JPH0240986B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はあるアミノ酸配列を包含する合成ポリ
ペプチドからなる癌診断剤に関する。 スエーデン特許出願第73―08917―９号および
米国特許第3960827号各明細書には、癌関連ポリ
ペプチド抗原（CAPA）、その単離技術および癌
診断および抗体の製造におけるその使用が記載さ
れている。CAPAは現在では、TPAの名称で市
販されており、これは「組織ポリペプチド抗原」
の意味である。前記スエーデン特許出願明細書お
よび米国特許明細書から明らかなように、天然抗
原の単離は複雑な操作であり、これは実際的に有
用な生成物を与えるにしても、高い製造コストを
伴ないそして更に必要な出発原料例えば腫瘍組織
その他の入手に困難さを伴なう。この背景に対し
て、合成的に製造される抗原は、厳密に規定され
た組成の生成物をそれによつて得ることができる
故に非常に魅力的であろう。こうした生成物はま
たより好ましい価格で製造されうる。 本発明の主たる目的は前記特許明細書記載のポ
リペプチド抗原により産生される抗体と単一特異
的に反応する抗原的に活性な合成ポリペプチドを
提供することである。 本発明によれば、アミノ酸配列すなわち Ｈ―Asp―Ala―Glu―Gln―Arg―Gly―Glu―
Leu―Ala―Ile―Arg―Asp―Ala―Asn―Ala―
Arg―Leu―Ser―Glu―Leu―OHを含む抗原的
に活性な合成ポリペプチドが提供される。 本発明の好ましい態様によれば、活性成分また
は免疫決定群として次のアミノ酸配列（）すな
わち Ｈ―Asp―Ala―Glu―Gln―Arg―Gly―Glu―
Leu―Ala―Ile―Arg―Asp―Ala―Asn―Ala―
Arg―Leu―Ser―Glu―Leu―Glu―Ala―Ala―
Leu―Gln―Arg―Ala―Lys―Gln―Asp―OHを
含有する抗原的に活性な合成ポリペプチドが提供
される。 本発明のその他の好ましい態様によればそのポ
リペプチドは次のアミノ酸配列（）すなわち Ｈ―Ala―Ser―Leu―Glu―Ala―Ala―Ila―
Ala―Asp―Ala―Glu―Gln―Arg―Gly―Glu―
Leu―Ala―Ile―Arg―Asp―Ala―Asn―Ala―
Arg―Leu―Ser―Glu―Leu―OH を含有する。 以後本明細書中では、アミノ酸に対して次の略
号が使用される。 アラニン Ala アスパラギン酸 Asp アルギニン Arg ダルタミン Gln アスパラギン Asn ダルタミン酸 Glu グリシン Gly バリン Val イソロイシン Ile スレオニン Thr セリン Ser フエニルアラニン phe ロイシン Leu リジン Lys チロシン Tyr 本発明はまた抗原的に活性なポリペプチドの製
造法にも関する。而してその方法においては、Ｎ
―保護アミノ酸をエステル化によつて樹脂に結合
させ、Ｎ―保護基を除去し、そして第２のＮ―保
護アミノ酸を樹脂結合アミノ酸のアミノ基にカツ
プリングさせ、そのＮ―保護基を除去し、そして
第３のＮ―保護アミノ酸を使用してこのカツプリ
ング段階をくりかえす。この方法における保護基
は通常の基でありそしてこれは以下に一層完全に
記載されている。所望のアミノ酸配列が得られる
までこの方法をくりかえしそして次いでポリペプ
チドを樹脂から切断させる。樹脂結合アミノ酸へ
のＮ―保護アミノ酸の結合を行わせるごとに、そ
の後ですべての副生成物および未反応可溶性物質
を洗去することが好ましい。 この合成に使用される樹脂はスチレンが共重合
体の主部分を構成するような例えば約98重量％の
スチレンおよび約２重量％のジビニルベンゼンの
ようなスチレンジビニルベンゼン共重合体より構
成されうる。 第１のアミノ酸にカツプリングさせるための反
