JPH05125096A

JPH05125096A - ペプチドおよびそれを含んでなるエイズ診断用要素

Info

Publication number: JPH05125096A
Application number: JP3288159A
Authority: JP
Inventors: Kazuyoshi Ikuta; 和良生田; Takashi Kurimura; 敬栗村; Yoshio Hayashi; 良雄林; Yoshimi Sato; 吉美佐藤
Original assignee: Nippon Steel Corp; Nippon Steel Chemical Co Ltd
Current assignee: Nippon Steel Corp; Nippon Steel Chemical and Materials Co Ltd
Priority date: 1991-11-02
Filing date: 1991-11-02
Publication date: 1993-05-21

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】新規ペプチド、特にエイズの診断に資するこ
とのできるペプチドを提供する。【構成】ＨＩＶに由来するｖｉｆ蛋白質のアミノ酸配
列断片であって、ｖｉｆ１０位〜３０位またはｖｉｆ１
７０位〜１９０位に相当する次の式のペプチドとその誘
導体、およびこれらのペプチドを含むエイズ診断用要
素。 H-Val-Trp-Gln-Val-Asp-Arg-Met-Arg-Ile-Asn-Thr-Trp-
Lys-Arg-Leu-Val-Lys-His-His-Met-Tyr-X［式中、ｘはC
ys-OHあるいは水酸である］、ならびに、Y-Thr-Glu-Asp
-Arg-Trp-Asn-Lys-Pro-Gln-Lys-Thr-Lys-Gly-His-Arg-G
ly-Ser-His-Thr-Met-Asn-Gly-His-OH［式中、ＹはH-Cys
あるいは水素原子である］。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、後天性免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ）を発症するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）に関連する新規なペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＩＶは、強度の免疫不全を誘発するエ
イズ（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスである。現在、完治で
きるような治療薬は未だ無く、感染すれば２〜１０年の
潜伏期間を経てエイズを発症し、致死率は非常に高い。
したがって、本ウイルス感染者において重要なことは、
その病態の変動をモニターして感染者におけるエイズ発
病を抑制することである。

【０００３】そこで、病態マーカーとしてのＨＩＶ抗体
価の変動が検討され、一般に症状の発現に従い、ｇａｇ
蛋白質に対する抗体価が低下する〔K.S.Steimer, et a
l, Virology, 150 , 283-290(1986) 〕のに対して、ｖ
ｉｆ蛋白質に対する抗体価は上昇する傾向〔S.K.Arya a
nd R.C.Gallo, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 2209-221
3 (1986), K.N.Kan, et al, Science, 231, 1553-1555
(1986) 及びT-H.Lee, etal, 同、vol.231, 1546-1549,
(1986）〕が報告されている。一方、ＨＩＶ感染者のエ
イズ症状の発現と、ＨＩＶの分離率は、様々な条件によ
り左右されるものの、有意の相関が認められている〔M.
J.McElrath,et al, Proc.Natl.acad.Sci.USA, Vol.86,
675-679,(1989)および立野佳子ほか、臨床血液、３２
巻、１２１−２２６項（１９９１）参照〕。

【０００４】また、ＨＩＶにはウイルス発現に関する約
６種類の機能調節蛋白質が存在し、これらの蛋白質がウ
イルスの発現および患者でのエイズ発症に機能している
ことが考えられている。

【０００５】ＨＩＶ感染者のエイズ発症を極力遅らせる
ためには、病態の変動をモニターし、病状に相応する有
効な治療が肝要であるが、現在、病状を的確にモニター
する有効かつ簡便な診断法は、主としてリンパ球のＣＤ
４／ＣＤ８比に頼っているに過ぎない。また、ＨＩＶの
分離率は上記のごとく病状の進行とともに上昇する傾向
が認められるが、簡便な方法ではなく、常時感染者をモ
ニターすることは難しい。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規ペプチ
ド、特にエイズの診断に資することの可能なペプチドを
提供するものである。さらにはこれらを用いてエイズの
進行をモニターする方法を開発せんとするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段および作用】本発明者ら
は、ウイルスの機能調節蛋白質の病態マーカーとしての
有用性を検索するために、各調節蛋白質の区分ペプチド
を化学合成し、それらペプチドを認識する患者血清中の
抗体の有無と、ＨＩＶ分離を指標とした病態の進行との
相関性を検討してきた。その過程において、ｖｉｆ蛋白
質のＮ端側ペプチドおよびＣ端ペプチドを有するある特
定のペプチドが患者血清中の抗体と明瞭に反応し、さら
にその抗体価が病状の進行（ＨＩＶ分離率の上昇）にと
もない上昇することを見い出し、両ペプチドが病態マー
カーとして有用であることを確認し、ここに本発明を完
成するに至った。

