JPH0242976A - 不定胚生長促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、不定胚生長促進剤に関する。

（従来の技術） 植物組織培養は、植物細胞の分化全能性による細胞の脱
分化（カルス化）、再分化に基づくものである。近年の
植物バイオテクノロジーの進歩にともない、植物組織培
養技術を用いて植物細胞を大量に培養し再分化させ、大
量に優良植物のクローン増殖を行うことが試みられてい
る。

一般に植物組織培養とは、一部組織片を植物の生長に必
要な成分を含む培地に植え、カルスと呼ばれる脱分化細
胞を誘導し無限培養するものである。誘導したカルスか
らは不定胚（体細胞胚）、不定芽や不定根を誘導し植物
体に再分化させることが可能である。これらの不定胚形
成の為の培養に於いては温度、光量、光同期などの物理
的条件。

培地の無機塩類、ビタミン糖などの化学的条件、サイト
カイニン・オーキシンなどの種類、サイトカイニン／オ
ーキシンの量比、ジベレリン類・アブシジン酸等の添加
などの植物ホルモン条件、用いる植物の齢１組織などの
条件、固体培養・液体培養（静置培養、回転培養振盪培
養、タンク培養など）などの諸条件について種々検討さ
れ、植物組織培養技術を用いた不定胚経由の大量育苗が
試みられている。

（発明が解決しようとする問題点） 植物組織培養を用いて植物組織あるいは培養細胞からの
不定胚の誘導、生長は種々の植物において検討されてい
る。人為的に不定胚、不定芽や不定根などの形態形成を
誘導する場合、培地の無機塩組成も去ることながら植物
ホルモンであるオーキシンやサイトカイニンの種類、濃
度、組合せについて検討することが一般的な手順となっ
ている。

しかし、オーキシンやサイトカイニンの処理だけでは不
定胚、不定芽や不定根などの形態形成を誘導できない植
物種も多い。現在までに報告されている植物生長調節物
質は種類も多くその作用は多岐にわたっているが、形態
形成に関してオーキシンやサイトカイニンに代わる特殊
な効果を示したとする報告は少なく、新しい植物生長調
節物質の検索は重要な課題となっている。特に不定胚を
経由して植物体を再生させる場合に於いて、不定胚の生
長は、その段階によって球状胚、心臓型胚、魚雷型胚、
成熟胚の順に成長していくが、その理由は定かではない
が誘導された不定胚はある段階まで生長後、その生長が
停止し植物体にまで再分化する率は極めて低下するとい
うことが知られている。例えば、不定胚発生系のモデル
として最も研究が進んでいるニンジン培養細胞に於いて
は、培養細胞を植物ホルモンを含まない植物組織培養用
培地で培養することで不定胚を誘導することができる。

誘導された不定胚は、魚雷型胚様体まで生長するとその
生長が停止して植物体まで再分化するものは非常に減少
してしまう。

不定胚を経由した植物体再生を産業的に利用しようする
場合、上述したように不定胚の生長が停滞せずに成熟胚
を経て植物体に再生するという点、別の表現を取れば生
長の止まらない優良な不定胚を得ることが最も重要であ
る。さらに、たとえ生長が停滞する不定胚であっても新
規な植物生長の発見などにより、その停滞を打破するこ
とができるようになることも重要である。このように、
不定胚発生及びその生長という形態形成を誘導する場合
、形態学的、生理学的な部分には未だ不明な点が多く、
現在知られている植物組織培養技術を用いても解決でき
ない幾多の問題点がある。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上述せる問題点に鑑みなされたもので、植物
の組織あるいは培養細胞から不定胚を誘導後、生長させ
る際に、不定胚生長促進剤として光合成原核微生物培養
濾液及び／又は光合成原核微生物抽出物を用いることを
特徴とする不定胚生長促進剤を要旨とするものである。

本発明で利用できる光合成原核微生物としては、シアノ
バクテリア類（ｒ　Ｒ，Ｒｉｐｐｋａ　ａｎｄ　Ｒ，Ｙ
。

５ｔａｎｉｅｒ　　：　Ｊ　、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｏｂｉｏ
ｌ、、　　１１１　、１−６１（１９７９）　Ｊにより
種々分類されている。）や光合成細菌類等がある。シア
ノバクテリア類としては、例えば、クロログレオフィシ
ス属（Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｉｓｉｓ　　ｓｐ、）
　、デルモカルパｆｐ、　（Ｄ　ｅｒｍｏｃａｒｐａ　
　ｓｐ、）、　ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ　　ｓｐ、
　）　、シネココッカス属（Ｓ　ｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃ
ｕｓ　　ｓｐ、　）　、オスシラトリア属（Ｏｓｃｉｌ
ｌａｔｏｒｉａ　　ｓｐ、）があり、具体例としては、
　クロログレオフィシス属（Ｃｈｌｏｒ。