応性基を与えるために、ベンゼン環は適当には部
分的にクロロメチル化されている。このクロロメ
チル化樹脂をＮ―保護アミノ酸のトリエチルアミ
ン塩で処理した場合、ベンジルエステルタイプの
結合が生成される。そのような結合はこの合成段
階では安定であるが、しかしこれは酢酸またはト
リフルオロ酢酸中のHBrにより切断されうる。
Ｎ―保護基は同時に除去されそしてポリペプチド
は樹脂から分離される。 アミノ酸のＮ―末端部分の保護のためには、適
当には第３級ブチルオキシカルボニル基を使用し
うる。その理由はそれが酢酸中のHClにより便利
に切断されるからである。この目的のためにはカ
ルボベンゾキシ基を使用することもまた可能であ
る。しかしながらこの場合には保護基の除去のた
めには酢酸中のHBrを使用しなくてはならない。
保護基としては、ｏ―ニトロフエニルスルフエニ
ル基も使用しうる。その他の保護基もまた使用で
き、そしてこれらは当業者には明白であろう。 この合成において最もひんぱんに使用されるカ
ツプリング剤はジシクロヘキシルカルボジイミド
である。溶媒としてメチレンクロリドが使用され
そして約50％過剰の第３級ブチルオキシカルボニ
ルアミノ酸およびジシクロヘキシルカルボジイミ
ドが使用される場合には、数分以内に定量的反応
が得られる。溶媒としてジメチルホルムアミドさ
えも使用しうる。合成法に関する更に詳細は
「protein Sequence Determination」（Springer
―Verlag1970年版）の特に第308〜310頁に見出
すことができる。その他のカツプリング剤もまた
適当であり、そしてこれらは当業者には明白であ
ろう。 ここに次の実施例により本発明を更に説明する
がこれらは本発明の限定するものではない。 例 １ メリフイールド（Merrifield）氏による固相法
（前掲文献参照）によつて次の生成物を製造する。 式中、Ｒは樹脂を表わし、Bocは第３級ブチル
オキシカルボニル基であり、

【式】そして R₂₅＝Ｈである。 第３級ブチルオキシカルボニル基と樹脂部分と
の間のアミノ酸配列はアミノ酸に関する前記の略
号を使用して次のように表わすことができる。 ―Asp―Ala―Glu―Gln―Arg―Gly―Glu―
Leu―Ala―Ile―Arg―Asp―Ala―Asn―Ala―
Arg―Leu―Ser―Glu―Leu―Glu―Ala―Ala―
Leu―Gln―Arg―Ala―Lys―Gln―Asp（） 0.4ミリモルのBoc―アスパラギン酸β―ベン
ジルエステルα―（樹脂ベンジルエステル）をベ
ツクマンペプチド合成装置のキユベツトに移し、
そしてメチレンクロリド（CH₂Cl₂）中で膨潤さ
た。メチレンクロリド中で過剰のトリフルオロ酢
酸で処理することによつて保護基であるBoc基を
除去した。メチレンクロリドで洗浄した後、トリ
メチルアミンで樹脂を中和し、そして再びメチレ
ンクロリドで洗つた。Ｎ―Boc―グルタミン酸ベ
ンジルエステル（カツプリング段階１）およびシ
クロヘキシルカルボジイミドをCH₂Cl₂に溶解さ
せて添加しそしてこの混合物を30分間撹拌した。
樹脂を洗いそしてこのカツプリング段階をくりか
えした。これは前記の段階１におけるR₂の導入
を停止させる。 合成の第２段階はＮ―末端アミノ酸からＮ―
Bocを除去しそして他のＢ―Boc―アミノ酸を使
用してカツプリング段階をくりかえすことにより
開始される。前記アミノ酸配列の構成のために
は、次の各段階で次の試薬が使用される。 第２段階Ｎ―Boc―グルタミン―キサントヒドリ
ル誘導体 第３段階α、Ｎ―Boc―ε（ｏ―クロロ―カルボ
ベンゾキシ）リジン 第４段階 Ｎ―Boc―アラニン 第５段階 Ｎ―Boc―Ｇ―トシルアルギニン 第６段階 第２段階と同じ 第７段階 Ｎ―Boc―ロイシン 第８段階 第４段階と同じ 第９段階 第４段階と同じ 第10段階Ｎ―Boc―グルタミン酸γ―ベンジルエ