【０００８】従って、上記課題は、ＨＩＶに由来するｖ
ｉｆ蛋白質のアミノ酸配列断片に相当するペプチドおよ
びその誘導体であって、下記式（Ｉ）および（II）で表
わされるペプチド類からなる群より選ばれる新規ペプチ
ドの提供、ならびにそれらのエイズ診断への使用によっ
て解決される。

【０００９】H-Val-Trp-Gln-Val-Asp-Arg-Met-Arg-Ile-
Asn-Thr-Trp-Lys-Arg-Leu-Val-Lys-His-His-Met-Tyr-X
〔式中、ｘはCys-OHあるいは水酸基である〕、ならび
に、（Ｉ） Y-Thr-Glu-Asp-Arg-Trp-Asn-Lys-Pro-Gln-Lys-Thr-Lys-
Gly-His-Arg-Gly-Ser-His-Thr-Met-Asn-Gly-His-OH〔式
中、ＹはH-Cys あるいは水素原子である〕。（II）

【００１０】上記式（Ｉ）および（II）で表わされる本
発明のペプチドは、ｖｉｆ蛋白質の１０位〜３０位およ
び１７０位〜１９２位のアミノ酸配列にそれぞれ相当す
るが、起源によって限定されるものでない。かかるペプ
チドのうち、それらのＣ末端またはＮ末端に結合するシ
ステイン（Ｃｙｓ）残基は、本発明のペプチドの作用を
阻害することなく、アッセイ用の標識酵素または高分子
蛋白質との選択的な架橋に利用できるので、その残基を
有するものが特に有用である。

【００１１】本明細書において、アミノ酸、ペプチド、
保護基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、国
際純正および応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）、国際生化学
連合（ＩＵＢ）の規定或は該当分野における慣用記号に
従うものとし、その例を次に挙げる。またアミノ酸など
に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示すものとする。

【００１２】Ａｒｇ：アルギニンＡｓｎ：アスパラギンＡｓｐ：アスパラギン酸Ｃｙｓ：システインＧｌｎ：グルタミンＧｌｕ：グルタミン酸Ｇｌｙ：グリシンＨｉｓ：ヒスチジンＩｌｅ：イソロイシンＬｅｕ：ロイシンＬｙｓ：リジンＭｅｔ：メチオニンＰｒｏ：プロリンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＴｒｐ：トリプトファンＴｙｒ：チロシンＶａｌ：バリンＢｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニルＢｕ^t：ｔ−ブチルＯＢｕ^t：ｔ−ブチルエステルＭｔｒ：４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニルＦｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニルＭ（Ｂｚｌ）：ｐ−メトキシベンジル

【００１３】本発明の上記式（Ｉ）および（II）で表わ
されるペプチド類は、入手容易な市販のアミノ酸を利用
して、簡単な操作で容易に合成することができ、該ペプ
チドを用いてこれを直接、あるいは適当な標識体を調製
して間接的に、エンザイムイムノアッセイあるいはラジ
オイムノアッセイなどの各種免疫測定法に供し、血清中
の該ペプチドに応答する抗体量を定量することができ
る。これは、ＨＩＶ感染の診断、及び感染患者における
エイズ発症モニターとして、診断薬の開発に有効であ
る。また病状の進行に伴い抗ｖｉｆ抗体価が増加するこ
とは本蛋白質が発病に大きく関与している事を示唆して
いる。従ってｖｉｆペプチドはエイズ発病防止ワクチン
の開発等にも有効に用いることができる。

【００１４】本発明の化合物は、ペプチド化学において
通常用いられる方法、例えば、「ザペプチド（Ｔｈｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」第１巻〔Schroder and Luhke著、
Academic Press, New York, U.S.A.（1966年）〕、「ペ
プチド合成の基礎と実験」〔泉屋信夫ら著丸善（株）(1
985 年）〕などに記載されている方法によって製造する
ことができ、液相法及び固相法のいずれによっても製造
できる。

【００１５】ペプチド結合を形成するための縮合方法と
して、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸
無水物法、カルボジイミド（ＤＣＣ）法、カルボジイミ
ド−アディティブ法、活性エステル法、カルボニルイミ
ダゾール法、酸化還元法、酵素法、ウッドワード試薬Ｋ
を用いる方法等が挙げられる。

【００１６】固相法でペプチド鎖を延長するときは、Ｃ
末端アミノ酸を有機溶媒に不溶な支持体、例えば樹脂に
結合する。アミノ酸を樹脂に結合するために、官能基を
導入した樹脂や、樹脂と官能基の間にスペーサーを挿入
したもの、更に条件によって種々の箇所で切断できる
（ｈａｎｄｌｅ）と称する鎖を導入した樹脂が目的に応
じて用いられる。例えば、クロロメチル樹脂などのハロ
メチル樹脂、オキシメチル樹脂、４−（オキシメチル）
−フェニルアセトアミドメチル樹脂、或は４−（オキシ
メチル）−フェノキシメチル樹脂などを挙げることがで
きる。かかる固相法での縮合法は、主としてＤＣＣ法、
酸無水物法、活性エステル法が用いられる。

