l'ascite.
A2. Traitement de malades présentant une récidive
La moyenne de survie de ces malades qui récidiven ne dépasse pas 6 mois habituellement quel que soi l'antimitotique de l'Art antérieur utilisé pour l traitement.
Avec la substance conforme à l'inventio administrée par voie intrapéritonéale . soit seule
. soit en association avec au moins un autr antimitotique,
Les durées de survie ont été prolongées de façon spec taculaire puisque le taux d'échecs n'a été que de 5 et que les durées de survie des malades récidiviste traités ont atteint de 13 mois à 92 mois, avec un disparition totale de l'ascite et du ventre énorme li à la présence de. l'ascite, procurant ainsi aux malade non seulement une amélioration au moins temporaire su le plan de la maladie elle-même, mais aussi un amélioration importante sur le plan psychologiqu résultant de l'amélioration de leur aspect physique e de leur confort.
Dans d'autres formes de cancers métastasés (pulmo naires, digestifs) des résultats similaires ont été obte nus, avec réduction de la tumeur principale et des métas tases. Les conditions d'administration ont été identiques à celles mises en oeuvre dans le traitement des cancers de l'ovaire.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Nouvelle substance à effet adjuvant, caractéri sée en ce que
- injectée à un mammifère expérimental, elle provoque che celui-ci l'apparition d'anticorps ;
- son poids moléculaire est sensiblement de l'ordre d 57 000 daltons ;
- elle se compose de sucres (environ 28,3 %), d'acides aminé (17 % environ) et d'acides gras (environ 9 %). 2e) Substance selon la revendication 1, caractéri sée en ce que sa composition en sucres comprend essentielle ment : rhamnose 4,1 % environ mamnose 42 % environ galactose 32 % environ glucose 2,3 % environ.
3°) Substance selon l'une quelconque des revendica tions 1 et 2, caractérisée en ce que sa composition en acides aminés comprend essentiellement : asparagine 8,2- 8,7 % environ glutamine 8,9-10,5 % environ serine 5,5- 7,2 % environ glycine 4,4- 8,6 % environ histidine 2,3- 3,4 % environ arginine 2,8- 4,1 % environ thréonine 5,1- 5,6 % environ alanine 7,2- 8,1 % environ proline 5,8- 7,6 % environ ammoniac 11,0-14,7 % environ tyrosine 2,0- 2,9 % environ valine 5,6- 6,3 % environ méthionine 0,9- 1,1 % environ cystéine 0,6- 1,1 % environ isoleucine 2,4- 2,8 % environ leucine 6,9- 8,8 % environ phénylalanine 3,4- 4,2 % environ lysine 4,6- 7,0 % environ.
4°) Substance selon l'une quelconque des revendi¬ cations 1 à 3, caractérisée en ce que sa composition en aci- des gras comprend^essentiellement des acides gras en C-|Q a C20 dans les proportions suivantes :
C-|o 4,5 % environ
C-j -j 15,4 % environ
C-ιo, 0H 15,5 % environ C12 14,5 % environ
C-J3 5,2 % environ
C-]2' 0H 1,7 % environ
C-J4 0,91% environ
C-]3,30H 0,1 % environ C-|4,30H 0,1 % environ
C-]g 1 0,13% environ
C-jg 1 ,05% environ
C*i8 1 0/5 % environ
C-J8 2,5 %" environ C-|9 0,13% environ
C20 0,5 % environ
C-J5 0,55% environ.
5°) Substance selon l'une quelconque des Revendica¬ tions 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est extraite de sur- nageant de Vibrio cholerae.
6° Composition antimitotique, caractérisée en ce qu'elle comprend la substance adjuvante selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 , associée à au moins un agent antimitotique. 7°) Composition selon la revendication 6, caracté¬ risée en ce que l'agent antimitotique est avantageusement pris dans le groupe qui comprend notamment le Cisplatine, le 5-fluorouracile, l'adriamycine, la mitomycine.
8e) Composition selon l'une quelconque des revendi- cations 6 et 7, caractérisée en ce que l'adjuvant et l'anti- mitotique sont présents dans la composition dans un rappor adjuvant/antimitotique de l'ordre de 1 à 10.
9e) Procédé d'obtention d'une substance présentant un effet adjuvant, à partir de cultures de Vibrio cholerae caractérisé en ce que du surnageant de cultures de Vibri cholerae est précipité, puis centrifugé, puis le culot d centrifugation est dissous en eau distillée, et la solutio chauffée puis centrifugée, dialysee et lyophilisée pour don ner lieu à une substance à effet adjuvant selon l'une quel conque des Revendications 1 à 5.
10e) Procédé selon la revendication 9, caractéris en ce que le surnageant de culture est obtenu à partir d'un culture de Vibrio cholerae sur gélose nutritive alcaline cultivée pendant 8 heures environ à 37°C environ et récolté dans du soluté physiologique tamponné, à raison d'enviro 1θ1 germes/ml, laquelle culture est ensemencée dans des fio les de culture contenant de l'eau peptonée trypsinisée d veau alcaline, après quoi la culture est poursuivie dans ce fioles pendant 18-20 heures environ dans une étuve à 37°C en viron sous agitation continue, puis la récolte est recueil lie, centrifugée et le surnageant de culture obtenu est re cueilli pour être traité en vue de l'obtention de la substan ce adjuvante selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5 11°) Procédé d'obtention d'une substance présentant u effet adjuvant, à partir de cultures de Vibrio cholerae, ca ractérisé en ce que du surnageant de culture de V. cholera est traité par du chloroforme, ce qui donne lieu à la forma tion d'un gel chloroforme-protéine qui est éliminé par décan tation, tandis que la substance adjuvante, selon l'une quel conque des Revendications 1 à 5, est recueillie dans la phas aqueuse.
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