ステル 第11段階 第７段階と同じ 第12段階 第10段階と同じ 第13段階 Ｎ―Boc―セリン―ベンジルエーテル 第14段階 第７段階と同じ 第15段階 第５段階と同じ 第16段階 Ｄ：ｏ第４段階と同じ 第17段階Ｎ―Boc―アスパラギン―キサントヒド
リル誘導体 第18段階 第４段階と同じ 第19段階Ｎ―Boc―アスパラギン酸β―ベンジル
エステル 第20段階 第５段階と同じ 第21段階 Ｎ―Boc―イソロイシン 第22段階 第４段階と同じ 第23段階 第７段階と同じ 第24段階 第10段階と同じ 第25段階 Ｎ―Boc―グリシン 第26段階 第５段階と同じ 第27段階 第２段階と同じ 第28段階 第10段階と同じ 第29段階 第４段階と同じ 第30段階 第19段階と同じ 保護樹脂結合ペプチドから保護基を除去し、０
℃で30分無水弗化水素酸を使用して樹脂を切断さ
せ、そして10重量％の酢酸水性溶液を使用して樹
脂からペプチドを抽出する。蒸発後、その残渣を
0.1M NH₄HCO₃中でセフアデツクスG25フアイ
ン上でゲル過することによつて精製する。ペプ
チドの凍結乾燥後、セフアデツクスG25およびセ
フアデツクスG50を使用したゲル過により測定
した場合に約3300の分子量と共に満足すべきアミ
ノ酸分析結果が得られる。理論的分子量値は
3320.80である。 天然癌抗原で標識したタンニン処理羊赤血球と
天然癌抗原（CAPAまたはTPA）を使用して産
生させた抗体との間の血球凝集反応の阻害能力に
関して、前記により製造されたポリペプチドを検
査した。この技術に関しては、前記スエーデン特
許出願第73―08917―９号および米国特許第
3960827号各明細書を参照することができる。こ
のポリペプチドの比活性は約0.2単位／mg（Ｕ／
mg）であることが見出された。比活性に対する前
記単位は、最小数すなわち最低量の抗体（最大抗
体希釈）により完全に凝集が生ぜしめられるよう
に10⁹個の羊赤血球細胞を標識するに必要な活性
ポリペプチド量の1/6として定義される。 前記の基本構造を有するポリペプチドの活性に
対してどの官能分が臨界的であるかを調べる目的
で、ある種の実験を実施した。すなわちPH13にお
いてシクロヘキサンジオンでアルギニンを閉塞
（ブロツク）すると、ほとんど完全な活性の喪失
を生じた。しかしこのポリペプチドを同一期間の
間PH13の塩基性環境においただけの場合には、ほ
んのわずかな活性しか失われない。このことは本
発明のポリペプチド中でのアルギニンの存在が抗
原活性に決定的に重要なものであるという事実を
示している。 その構造の特性から、このポリペプチドが酸性
的性質を有していることが明白であり、従つて中
性溶液中ではそのアルギニン部分では正の荷電を
保持しつつ負に荷電していることが明白である。 このポリペプチドの孔原性に対する化学的基盤
は、即ち前記に記載されている。小さな決定基の
故にその活性はハプテン的性質のものであるとい
うことのできる、合成的に製造された生成物によ
り得られた顕著な比活性は、免疫および試験すな
わち癌分野での診断への応用に関して開拓的進歩
を構成するものである。 明らかにそして免疫学においての知識によれ
ば、抗原活性はハプテン的決定基の構造のみなら
ずポリペプチドのサイズの函数でもある。しかし
ながら前記サイズはペプチドの特異性には影響せ
ず、活性程度にのみ影響する。すなわちより大な
る分子はより小なる分子よりも一層活性となる傾
向がある。従つて、ポリペプチドを適当な免疫学
的に活性な担体例えば蛋白質例えばアルブミン例
えば卵白上に配置した場合には、改善された活性
が得られる。しかしながら基本的構造形態にある
（すなわち少くとも20個のアミノ酸単位を有する）
ポリペプチドはすでにポリペプチドを相当する抗
体と反応させうるに充分なだけの抗原活性を示
す。更に、このポリペプチドは抗体産生に使用す