【００１７】縮合反応を行なう前に、それ自体公知の手
段により、反応に関与しないカルボキシル基、アミノ基
等を保護したり、また反応に関与するカルボキシル基、
アミノ基を活性化してもよい。カルボキシル基の保護基
としては、例えば、メチル、エチル、ベンジル、ｐ−ニ
トロベンジル、ｔ−ブチル、シクロヘキシル等のエステ
ルを挙げることができる。

【００１８】アミノ基の保護基としては、例えば、ベン
ジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、
イソボルニルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメ
トキシカルボニル基等を挙げることができる。イミダゾ
リル基の保護基としては、例えば、ｐ−トルエンスルホ
ニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ベンジル基、フ
ェナシル基、ベンジルオキシメチル基、ｔ−ブトキシカ
ルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基等
を挙げることができる。

【００１９】水酸基の保護基としては、例えば、ｔ−ブ
チル基、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、アセチ
ル基等を挙げることができる。メルカプト基の保護基と
しては、例えば、トリチル基、アセトアミドメチル基、
ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３−ニトロ−２
−ピリジンスルフェニル基等を挙げることができる。

【００２０】インドール環の保護基としては、例えば、
ホルミル基、メシチレンスルフォニル基等を挙げること
ができる。グアニジノ基の保護基としては、例えば、ニ
トロ基、トシル基、メシチレンスルフォニル基、４−メ
トキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル
基、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−
スルフォニル基等を挙げることができる。アミド基の保
護基としては、例えば、４，４′−ジメトキシベンズヒ
ドリル基、トリチル基等を挙げることができる。

【００２１】カルボキシル基の活性化されたものとして
は、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル
〔アルコール（例、ベンタフルオロフェノール、２，４
−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−
ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ
−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキ
シミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール）とのエステル〕等が挙げられる。
アミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応す
る燐酸アミドが挙げられる。

【００２２】縮合反応は、通常溶媒中で行なわれ、溶媒
としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、酢
酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルス
ルホキシド、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、Ｎ−メチルピロリドン、水、メタノール等の溶媒、
又は、これらの混合物を用いることができる。反応温度
は、一般に使用される約−３０℃〜約５０℃の範囲で行
なうことができる。

【００２３】本発明のペプチドの保護基脱離反応は、使
用する保護基の種類によって異なるが、ペプチド結合に
影響を与えず、保護基が除かれることが必要である。保
護基の脱離法としては、例えば、塩化水素、臭化水素、
無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタ
ンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、又はこれらの混合物
等による酸処理、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
ヒドラジン、ジエチルアミン、ピペリジン等による塩基
処理、液体アンモニア中ナトリウム、パラジウム炭素に
よる還元、及び、トリメチルシリルトリフラート、トリ
メチルシリルブロマイド等のシリル化剤等が挙げられ
る。上記酸及びシリル化剤処理による脱保護基反応にお
いては、アニソール、フェノール、クレゾール、チオア
ニソール、エタンジチオールの如きカチオン補足剤の添
加が有効である。

【００２４】また、固相法で合成したペプチドの樹脂か
らの切断方法としては、上記酸およびシリル化剤処理が
挙げられる。この様にして製造された本発明のペプチド
は、反応終了後、それ自体公知のペプチドの分離手段、
例えば、抽出、分配、再沈澱、再結晶、カラムコロマト
グラフィー等によって収得することができる。

【００２５】また、本発明のペプチドは、その方法の条
件により塩基またはその塩の形で得られる。塩としては
無機酸塩、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、
コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、などの有機酸
との塩である。

【００２６】かくして得られる本発明の合成ペプチド
は、そのまま、または必要に応じて適当な標識を導入し
て免疫測定法の抗原として被検者血清中の抗体価の測定
に利用可能である。即ち本発明のペプチドを、例えば５
０−１００ng／ｗｅｌｌの濃度で９６穴マイクロプレー
ト（コーニング社製あるいは住友ベークライトアミノプ
レートなど）にコートした後、２０００倍希釈した被検
者の血清を反応させ、次ぎに２次抗体として、パーオキ
シダーゼ等で酵素標識した山羊由来抗ヒトイムノグロブ
リン（Ｉｇ）Ｇを反応させ、さらに適当な発色性の酵素
基質を加え、発色させることにより、被検者血清中の該
ペプチドに応答する抗体量を定量することができる。