＼ 、） ｇｌｏｅｏｐｉｓｉｓ　　ｓｐ、）　ＡＴＣＣ２７１８
１，デルモカルパｇ！ａ（Ｄｅｒｍｏｃａｒｐａ　　ｓ
ｐ、）　ＡＴＣＣ２９３７、ノストック属（Ｎｏ５ｔｏ
ｃ　　ｓｐ、　）　Ａ　Ｔ　ＣＣ２７８９５、シネココ
ッカス属（Ｓ　ｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ、）ＡＴ
ＣＣ２７１９２，ＡＴＣＣ２９４０４、ＡＴＣＣ２９５
３４、ＡＴＣＣ２７１７０、オスシラトリア属（Ｏｓｃ
ｉｌｌａｔｏｒｉａ　　ｓｐ。

）ＡＴＣＣ２７９０６などが挙げられ、また、光合成細
菌類としては、例えば、ハロバクテリウム、］（Ｈａｌ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｓｐ、）　、ロドシュードモ
ナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｓｐ、
）　、ロドスピリラム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕ
ｍ　　ｓｐ、）があり、具体例としては、ハロバクテリ
ウム・クチルブルム（Ｈａ　１ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３３１７０、ハ
ロバクテリウム・メディテラネイ（Ｈａｌｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）ＡＴＣＣ３３５０
０，ハロバクテリウム・サラカルホルム（Ｈａｌｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｎ　ｓａｃｃｈａｒｏｖｏｒｕｍ）　Ａ　
Ｔ　ＣＣ２９２５２＋ハロバクテリウム・サリナリウム
（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｌｉｎａｒｉｕｍ）
　Ａ　Ｔ　ＣＣ１９７００、ハロバクチリウム・ソドメ
ンセ（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｏｄｏｍｅｎｓ
ｓ）ＡＴＣＣ３３７５５、ロドシュードモナス響アシド
フイラ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｔ＋ｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉ
ｄｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ２５０９２、ロドシュードモ
ナス・ルテイラ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ｒｕｔｉｌａ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８７２、ロドシュー
ドモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　５ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１７
０２４、ロドシュードモナス・ビリディス（Ｒｈｏｄｏ
ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖｉｒｉｄｉｓ）　Ａ　Ｔ　
ＣＣ１９５６７、ロドシュードモナス・プラスチイカ（
Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ　ｂｌａｓｔｉｃ
ａ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３３４８５、ロドスピリラム・モリ
シアナム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｍｏｌｉｓｃ
ｈｉａｎｕｎ＋）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１４０３１、ロドスピ
リラム・ホトメトリクム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕ
ｍ　ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｕｍ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ２７
８７１、ロドスピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉ
ｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕｍ）　ＡＴＣＣ２７７、ＡＴ
ＣＣ１７０３１，ロドスピリラム・テヌエ（Ｒｈｏｄｏ
ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｔｅｎｕｅ）　Ａ　ＴＣＣ２５０
９３などが挙げられる。また、光合成原核微生物は、上
記した微生物あるいはその変種や変異株に限ることなく
、天然から分離した海洋性、淡水性の光合成原核微生物
も含まれる。

光合成原核微生物の培養は、通常、無機塩類等を含む培
地を用い、タンク培養あるいは太陽光を利用した屋外開
放培養で行い得るが、本発明においては、目的とする光
合成原核微生物が天然にある程度豊富に存在するならば
、その微生物の生育存在する海水あるいは淡水を培養液
とすることができる。

光合成原核微生物培養濾液は上述した培養法で得られる
培養液を遠心分離あるいは濾過などを行って取得される
が、目的とする培養濾液の生物活性が弱い場合は、前記
濾液を減圧濃縮などにより濃縮して用いてもかまわない
。この際、濃縮倍率が大きくなり塩濃度が高くなると植
物組織に悪影響を与えることがあるので、電気透析など
で植物組織に悪影響がなくなるまで脱塩して使用するの
が望ましい。

また、光合成原核微生物の抽出物は、前記のようにして
得られた菌体または適度に破砕した菌体を常温または加
熱した適当な溶媒と接触させて行い得たものであるが、
ここで用いる溶媒としては、菌体によって種々の溶媒を
単独または複数併用してかまわないが、一般的には水性
溶媒が好ましい。