ることができる。しかしこれにはこのポリペプチ
ドを担体またはいわゆる「シユレツパー
（Schlepper）抗原」として作用する適当な蛋白
質例えば豚血清にカツプリングさせることを必要
とする。 前記例１においては、合成ポリペプチドの抗原
活性は次のようにして決定される。 ポリペプチド量の定量的測定のためには、ペプ
チド７mgを、1.4mlのバツフアー級血清すなわち
２％不活性人血清を含有しそして燐酸バツフア―
で約7.5のPHに緩衝された生理食塩水に溶解させ
る。段階的な一連の希釈を行つて漸減量のポリペ
プチド濃度を有する一連の試料溶液を調製しそし
て前記試料の各々にTPAに特異的は抗体を含有
する前以つて定めた量の抗血清を加える。得られ
た試料の各々に、培養後、粒上担体に付着させた
前以つて定めた量のポリペプチドを加え、そして
有効抗体量に相当する程度の血球凝集反応を行わ
せる。平行して、既知の漸減量のTPAを含有す
る相当する一連の対照試料を準備する。次いで対
照試料の血球凝集沈着物の直径を対照試料のそれ
と視覚的に比較して活性を推定する。 例 ２ 例１と同一の方法で次のポリペプチドを製造
し、そしてこれが例１のポリペプチドと大約等し
い免疫学的活性であることが見出された。 式中、Ｒは樹脂を意味し、Bocは第３級ブチル
オキシカルボニル基であり、 R₁₂＝R₆、 R₁₃＝R₁、 R₁₄＝R₂、 R₁₅＝Ｈ、 R₁₆＝R₅、 R₁₈＝R₂、 R₁₉＝R₆、 R₂₀＝R₉、 R₂₁＝R₆、 R₂₂＝R₁₁、 R₂₃＝R₂₄＝R₆、 R₂₅＝R₂、 R₂₆＝R₁、 R₂₇＝R₃、 R₂₈＝R₆ である。 第３級ブチルオキシカルボニル基と樹脂部分と
の間のアミノ酸配列はアミノ酸に関する前記の略
号を使用して次のように表わすことができる。 ―Ala―Ser―Leu―Glu―Ala―Ala―Ile―Ala
―Asp―Ala―Glu―Gln―Arg―Gly―Glu―Leu
―Ala―Ile―Arg―Asp―Ala―Asn―Ala―Arg
―Leu―Ser―Glu―Leu― （） 0.4ミリモルのBoc―ロイシンをベツクマンペ
プチド合成装置のキユベツトに移し、そしてメチ
レンクロリド（CH₂Cl₂）中で膨潤させた。メチ
レンクロリド中で過剰のトリフルオロ酢酸で処理
することによつて保護基たるBoc基を除去した。
メチレンクロリドで洗浄した後、トリメチルアミ
ンで樹脂を中和しそして再びメチレンクロリドで
洗つた。Ｎ―Boc―グルタミン酸ベンジルエステ
ル（カツプリング段階１）およびシクロヘキシル
カルボジイミドをCH₂Cl₂に溶解させて添加し、
そしてこの混合物を30分間撹拌した。樹脂を洗
い、そしてこのカツプリング段階をくりかえし
た。これは前記の段階１におけるR₂の導入を停
止させる。 合成の第２段階はＮ―末端アミノ酸からＮ―
Bocを除去し、そして他のＮ―Boc―アミノ酸を
使用してこのカツプリング段階をくりかえすこと
により開始される。前記アミノ酸配列の構成のた
めには次の段階で次の試薬が使用される。 第２段階Ｎ―Boc―グルタミン酸γ―ベンジルエ
ステル 第３段階 ―Boc―セリン―ベンジルエーテル 第４段階 Ｎ―Boc―ロイシン 第５段階 Ｎ―Boc―Ｇ―トシルアルギニン 第６段階 Ｎ―Boc―アラニン 第７段階Ｎ―Boc―アスパラギン―キサントヒド
リル誘導体 第８段階 Ｄ：０第６段階と同じ 第９段階Ｎ―Boc―アスパラギン酸β―ベンジル
エステル 第10段階 Ｄ：０第５段階と同じ 第11段階 Ｎ―Boc―イソロイシン 第12段階 Ｄ：０第６段階と同じ 第13段階 Ｄ：０第４段階と同じ 第14段階 Ｄ：０第２段階と同じ 第15段階 Ｎ―Boc―グリシン 第16段階 Ｄ：０第５段階と同じ 第17段階Ｎ―Boc―グルタミンキサントヒドリル