【００２７】本発明のペプチドは、また、これに
¹²⁵Ｉ，¹³¹Ｉ等の放射性物質やパーオキシダーゼ、キ
モトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グ
リセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、アミラー
ゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−Ｎａｓｅ，Ｐ−Ｎａｓｅ，β
−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−フォスフェート
デハイドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等
の各種酵素試薬等を導入することによっても、ラジオイ
ムノアッセイ又はエンザイムイムノアッセイにおいて用
いられる標識抗原として利用できる。上記放射性物質の
導入は、通常の方法により行なわれる。例えば、放射性
ヨードは、クロラミンＴを用いる酸化的ヨード化法〔W.
M.Hunter and F.C.Greenwood, Nature, 194 , 495,(196
2), Biochem.J., 89, 144(1968)参照〕等によりペプチ
ドに導入される。

【００２８】該方法は具体的には適当な溶媒例えば０．
２Ｍリン酸緩衝液（pH＝０．４）等の溶媒中、クロラミ
ンＴの存在下、室温付近にて１０〜３０秒程度で行なわ
れる。ペプチド、放射生ヨード及びクロラミンＴの使用
割合は、例えばチロシン当り放射性ヨード１個を導入す
る場合には、ペプチド中に含まれるチロシン分子１ナノ
モルに対して放射性ヨードを２ミリキューリー程度、ク
ロラミンＴを１０〜１００ナノモル程度用いるのがよ
い。かくして製造される放射性ヨードにより標識化され
たペプチドは、通常の分離手段例えば抽出、分配、カラ
ムクロマトグラフィー、透析等により単離精製される。
このようにして得られるペプチドは必要ならば凍結乾燥
させて保存しておくこともできる。

【００２９】上記酵素試薬の導入は、通常のカップリン
グ法、例えばエルランガー(B.F.EERLANGER) らの方法
〔Acta, Endocrinol.Suppl., 168, 206(1972〕及びカロ
ール(M.H.KAROL) らの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,
57 , 713(1967）〕等の公知の方法によって製造され
る。即ち本発明のペプチドと酵素とをＮａＩＯ₄等の酸
化剤の存在下、pH４〜６の緩衝液、例えば１mM酢酸緩衝
液（pH４．４）中で、室温付近で、２〜５時間程度反応
させ、次いでＮａＢＨ₄等で還元することによって行な
われる。酵素はペプチド１モルに対して、１〜３倍モル
量程度用い得る。酸化剤はペプチドの１００〜３００倍
モル量程度及び還元剤は酸化剤の１〜２倍モル程度用い
られるのが好ましい。かくして製造される酵素により標
識化されたペプチドは、上記放射性ヨード標識ペプチド
と同様にして単離精製及び保存することができる。

【００３０】

【実施例】以下に実施例を示す。実施例１（１．）H-Val-Trp-Gln-Val-Asp-Arg-Met-Arg-Ile-Asn-
Thr-Trp-Lys-Arg-Leu-Val-Lys-His-His-Met-Tyr-OHの合
成

【００３１】ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂
（Ｗａｎｇ−樹脂）と５当量のFmoc-Tyr(tBu)-OHを４，
４−ジメチルアミノピリジン（１当量）の存在下、ジイ
ソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ、５当量）を用
い、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で縮合し、Fmoc
-Tyr(tBu)-Wang樹脂（Ｔｙｒの導入量：０．９７meq ／
ｇ樹脂）を得た。この樹脂（０．２６ｇ、０．２５ミリ
モル）を反応容器にいれて、表１に示す振盪、濾過ステ
ップを繰り返し、Fmoc-Val-Trp-Gln-Val-Asp-(OtBu)-Ar
g-(Mtr)-Met-Arg(Mtr)-Ile-Asn-Thr(tBu)-Trp-Lys(Boc)
-Arg(Mtr)-Leu-Val-Lys(Boc)-His(Boc)-His(Boc)-His(B
oc)-Met-Tyr(tBu)-Wang 樹脂を得た。

【００３２】得られた保護ペプチド樹脂を、ｍ−クレゾ
ール、エタンジチオール存在下に、１Ｍトリメチルシリ
ルブロマイドと１Ｍチオアニソールで、トリフルオロ酢
酸中、０℃で１時間処理した。樹脂を濾去後に、反応液
にジエチルエーテルを加え、樹脂から切断されたペプチ
ドを粉末として得、更にこの粉末をジエチルエーテルで
洗浄した。これをセファデックスＧ−１０を支持体とす
るゲル濾過により脱塩し、凍結乾燥して粗体を得た。得
られた粗体を高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｏ
ＤＳ５Ｃ１８（２０×１５０mm）、移動相：（Ａ）
０．１％ＴＦＡ，（Ｂ）１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％
ＴＦＡ、ｇｒａｄｉｅｎｔ：（Ａ）：（Ｂ）＝７３：
２７から（Ａ）：（Ｂ）＝７０：３０、１８分間、流
速：１７ml）にて精製し、更にセファデックスＧ−２５
を支持体とするゲル濾過により酢酸塩とし、凍結乾燥す
ることにより表題のペプチド（Ｘ＝水酸基）を得た。