例えば水性溶媒としては、水単独あるいは酸、塩基、塩
類、もしくは有機溶媒を溶解した溶液などがある。また
、メタノール、エタノール、酢酸エチルエステル、エー
テル等の有機溶媒で抽出後、有機溶媒を除去後水に溶解
させてもよい。

上述した方法により得られた光合成原核微生物培養濾液
あるいは光合成原核微生物抽出物から有機溶媒抽出によ
る分画により塩基性物質を得るための方法は、「物質の
単離と精製Ｊ　　（１９７６年発行、大竹、鈴木、高橋
、室状、米原、東京大学出版会）ｐ２５−ｐ３１に記載
の一般的理論と分画方法に基づいて行うことが可能であ
る。一般的な分画操作では、試料水溶液に塩酸などの酸
を加えてｐＨ３に調整後、適当な有機溶媒を加え酸性物
質を抽出する。次に、水層のｐＨを水酸化ナトリウムな
どのアルカリを加えてｐＨ１２に調整し）ｊ 適当な有機溶媒を加えて塩基性物質を抽出する。

この分画操作は、常法とも言えるものであるので目的に
応じて適宜ｐＨなどの諸条件をかえて抽出を行っても差
し支えない。分画に用いる有機溶媒としては、エチルエ
ーテル、クロロホルム、酢酸エチル、ブタノールなどを
用いることが多いが、適当な溶媒を適宜選択して用いる
ことができる。

また、上述した方法で得られた塩基性画分から有機溶媒
を除去後、水に溶解させて用いてもよい。

このようにして得られた光合成原核微生物培養濾液ある
いは抽出物またはこれらから得られた塩基性物質を添加
する形態としては、上述した溶液の形態で添加してもよ
いし、これらを適宜濃縮あるいは希釈して使用できる。

さらに、これらの培養濾液あるいは抽出液または塩基性
物質を含む分画液を減圧乾燥、凍結乾燥、噴震乾燥等に
より乾燥し粉末としても使用できる。光合成原核微生物
培養濾液及び／又は光合成原核微生物抽出物の基本培地
への添加量は、０．０００１〜５０％で使用目的、使用
方法によって適宜選択できるが、望ましくは０．００１
〜１０％である。また、光合成原核微生物培養濾液ある
いは光合成原核微生物抽出物から得られた塩基性物質の
基本培地への添加量は、０．０１−１０１−１Ｏ００ｐ
ｐ／ｌ）で使用目的、使用方法によって適宜選択できる
が、望ましくは０．１１−３００ｐｐである。

以上述べた、光合成原核微生物培養濾液及び／又は光合
成原核微生物抽出物や光合成原核微生物培養濾液あるい
は光合成原核微生物抽出物から得られた塩基性物質を不
定胚生長促進剤として基本培地に添加し、その培地によ
り不定胚を誘導、生長させる為の培養を行うのであるが
、基本培地、培養方法などは通常の植物組織培養におけ
るものと同様で良い。すなわち基本培地としては、ムラ
シゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）　＆スクーグ（Ｓ　ｋｏｏ
ｇ）培地が代表的なものとして挙げられるが、その他の
植物組織培養に適した種々の培地、あるいはそれらの改
変培地を適宜選択して使用できる。更に、通常の培養に
使用される植物ホルモン、ココナツツミルク、カゼイン
分解物や酪母抽出物々を目的に応じて併せて添加しても
よい。

本発明において培養の対象となる植物としては、特に制
限はなく、全ての植物に適用可能である。

また、これらの植物の茎頂、体眠芽、側芽、胚、種子、
胚軸、子葉、茎、などの組織が適用可能で、更にこれら
組織の初代培養体、継代培養体も用いることができる。

（実施例） 以下、実施例によってさらに詳しく説明するが。

これによって限定されるものではない。

（１）光合成原核微生物培養濾液、光合成原核微生物抽
出物、光合成原核微生物培養濾液中の塩基性物質及び光
合成原核微生物抽出物中の塩基性物質の調整 シアノバクテリア類としてシネココツカス属（Ｓｙｎｅ
ｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　　ｓｐ、）　　ＡＴＣＣ２７１９
２、ロドシュードモナス・プラスチイカ（Ｒｈｏｄｏｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｂｌａｓｔｉｃａ）　　ＡＴ
ＣＣ３３４８５を用いて調製した。