誘導体 第18段階 Ｄ：０第２段階と同じ 第19段階 Ｄ：０第６段階と同じ 第20段階 Ｄ：０第９段階と同じ 第21段階 Ｄ：０第６段階と同じ 第22段階 Ｄ：０第11段階と同じ 第23段階 Ｄ：０第６段階と同じ 第24段階 Ｄ：０第６段階と同じ 第25段階 Ｄ：０第２段階と同じ 第26段階 Ｄ：０第４段階と同じ 第27段階 Ｄ：０第３段階と同じ 第28段階 Ｄ：０第６段階と同じ 得られた保護された樹脂結合ペプチドを次いで
例１の方法により処理しそして分析する。 セフアデツクスG25およびセフアデツクスG50
を使用したゲル過により測定された分子量は約
3000であり、一方理論分子量は2936.38である。 前記例１および例２のポリペプチドに関して実
施されたアミノ酸分析の結果は次の表に要約され
ている。アミノ酸分析はMoore and Steinのア
ミノ酸分析法による常法に従つて実施された。そ
こに与えられる数字は各アミノ酸のモル％すなわ
ちペプチド中の100個のアミノ酸当りのそれぞれ
のアミノ酸の数を意味している。表に与えられて
いる数字は理論値に満足に合致する

【表】 本発明は決して前記具体例に限定されるもので
はない。すなわち、ポリペプチド製造において
は、樹脂は、ベンゼン環を含有し且つ更にエステ
ル化によりＮ―保護アミノ酸を結合させる能力を
有する少くとも一つの基を含有する任意の物質で
ありうる。そのエステル結合は比較的容易に加水
分解されなくてはならず、そして勿論これはポリ
ペプチド中のペプチド結合よりも一層容易に切断
されなくてはならない。しかしながらそのエステ
ル結合は合成下の反応条件に耐え得るに充分なだ
け安定でなくてはならない。 グルタミンおよびアスパラギン単位の結合の場
合には、前記カツプリング剤のジシクロヘキシル
カルボジイミドの代りに、カツプリングをいわゆ
る活性エステル例えばシアノメチル、チオフエニ
ルまたはニトロフエニルエステルを使用して実施
することができる。合成の溶媒としては、いわゆ
る中性溶媒特にいくらか親水性または「半極性」
である溶媒が適当である。 Ｎ―アミノ酸の保護のために有用な基に関して
は、１個または２個のメチル基がフエニルにより
置換された第３級ブチルオキシカルボニル基を有
利に使用しうることが認められている。これに関
しては、合成により得られる生成物は、Ｎ―保護
基を与えられそしてエステル化により樹脂に結合
されるということ、そして有利には分解されるこ
となく長期間保存できるものであることを述べる
ことができる。ポリペプチドの使用に関連して、
保護基および樹脂部分が次いで除去されうる。 本発明の生成物に与えられているアミノ酸配列
においては、末端基（保護基および樹脂部分の除
去後）は常にそれぞれのアミノ基およびカルボキ
シル基である。アミノ基は鎖の左端に見出され、
一方カルボキシル基はアミノ酸配列の反対の端に
見出される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 免疫的に活性の担体に共有結合的に結合せし
   められた、次記すなわち R₁―Asp―Ala―Glu―Gln―Arg―Gly―Glu
   ―Leu―Ala―Ile―Arg―Asp―Ala―Asn―Ala
   ―Arg―Leu―Ser―Glu―Leu―R₂ （式中、R₁はＨまたはＨ―Ala―Ser―Leu―
   Glu―Ala―Ala―Ile―Ala―を表わしそしてR₂
   はOHまたはGlu―Ala―Ala―Leu―Gln―Arg―
   Ala―Lys―Gln―Asp―OHを表わす） のアミノ酸配列で表わされることを特徴とする、
   抗原的に活性な合成ポリペプチドからなる癌診断
   剤。 ２ 担体が蛋白質である、前記第１項記載の癌診
   断剤。 ３ 蛋白質がアルブミンである、前記第２項記載
   の癌診断剤。 ４ 薬物学的に許容しうる担体または希釈剤と組
   合わされた状態でポリペプチドを包含する、前記
   第１〜３項のいずれかに記載の癌診断剤。