【００３３】アミノ酸分析（６ＮＨＣｌ＋ｐｈｅｎｏ
ｌ，２４hr，１１０℃）Ａｓｐ２．０２（２）Ｔｈｒ０．９９（１）Ｇｌｕ１．００（１）Ｖａｌ２．９７（３）Ｍｅｔ２．１０（２）Ｉｌｅ０．９９（１）Ｌｅｕ１．０６（１）Ｔｙｒ１．０２（１）Ｌｙｓ２．０５（２）Ｈｉｓ２．０３（２）Ｔｒｐ − （２）Ａｒｇ２．８４（３）

【００３４】ＨＰＬＣ分析Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲ（４．６×２００m
m）カラムを用い、流速１．０ml／min で、０．１％
ＴＦＡ中アセトニトリル１０−４０％（６０分）のｇｒ
ａｇｉｅｎｔ溶出での分析ＨＰＬＣで保持時間４０．７
分の単一ピークを示した。

【００３５】アミノ酸配列分析ペプチドシークエンサー（アブライドバイオシステムズ
社製）による配列分析の結果、図１に示すようなｖｉｆ
−Ｎ（１０−３０）のアミノ酸配列の分析結果が得ら
れ、本合成品が、表題のペプチド（Ｘ＝水酸基）であ
ることが確認された。

【００３６】ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ計算値２７９６．５、
実測値２７９５．５

【００３７】（２．）H-Val-Trp-Gln-Val-Asp-Arg-Met-
Arg-Ile-Asn-Thr-Trp-Lys-Arg-Leu-Val-Lys-His-His-Me
t-Tyr-Cys-OHの合成

【００３８】ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂
（Ｗａｎｇ−樹脂）と５当量のFmoc-Cys(Mbzl)-OH を
４，４−ジメチルアミノピリジン（１当量）の存在下、
ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ、５当量）
で、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中縮合し、Fmoc-C
ys(Mbzl)-Wang 樹脂（Ｃｙｓの導入量：０．０９meq ／
ｇ樹脂）を得た。この樹脂（２．２ｇ、０．２ミリモ
ル）を反応容器にいれて、表１に示す振盪、濾過ステッ
プを繰返し、Fmoc-Val-Trp-Gln-Val-Asp(OtBu)-Arg-(Mt
r)-Met-Arg(Mtr)-Ile-Asn-Thr(tBu)-Trp-Lys(Boc)-Arg
(Mtr)-Leu-Val-Lys(Boc)-His(Boc)-His(Boc)-Met-Tyr(t
Bu)-Cys(MBzl)-Wang 樹脂を得た。

【００３９】

【表１】

【００４０】得られた保護ペプチド樹脂を、ｍ−クレゾ
ール、エタンジチオール存在下に１Ｍトリメチルシリル
ブロマイドと１Ｍチオアニソールで、トリフルオロ酢酸
中、０℃で１時間処理した。樹脂を濾去後に反応液にジ
エチルエーテルを加え、樹脂から切断されたペプチドを
粉末として得、更にこの粉末をジエチルエーテルで洗浄
した。これをセファデックスＧ−１０を支持体とするゲ
ル濾過により脱塩し、凍結乾燥して粗体を得た。得られ
た粗体を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ
５Ｃ１８（２０×１５０mm）、移動相：（Ａ）０．１
％ＴＦＡ，（Ｂ）１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦ
Ａ、ｇｒａｄｉｅｎｔ：（Ａ）：（Ｂ）＝７３：２７か
ら（Ａ）：（Ｂ）＝７１：２９、１２分間、流速：１７
ml）にて精製し、更にセファデックスＧ−２５を支持体
とするゲル濾過により酢酸塩とし、凍結乾燥することに
より表題のペプチド（ X＝Cys-OH) を得た。

【００４１】アミノ酸分析（６ＮＨＣｌ＋ｐｈｅｎｏ
ｌ，２４hr，１１０℃）Ａｓｐ２．０２（２）Ｔｈｒ１．０２（１）Ｇｌｕ１．００（１）Ｖａｌ２．６８（３）Ｃｙｓ − （１）Ｍｅｔ１．９７（２）Ｉｌｅ０．９５（１）Ｌｅｕ１．０５（１）Ｔｙｒ１．０７（１）Ｌｙｓ１．９２（２）Ｈｉｓ２．０１（２）Ｔｒｐ − （２）Ａｒｇ３．１５（３）