前記光合成原核微生物をＡＴＣＣ指定の培養条件にて培
養後、培養液を遠心濾過し濾液を得、エバポレイターで
１００倍に濃縮した。この濃縮液をモザイク荷電膜脱塩
器（デザルトン　ＤＳ−１０３：東ソー株式会社）で脱
塩し、０．４５μｍのメンツブランンフィルターを用い
て濾過し、得られた濾液を光合成原核微生物培養濾液と
した。

光合成原核微性物抽出物は菌体を集菌後凍結乾燥し、水
に対して３％になるように菌体を’ＭＳさせ、１００℃
で６０分間熱水抽出し、遠心分離して上澄液を０．４５
μｍメンブランフィルタ−にで濾過して得た。

光合成原核微生物培養濾液あるいは光合成原核微生物抽
出物からの塩基性物質の調製は以下のように行った。上
述した光合成原核微生物培養濾液及び光合成原核微生物
抽出物それぞれにＩＮの塩酸を加えてｐＨ３に調整後、
クロロホルムを加え酸性物質を抽出した。次に、それぞ
れの水層のｐＨをＩＮの水酸化ナトリウムを加えてｐＨ
１２に調整し、クロロホルムを加えて塩基性物質を抽出
した。得られた塩基性物質は、クロロホルムを減圧蒸留
して除去しｐＨ４の超純水に溶解し、その後凍結乾燥を
行い、供試塩基性物質とした。

（２）ニンジン培養細胞の作製と不定胚の培養ニンジン
の無菌種子の芽生えにおいて胚軸が１０ｃｍ位に生長し
たものを約１ｃｍ位に切断し、下記培地中で２５℃、暗
条件下で培養した。培地は、基本培地としてムラシゲ（
Ｍｕｒａｓｉｇｅ）　＆スクーグ（Ｓ　ｋｏｏｇ）培地
を使用し、これに植物ホルモンのオーキシン類である２
、４−Ｄを１　ｍ　ｇ　／　ｌの濃度で添加しｐＨ５，
５−５，７に調整したものである。得られたカルスを液
体培養にて継代培養し、不定胚の形成に用いた。

不定胚は植物ホルモンである２、４−Ｄ　を含まない前
記基本培地を用いて１４日間、２５℃、暗条件下で液体
振盪培養することで誘導された。以下の実験では、１４
８μｍのナイロンメツシュを用いて１４８μｍ以上に生
長した不定胚のみを選別し使用した。得られた不定胚の
ほとんどは、球状から初期の心臓型胚であった。

実施例１ （２）で得られた不定胚を生長、あるいは植物体にまで
再生させる際に光合成原核微生物培養濾液、光合成原核
微生物抽出物およびそれらの塩基性画分の添加による影
響を調べた。

得られた不定胚を生長させるため植物ホルモンを含まな
いムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）　＆スクーグ（Ｓ　
ｋｏｏｇ）培地で液体振盪培養した。この際、（１）で
調製された光合成原核微生物培養濾液、光合成原核微生
物抽出物を１．５％添加した培地。

光合成原核微生物培養濾液あるいは光合成原核微生物抽
出物から得られた塩基性物質を１１００ｐｐ添加した培
地と比較例として無添加の培地を用いて、２５℃、明条
件下（２０００ルツクス、１２時間照明）で１ケ月間培
養した結果を表に示す。

（以下余白） 生長した不定胚とは、不定胚の長さが５ｍｍ以上に生長
したものである。

（）内の数値は、芽、根の再生が確認出来た（発明の効
果） 光合成原核微生物培養濾液及び／又は光合成原核微生物
抽出物や光合成原核微生物培養濾液あるいは光合成原核
微生物抽出物から得られた塩基性物質を含む培地を用い
て不定胚を培養することによって、不定胚の生長を効率
よく行わせることができる。　従って、クローン植物大
量増殖法のひとつである不定胚を経由する植物体再生を
効率よく行うことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）植物組織培養技術を用いて植物組織あるいは培養細
   胞から不定胚を誘導後、生長させる際に、不定胚生長促
   進剤として光合成原核微生物培養濾液及び／又は光合成
   原核微生物抽出物を用いることを特徴とする不定胚生長
   促進剤。 ２）光合成原核微生物はシアノバクテリア類及び／又は
   光合成細菌類である特許請求の範囲第１項記載の不定胚
   生長促進剤。 ３）有効成分が塩基性物質である特許請求の範囲第１項
   記載の不定胚生長促進剤。