【００４２】ＨＰＬＣ分析Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲ（４．６×２００m
m）カラムを用い、流速１．０ml／min で、０．１％
ＴＦＡ中アセトニトリル１０−４０％（６０分）のｇｒ
ａｇｉｅｎｔ溶出での分析ＨＰＬＣで保持時間３８．６
分の単一ピークを示した。

【００４３】実施例２（１．）H-Thr-Glu-Asp-Arg-Trp-Asn-Lys-Pro-Gln-Lys-
Thr-Lys-Gly-His-Arg-Gly-Ser-His-Thr-Met-Asn-Gly-Hi
s-OHの合成

【００４４】ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂
（Ｗａｎｇ−樹脂）と５当量のFmoc-His(Boc)-OHを４，
４−ジメチルアミノピリジン（１当量）の存在下、ジイ
ソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ、５当量）で、
ＤＭＦ中縮合し、Fmoc-His(Boc)-Wang樹脂（Ｈｉｓの導
入量：０．０９meq ／ｇ樹脂）を得た。この樹脂（２．
２ｇ、０．２ミリモル）を反応容器にいれて、表１に示
す振盪、濾過ステップを繰り返し、Fmoc-Thr(tBu)-Glu
(0tBu)-Asp(0tBu)-Arg(Mtr)-Trp-Asn-Lys(Boc)-Pro-Gln
-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Gly-His(Boc)-Arg(Mtr)-
Gly-Ser(tBu)-His(Boc)-Thr(tBu)-Met-Asn-Gly-His(Bo
c)-Wang 樹脂を得た。

【００４５】得られた保護ペプチド樹脂をｍ−クレゾー
ル、エタンジチオール存在下に、１Ｍトリメチルシリル
ブロマイドと１Ｍチオアニソールで、トリフルオロ酢酸
中、０℃で１時間処理した。樹脂を濾去後に、反応液に
ジエチルエーテルを加え、樹脂から切断されたペプチド
を粉末として得、更にこの粉末をジエチルエーテルで洗
浄した。これをセファデックスＧ−１０を支持体とする
ゲル濾過により脱塩し、凍結乾燥して粗体を得た。得ら
れた粗体を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤ
Ｓ５Ｃ１８（２０×１５０mm）、移動相：（Ａ）０．
１％ＴＦＡ，（Ｂ）１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％Ｔ
ＦＡ、ｇｒａｄｉｎｅｔ：（Ａ）：（Ｂ）＝８８：１２
から（Ａ）：（Ｂ）＝８４：１６、２４分間、流速：１
７ml）にて精製し、更にセファデックスＧ−２５を支持
体とするゲル濾過により酢酸塩とし、凍結乾燥すること
により表題のペプチド（Ｙ＝水素原子）を得た。

【００４６】アミノ酸分析（６ＮＨＣｌ，２４hr，１
１０℃）Ａｓｐ３．０５（３）Ｔｈｒ２．９１（３）Ｓｅｒ０．９３（１）Ｇｌｕ２．００（２）Ｇｌｙ３．０７（３）Ｐｒｏ０．９２（１）Ｍｅｔ１．０２（１）Ｌｙｓ２．８８（３）Ｈｉｓ３．０９（３）Ｔｒｐ − （１）Ａｒｇ２．０１（２）

【００４７】ＨＰＬＣ分析Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲ（４．６×２００m
m）カラムを用い、流速１．０ml／min で、０．１％
ＴＦＡ中アセトニトリル０−４０％（６０分）のｇｒａ
ｇｉｅｎｔ溶出での分析ＨＰＬＣで保持時間２７．１分
の単一ピークを示した。アミノ酸配列分析ペプチドシークエンサー（アブライドバイオシステムズ
社製）による配列分析の結果、図２に示すようなｖｉｆ
−Ｃ（１７０−１９２）のアミノ酸配列の分析結果が得
られ、本合成品が、表題のペプチド（Ｙ＝水素原子）
であることが確認された。

【００４８】ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ計算値２７０２．３、
実測値２７０２．６

【００４９】（２．）H-Cys-Thr-Glu-Asp-Arg-Trp-Asn-
Lys-Pro-Gln-Lys-Thr-Lys-Gly-His-Arg-Gly-Ser-His-Th
r-Met-Asn-Gly-His-OHの合成

【００５０】実施例２−（１）で合成した保護ペプチド
樹脂（Fmoc-Thr(tBu)-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Arg(Mtr)-T
rp-Asn-Lys(Boc)-Pro-Gln-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Lys(Boc)
-Gly-His(Boc)-Arg(Mtr)-Gly-Ser(tBu)-His(Boc)-Thr(t
Bu)-Met-Asn-Gly-His(Boc)-Wang 樹脂）のＮ端に、表１
に示す振盪、濾過ステップを行なうことにより、Fmoc-C
ys(MBzl)-OH を導入し、Fmoc-Cys(MBzl)-Thr(tBu)-Glu
(0tBu)-Asp(0tBu)-Arg(Mtr)-Trp-Asn-Lys(Boc)-Pro-Gln
-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Gly-His(Boc)-Arg(Mtr)-
Gly-Ser(tBu)-His(Boc)-Thr(tBu)-Met-Asn-Gly-His(Bo
c)-Wang 樹脂を得た。

【００５１】得られた保護ペプチド樹脂をｍ−クレゾー
ル、エタンジチオール存在下に、１Ｍトリメチルシリル
ブロマイドと１Ｍチオアニソールで、トリフルオロ酢酸
中、０℃で１時間処理した。樹脂を濾去後に反応液にジ
エチルエーテルを加え、樹脂から切断されたペプチドを
粉末として得、更にこの粉末をジエチルエーテルで洗浄
した。これをセファデックスＧ−１０を支持体とするゲ
ル濾過により脱塩し、凍結乾燥して粗体を得た。得られ
た粗体を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ
５Ｃ１８（２０×１５０mm）、移動相：（Ａ）０．１
％ＴＦＡ，（Ｂ）１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦ
Ａ、ｇｒａｄｉｎｅｔ：（Ａ）：（Ｂ）＝８８：１２か
ら（Ａ）：（Ｂ）＝８５：１５、１８分間、流速：１７
ml）にて精製し、更にセファデックスＧ−２５を支持体
とするゲル濾過により酢酸塩とし、凍結乾燥することに
より表題のペプチドを得た。

【００５２】アミノ酸分析（６ＮＨＣｌ，２４hr，１
１０℃）Ａｓｐ３．０８（３）Ｔｈｒ２．９８（３）Ｓｅｒ１．０１（１）Ｇｌｕ２．００（２）Ｇｌｙ３．１３（３）Ｐｒｏ０．９６（１）Ｃｙｓ − （１）Ｍｅｔ１．０４（１）Ｌｙｓ３．０５（３）Ｈｉｓ３．０４（３）Ｔｒｐ − （１）Ａｒｇ２．０６（２）

【００５３】ＨＰＬＣ分析Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲ（４．６×２００m
m）カラムを用い、流速１．０ml／min で、０．１％
ＴＦＡ中アセトニトリル１０−４０％（６０分）のｇｒ
ａｇｉｅｎｔ溶出での分析ＨＰＬＣで保護時間１１．３
分の単一ピークを示した。

【００５４】実施例３被検血清のＥＬＩＳＡ試験（１．）ペプチドを５０−１００ng／wellの濃度で９６
穴マイクロプレート（コーニング社製）、又は１００ng
／wellの濃度で９６穴マイクロプレート（住友ベークラ
イトアミノプレート）にコートした後、２０００倍希釈
した被検者の血清で反応した。２次抗体として、パーオ
キシダーゼ標識山羊由来抗ヒトイムノグロブリン（Ｉ
ｇ）Ｇ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を反応させ、さらに発色
性の酵素基質を加え、発色させた後、ＯＤ４９０nmの
吸光度を測定した。この時、比較として本発明のペプチ
ド以外に、バキュロウイルスベクター発現系により得ら
れた精製ｅｎｖｇｐ１２０及びｇａｇｐ２４，Smit
h & Johnson の方法〔D.B.Smith and K.S.Johnson, Gen
e, 67 , 31-40(1988) 〕にしたがって大腸菌でｇｌｕｔ
ａｔｈｉｏｎｅＳ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳ
Ｔ）との融合蛋白質として発現させ、精製したＧＳＴ−
ｇａｇｐ１５融合蛋白質及びＧＴＳ−ｒｅｖ融合蛋白
質、更に化学合成したｖｐｒ（１−２０），ｖｐｕ（２
７−５１），ｔａｔ（６７−９５），ｎｅｆ（１５−４
３）も同様の試験に用いた。

【００５５】試験に用いた血清は８人のＨＩＶ保持者末
梢血からのＨＩＶ分離テストにおいて、陰性であった時
点と陽性であった時点における血清、合計１６検体を用
いた。これらの血清分離時における保持者の症状は、Ｃ
ＤＣ病型分類にしたがい、表２に示した。陰性対照血清
として、５人のＨＩＶ非感染健常者の血清を用いた。

【００５６】

【表２】

【００５７】本試験の結果を図３に示すが、構造蛋白質
として比較に用いたｅｎｖｇｐ１２０及びｇａｇｐ
２４に対する抗体価は、全体に高い傾向が認められた。
しかしＨＩＶ分離の陰性時と分離陽性時との間に大きな
差は観察されなかった。そしてｇａｇｐ２４に対する
抗体価は報告〔K.S.Steimer, et al, Virology, 150, 2
83-290(1986) 〕されているようにＨＩＶ分離陰性時に
比べ陽性時に低下していた。またＧＳＴ−ｇａｇｐ１
５融合蛋白質に対する抗体価もＨＩＶ分離陰性及び陽性
時で相関は無かった。

【００５８】一方、ＨＩＶの調節蛋白質についてみる
と、本発明のポリペプチドに対する抗体価は全体に高い
傾向が観察されると同時に、ＨＩＶ分離陰性時から分離
陽性になるにしたがって上昇する傾向が認められ、病状
のモニタリングマーカーとして有用なことが示唆され
た。図３には本発明のポリペプチド〔ｖｉｆ（１７０
−１９２）〕に対する抗体価の変動を示した。

【００５９】他の調節蛋白質の類似物ＧＳＴ−ｒｅｖ融
合蛋白質及び、ｖｐｒ，ｖｐｕ，ｔａｔ，ｎｅｆの各区
分ペプチドに対する抗体価は高いものもあるが、病状の
変動に対する規則性は観察されなかった。また対照のＨ
ＩＶ非感染健常者５人のＥＬＩＳＡ値は０．２以下であ
った。

【００６０】以上のことから、本発明のポリペプチドに
対する抗体価の変動が活発なＨＩＶ増殖・複製のマーカ
ー、すなわち病状の進行のマーカーとして利用できるこ
とを示している。

【００６１】（２．）本発明のポリペプチドはｖｉｆ１
０位〜３０位、ｖｉｆ１７０位〜１９２位に相当するペ
プチド配列を有するものであるが、ｖｉｆ蛋白質におけ
る本領域の診断マーカーとしての有用性を以下の実験に
より確認した。

【００６２】すなわち、実施例３の（１）で記した内容
と同様な試験をｖｉｆ蛋白質の区分ペプチドに関して再
度検討した。本発明のペプチドに対し、ｖｉｆ８５位〜
１０６位に相当する区分ペプチドを比較として用いた。
その結果を図４に示す。用いた血清はＨＩＶ分離陰性血
清１３例、ＨＩＶ分離陽性血清１２例、ＨＩＶ非感染健
常人血清４例である。これらの血清間には実施例３の
（１）で述べたような関係はない。

【００６３】本発明のペプチドにおいてはどちらも高い
抗体価を示すとともに、ＨＩＶ分離陰性時よりも陽性時
の検体における抗体価の方が高い傾向にあることが示唆
された。

【００６４】一方、ｖｉｆ８５位〜１０６位に相当する
区分ペプチドでは抗体価が低く、又本発明のペプチドで
示されたような規則性は観察されなかった。また、本発
明のペプチドについては、ウイルス分離陰性のＨＩＶ感
染血清においても、対照のＨＩＶ非感染健常人血清に比
して、比較的高値のＥＬＩＳＡ値が得られている。この
ことは本発明のペプチドがＨＩＶ感染のスクリーニング
にも有用であることを示している。

【００６５】

【発明の効果】本発明のペプチドは、新規な化合物であ
り、ＨＩＶ感染者のスクリーニングおよび病態変動のモ
ニターとして利用でき、診断薬として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｖｉｆ−Ｎ（１０−３０）のアミノ酸配列分析
結果を示す。

【図２】ｖｉｆ−Ｃ（１７０−１９２）のアミノ酸配列
分析結果を示す。

【図３】ＨＩＶ−１ウイルス分離陰性時および陽性時に
おける、感染患者血清の各種ウイルス抗原および合成ペ
プチドに対するＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。

【図４】ＨＩＶ−１感染患者血清の各ＶＩＦ区分ペプチ
ドに対するＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者林良雄神奈川県川崎市中原区井田1618番地新日本製鐵株式会社先端技術研究所内 (72)発明者佐藤吉美神奈川県川崎市中原区井田1618番地新日本製鐵株式会社先端技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＨＩＶに由来するｖｉｆ蛋白質のアミノ
酸配列断片に相当するペプチドおよびその誘導体であっ
て、下記式で表わされるペプチド類からなる群より選ば
れるペプチド。 H-Val-Trp-Gln-Val-Asp-Arg-Met-Arg-Ile-Asn-Thr-Trp-
Lys-Arg-Leu-Val-Lys-His-His-Met-Tyr-X 〔式中、ｘは
Cys-OHあるいは水酸基である〕、ならびに、Y-Thr-Glu-
Asp-Arg-Trp-Asn-Lys-Pro-Gln-Lys-Thr-Lys-Gly-His-Ar
g-Gly-Ser-His-Thr-Met-Asn-Gly-His-OH〔式中、ＹはH-
Cys あるいは水素原子である〕。
【請求項２】請求項１記載のペプチドを含んでなるエ
イズ診断用要素